In h?heren Pflanzen vermittelt der Blaulicht-sensitive Photorezeptor Phototropin verschiedene Reaktionen wie Phototropismus, Chloroplastendrehung und die ?ffnung von Schlie?zellen. Alle Reaktionen haben mit der Optimierung der pflanzlichen Lichtaufnahme und damit einer angepa?ten Photosynthese sowie der Vermeidung von Lichtsch?digung zu tun. In C.reinhardtii haben alle Phototropinreaktionen mit dem Sexualleben dieser Alge zu tun, d.h. Gametogenese, sexueller Kompetenz sowie der Keimung von Zygoten. Diese Doktorarbeit wurde Ende 2001 begonnen und verlief parallel zu den Arbeiten von Huang. Im Unterschied zu den Ergebnissen von Huang war das Chlamydomonas Phototropin in meinen H?nden unl?slich. Das Protein war nicht komplett membranassoziiert, sondern ein Teil des Proteins blieb immer l?slich. Die Phototropinmenge sowie die Verteilung waren in vegetativen Zellen, die unter Stark- oder Schwachlicht gewachsen waren, unterschiedlich. Deshalb wurde fš¹r diesen Unterschied Licht als wesentlicher Faktor verantwortlich gemacht. Jedoch zeigen verschiedene St?mme bei vegetativem Wachstum unter identischen Lichtbedingungen unterschiedliche Phototropinmengen. Das deutet auf weitere Faktoren hin, die Konzentration und Verteilung von Phototropin beeinflussen. In Chlamydomonas wurde neben dem Volll?ngenprodukt noch eine c-terminal verkš¹rzte Phototropinvariante gefunden. Licht wurde als Verursacher der Verkš¹rzung identifiziert. Aber nur lange Belichtungen von ca. 48 h fš¹hrten je nach Intensit?t zu klaren Abbaumustern. Fš¹r das Studium der Beteiligung des Phototropins am Sexualleben von Chlamydomonas, sollte ein Phot- Stamm generiert werden. Dazu wurde ein RNAi-Konstrukt hergestellt, mit dem es m?glich war, im Stamm cw15 arg- A das Phototropin bis auf 10% des Originalniveaus zu reduzieren. Leider funktionierte das Konstrukt in anderen St?mmen nicht zuverl?ssig. Im Stamm CC32pab1mt(+) konnte nur ein Klon mit einer Reduktion auf 15% des Originalniveaus erreicht werden. Au?erdem war die Silencing-Effizienz stark von den Wachstumsbedingungen abh?ngig. Die beste Reduktion wurde bei niedrigen Lichtintensit?ten gefunden. Es wurde ein weiterer Kreuzungstest etabliert, der fš¹r die Analyse der Zygotenkeimung verschiedene Vorteile gegenš¹ber bekannten Tests liefert. Aus den durchgefš¹hrten Tests konnte geschlossen werden, dass Licht auch ein wesentlicher Faktor fš¹r die Zygotenkeimung ist. Bei mittleren Lichtintensit?ten keimen Zygoten mit wenig Phototropin sp?ter. Starklicht kann diesen Mangel weitgehend kompensieren. Zur biochemischen Analyse des Phototropins in vitro war die Expression eines markierten Phototropins notwendig. Zur Analyse des Phototropinabbaus und fš¹r die sp?tere Reinigung wurde auch versucht, Phototropin in verschiedenen Gastorganismen zu exprimieren. In dieser Arbeit wurde Phototropin in Xenopus Oocyten und Diatom?en exprimiert. Diese Versuche haben best?tigt, dass das Phototropinabbauprodukt vom selben Gen wie das Volll?ngenprotein resultiert. Durch Expression der Phot-Mutante S57S/C250S konnte auch gezeigt werden, dass die Aktivierung des Phototropins keine Voraussetzung fš¹r den Abbau ist. Erstmalig konnte auch Phototropin als Fusionsprotein in Chlamydomonas exprimiert werden. Das Fusionsprotein wurde gereinigt und die Identit?t massenspektrometrisch verifiziert. Es wurde ein Stamm gefunden, der nur eine verkš¹rzte Variante des Phototropins exprimiert. Das Produkt war besser l?slich als die Volll?ngenversion. Eine Gro?produktion sollte fš¹r die Reinigung und nachfo! lgende Kristallisation angesetzt werden. Tandem Affinit?tsreinigungen sollten fš¹r die Identifizierung von Reaktionspartnern durchgefš¹hrt werden. / Abstract In higher plants, phototropin is in charge of phototropism (Liscum, 2002), chloroplast relocation (Wada et al., 2003) and stomatal opening (Schroeder et al., 2001). All its functions are connected with plants' modulation to the surrounding light conditions so that plants can make the best use of light for photosynthesis and dodge harmful strong light. In C.reinhardtii, all its reported functions are connected to the sexual life of this green alga, i.e. gametogenesis, maintenance of gamete competence and zygote germination. This PhD work started at the end of 2001 and went on in parallel with Huang's work. Different from Huang's observation that phototropin was insoluble (Huang et al., 2002), it was found that phototropin existed not only as a membrane associated protein, a portion of phototropin always remained soluble. Phototropin levels and distributions were different between vegetative cells grown in strong light or in darkness. Light was thought to be the essential factor that caused this difference. But, different strains grown vegetatively under same light conditions showed that the levels of phototropin and its distributions varied. This suggested the existence of other factors in the determination of its level and distribution. A C-terminus degradation product of phototropin was found as a stable component in C. reinhardtii. Light was found as a reason that caused the degradation. However, short time of illumination with strong light (up to 2 h) did not evoke the degradation machinery. In light gradient experiment, long time illumination (~48h) with different light intensity showed a clear degradation pattern. To study phototropin involvement in Chlamydomonas sexual life, a Phot1- strain was needed. An RNAi phototropin construct was made. It managed to reduce the level of phototropin in strain cw15 arg- A down to 10% of its original level. However, the construct did not work properly in other strains. Only one transformant of strain CC32pab1mt(+) with a reduction of the phototropin level to around 15% of the original level was found. Under different growth conditions, the silencing efficiency varied. The best silencing result appeared when cells were grown under low light conditions. A new mating assay was established in this work, which has many benefits over the traditional way of studying zygote germination. The conclusion was drawn from this assay that light was the primary factor that determines zygote germination; under moderate light conditions, zygotes with higher phototropin level would germinate earlier; strong illumination could compensate the difference caused by the low phototropin level in zygote germination. For phototropin function analysis in vitro, a Chlamydomonas strain that over-expressed phototropin was in need. To prove that the suspected degradation product originated from the phototropin gene and to purify phototropin for crystallization, trials to express C.r. phototropin cDNA in different organisms were also made. Phototropin was expressed in Xenopus oocytes and diatom in this work. The expression pattern confirmed that both the full-length and the suspected degradation product did originate from the same phototropin gene. It was also found that the degradation was independent on phototropin activation state by expressing C.r. Phot1 (C57S, C250S) in oocytes. For the first time, recombinant phototropin got expressed in Chlamydomonas by fusion expression strategy. The fusion product was purified and the identity was confirmed by Mass Spectrometry analysis. One strain which expressed only a C-terminus truncation version of the fusion product was found. Compared with the full length product, this mutant had better solubility and was easier to be purified. Large scale of purification should be performed to obtain enough material for crystallographic studies. Tandem affinity purification (TAP) tag should also be performed in Chlamydomonas proteomic studies about phototropin.

Lipoxygenasen sind nichthämeisenhaltige Dioxygenasen, die die Bildung von Hydroperoxiden aus molekularem Sauerstoff und mehrfach ungesättigten Fettsäuren katalysieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Lipoxygenase-Ligand-Wechselwirkungen untersucht: a) Durch gezielte Substratveränderungen und ortsgerichtete Mutagenese konnte gezeigt werden, dass Fettsäuren normalerweise mit dem Methylende in der Bindungstasche tierischer Lipoxygenasen gebunden werden. Unterschiedliche Positionsspezifitäten basieren demzufolge auf dem Volumen der Substratbindungstasche (Volumenhypothese). Darüber hinaus konnte bei der 15-Lipoxygenase eine inverse Substratbindung (Carboxylgruppe im aktiven Zentrum) durch Modifikation beider Enden der Fettsäure erzwungen werden, wodurch ausschließlich 5-Lipoxygenierung katalysiert wurde. b) Untersuchungen mit dem Hemmstoff Ebselen ergaben unterschiedliche Hemmmechanismen für verschiedene Enzymzustände. Die Hemmung der Lipoxygenase im Grundzustand (Fe[II]) erfolgt durch kovalente Bindung und Veränderung der Eisenligandensphäre irreversibel nach einem nicht-kompetitiven Mechanismus. Dagegen wird die aktive Lipoxygenase (Fe[III]) nur noch kompetitiv durch Ebselen gehemmt. c) Die Membranbindung der tierischen 15-Lipoxygenase erfolgt über hydrophobe Wechselwirkungen, vermittelt durch oberflächenexponierte, hydrophobe Aminosäuren aus beiden Enzymdomänen. Die Expression einer enzymatisch aktiven Trunkationsmutante, der die N-terminale Domäne fehlt, zeigte, dass diese nicht essentiell ist für die Membranbindung. / Lipoxygenases are nonheme iron-containig dioxygenases that catalyze the oxygenation of polyunsaturated fatty acids to hydroperoxy derivatives. Here, the interaction of lipoxygenases with various ligands was investigated: a) From substrate modifications and site directed mutagenesis it was concluded that fatty acids are bound with their methyl end in the substrate binding pocket of mammalian lipoxygenases. The positional specificity is therefore related to different volumes of this binding pocket (space-based hypothesis). For the 15-lipoxygenase an inverse substrate binding (carboxy terminus in the pocket) could be forced by simultaneous modification of both ends of the fatty acid. This lead to an exclusive 5-lipoxygenation by the 15-lipoxygenase. b) The mechanism of lipoxygenase inhibition by ebselen depends on the enzyme's state. The groundstate lipoxygenase (containing Fe[II]) is irreversibly inhibited in a non-competetive manner due to covalent modification and alteration of the iron ligand sphere. The active enzyme (containing Fe[III]) on the other hand is only competetively inhibited. c) The membrane binding of the mammalian 15-lipoxygenase is based on hydrophobic interactions mediated by solvent exposed, hydrophobic amino acid residues of both enzyme domains. The expression of an enzymatically active truncation mutant, which lacks the entire N-terminal domain, showed that this domain is not essential for membrane binding.

Diese Arbeit basiert auf der grundlegenden Annahme, dass Signaltransduktionsnetzwerke in lebenden Organismen als das Ergebnis eines evolutionären Prozesses betrachtet werden können, der sich durch Mutations- und Selektionsprinzipien auszeichnet. Basierend auf dieser Hypothese werden zwei Ansätze vorgestellt, um Design und Kontrollmechanismen von Netzwerken zu untersuchen. In Kapitel 2 wird ein Modell entwickelt, welches die Struktur analysiert. Ein vereinfachtes Modell wird benutzt, um Systeme, bestehend aus Rezeptoren, Kinasen und Phosphatasen, zu beschreiben. Zwei dynamische Eigenschaften sollten für die Überlebensfähigkeit der Organismen eine wichtige Rolle spielen: (i) Um eine Autoaktivierung zu verhindern, z.B. gegenüber stochastischen Schwankungen von Rezeptorliganden, muss der Signal-Aus Zustand dynamisch stabil sein. (ii) Das Ausgangssignal sollte verstärkt werden. Um Netzwerke zu charakterisieren, die beide Kriterien gleichzeitig erfüllen, wird eine systematische Analyse von kleinen Netzwerken durchgeführt. Die Untersuchungen machen deutlich, dass für solche Netzwerke die folgenden zwei Design-Eigenschaften gelten: (i) Mit steigender Netzwerkgröße verringert sich die Konnektivität, was einer steigenden Spezifität der Kinasen gleichkommt. (ii) Die Anzahl der "Feedback"-Zyklen nimmt mit zunehmender Netzwerkgröße ab, was eine abnehmende Tendenz anzeigt, dass "nachgeschaltete" Kinasen "vorgelagerte" Kinasen aktivieren. Die allgemeine Gültigkeit dieser Eigenschaften wird durch die Untersuchung eines großen Kinase-Netzwerks aus der Datenbank TRANSPATH gestützt, welches hinsichtlich verschiedener Strukturmerkmale weitergehend untersucht. Das Netzwerk-Design unterscheidet sich aussagekräftig von Zufallsnetzen. In Kapitel 3 werden Kontrollmechanismen unterschiedlicher Signalnetzwerke analysiert, indem die Metabolische Kontroll Theorie auf transiente Aktivierungsprofile angewendet wird, indem Kontrollkoeffizienten für Amplitude, Signaldauer berechnet werden. / This work is based on the hypothesis that signal transduction networks in living cells are the result of an evolutionary development which is governed by mutations and natural selection principles. Based on this working hypothesis, two approaches are presented to investigate design and control mechanisms of signal transduction networks. In the first approach, covered in chapter 2, a model is developed to analyse the structural design of signaling networks. A simplified model is used to describe systems consisting of receptors, kinases and phosphatases. Two dynamic features of signaling systems are assumed to be crucial for the organism''s surviving capacity: (i) To avoid autoactivation, e.g. due to stochastic fluctuations of receptor ligand, the signal off-state must be dynamically stable. (ii) The signal output should be amplified. To characterise networks fulfilling both criteria simultaneously, a systematic analysis is performed for small networks. The investigations reveal that for such networks the following two design principles hold true: (i) With increasing network size the connectivity decreases connoting an increasing specificity of kinase activities. (ii) The number of feedback cycles decrease with increasing network size indicating a decreasing tendency of downstream kinases to activate upstream kinases. The general validity of these design principles is supported by the analysis of a large kinase network retrieved from the TRANSPATH database. This signaling network is further investigated regarding several design properties. When comparing the design and dynamic features of the TRANSPATH network to random networks, significant differences are observed. In the second approach, described in chapter 3, control mechanisms of different signaling networks are analysed by applying Metabolic Control Analysis to transient activation profiles. Control coefficients on the signal amplitude, signal duration and integrated response are calculated.

Innerhalb der Decapoda stellt das Taxon Brachyura eines der artenreichsten Taxa mit bis zu 10000 Arten dar. Die Phylogenie der Brachyura wird aufgrund morphologischer und molekularer Untersuchungen seit mehr als ein Jahrhundert kontrovers diskutiert. Zur Klärung phylogenetischer Fragestellungen wurde mit den vergleichenden Untersuchungen der Magenossikel und der Magenzähne von 66 Taxa der Brachyura ein neuer phylogenetischer Ansatz gewählt. Mit Anwendung eines spezifischen Färbepigmentes, Alizarin-Rot S, konnten sechs neue Magenossikel einer bereits existierenden Nomenklatur hinzugefügt werden, so dass jetzt 41 Magenossikel für das Grundmuster der Brachyura angenommen werden können. Im Ergebnis der phylogenetischen Analyse wird ein monophyletisches Taxon Brachyura einschließlich der Taxa Dromiidae und Raninidae unterstützt. Die von Guinot (1977, 1978) als Monophyla postulierten Teiltaxa Podotremata und Heterotremata finden hier keine Unterstützung. Taxa wie Raninidae und Cymonomidae, welche aufgrund der coxalen Position ihrer Genitalporen dem Taxon Podotremata sensu Guinot zugeschrieben werden, weisen nach vorliegenden Daten eine nähere Verwandtschaft zu den "höheren" Krabben auf. Eine Monophylie eines Taxons Thoracotremata sensu Guinot kann dagegen basierend auf den analysierten Magenstrukturen, aber auch auf der Grundlage molekularer Studien (Schubart et al. 2000a, 2000b) und dem vorliegenden Daten zum Fossilbericht angenommen werden. Eine basale Stellung der Dynomenidae und Dromiidae im Ergebnis der kladistischen Analyse lässt sich mit den Fossilfunden aus dem mittleren Jura in Übereinstimmung bringen. Des weiteren kann für die meisten Taxa der "höheren" Krabben ein gemeinsamer Vorfahre für die obere Kreide bzw. bis zum Beginn des Tertiärs postuliert werden. / Within the Decapoda the taxon Brachyura is the species-richest taxon with up to 10000 species. The phylogeny of the Brachyura has been discussed based on morphological and molecular investigations since more than a century. The investigation of the foregut-ossicles and gastric-teeth of 66 brachyuran species, is a new approach to answer important phylogenetic questions. Using a specific staining pigment Alizarin Red S, six new described foregut-ossicles are added to an existing nomenclature. As a result of this method the presence of 41 foregut-ossicles is proposed for the ground pattern of the Brachyura. The cladistic analysis supports a monophyletic origin of the Brachyura including the Dromiidae and the Raninidae. The taxa Podotremata and Heterotremata, postulated as monophyletic by Guinot (1977, 1978), are not supported in the present study. The Dromiidae and Raninidae, which are placed within the Podotremata sensu Guinot, are closer related to the "higher crabs". Based on the analysed foregut-characters, several molecular studies (Schubart et al. 2000a, 2000b), and the data of the fossil record, a monophyletic origin of the Thoracotremata sensu Guinot is suggested. The analysed basal position of the Dynomenidae and Dromiidae is in agreement with the brachyuran fossil record. A common ancestor for most of the "higher" brachyuran crabs is suggested for the period between the upper Cretaceous and the beginning of the Tertiary.

Eine wesentliche Aufgabe auditorischer Systeme besteht in der Erkennung und Klassifikation verhaltensrelevanter Signale. Die akustischen Kommunikationssignale vieler Feldheuschrecken zeichnen sich durch artspezifische Modulationen der Signalamplitude aus, die im Kontext der Partnerwahl zur Erkennung der eigenen Art genutzt werden. Die Kommunikation ist jedoch auch als Basis für sexuelle Selektion von Interesse - einer Abschätzung der Qualität des Senders anhand der akustischen Signale, welche eine Bewertung subtiler Variationen der artspezifischen Musters erfordert. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin zu untersuchen, wie amplitudenmodulierte akustische Signale in den Antworten identifizierter auditorischer Interneurone der zweiten und dritten Verarbeitungsstufe repräsentiert werden, insbesondere, wie gut sie anhand dieser Antworten unterscheidbar sind. Dazu wurden (i) sinusförmig amplitudenmodulierte Stimuli genutzt und die Parameter Modulationsfrequenz und Modulationstiefe systematisch variiert, (ii) individuelle Gesänge der gleichen Art, und (iii) im Grundmuster zeitlich reskalierte Gesänge. Lokale Interneurone zeichneten sich aus durch: ein oft sehr hohes zeitliches Auflösungsvermögen, hohe Empfindlichkeit gegenüber Schwankungen der Signalamplitude, sowie gute Unterscheidbarkeit der sinusförmig amplitudenmodulierten Signale und der Gesänge auf der Basis von Spikeantworten. Bei den aufsteigenden Interneuronen nahm die Fähigkeit zur zeitlichen Ankopplung der Spikes an die Amplitudenmodulationen der Stimuli ab, was sich auch in deren reduzierter Unterscheidbarkeit äußerte. Ursächlich hierfür war einerseits die Zunahme der Antwortvariabilität (Jitter der Spikezeitpunkte), aber auch verstärkt auftretende Filtereigenschaften. Auf dieser dritten Verarbeitungsebene kommt es zu einer stärkeren Spezialisierung auf bestimmte zeitliche Aspekte des Stimulus, die als Grundlage einer verhaltensrelevanten Klassifikation von akustischen Signalen interpretiert werden kann. / A central task of auditory systems is the recognition and classification of behaviorally relevant signals. The communication signals of many grasshoppers can be characterized by a species-specific pattern of amplitude modulation, which is mainly used for species recognition in the context of mate finding. Additionally, the communication is also of interest with respect to sexual selection - an evaluation of the signaler''s quality from the signal pattern, which requires the quantification of subtle variations of the common species-specific pattern.The goal of this study was to investigate how amplitude modulated acoustic signals are represented in the responses of identified 2nd and 3rd order auditory interneurons, particularly, how well they can be discriminated on the basis of the responses. For this (i) sinusoidal amplitude modulated stimuli were used and the parameters modulation frequency and modulation depth were systematically varied, (ii) individual songs of the same species and (iii) songs with temporal rescaled basic pattern were presented. Local interneurons can be characterized by: mostly high temporal resolution capacities, high sensitivity to fluctuations of the signal amplitude as well as a good distinguishability of sinusoidal amplitude modulated stimuli and songs on the basis of the spike trains. In ascending interneurons the synchronization to the amplitude modulations decreased, which also appeared in a reduced discrimination performance. This is caused by an increase of response variability (jitter of spike timing) but also by distinctive filter properties of the respective neurons. Neurons on this third processing level exhibit a greater specialization to particular temporal aspects of the stimulus. This can be interpret as a basis of a behaviorally relevant classification of acoustic signals.

Arteriogenese bezeichnet das adaptive Wachstum von präexistenten kollateralen Arterien. Im Falle eines Arterienverschlusses ist Arteriogenese der endogen effizienteste Kompensationsmechanismus, um das Hypoperfusionsgebiet mit ausreichend Blut zu versorgen (Biologischer Bypasses). In dieser Arbeit wurde das frühe Wachstum von Kollateralgefäßen im Gehirn im ersten Modell für zerebrale Arteriogenese, dem 3-VO Modell (3-vessel occlusion), in der Ratte charakterisiert. (I) Die Untersuchung am nicht-ischämischen 3-VO Hypoperfusionsmodell zeigten, dass 7 Tage nach 3-VO die Arteria cerebri posterior (PCA) signifikant im Diameter anwächst. Histologische Untersuchungen konnten ein vermehrtes Zellwachstum in der PCA und das Einwandern von Makrophagen in den perivaskulären Bereich (24 Stunden und 3 Tage post 3-VO) darstellen und eine Aktivierung des Endothels 3 Tage nach 3-VO wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie identifizieren. (II) Für eine genaue Anaylse des globalen Genexpressionsprofils der zerebralen Arteriogense wurde die wachsende PCA selektiv aus dem Gehirn entnommen und ein Genexpressionsprofil für die frühe zerebrale Arteriogenese erstellt (164 Gene dereguliert). Eine Unteruschung von biologischen und molekularen Prozessen zeigte, dass eine Vielzahl der deregulierten Gene in Zellproliferation und Inflammation involviert sind. Die Expression der Protease-Inhibitoren Kininogen und TIMP-1 wurde als “Marker” der frühen Arteriogenese in der PCA lokalisiert werden. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit erstmals eine Übersicht der biologischen Prozesse in der zerebralen Arteriogenese und eröffnet neue Ideen für eine mögliche therapeutische Strategie. / Arteriogenesis, the adaptive outward growth of pre-existing collateral arteries, is the most efficient endogenous rescue mechanisms in vertebrates against the occlusion of a major artery (biological bypass). Here, collateral growth was induced using the first model for cerebral arteriogenesis, the 3-vessel occlusion (3-VO) rat model. (I) 3-VO resulted in a significant diameter increase within 7 days in the posterior cerebral artery (PCA) and posterior communicating artery (Pcom), classifying the region of interest. Immunhistological staining demonstrated proliferative activation and macrophage invasion, already 24h post 3-VO within the PCA, confirming the arteriogenic phenotype. Furthermore, activation of the PCA endothelium was detected within 3 days post 3-VO by scanning electron microscopy. (II) For analysing the molecular mechanism of cerebral arteriogenesis, collateral tissue from the growing PCA was selectively isolated. Here, 24h post 3-VO 164 genes were detected to be significantly deregulated. Analysis of molecular annotations and networks associated with differentially expressed genes revealed that expression patterns contain gene transcripts predominantly involved in proliferation, inflammation, and migration. Early-phase cerebral arteriogenesis is characterized by protease inhibitor expression and showed that protease inhibitors TIMP-1 and kininogen are molecular markers of early-phase cerebral arteriogenesis. In summary, this work characterizes morphological features and genomic profiles of growing collaterals in the brain and develops novel ideas for a therapeutic stimulation of arteriogenesis.

Plakophiline sind Proteine der Armadillo-Familie, die eine Funktion während der Embryonalentwicklung und im adulten Organismus aufweisen. Mutationen in Genen, die für diese Proteine kodieren, führen häufig zu Krankheiten. In dieser Arbeit wird der Phänotyp von Plakophilin 2-defizienten Mausembryonen untersucht, welche Probleme in der Morphogenese des Herzens und dessen Stabilität aufzeigen. Feine Risse in der Herzwand in den Tagen 10.5-11 der Embryogenese führen zu Blutfluss in die Perikardialhöhle und resultieren in embryonalem Tod. In Abwesenheit von Plakophilin 2 löst sich das Zytoskelett-bindende Protein Desmoplakin aus den Zellverbindungen der Kardiomyozyten und bildet Aggregate im Zytoplasma. Im Gegensatz dazu bleiben Zellverbindungen der Epithelien unverändert. Die molekulare Analyse des betroffenen Gewebes lässt eine essentielle Rolle für Plakophilin 2 in der Organisation der Zellverbindungen im Herz ableiten. Besonderen Wert bekamen diese Untersuchungen, als es gelang, die erarbeiteten Zusammenhänge mit einer Krankheit beim Menschen zu koppeln. Beachtlicherweise wurden bei mehr als 25% der an Arrhythmogener-Rechts-Ventikulärer-Kardiomyophathie (ARVC) erkrankten Menschen, Mutationen im Gen für Plakophilin 2 gefunden. / Plakophilins are proteins of the armadillo family that function in embryonic development and in the adult, and when mutated can cause disease. We have ablated the plakophilin 2 gene in mice. The resulting mutant mice exhibit lethal alterations in heart morphogenesis and stability at mid-gestation (E10.5–E11), characterized by reduced trabeculation, disarrayed cytoskeleton, ruptures of cardiac walls, and blood leakage into the pericardiac cavity. In the absence of plakophilin 2, the cytoskeletal linker protein desmoplakin dissociates from the plaques of the adhering junctions that connect the cardiomyocytes and forms granular aggregates in the cytoplasm. By contrast, embryonic epithelia show normal junctions. Thus, we conclude that plakophilin 2 is important for the assembly of junctional proteins and represents an essential morphogenic factor and architectural component of the heart. Interestingly we identified heterozygous mutations in the Plakophilin 2 gene in 32 out of 120 patients suffering from arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC). ARVC is associated with fibrofatty replacement of cardiac myocytes, ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death. Many of the identified mutations lead to an early STOP in protein translation and reduced expression of Plakophilin 2 protein likely due to RNA or protein degradation. Since loss of one functional allele of Plakophilin 2 leads to ARVC, we want to investigate the occurrence of typical ARVC-phenotypes in heterozygous Plakophilin 2 mice in future to provide a new insight into possible molecular mechanisms of ARVC.

Derzeit gibt es keine wirksame Therapie gegen das maligne Melanom. Der Todesligand TRAIL erscheint als eine vielversprechende Krebstherapie. Trotzdessen weisen Melanomzellen sowohl eine bestehende als auch induzierbare TRAIL-Resistenz auf. In der vorliegenden Arbeit wurde die Überwindung der TRAIL-Resistenz durch drei Kinaseinhibitoren untersucht.Das Indirubin-Derivat 8-Rha-β ist in der Lage, die Sensitivität von Melanomzellen für die Todesliganden zu erhöhen und die Resistenz für TRAIL und CD95-Agonisten zu überwinden. Die Behandlung mit 8-Rha-β vermittelt sowohl die Aktivierung des extrinsischen als auch intrinsischen Signalweges. Der Tumorsuppressor p53 zeigte sich als Hauptregulator dieser proapoptotischen Änderungen und ist der Transaktivator der proapoptotischen Proteine, welche durch das 8-Rha-β heraufreguliert wurden. Die Anwendung eines Melanommodells von TRAIL-sensitiven und resistenten Zelllinien konnte eine Sensitivierung für TRAIL mittels des Kinaseinhibitors BMS-345541 aufzeigen. Die Behandlung von BMS-345541 resultierte alleine in einer frühen Bax-Aktivierung, was in den Konformationsänderungen, veränderten Phosphorylierungen und der Translokation von Bax beobachtet werden konnte. Die synergistischen Effekte resultierten aus der Aktivierung von Bid durch TRAIL, welches Bcl-2 inhibiert und der Aktivierung von Bax durch BMS-345541. Mutiertes BRAF wurde als der kritische Faktor für das kutane Melanom identifiziert. In dieser Arbeit wird ein pan-RAF-Inhibitor, L-779,450, verwendet. Dieser Inhibitor sensitiviert ebenfalls für eine TRAIL-induzierte Apoptose. Die Apoptose war mit der Aktivierung des intrinsischen Signalweges verbunden. L-779,450 allein induziert keine Apoptose, aber resultiert in einer Aktivierung von Bax und der Hochregulation von Bim. Die hier identifizierten Kinaseinhibitoren könnten bei der Behandlung des malignen Melanoms helfen, um die TRAIL-Resistenz zu überwinden und die Wirksamkeit TRAIL-vermittelter Therapieformen zu optimieren. / Until today efficient therapies are lacking for metastatic melanoma. The death ligand TRAIL appears as promising in cancer treatment; however, melanoma cells reveal both preexisting and inducible TRAIL resistance. In the present study the mechanisms of TRAIL-induced apoptosis by three kinase inhibitors were investigated. The indirubin derivative 8-Rha-β is able to enhance melanoma cell sensitivity for death ligands and overcomes resistance to TRAIL and CD95 agonists. Indirubin activated the extrinsic and intrinsic apoptosis pathways. The tumor suppressor p53 by its ability to transactivate proapoptotic proteins appeared as master regulator of these proapoptotic changes which was upregulated by indirubin. Applying a melanoma model of TRAIL-sensitive and resistant cell lines, efficient sensitization for TRAIL is demonstrated for the kinase inhibitor BMS-345541. Of note, BMS-345541 alone resulted in early Bax activation, seen by conformational changes, altered Bax phosphorylation and Bax translocation. The synergistic effects resulted from Bid activation in response to TRAIL, which inhibits Bcl-2, and the activation of Bax through BMS-345541. Mutated BRAF represents a critical oncogene in melanoma. Here, we investigated effects of the pan-RAF inhibitor L-779,450, which resulted in strong enhancement of apoptosis in combination with TRAIL. Apoptosis coincided with activation of mitochondrial pathways. Apoptosis induction by L-779,450/TRAIL was dependent on Bax. Thus, activation of Bax by L-779,450 alone was demonstrated by Bax conformational changes. Furthermore, the BH3-only protein Bim was upregulated in response to L-779,450. This identified specific role of these kinase inhibitors, which are able to enhance melanoma cell sensitivity for TRAIL could be helpful for treatment of malignant melanoma to overcome the TRAIL-resistance and to optimize the efficiency of recent therapies.

Sauerstoffmangel in Pflanzenzellen führt durch Hemmung der mitochondrialen Atmung zur Akkumulation von NADH und zu ATP-Mangel. Reis kann, im Gegensatz zu Weizen oder Kartoffeln, längere Sauerstoffmangel-Perioden überstehen. Ziel dieser Promotionsarbeit war es, einige Aspekte des Primär-Stoffwechsels zu untersuchen, die für das Überleben solcher Stresssituationen verantwortlich sein können, wie die Ethanol-Gärung, die Photosynthese sowie die Nutzung alternativer Energiedonoren. Die Ethanol-Gärung ermöglicht es Pflanzen, NAD zu regenerieren, und so die glycolytische ATP-Bildung aufrechtzuerhalten. Tolerante Reis-Pflanzen bildeten unter Anoxie in Dunkelheit mehr Ethanol als sensitive Weizen-Pflanzen. Dieser Unterschied war allerdings nur im Spross nachzuweisen und resultierte aus hohen Aktivitäten der Gärungsenzyme sowie aus großen Substratmengen in Reis-Blättern. Mehr als 24 h Anoxie konnten aber auch vom Reis aufgrund von Substratmangel nicht überlebt werden. Wurden Pflanzen bei Anoxie belichtet, verbesserten sich die Überlebensraten erheblich. Die Ethanol-Bildung war deutlich verringert, so dass neben der Gärung lichtabhängige Energie-liefernde Prozesse vermutet werden. Allerdings verlief die Photosynthese unter Anoxie aufgrund von CO2-Mangel nur vermindert ab. Eventuell könnte zyklischer Elektronentransport unter diesen Bedingungen zusätzliches ATP produzieren. In der Vergangenheit wurde vermutet, dass Pflanzen unter Sauerstoffmangel für Phosphorylierungsreaktionen statt ATP auch PPi nutzen könnten. In transgenen Kartoffelpflanzen, die infolge von Überexpression der E. coli-Pyrophosphatase weniger PPi enthielten als Wildtypen, wurde unter Hypoxie-Bedingungen nachgewiesen, dass PPi als alternativer Energiedonor bei der Saccharose-Spaltung eine bedeutende Rolle spielt. Dagegen konnte in transgenen Kartoffelpflanzen mit drastisch verminderter Aktivität der PPi-abhängigen Phosphofructokinase keine Beeinträchtigung der Stoffwechsel-Leistungen unter Hypoxie gezeigt werden. / Oxygen deficiency stress in plant cells leads through inhibition of mitochondrial respiration to an accumulation of NADH and a decrease in ATP content. Rice plants can survive oxygen deficiency better than wheat or potato plants. The aim of this PhD-work was to examine, which biochemical processes are responsible for plant tolerance against low oxygen stress. The studies were focused on the analysis of ethanolic fermentation, photosynthesis and the function of pyrophosphate (PPi) as an alternative energy source. By using ethanolic fermentation, plants can regenerate NAD and maintain ATP formation during glycolysis. Tolerant rice plants produced much higher amounts of ethanol during anoxia in darkness compared to sensitive wheat plants. The high fermentation rate mainly occurred in the shoots as a result of high activities of fermentative enzymes as well as high availability of carbohydrates. Nevertheless, rice plants could not survive more than 24 h of anoxia in the dark because of carbohydrate depletion. Illumination during anoxia extended survival of plants. Ethanolic fermentation rate was reduced during light exposure of plants, indicating that other energy-producing processes can compensate. However, it could be shown that the complete photosynthesis was slowed down during oxygen deficiency due to CO2 deficiency. It is likely that cyclic electron transport could at least partially contribute to ATP production during these conditions. In the past, it was speculated that PPi could replace ATP for phosphorylating processes during low oxygen stress. With transgenic potato plants expressing E. coli pyrophosphatase and therefore containing less PPi it was demonstrated that PPi is a significant alternative energy donor for sucrose cleavage during hypoxia. However, in transgenic potato plants with a reduction of synthesis and activity of PPi-dependent phosphofructokinase it could not be demonstrated that these plants suffer more from oxygen deficiency than the wildtype.

Menschliche Mitochondrien enthalten etwa 1500 bis 2000 Proteine. Die meisten dieser Proteine werden im Zellkern kodiert und im Zytoplasma synthetisiert, und müssen daher über eine spezielle Maschinerie in die Mitochondrien transportiert werden. Obwohl mittlerweile viele Details über die Wirkungsweise dieser Proteinschleusen bekannt sind, wurden einige wichtige Aspekte des Proteinimports noch nicht ausreichend untersucht. Zum einen ist nicht bekannt, ob die einzelnen Importkomplexe einen Einfluss auf die mitochondrienvermittelte Apoptose haben. Weiterhin ist offen, welche genaue Rolle der Mitochondrienimport in der Pathogenese von Neisseria gonorrhoeae spielt. Außerdem ist unklar, ob Faktoren des Importapparates für die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Morphologie notwendig sind. Um diese Fragestellungen zu untersuchen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit permanente Zelllinien hergestellt, in denen die Expression einzelner am Mitochondrienimport beteiligter Proteine mittels RNA-Interferenz (RNAi) inhibiert werden kann. Mithilfe dieser Zelllinien wurde getestet, ob die proapoptotischen Proteine Bax und Bak die Importmaschinerie benötigen, um in die äußere Mitochondrienmembran zu gelangen. Die Präsenz der beiden proapoptotischen Proteine in Mitochondrien während der Apoptose ist sehr entscheidend, da Bax und Bak in den Mitochondrien oligomerisieren und damit weitere Schritte der Apoptose einleiten. Im Widerspruch zu früheren Publikationen konnte hier gezeigt werden, dass die Translokation von Bax und Bak in die äußere Mitochondrienmembran unabhängig von Proteinimportfaktoren erfolgt. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss mitochondrialer Importproteine auf die Pathogenese von Neisseria gonorrhoeae. Das Neisserienprotein PorB transloziert während der Infektion in die Mitochondrien der Wirtszelle und induziert Apoptose. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit von PorB zu bestimmten Proteinen der äußeren Mitochondrienmembran wurde bisher angenommen, dass PorB diesen endogenen Proteinen auf ihrem Importweg in die äußere Mitochondrienmembran folgt. Überraschenderweise wurde im Rahmen dieser Arbeit entdeckt, dass PorB nicht von allen Komplexen der Importmaschinerie in den Mitochondrien erkannt wird. Infolgedessen transloziert es in die innere Mitochondrienmembran und wirkt dadurch toxisch auf die Wirtszelle. In einem weiteren Projekt wurde untersucht, welche Rolle die Proteinimportkomplexe der äußeren mitochondrialen Membran in der Aufrechterhaltung der Mitochondrienmorphologie spielen. Unter Verwendung der beschriebenen Zelllinien wurde entdeckt, dass in Abwesenheit des SAM (sorting and assembly) Importkomplexes die Struktur der inneren Mitochondrienmembran derangiert ist. Es wurden zudem Hinweise darauf gefunden, dass die Ursache für diesen Befund in einer Unterbrechung von Kontaktstellen zwischen den beiden Mitochondrienmembranen liegen könnte, für deren Aufrechterhaltung möglicherweise der SAM-Komplex verantwortlich ist. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse erlauben neue Einblicke in verschiedene Aspekte des Proteinimports in Mitochondrien. Zudem wurde mit der Entwicklung der stabilen Zelllinien ein neues Model geschaffen, anhand dessen in Zukunft weitere Detail des mitochondrialen Proteinimports erforscht werden können. / Human mitochondria comprise about 1500 to 2000 proteins. While only 13 proteins are encoded by the mitochondrial DNA the vast majority of mitochondrial proteins is encoded in the nucleus, synthesized in the cytosol, and translocated into mitochondria by a special protein import machinery. Although many details are now known about its function several important aspects of protein import in mitochondria were not unraveled yet. To begin with, the influence of the different mitochondrial import complexes on apoptosis is not known. Further, the exact role of the protein import machineries in mitochondria in the pathogenesis of Neisseria gonorrhoeae has not been clarified yet. Moreover, the question whether factors involved in protein import are required for the maintenance of the mitochondrial morphology is still unsolved. In order to address these open issues, permanent cell lines were generated within the frame of the present thesis in which the expression of single proteins implicated in mitochondrial import can be inhibited via RNA interference (RNAi). Using these cell lines, it was investigated whether the proapoptotic proteins Bax and Bak require the import machinery in order to gain access to the outer mitochondrial membrane. The presence of both proapoptotic proteins in mitochondria is essential during apoptosis as Bax and Bak oligomerize in the outer mitochondrial membrane leading to the execution of apoptosis. In contrast to earlier publications, results presented here prove that the translocation of Bax and Bak into the outer mitochondrial membrane occurs independent of its import machineries. The second part of this thesis explores the influence of mitochondrial import proteins on the pathogenesis of Neisseria gonorrhoeae. The neisserial protein PorB translocates into the mitochondria of host cells during infection and induces apoptosis. Because of structural similarities of PorB to a certain class of proteins in the outer mitochondrial membrane, it was assumed that PorB would follow the import pathway of these endogenous proteins into the outer mitochondrial membrane. Surprisingly, it was found within the present study that PorB is not recognized by all complexes implicated in this import pathway. As a consequence, it translocates into the inner mitochondrial membrane to exert its toxic effect on the host cell. In a further project, the role of import complexes of the outer mitochondrial membrane in the maintenance of the mitochondrial morphology was investigated. Using the described cell lines, it was found that in the absence of the SAM (sorting and assembly) import device, the structure of the inner mitochondrial membrane was disrupted. Further, evidence was found that the reason for this phenotype could be an interruption of contact sites between the two mitochondrial membranes, whose preservation possibly requires the SAM complex. The results presented here allow new insights into different aspects of mitochondrial protein import. Further, with the development of the stable cell lines a new model was generated that will allow future investigations on details about mitochondrial protein import.