Ein charakteristisches Merkmal des humoralen Immunsystems ist die Produktion vieler verschiedener Antikörper. Geläufige diagnostische Tests für den Nachweis von Krankheit-spezifischen Serumantikörpern nutzen Antigene zum Nachweis der Krankheit via Antikörperbindung. Derartige diagnostische Tests setzen jedoch die Kenntnis von Krankheit-spezifischen Antigenen voraus. Die vorliegende Arbeit berücksichtigt die unterschiedlichen Bindungsreaktivitäten ganzer Antikörperrepertoires verschiedener Gruppen von Individuen. Dazu werden die Serumantikörperbindungen gegenüber Zufallsbibliotheken gemessen. Die Moleküle dieser beliebigen Bibliotheken müssen keine Verwandtschaft zu den Antigenen der Krankheit haben. Mit modernen Herstellungsverfahren von Peptidarrays auf Glasträgern können mit einmal synthetisierten Peptiden hunderte von Träger-Replikas produziert werden. Die Suche nach hochaffinen Bindern zur Diagnose von Krankheiten mit unbekannten Antigenen oder mit Kreuzreaktivitäten zwischen gesunden und kranken Individuen könnte überflüssig werden. Gestützt auf die beschriebenen Voraussetzungen zeigt die vorliegende Arbeit, dass die Messung von Serumantikörper-Bindungen gegenüber Peptidbibliotheken mit zufälligen Sequenzen die Unterscheidung zwischen Gruppen von gesunden und kranken Individuen für unterschiedliche Krankheiten ermöglicht. Eine unerwartet kleine Anzahl von Peptiden ist ausreichend für eine zuverlässige Vorhersage der untersuchten Gruppen. Der unvoreingenommene Ansatz ermöglicht eine ebenso gute Unterscheidung von gesund und krank, wie sie auch mit voreingenommenen Bibliotheken gezeigt worden sind. Wir vermuten, dass der vorliegende Ansatz ein wichtiger Schritt in Richtung zuverlässiger Diagnose darstellt, insbesondere für Krankheiten mit noch unbekannten Antigenen. Ausserdem bietet die hohe Spezifizität der Detektone und deren kleinen Mitgliederzahl eine Grundlage für die gleichzeitige Diagnose von verschiedenen Krankheiten auf einem einzigen Peptid-Mikroarray. / A characteristic trait of the humoral immune system is the production of lots of different antibodies. Commonly used diagnostic tests for the detection of disease-specific serum-antibodies successfully exploit these antibody reactivities against disease eliciting antigens. Such diagnostic tests do however need the knowledge of disease specific antigen as a prerequisite. The presented work looks at the binding reactivities of whole antibody repertoires of different groups of individuals. Therefore the binding of serum-antibodies are measured against arbitrary probe molecule libraries. The arbitrary molecules of such libraries do not need to be related to the antigens of the disease to be diagnosed. Modern synthesis and printing processes of peptides on glass chips arrays allow the production of hundreds or peptide-chip replicas with small amounts of uniquely synthesized peptides. The search for high-affinity binders for the diagnosis of diseases with no known antigens might become redundant. Based on the described premises the presented work demonstrates the differentiation of different diseases by means of antibody serum reactivity differences towards arbitrary peptide libraries between healthy and diseased individuals. The number of peptides necessary for reliable prediction of the investigated groups of individuals are unanticipated small. The unbiased approach of the library design works as well as it possibly could with intended libraries, like whole-proteome arrays, used in recent other works. We presume our approach to be an important step forward towards reliable diagnosis, in particular for diseases caused by yet unknown antigens. Furthermore, the high specificity of the detectons and their smallness in size might provide a basis for simultaneous diagnosis of various diseases on a single peptide microarray.

Die Huntington''sche Krankheit (Huntington''s disease, HD) ist eine tödliche neurodegenerative Erkrankung mit einem extensiven Verlust von Neuronen im Striatum. Die Ursache für HD ist eine genetische Mutation, bei der eine CAG-Wiederholungssequenz verlängert wird. Im resultierenden Protein, das Huntingtin (htt) genannt wurde, diese Mutation führt zur Missfaltung und Aggregation von htt. Ich habe untersucht ob die Bildung von htt-Aggregaten die Transkription von Genen dass sie von HD-assoziierten Transkriptionsfaktoren kontrolliert werden, verändert. Zur Untersuchung der Transkription wurden die zu untersuchenden Gene auf cDNA-Mikroarrays aufgebracht und mit RNA, welche aus den Zellen nach der Induktion der Expression des mutierten htt gewonnen wurde, hybridisiert. Es wurden keine systematischen Veränderungen innerhalb der durch spezifische Transkriptionsfaktoren regulierten Gengruppen gefunden. Ich habe auch mehrere mathematische Modelle erstellt, welche die htt-Aggregation und den Zelltod beschreiben. Die Ergebnisse zeigten, dass eine transiente Dynamik im System und die nicht-monotone Reaktion auf Parameteränderungen zu den nicht-intuitiven Ergebnissen bei Behandlungsansätzen, welche die htt-Aggregation beeinflussen, führen könnten. Für den Fall, dass Aggregate die toxische Form von htt sind, zeigten die numerischen Simulationen dass das Einsetzen der Aggregation, welches durch ein Überschießen der Aggregatkonzentration gekennzeichnet ist, am ehesten zum Zelltod führt. Dieses Phänomen wurde "one-shot"-Modell genannt. Es gibt, auch bei HD-Patienten mit gleicher Länge der CAG-Wiederholungssequenz, eine große Varianz des Alters bei Krankheitsausbruch (age of onset, AO). Ich habe ein stochastisches Modell für den neuronalen Zelltod im Striatum entwickelt. Das Modell zeigte, dass ein signifikanter Anteil der nicht erklärbaren Varianz des AO der intrinsischen Dynamik der Neurodegeneration zugeschrieben werden kann. / Huntington''s disease (HD) is a fatal neurodegenerative disorder characterized by a progressive neuronal loss in the striatum of HD patients. HD is caused by a CAG repeat expansion which translates into a polyglutamine stretch at the N-terminus of the huntingtin protein (htt). The polyQ stretch induces misfolding, cleavage and aggregation of htt. To test the hypothesis that the sequestration of transcription factors into the htt aggregates causes transcriptional changes observed in HD models, I compiled lists of genes controlled by the transcription factors associated with HD. These genes were spotted on cDNA microarrays that were later hybridized with RNA extracted from cells expressing a mutant htt fragment. In this study, no systematic changes related to a specific transcription factors were observed. Formation and the accumulation of htt aggregates causes neurotoxicity in different HD model systems. To investigate the consequences of therapeutic strategies targeting aggregation, I derived several mathematical models describing htt aggregation and cell death. The results showed that transient dynamics and the non-monotonic response of cell survival to a change of parameter might lead to the non-intuitive outcome of a treatment that targets htt aggregation. Also, the numerical simulations show that if aggregates are toxic, the onset of aggregation, marked by the overshoot in the concentration of aggregates, is the event most likely to kill the cell. This phenomenon was termed a one-shot model. The principal cause of the variability of the age at onset (AO) is the length of the CAG repeat. Still, there is a great variance in the AO even for the same CAG repeat length. To study the variability of the AO, I developed a stochastic model for clustered neuronal death in the HD striatum. The model showed that a significant part of the unexplained variance can be attributed to the intrinsic stochastic dynamics of neurodegeneration.

Interaktionen zwischen Zellen sowie deren Aktivierung werden im Immunsystem durch verschiedene Zelloberflächenmoleküle reguliert. Inhalt dieser Arbeit war die Untersuchung des kürzlich identifizierten Rezeptor-Ligand-Paares BTLA und HVEM. Zunächst wurden diverse BTLA-spezifische monoklonale Antikörper generiert, mit deren Hilfe erstmals die Lokalisation BTLA-tragender Zellen im Gewebe gezeigt werden konnte. Bei umfassenden Expressionsanalysen fiel auf, dass BTLA auf nahezu allen Leukozytenpopulationen der lymphatischen Organe konstitutiv vorhanden ist, und mit seinem Liganden HVEM koexprimiert wird. Beide Moleküle werden auf verschiedenen Zellpopulationen differenziell exprimiert und aktivierungsabhängig reguliert. Funktionelle Analysen in vitro als auch in vivo ergaben, dass die BTLA-HVEM-Interaktion durch Suppression der T-Zellaktivierung und –proliferation wesentlich zur negativen Regulation der Immunantort beiträgt. Die negative Wirkung von BTLA zeigte sich sowohl bei der Initiation als auch bei bereits fortgeschrittener Aktivierung, unabhängig von der Beteiligung positiver kostimulatorischer Signalwege. Durch Stimulation von T Zellen mit unterschiedlicher BTLA-Oberflächenexpression (verschiedene Subpopulationen oder aus transgenen Mäusen) konnte die strikte Korrelation der negativen Funktion mit der BTLA-Menge auf den Zellen gezeigt werden. Es stellte sich heraus, dass BTLA essentiell für die HVEM-vermittelte Suppression ist und eine wesentliche Beteiligung weiterer HVEM-Interaktionspartner (z.B. CD160) nicht vorliegt. Die Beobachtung von veränderten Lymphozytenpopulationen in BTLA-transgenen Mäusen im Ruhezustand weist zudem auf einen zentralen Beitrag des negativen BTLA-Signals zur Aufrechterhaltung der Homöostase hin. Die ubiquitäre Expression von HVEM und BTLA in Kombination mit der gegenseitigen Modulation beider Interaktionspartner ermöglicht eine flexible Reaktion des Immunsystems auf äußere Einflüsse unter anderem über die negative Regulation durch BTLA / Activation of immune cells is regulated by various cell surface molecules during cell-cell interactions. The aim of this work was the characterization of the recently identified receptor-ligand-pair BTLA and HVEM. Initially, several BTLA-specific monoclonal antibodies were generated. With these antibodies, the localization of BTLA expressing cells in the tissues has been determined for the first time. Further detailed flow cytometric analysis revealed a strong constitutive expression of BTLA on nearly all leukocytes in lymphoid organs. Interestingly, all BTLA-expressing cells co-expressed its ligand HVEM. However, both molecules were differentially expressed on different cell populations in the steady state, but were also regulated in an activation-dependent way. Functional analyses in vitro and in vivo (in an antigen-specific adoptive transfer system) revealed a substantial contribution of the BTLA-HVEM interaction for negative regulation of immune responses by suppressing T cell activation and proliferation. Inhibitory signals of BTLA affect the initial and ongoing activation, irrespective of simultaneous positive signals from other co¬stimulatory pathways. Using wildtype and BTLA-transgenic primary T cells, a strictly linear relationship between the inhibitory function of BTLA and its cell surface levels was observed. The data clearly demonstrate that BTLA expression determined the strength of HVEM-mediated suppression, but also that BTLA is essential for this negative co-stimulation, whereas other HVEM-interaction partners were apparently not involved. Finally, the observed changes in lymphoid cell populations of the BTLA-transgenic mice even in the resting state indicate a prominent role for negative BTLA signals to maintain homeostasis. The ubiquitous expression of HVEM and BTLA together with the reciprocal modulation of both interaction partners supports flexible reaction and regulation of the immune system particularly via the inhibitory function of BTLA.

Mycoplasma pneumoniae, einer der kleinsten lebenden Organismen, ist ein erfolgversprechender Modellorganismus der Systembiologie um eine komplette lebende Zelle zu verstehen. Wichtig dahingehend ist die Konstruktion mathematischer Modelle, die zelluläre Prozesse beschreiben, indem sie beteiligte Komponenten vernetzen und zugrundeliegende Mechanismen entschlüsseln. Für Mycoplasma pneumoniae wurden genomweite Datensätze für Genomics, Transcriptomics, Proteomics und Metabolomics produziert. Allerdings fehlten ein effizientes Informationsaustauschsystem und mathematische Modelle zur Datenintegration. Zudem waren verschiedene Beobachtungen im metabolischen Verhalten ungeklärt. Diese Dissertation präsentiert einen kombinatorischen Ansatz zur Entwicklung eines metabolischen Modells für Mycoplasma pneumoniae. Zuerst haben wir eine Datenbank, MyMpn, entwickelt, um Zugang zu strukturierten, organisierten Daten zu schaffen. Danach haben wir ein genomweites, Constraint-basiertes metabolisches Modell mit Vorhersagekapazitäten konstruiert und parallel dazu das Metabolome experimentell charakterisiert. Wir haben die Biomasse einer Mycoplasma pneumoniae Zelle definiert, das Netzwerk korrigiert, gezeigt, dass ein Grossteil der produzierten Energie auf zelluläre Homeostase verwendet wird, und das Verhalten unter verschiedenen Wachstumsbedingungen analysiert. Schließlich haben wir manuell das Genom reannotiert. Die Datenbank, obwohl noch nicht öffentlich zugänglich, wird bereits intern für die Analyse experimenteller Daten und die Modellierung genutzt. Die Entdeckung von Kontrollprinzipien des Energiemetabolismus und der Anpassungsfähigkeiten bei Genausfall heben den Einfluss der reduktiven Genomevolution hervor und erleichtert die Entwicklung von Manipulationstechniken und dynamischen Modellen. Überdies haben wir gezeigt, dass die Genomorganisation in Mycoplasma pneumoniae komplexer ist als bisher für möglich gehalten, und 32 neue, noch nicht annotierte Gene entdeckt. / Mycoplasma pneumoniae, one of the smallest known self-replicating organisms, is a promising model organism in systems biology when aiming to assess understanding of an entire living cell. One key step towards this goal is the design of mathematical models that describe cellular processes by connecting the involved components to unravel underlying mechanisms. For Mycoplasma pneumoniae, a wealth of genome-wide datasets on genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolism had been produced. However, a proper system facilitating information exchange and mathematical models to integrate the different datasets were lacking. Also, different in vivo observations of metabolic behavior remained unexplained. This thesis presents a combinatorial approach to design a metabolic model for Mycoplasma pneumoniae. First, we developed a database, MyMpn, in order to provide access to structured and organized data. Second, we built a predictive, genome-scale, constraint-based metabolic model and, in parallel, we explored the metabolome in vivo. We defined the biomass composition of a Mycoplasma pneumoniae cell, corrected the wiring diagram, showed that a large proportion of energy is dedicated to cellular homeostasis, and analyzed the metabolic behavior under different growth conditions. Finally, we manually re-annotated the genome of Mycoplasma pneumoniae. The database, despite not yet being released to the public, is internally already used for data analysis, and for mathematical modeling. Unraveling the principles governing energy metabolism and adaptive capabilities upon gene deletion highlight the impact of the reductive genome evolution and facilitates the development of engineering tools and dynamic models for metabolic sub-systems. Furthermore, we revealed that the degree of complexity in which the genome of Mycoplasma pneumoniae is organized far exceeds what has been considered possible so far and we identified 32 new, previously not annotated genes.

Glutamat ist der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter im Zentralnervensystem der Säugetiere. Die präzise Kontrolle des extrazellulären Glutamatspiegels ist für eine normale synaptische Transmission wichtig und erforderlich, um die Neurone vor Exzitotoxizität zu schützen. Im Gehirn sorgen vor allem verschiedene hochaffine Na+-abhängige Glutamattransporter für diese Kontrolle. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb untersucht, welchen Einfluß die Inhibition der Glutamattransporter auf die exzitatorische synaptische Transmission in Schicht III, einer Region in der bei Alzheimer-Demenz, Schizophrenie und Epilepsie häufig Zellschädigungen und Zellverluste beobachtet werden, und Schicht V des medialen entorhinalen Kortex (mEC) hat. Extrazelluläre Messungen in den Schichten III und V der Ratte zeigten, daß die verwendeten Transport-Inhibitoren signifikant die negativen Feldpotentialkomponenten beider Schichten reduzierten. Schichtspezifische Unterschiede konnten dabei nicht festgestellt werden, was auf eine ähnliche Glutamatregulation in beiden Schichten schließen läßt. Für die anschließenden intrazellulären und patch-clamp Messungen wurden aus diesem Grund nur noch Neurone der Schicht III untersucht. Beide Transport-Inhibitoren (L-trans-2,4-PDC und DL-TBOA) reduzierten die Amplituden der pharmakologisch isolierbaren EPSPs/EPSCs ohne die Kinetik zu beeinflussen. Diese reduzierende Wirkung konnte durch trans-(±)-ACPD, einen Agonisten der Gruppe I und II metabotropen Glutamatrezeptoren (mGluRs), nachgeahmt werden. Die Vorinkubation der Hirnschnitte mit dem unspezifischen Gruppe I und II mGluR-Antagonisten MCPG verhinderte die durch trans-(±)-ACPD hervorgerufene Amplitudenreduktion und auch den reduzierenden Effekt der beiden Transport-Inhibitoren. In nachfolgenden Experimenten mit dem spezifischen Gruppe II mGluR-Antagonisten EGLU konnte dieser zwar die durch L-trans-2,4-PDC hervorgerufene Wirkung verhindern, nicht aber den durch DL-TBOA vermittelten Effekt, was auf eine Aktivierung von Gruppe I mGluRs hinweist. Zusätzlich führte die Applikation von DL-TBOA zu einer signifikanten Veränderung des Doppelpuls-Index, was auf einen präsynaptischen Wirkmechanismus hinweist. Die Applikation von L-trans-2,4-PDC hingegen hatte keinen Effekt auf den Doppelpuls-Index. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sprechen dafür, daß beide Transport-Inhibitoren die erregende synaptische Transmission über eine Aktivierung präsynaptischer metabotroper Glutamatrezeptoren der Gruppen I und II hemmen. Dabei konnte festgestellt werden, daß diese Hemmung unter Applikation von DL-TBOA die präsynaptische Transmitterausschüttung über einen negativen Rückkopplungsmechanismus durch Aktivierung von Gruppe I mGluRs vermindert, während L-trans-2,4-PDC seine Wirkung vor allem über eine Aktivierung der Gruppe II vermittelt. Dabei kann davon ausgegangen werden, daß L-trans-2,4-PDC in der benutzten Konzentration die mGluRs der Gruppe II direkt aktivieren kann und der Effekt nicht nur präsynaptisch vermittelt wird. / Glutamate is the primary excitatory neurotransmitter in the mammalian central nervous system. The precise control of extracellular glutamate is crucial for the maintenance of normal synaptic transmission and the prevention of excitotoxicity. High-affinity glutamate transporters ensure termination of glutamatergic neurotransmission and keep the synaptic glutamate concentration below excitotoxic levels. In layer III, a region that is especially prone to cell damage in Alzheimer's disease, schizophrenia and epilepsy, and layer V of the medial entorhinal cortex (mEC) effects of blocking glutamate uptake on excitatory synaptic transmission were studied. Extracellular recordings in rat brain slices revealed that application of glutamate uptake inhibitors significantly reduced stimulus-induced negative field potentials in both, layer III and V of the mEC. This effect showed no significant differences in both layers suggesting a similar glutamate regulation in layer III and V. Therefore, only layer III neurons of the mEC were used for the subsequent intracellular and patch-clamp recordings. Two competitive glutamate transporter antagonists, DL-TBOA and L-trans-2,4-PDC, reduced the amplitude of pharmacologically isolated EPSPs/EPSCs without changing the time course of the events. This effect was mimicked by trans-(±)-ACPD, an agonist of group I and II metabotropic glutamate receptors (mGluRs). The competitive group I and II mGluR antagonist MCPG blocked the depression of the EPSC amplitude induced by trans-(±)-ACPD and also masked the effect of either DL-TBOA or L-trans-2,4-PDC. Furthermore, EGLU, which selectively antagonizes group II mGluRs, masked the effect of L-trans-2,4-PDC but not that of DL-TBOA, indicating an involvement of group I mGluRs in the latter case. Finally, DL-TBOA significantly enhanced the paired-pulse index, suggesting a presynaptic mechanism for the depression of EPSP/EPSC amplitude, whereas application of L-trans-2,4-PDC had no significant effect on the paired-pulse behaviour. The present study shows that both transport inhibitors depress pharmacologically isolated EPSPs/EPSCs in layer III neurons of the mEC in combined entorhinal-hippocampal slices. This effect seems to be mediated via activation of different groups of mGluRs. The results suggest that DL-TBOA causes a negative feedback on glutamate release via indirect activation of presynaptic group I mGluRs, possibly due to an accumulation of glutamate, whereas application of L-trans-2,4-PDC most likely leads to an activation of presynaptic group II mGluRs reducing Ca2+-independent release. The latter might be due to a direct action of L-trans-2,4-PDC at these receptors. The present data suggest that blockade of glutamate transport in the mEC does not lead to an excessive accumulation of glutamate because of a counteractive autoinhibiting mechanism.

Im 1997 wurden der Orphan GPR30 aus HUVECs kloniert, die FSS ausgesetzt waren. In dieser Studie konnte gezeigt werden dass die Expression von GPR30 durch die FSS-Behandlung im Vergleich zu unbehandelten HUVEC-Zellen deutlich induziert wurde. Daraufhin wurde in einer Studie von Isensse et al. die zelluläre und gewebsspezifische Expression von GPR30 in GPR30-LacZ Reportergen-Mäusen untersucht. Es konnte eine Expression von GPR30 vorwiegend in den Endothelzellen der kleinen Arterien verschiedenster Gewebetypen nachgewiesen werden. GPR30 war postuliert dass E2 direkt binden kann und dadurch rasche nicht-genomische Signale vermittelt. Im Gegensatz dazu haben verschiedene andere Veröffentlichungen gezeigt dass E2 nicht spezifisch an GPR30 bindet. Trotz der Kontroverse ob es sich bei GPR30 um einen Östrogenrezeptor oder nicht ist bislang nichts über seine Interaktion zu anderen Proteinen und deren Wechselwirkung bekannt. Deswegen war ein Ziel dieser Arbeit, Interaktionspartner von menschlichen GPR30 zu identifizieren und folglich ein humanes vaskuläres in vitro Modell zu etabliren, um die potentiellen Interaktionen von GPR30 sowie die downstream-Effekte der Wechselwirkung zwischen GPR30 und den neuen Interaktionspartner des vaskulären Modells auf Transkriptebene zu evaluieren. Ein Screening einer humanen kardiovaskulären cDNA-Bibliothek mit Hilfe des Y2H-Systems führte zur Identifizierung mehrerer Interaktionspartner für GPR30 darunter PATJ und FUNDC2. Durch anschließende CoIP konnte die Interaktion von GPR30 mit PATJ validiert werden. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit die Wirkung von FSS auf die Expression von GPR30 in HUVECs bestätigt und ebenfalls in weiteren anderen Endothelzellen gezeigt werden. Abschließend wurde die Rolle von GPR30 und PATJ bei der Reaktion auf FSS auf transkriptioneller Ebene in HMEC-1-Zellen genomweit untersucht. Interessanterweise war eine Gruppe von Genen aufgrund von FSS in Zellen die GPR30 überexprimierten dereguliert als alleine durch FSS. / In 1997, the orphan G protein-coupled receptor 30, GPR30, was cloned using HUVECs exposed to FSS. It was shown that the level of GPR30 expression was up-regulated in response to FSS. Subsequently, in a study performed in the laboratory where the work for this thesis was carried out, the cellular and tissue distribution of GPR30 were investigated in GPR30-LacZ reporter mice and the expression was found predominantly in the endothelial cells of small arteries in several tissue types. GPR30, was also claimed to bind 17-β-estradiol (E2) directly and to mediate rapid non-genomic signalling. In contrast, various reports have indicated that E2 fails to bind GPR30 in a specific manner. Despite the controversy on whether GPR30 is an estrogen receptor or not, nothing is known at present about its relation and interaction with other proteins. Therefore, the aim of the work described in this thesis was to identify human GPR30 protein interaction partners and to establish a human vascular in vitro model in order to evaluate the potential role of GPR30 and the downstream effects of the interaction between GPR30 and new interaction partners in a vascular model at transcript level. The screening of a human heart cDNA library using the yeast two-hybrid assay led to the identification of several interaction partners for GPR30, among them PATJ and FUNDC2. These interactions were verified by CoIP experiments and the interaction of GPR30 with PATJ could be confirmed. The effect of FSS on the expression of GPR30 was confirmed in HUVECs and was detected in other endothelial cell types. In HUAECs, HAoECs and HMEC-1 cells GPR30 was also found up-regulated upon FSS, suggesting that GPR30 may indeed play a key role in vascular physiology. Finally, the role of GPR30 and PATJ in the FSS response was investigated at the genome-wide transcript level in HMEC-1 cells. Interestingly, a different panel of genes was deregulated owing to FSS in cells over-expressing GPR30 compared to FSS alone.

Bei der Eiablage müssen sich Pflanzen fressende Insekten wiederholt entscheiden, Eier auf Wirtspflanzen niedriger Qualität zu legen oder auf bessere Pflanzen zu warten. Diese Entscheidungen sind Fitness relevant, weil Larven sich je nach Wirt unterschiedlich entwickeln und weil Weibchen in diesem inter-temporären Optimierungsproblem sowohl zu wählerisch als auch nicht wählerisch genug sein und so nicht alle Eier bzw. Eier in zu geringer Qualität legen können. Meine Arbeit nutzt vier Ansätze um zu untersuchen, wie diese Entscheidungsprobleme entstehen und wie Weibchen diese strategisch lösen. Erstens benutze ich analytische Optimierungsmodelle um zu zeigen, dass ein evolutionärer Trade-Off zwischen Vermehrung und Überleben variierender evolutionär stabiler Ei- und Zeit-Limitierung führen kann, dass aber keiner dieser zwei Faktoren ignoriert werden darf. Zweitens stelle ich klar, dass in der Vergangenheit vorgeschlagene schematische Zeit- und Ei-Kosten der Eiablage sich nicht mit den wirklichen Selektionskräften auf die Ei-Anzahl decken und daher kein gutes Werkzeug zur Analyse von Eiablage-Strategien darstellen. Drittens zeige ich mit Optimierungs- und populationsgenetischen Modellen, dass räumliche Heterogenität in der Wirtsverfügbarkeit keine notwendige Bedingung für die Evolution von Generalismus ist, weil emergente Quellen-Senken Dynamiken die Anpassung der Insekten an marginale Habitate verhindern, wenn Migrationsraten nicht hoch sind. Viertens zeige ich an Agenten basierte Simulationen zum Beispiel des Aurorafalters, Anthocharis cardamines, dass der phänologische Spezialismus der Larven dieser Art den Eiablage-Generalismus der Weibchen zur Folge hat. Insgesamt zeigen diese vier Ergebnisse, wie nützlich theoretische Ansätze zur Untersuchung spezifischer Szenarios der strategischen Eiablage sein können und machen deutlich, dass die Evolution von Generalismus leichter aus zeitlicher denn aus räumlicher Heterogenität folgt. / Ovipositing phytophagous insects repeatedly face the decision problem of laying eggs on lower-quality host plants or waiting out for higher-quality ones. These choices carry fitness costs and benefits because larvae develop differentially on different hosts and because, in this inter-temporal optimization task, females may be too choosy and die before laying all eggs (i.e. become time-limited) or not be choosy enough and run out of eggs before their death (i.e. become egg-limited). This thesis employs four approaches to examine how oviposition decision problems arise and how they are strategically solved by female insects. First, I use analytical optimization models to show that a life-history trade-off between survival and reproduction can lead to varying evolutionarily stable levels of egg and time limitation, but that neither egg nor time limitation can be ignored in evolutionary analyses of oviposition. Second, I highlight that such schematic time and egg costs of oviposition as advocated in the past do not match the actual forces of natural selection on egg number as partitioned between egg and time limitation and therefore represent a less useful practice to analyze oviposition strategies. Third, I use optimality and population genetic models to show that spatial heterogeneity in host availability is not a sufficient condition for the evolution of generalism because emergent source-sink dynamics preclude adaptation of insects to marginal habitats unless migration rates are high. Fourth, I employ individual-based simulations built around the case study of the orange tip butterfly, Anthocharis cardamines, to show that this species’ larvae’s phenological specialism may drive the adult females’ oviposition generalism. All these findings show the usefulness of theoretical approaches to examine specific questions of strategic oviposition. Moreover, they demonstrate that evolution of generalism more likely results from resource unpredictability in time than in space.

Spurenanalytische Untersuchungen von Umweltproben erfolgen meist standardmäßig mittels Festphasenextraktion (SPE) und anschließender GC/MS. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, alternative Methoden für die spurenanalytische Bestimmung von Estrogenen aus Umweltproben aufzuzeigen. Als Analyte wurden die natürlichen Estrogene Estron (E1), Estradiol (E2) und Estriol (E3), sowie das synthetische Ethinylestradiol (EE2) ausgewählt. Da als Haupteintragspfad dieser Substanzen in die Umwelt die Kläranlagen anzunehmen sind, erfolgte die Methodenentwicklung ausgehend von gereinigtem Abwasser. Als Probenvorbereitungstechniken kamen neben der Festphasenextraktion (SPE), die klassische Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE), sowie die relativ neue Methode der Festphasenmikroextraktion (SPME) zum Einsatz. Die analytische Bestimmung der angereicherten Extrakte erfolgte mittels HPLC/UV und HPLC/ELCD bzw. mittels GC/FID und GC/MS. Zur Entwicklung einer Screening-Methode wurde die adsorptive Anreicherung der Estrogene an Kohlenstoffelektroden sowie das Cathodic Stripping von EE2 an Quecksilber erprobt. Die Verfahrensschritte wurden zunächst anhand dotierter Proben optimiert, und die Methoden dann anhand der erzielten Bestimmungsgrenze, Selektivität und Präzision verglichen. Die Eignung der Verfahren wurde abschließend durch die Messung realer Abwasserproben überprüft. / Trace analytical environmental investigations are usually done by solid phase extraction (SPE) and GC/MS. The aim of the present thesis was the development of alternative methods for the trace analysis of estrogens in the environment. Estrone (E1), Estradiol (E2) and Estriol (E3) as well as the synthetic estrogen Ethynylestradiol (EE2) were chosen for this investigation. These estrogens enter the environment mainly via sewage treatment plants. Therefore the method development was launched on purified waste water. Solid phase extraction (SPE), liquid liquid extraction (LLE) and the relatively new solid phase micro extraction (SPME) were used for sample preparation. The analytical determination of the extracted analytes was done by HPLC/UV and HPLC/ELCD or GC/FID and GC/MS. Adsorptive enrichment of estrogens on different carbon electrodes and cathodic stripping of EE2 on mercury were tested as possible screening methods. The established methods were optimized using spiked samples. After comparing their quantitation limits, selectivity and precision, they were applied to real sewage water samples for showing qualification.

Das Prostatakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung des Mannes. Bei den zu Tode führenden Tumoren wird es im Jahre 2003 nach dem Bronchialkarzinom an 2. Stelle stehen. Diese Inzidenz zeigt, dass dringend neue diagnostische Marker und therapeutische Zielgene zur Behandlung von Prostatakrebs benötigt werden. Ziel dieser Dissertation war es, mit Hilfe der DNA-Chiptechnologie neue tumorrelevante Gene für eine Small-Molecule- und Antikörper-Basierte Therapie des Prostatakarzinoms zu identifizieren. Auf einen proprietären Tumor-Chip der Firma metaGen Pharmaceuticals GmbH wurde mikrodissektiertes Normal- und korrespondierendes Tumorgewebe von 52 Prostatatumorpatienten hybridisiert. Mit Hilfe bioinformatischer Analysen der Chipergebnisse konnte das Gen TRPM8 identifiziert werden, das in Prostatatumoren in mehr als 56% der Patienten überexprimiert ist. Northern-Blot, Dot-Blot und Chipexperimente zeigten, dass TRPM8 ungewöhnlich gewebespezifisch exprimiert wird. In mehr als 400 getesteten Tumorpatienten und in 23 Normalgeweben wurde TRPM8 ausschließlich in der Prostata und neuroendokrinen Tumoren nachgewiesen. TRPM8 gehört zur Familie der Transient Receptor Potential Channel Proteins. Es konnte hier erstmals in Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Experimenten (FRET) gezeigt werden, dass TRPM8 Multi-Homomere bildet. Dies wurde bisher nur für Kanäle anderer TRP-Subfamilien (TRPV und TRPC) gezeigt. Weiterhin konnten erstmals mehrere Spleißvarianten von TRPM8 identifiziert werden. Quantitative RT-PCR Experimente zeigten, dass diese noch stärker in Prostatatumoren überexprimiert sind als TRPM8 selbst. Des Weiteren wurde ein neues Gen auf dem DNA-Gegenstrang von TRPM8 entdeckt, das mit Exon 11 von TRPM8 100% komplementär ist und an der Regulation von TRPM8 beteiligt sein könnte. Der Promotor von TRPM8 wurde durch eine in silico Analyse identifiziert und in vitro bestätigt. Obwohl eine starke androgenabhängige Expression von TRPM8 in LNCaP Zellen gezeigt werden konnte, wurden keine Bindungsstellen für androgenabhänginge Elemente gefunden. Allerdings ließen sich drei Bindungsstellen des androgenregulierten Homeoboxgens NKX3.1 identifizieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass TRPM8 und seine Isoformen aufgrund ihrer Gewebspezifität ausgezeichnete Angriffspunkte für eine zielgerichtete Prostatakrebstherapie sind. / Prostate cancer is the most commonly diagnosed malignancy in men in the Western World. In 2003 malignancies of the prostate will be the second most common fatal cancer in men after lung cancer as estimated by the American Cancer Society. Despite the tremendous efforts made in the past to improve the treatment of prostate cancer patients, there is still an urgent need for new markers and therapeutic targets for medication. The aim of this thesis was the identification of new genes relevant in prostate cancer, which could be used in a small-molecule or antibody based therapy of prostate cancers. Microdissected matched prostate cancer and normal tissues of 52 prostate cancer patients were hybridized to a proprietary high density Cancer-Chip based on Affymetrix GeneChip technology. Using a bioinformatic analysis, it was possible to identify TRPM8, which was highly overexpressed in 56% of prostate cancer patients. Northern blot, dot blot and gene chip experiments revealed that TRPM8 expression is extremely tissue specific. Of 400 patients and 23 tissues tested, TRPM8 expression could only be detected in the prostate and neuroendocrine tumors. Functionally, the protein belongs to the transient receptor potential channel family of non-voltage gated proteins. It could be shown for the fist time that TRPM8 subunits form homomers using FRET technology. Molecular characterization of TRPM8 transcription revealed multiple splice forms of TRPM8. Further, it was possible to identify a new mRNA present on the opposite strand of TRPM8, which was 100% complementary to exon 11 of TRPM8, thus it could possibly function as a regulatory RNA of TRP channel. All of these isoforms were found to be even higher overexpressed in prostate tumors than TRPM8 itself. The promoter region of TRPM8 was identified using in silico methods and confirmed in promoter reporter assays. Although a high androgen dependent transcriptional activation of TRPM8 could be found by RT-PCR in LNCaP cells, no androgen responsive elements was identifiable within the promoter region. On the other hand three binding sites for the androgen dependent homeobox gene NKX3.1 and several other homeobox genes were discovered. The results of the thesis show that TRPM8 and its isoforms are, due to their tissue specificity, ideal targets for the development of new therapeutic drugs for the treatment of prostate cancer.

Die Tryptophanhydroxylase (TPH) katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Synthese des wichtigen Neurotransmitters Serotonin. Kürzlich wurde ein zweites TPH-Isozym, die TPH2, entdeckt. Es stellte sich heraus, dass dieses Isozym für die Serotoninsynthese im Zentralnervensystem verantwortlich ist, wohingegen die TPH1 lediglich der Ausgangspunkt der Serotoninsynthese in den peripheren Geweben ist. Da Störungen im Serotoninstoffwechsel mit einer Vielzahl von psychiatrischen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden, rückt nun die als neuronales Enzym identifizierte TPH2 in den Fokus der Forschung. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass TPH1 und 2 sich nicht nur in ihren Expressionsorten sondern auch in ihren grundlegenden biochemischen Eigenschaften voneinander unterscheiden. Die TPH1 stellte sich als aktiveres der beiden Enzyme heraus. Der N- und C-Terminus der TPH2 konnten als auf die Aktivität des Enzyms inhibierend bzw. aktivierend wirkende Strukturen identifiziert werden und stellen damit interessante Angriffspunkte für die pharmakologische Beeinflussung dar, wobei der N-Terminus als TPH2-spezifische Struktur eine gezielte Beeinflussung des serotonergen Systems im Zentralnervensystem ohne Auswirkungen auf das periphere System ermöglichen würde. In weiteren Projekten konnte die Existenz von mindestens zwei, die Enzymaktivität nicht beeinflussenden Proteinkinase A-Phosphorylierungsstellen in der TPH2 nachgewiesen werden, es konnte ein auf einem fluorometrischen Prinzip basierender High-Throughput-Assay zur Bestimmung der TPH-Aktivität entwickelt werden, Tubulin beta2A wurde als Interaktionpartner der TPH2 identifiziert, die Auswirkungen eines in vitro aktivitätssenkenden Tph2-SNPs auf die Serotoninlevel und das Verhalten verschiedener Mausstämme konnte durch die Generierung und Untersuchung von congenen Mäusen als unbedeutend eingestuft werden und die Expression von TPH1-mRNA wurde als Marker für endometriale Karzinome identifiziert. / Tryptophan hydroxylase (TPH) catalyzes the rate limiting step of the synthesis of the important neurotransmitter serotonin. Recently a new TPH isoenzyme, TPH2, was discovered. It turned out that this isoenzyme is responsible for the serotonin synthesis within the central nervous system, whereas the TPH1 is merely the starting point of serotonin synthesis in peripheral tissues. Since dysfunction in the metabolism of serotonin is related to a large number of psychiatric diseases, the neuronal TPH2 moved into the centre of interest. As a basis for the pharmacological manipulation of the central nervous serotonergic system, without influencing the periphery, the identification of differences between the two isoenzymes is essential. In this thesis it was shown that TPH1 and 2 not only differ in their expression sites but also in their basic biochemical characteristics. TPH1 turned out to be the more active enzyme. Furthermore it was shown that the N- and C-termini of TPH2 have an inhibitory respectively activating influence on the enzymatic activity. Therefore they became interesting targets for pharmacological interference, whereas the N-terminus as a TPH2 specific structure would facilitate the manipulation of the central nervous serotonergic system without exerting influence on the peripheral system. In further projects the existence of at least two protein kinase A phosphorylation sites could be verified, whereas the phosphorylation doesn’t seem to have any influence on the enzymatic activity, a high throughput assay for determination of TPH activity, based on a fluorometric principle, was developed, Tubulin beta2A was identified as a TPH2 interaction partner, the effect of a SNP in the Tph2 gene that decreases the TPH2 activity in vitro on the serotonin level and the behaviour of different mouse strains could be rated as insignificant by the generation of congenic mice und the expression of TPH1 mRNA was identified as a marker for endometrial cancer.