Im ersten Teil dieser Dissertation wurde der Einfluss des mitochondrialen Proteins TCAIM (T cell activation inhibitor, mitochondrial) auf die T-Zellaktivierung untersucht. Hierzu wurde eine transgene Mauslinie mit einem T-zellspezifischen knock-in (KI) von Tcaim in den Rosa26 Lokus generiert. Die Tcaim-Überexpression beeinflusste die Fission und Umverteilung von Mitochondrien und reduzierte die T-Zellrezeptor (TZR)-induzierte Bildung mitochondrialer, radikaler Sauerstoffspezies. In vitro stimulierte CD4+ Tcaim KI T-Zellen zeigten eine geringere Aktivierung, Proliferation und IL-2 Sekretion als Kontrollzellen. T-Zellen aus Tcaim KI Mäusen, die in Rag-1 knock-out Mäuse transferiert wurden, waren nicht fähig ein allogenes Haut-Transplantat abzustoßen und behielten einen naiven Phänotyp. Diese Ergebnisse zeigen, dass TCAIM als mitochondriales Protein wichtige Schritte in der Zellaktivierung und der Bildung von Gedächtnis-T-Zellen beeinflusst. Der zweite Teil der Dissertation beschäftigte sich mit dem Einfluss der CD44-Oberflächenexpression auf die Differenzierung von T-Helfer (TH)-Zellen. Eine hohe CD44-Expression unterscheidet Effektor- von naiven T-Zellen. Durch die allogene Stimulation von CD4+ T-Zellen bildeten sich drei verschiedene Populationen: CD44+, CD44++ und CD44+++. Sowohl in vitro als auch in vivo generierte alloreaktive TH17-Zellen wurden in der CD44+++ Population, TH1-Zellen hingegen in der CD44++ Population, detektiert. Es wurde beschrieben, dass sowohl eine geringe TZR- als auch eine geringe CD28-Stimulation eher die Bildung von TH17- als TH1-Zellen unterstützen. Unter genau diesen Bedingungen kann CD44 als kostimulatorisches Molekül die Signaltransduktion verstärken. Tatsächlich zeigten allogenreaktive CD44+++ TH-Zellen eine höhere ZAP-70-Phosphorylierung als CD44++ TH-Zellen. Diese Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass CD44 durch die Verstärkung der Signaltransduktion die TH17-Differenzierung fördern kann. / Within the first part of this thesis, the influence of the mitochondrial Protein TCAIM (T cell activation inhibitor, mitochondrial) on T cell activation was investigated. Tcaim expression correlated negatively with the rejection of allografts and it is down-regulated during T cell activation. To study effects of TCAIM during T cell activation, we generated a T cell-specific mouse strain with a Tcaim knock-in (KI) targeted to the Rosa26 locus. Tcaim overexpression changed the mitochondrial morphology and reduced the T cell receptor (TCR)-induced mitochondrial reactive oxygen species production. In vitro activation of Tcaim KI CD4+ T cells resulted in a decreased activation, proliferation and cytokine release. Importantly, Rag-1 knock-out mice, reconstituted with Tcaim KI T cells, tolerated allogeneic skin grafts. Thus, by regulating TCR-induced mitochondrial distribution and ROS production, TCAIM controls important steps during T cell activation and memory formation. The second part dealt with the influence of CD44 surface expression level for T helper cell (Th cell) differentiation. By association with lymphocyte-specific protein kinase (LCK) it can enhance T cell signaling. Allogeneic stimulation of CD4+ T cells resulted in the formation of three distinguishable populations: CD44+, CD44++ and CD44+++. In vitro and in vivo generated allo-reactive TH17 cells were mainly CD44+++. This is in contrast to TH1 cells which were dominantly CD44++. Titration experiments revealed that low TCR- and co-stimulation supports TH17 rather than TH1 development. Under exactly these conditions it was reported that CD44 can act as co-stimulatory molecule and replace CD28. Indeed, CD44+++CD4+ T cells contained already more phosphorylated ZAP-70 as compared to CD44++ cells. Our results support the notion that CD44 enhances TCR signaling strength by delivering LCK, which is required to support TH17 development.

Lebewesen sind jeden Tag Sequenzen von Ereignissen ausgesetzt, die sie sich merken wollen. Es ist jedoch ein allgemeines Problem, dass sich die Zeitskalen des Verhaltens und der Induzierung von neuronalem Lernen um mehrere Größenordnungen unterscheiden. Eine mögliche Lösung könnte "Phasenpräzession" sein - das graduelle Verschieben von Aktionspotential-Phasen relativ zur Theta-Oszillation im lokalen Feldpotential. Phasenpräzession ermöglicht es, Verhaltens-Sequenzen zeitlich zu komprimieren, herunter bis auf die Zeitskala von synaptischer Plastizität. In dieser Arbeit untersuche ich das Phasenpräzessions-Phänomen im medialen entorhinalen Kortex der Ratte. Ich entdecke, dass entorhinale Gitterzellen auf der für das Verhalten relevanten Einzellaufebene Phasenpräzession zeigen und dass die Phasenpräzession in Einzelläufen stärker ist als in zusammengefassten Daten vieler Läufe. Die Analyse von Einzelläufen zeigt zudem, dass Phasenpräzession (i) in Zellen aus allen Schichten des entorhinalen Kortex existiert und (ii) von den komplexen Bewegungsmustern der Ratten in zweidimensionalen Umgebungen abhängt. Zum Abschluss zeige ich, dass Phasenpräzession zelltyp-spezifisch ist: Sternzellen in Schicht II des medialen entorhinalen Kortex weisen klare Phasenpräzession auf, wohingegen Pyramidenzellen in der selben Schicht dies nicht tun. Diese Ergebnisse haben weitreichende Implikationen sowohl für das Lokalisieren des Ursprungs als auch für die m"oglichen Mechanismen von Phasenpräzession. / Every day, animals are exposed to sequences of events that are worth recalling. It is a common problem, however, that the time scale of behavior and the time scale for the induction of neuronal learning differ by multiple orders of magnitude. One possible solution could be a phenomenon called "phase precession" - the gradual shift of spike phases with respect to the theta oscillation in the local field potential. Phase precession allows for the temporal compression of behavioral sequences of events to the time scale of synaptic plasticity. In this thesis, I investigate the phase-precession phenomenon in the medial entorhinal cortex of the rat. I find that entorhinal grid cells show phase precession at the behaviorally relevant single-trial level and that phase precession is stronger in single trials than in pooled-trial data. Single-trial analysis further revealed that phase precession (i) exists in cells across all layers of medial entorhinal cortex and (ii) is altered by the complex movement patterns of rats in two-dimensional environments. Finally, I show that phase precession is cell-type specific: stellate cells in layer II of the medial entorhinal cortex exhibit clear phase precession whereas pyramidal cells in the same layer do not. These results have broad implications for pinpointing the origin and possible mechanisms of phase precession.

Das Multiple Myelom (MM) ist eine hämatologische Erkrankung, welche sich durch eine Akkumulation von malignen Plasmazellen im Knochenmark auszeichnet und eine gestörte Hämatopoiese und Osteolyse zur Folge hat. Komplexe molekulare Interaktionen zwischen MM-Zellen und der Mikroumgebung/Nische im Knochenmark (bone marrow microenvironment, BMM) führen zu einer Aktivierung von verschiedenen Wachstums-, Überlebens- und anti-apoptotischen Signalwegen, die zur Entstehung bzw. Wirkstoffresistenz von MM-Zellen beitragen. IL-6R/STAT3, Ras/MAPK und PI3K/Akt sind die drei wichtigsten Signalwege, die mit dem Wachstum und der Entwicklung des MM assoziiert sind. Auf der anderen Seite sind Myelomzellen insensitiv gegenüber einer Blockade des IL6R/STAT3-Signalweges bzw. des Ras/MAPK-Signalwegs in der Gegenwart von Knochenmarksstromazellen (bone marrow stroma cells, BMSCs), was die Entbehrlichkeit dieser beiden Signalwege unter Ko-Kultur-Bedingungen nahelegt. Interessanterweise aber induziert die gleichzeitige Unterbrechung der IL6R/STAT3 und Ras/MAPK Signalwege Apoptose in MM-Zellen. Ziel der Arbeit war die Identifizierung und Analyse von Zielgenen, die von beiden Signalwegen und nicht durch einen Signalweg alleine reguliert werden. Genexpressionsanalysen zeigten eine deutliche Herunterregulierung der Proteine Hsp90alpha und Hsp90beta nach einer gleichzeitigen Inhibition der IL6R/STAT3 und Ras/MAPK Signalwege. In Hinblick auf die zentrale Rolle von Hsp90 in der Tumorbiologie fokussiert sich die vorliegende Arbeit auf die Erforschung der Rolle von Hsp90 im Multiplen Myelom. Die siRNA-vermittelte Herunterregulation der Proteinexpression von Hsp90-Proteinen zeigte, daß das Ausschalten von HsP90alpha alleine nur zu einer moderaten Apoptoseinduktion in INA-6- und MM.1s-Zellen führte. Die gleichzeitige Herunterregulation von HsP90beta hingegen führte zu einer Verstärkung dieses Effektes und deutet darauf hin, daß beide Proteine miteinander kooperieren. Die pharmakologische Inhibition der Hsp90-Funktion mittels eines neuen Hsp90-Inhibitors (17-DMAG) führte zu einer Verringerung von phospho-ERK1/2, zur Degradation von STAT3 und zu einem verminderten Überleben von MM-Zellen. Die pro-apoptotischen Effekte der gestörten Hsp90-Funktion konnten weder durch BMSCs und Osteoklasten noch durch ECs (??) abgeschwächt werden, obwohl für ECs beschrieben wurde, daß sie zum Wachstum und Überleben von MM-Zellen beitragen können. Diese Beobachtungen deuten auf einen positiven Rückkopplungskreislauf zwischen HsP90alpha/beta und den wichtigsten Signalwegen hin, welcher das Überleben von MM-Zellen gewährleistet. Desweiteren zeigten immunhistologische Analysen, daß Hsp90-Proteine im Vergleich zu MGUS (??) bzw. normalen Plasmazellen in MM-Plasmazellen hochreguliert sind. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit die essentielle Rolle von Hsp90-Proteinen für die Überlebensfähigkeit von MM-Zellen. Ein neuer Mechanismus der Hsp90-Regulation durch das Zusammenwirken der Signalwege IL6R/STAT3 und Ras/MAPK in MM-Zellen konnte gezeigt werden. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse darauf hin, daß ein positiver Rückkopplungskreislauf zwischen Hsp90-Proteinen und den wichtigsten Signalwegen existiert, welcher zum Wachstum und zur Entwicklung von MM-Zellen beiträgt. Die Inhibition der Hsp90-Funktion durch den pharmakologischen Inhibitor 17-DMAG führte zum Absterben von MM-Zellen und der pro-apoptotische Effekt der Hsp90-Depletion konnte nicht durch unterstützende BMM-Zellen aufgehoben werden. Diese Beobachtungen untermauern die multifunktionelle Rolle von Hsp90 in der MM-Biologie und zeigen die Wichtigkeit der Entwicklung neuer therapeutischer Wirkstoffe zur Inhibition der Hsp90-Funktion bei der Behandlung des MM. / Multiple myeloma (MM) is a haematological malignancy characterised by the accumulation of malignant plasma cells in the bone marrow leading to impaired haematopoiesis and osteolytic bone destruction. Intricate molecular interactions between MM cells and the BMM activate a diverse set of growth, survival and anti-apoptotic signaling cascades that mediate tumor progression and drug resistance. IL-6R/STAT3, Ras/MAPK and PI3K/Akt are the three major signal transduction pathways that are associated with MM growth and progression. However, myeloma cells have shown independence from IL-6R/STAT3 blockade or insensitivity towards Ras/MAPK pathway inhibition in the presence of BMSCs, indicating the dispensability of both in co-culture conditions. Interestingly, concomitant disruption of both IL-6R/STAT3 and Ras/MAPK pathways was successful to drive MM cells into significant apoptosis. This study aimed to identify and analyse the downstream target genes that are regulated by both pathways and not by either pathway alone. Gene expression profiling revealed prominent downregulation of Hsp90alpha and Hsp90beta proteins after combined inhibition of the IL-6R/STAT3 and Ras/MAPK pathways. Owing to the important role played by Hsp90 in cancer biology, this study was narrowed down to investigate the role of Hsp90 in MM. Specific siRNA-mediated knockdown of Hsp90 proteins showed that although knockdown of Hsp90beta was sufficient to induce moderate apoptosis in INA-6 and MM.1s cells, the effect was more pronounced when both Hsp90 proteins were targeted, indicating co-operation between them. Pharmacological inhibition of Hsp90 function by using a novel Hsp90 inhibitor (17-DMAG) down-regulated the levels of pERK1/2 and led to degradation of STAT3 and decreased viability of MM cells. The pro-apoptotic effects of compromised Hsp90 function could not be alleviated by either BMSCs, OCs or ECs, which are well-known to support myeloma growth and survival. These observations point to the existence of a positive feedback loop consisting of Hsp90alpha/beta and major signaling pathways supporting MM cell survival. Furthermore, immunohistochemical analysis unveiled the up-regulated status of Hsp90 proteins in MM PCs as compared to MGUS or normal PCs. Taken together, the results of this study explain the critical contribution of Hsp90 proteins to MM cell survival. A novel mechanism of Hsp90 regulation by co-operation between the IL-6R/STAT3 and Ras/MAPK pathways was discovered in myeloma cells. There is also strong evidence of the existence of a positive feedback loop between Hsp90alpha/beta proteins and major signaling pathways supporting MM growth and progression. Inhibition of Hsp90 function by using the Hsp90 inhibitory drug 17-DMAG proved to be lethal for myeloma cells and the pro-apoptotic effects of Hsp90 blockade could not be reversed by the presence of cells from the supportive BMM. These observations highlight a multi-functional role of Hsp90 in MM biology and strongly strengthen the notion that therapeutic strategies targeting Hsp90 may open new perspectives for anti-myeloma drug development.

Unbegrentzte Selbsterneuerungkapazität und Pluripotenz sind charakteristische Merkmale von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen). Dennoch sind die molekularen und zellulären Mechanismen, die für das Schicksal der ES-Zellen zuständig sind, noch nicht genau definiert. Um regulierende Faktoren des undifferenzierten Zustands von ES-Zellen zu identifizieren, wurden undifferenzierte ES Zellen, "Embryoid Bodies", spontan differenzierte und mit Retinsäure differenzierte ES Zellen mittels Microarray-Analysen verglichen. Neben bereits etablierten Pluripotenz-Markern, wurde Sprouty4 als eines der am stärksten degerulierten Transkripte unter diesen Bedingungen identifiziert. Sprouty4 ist als Inhibitor des ERK (Extracellular signal-regulated protein kinase)-Signalweges bekannt, aber seine Rolle in ES-Zellen wurde noch nicht definiert. Mittels Genexpression und Western BlotAnalysen konnte gezeigt werden, dass Sprouty4 in undifferenzierten ES-Zellen stark exprimiert ist und im Verlauf der Differenzierung schnell herunterreguliert wird. In vivo war Sprouty4 auf die innere Zellmasse (ICM) der Mausblastozyste beschränkt. Außerdem wurde gezeigt, dass der Sprouty4 Promotor durch direkte Bindung der PluripotenzMarkern Nanog, Klf4 und Stat3 reguliert wird. ES-Zellen, die Sprouty4 konstitutiv exprimieren, waren resistent gegen Differenzierung durch Zugabe von Retinsäure oder Bildung von Embryoid Bodies. Hingegen führte die Expression einer dominant-negativen Mutante von Sprouty4 zu einer erhörten Sensitivierung von ES-Zellen gegenüber der Differenzierung und zur Bildung extraembryonaler Gewebe begleitet von Endoreduplikation. Zusammenfassend konnten unsere Ergebnisse zeigen, dass die enge Regulation des ERK-Signalweges und warscheinlich anderer Signalwege durch Sprouty4 notwendig ist, um die Balance zwichen Pluripotenz und Differenzierung embryonaler Stammzellen zu kontrollieren. / A hallmark feature of embryonic stem (ES) cells is the ability to self-renew indefinitely while maintaining pluripotency. However, the molecular and cellular mechanisms underlying ES cell fate are poorly understood. To identify signaling pathway molecules that maintain the uncommitted state of ES cells, a microarray analysis was performed comparing undifferentiated ES cells, mature embryoid bodies, spontaneously differentiated and retinoic acid-induced differentiated ES cells. Among several well-validated pluripotency markers, Sprouty4 was identified as one of the most highly deregulated transcripts under these conditions. Sprouty4 is known as an inhibitor of the extracellular signal-regulated protein kinase (ERK/MAPK) pathway however its role in ES cells has not yet been defined. Gene expression and western-blot analyses have shown that Sprouty4 is highly expressed in ES cells and strongly downregulated upon differentiation whilst in vivo, Sprouty4 is confined to the founder population of ES cells, the inner cell mass of mouse blastocysts. Moreover, the Sprouty4 promoter was found to be regulated via the direct binding of the intrinsic pluripotency-associated factors Nanog, Klf4 and Stat3. ES cells engineered to constitutively express a wild-type version of Sprouty4 were found to be resistant to differentiation induced by retinoic acid or embryoid bodies formation. Conversely, expression of a dominant negative Sprouty4 mutant activating the ERK/MAPK pathway in a sustained manner sensitized ES cells to differentiation and triggered endoreduplication leading to the formation of extraembryonic tissue. Taken together, these results highlight the essential role of Sprouty4 in the tight regulation of the ERK/MAPK pathway- and probably others- for the balance between pluripotency and lineage commitment in mouse embryonic stem cells.

Der primäre somatosensorische Kortex (S1) besteht aus sechs Schichten (L1L6).Die koordinierte Aktivität dieser sechs Schichten kortikaler Neurone ist entscheidend für die sensorische Wahrnehmung und die Steuerung willkürlichen Verhaltens. Es ist jedoch noch wenig über die synaptischen Mechanismen bekannt, die die Verarbeitung zwischen den kortikalen Schichten bei sich aktiv verhaltenden Tieren bestimmen. Ich habe einfache und doppelte in vivoGanzzellableitungen im VorderpfotenAreal von S1 in der Maus gemacht, und gezeigt, dass Pyramidalzellen in L2/3 und L5 während einer Bewegung der Vorderpfote Unterschiede in ihren intrinsischen Eigenschaften und der Dynamik ihrer Membranpotenziale zeigen. Doppelableitungen haben gezeigt, dass sensorisch und motorisch ausgelöste synaptische Eingänge zwischen den Zellschichten weitgehend korreliert waren, niederfrequente unterschwellige Potenzialschwankungen und spontane Aktionspotenziale jedoch einen schichtspezifischen Zeitverlauf zeigten. Auf einer längeren Zeitskala beobachteten wir, dass spontane Bewegungen der Vorderpfote eine Dekorrelation unterschwelliger Aktivität zwischen den Schichten auslösten. Des Weiteren zeigten L5Pyramidalzellen durch ihre Aktivität sensorisch ausgelöste und spontane Bewegungen der Vorderpfote stärker an, als L2/3Neurone. Insgesamt deuten meine Daten darauf hin, dass Unterschiede zwischen den Zellschichten beim Timing von Aktionspotenzialen, bei der unterschwelligen Synchronisierung und bei den mittleren Feuerraten sowohl von der Quelle des zu Grunde liegenden synaptischen Eingangs als auch vom resultierenden Verhalten abhängen. Außerdem konnte ich zeigen, dass Neurone im VorderpfotenAreal von S1 auf leichte Kältereizung der Vorderpfote antworten, und dass diese Antwort vom Ionenkanal transient receptor potential cation channel subfamily M member 8 (TRPM8) in primären sensorischen afferenten Neuronen vermittelt wird. / The primary somatosensory cortex (SI) is composed of six layers (L1L6). The coordination of neural activities across six layers of cortical neurons is essential for reliable sensory perception and the control of voluntary behavior. However, the synaptic neural mechanisms governing translaminar cortical processing in behaving animals are still unknown. I made in vivo single and dual whole cell recordings in mouse forepaw SI, my work revealed that L2/3 and L5 pyramidal neurons have distinct intrinsic properties and membrane potential dynamics during forepaw behavior. Dual recordings showed that sensory and movement evoked synaptic inputs were closely correlated across layers, but low frequency subthreshold fluctuations and spontaneous action potentials exhibited a laminar specific temporal profile. At longer time scales, my data showed that spontaneous forepaw movement evoked a decorrelation of subthreshold activity across layers. Furthermore, L5 pyramidal neurons signaled sensory evoked and spontaneous forepaw movements more strangely than L2/3 neurons. Overall, my work suggests that laminar differences in the timing of action potential firing, subthreshold synchrony and mean firing rates are dependent both on the origin of the underlying synaptic input and the behavioral outcome of the event. In addition, I identified that forepaw SI neurons respond to mild cooling stimulation of the forepaw and that this response is mediated by the Transient receptor potential cation channel subfamily M member 8 (TRPM8) in primary sensory afferent neurons.

Derzeit wird die Anwendung von Erythropoietin (Epo) zur Neuroprotektion in präklinischen und klinischen Studien intensiv untersucht. Für die Neuroprotektion ist die Regulation des Erythropoietin-Rezeptors (EpoR) in neuronalen Zellen von hoher Relevanz. In dieser Arbeit wurden die transkriptionellen Mechanismen der EpoR-Regulation in humanen Neuroblastom-Zellen SH-SY5Y mit neuronalem Phänotyp untersucht. Da der hämatopoietische Transkriptionsfaktor GATA-1 die EpoR-Transkription in erythroiden Vorläuferzellen in Kooperation mit Sp1 stimuliert, wurde die Rolle der in neuronalen Vorläuferzellen exprimierten GATA-Transkriptionsfaktoren bei der EpoR-Expression untersucht. Es wurde eine in vitro Bindung von GATA-2, -3 und -4 an zwei Motive in der EpoR 5’-flankierenden Region (-274/-271; -47/-44) nachgewiesen. In Reportergen-Assays zeigten diese Genabschnitte eine bis zu 4,8-fache Aktivitätssteigerung bei Überexpression von GATA-2, -3 oder -4. Die endogene EpoR mRNA-Expression wurde dadurch aber nicht erhöht. Hypoxie (2% O2, 3 d) erhöhte die EpoR-Expression signifikant (1,8-fach, p < 0,01), wobei überexprimierte GATA-Transkriptionsfaktoren diesen Effekt nicht weiter steigerten. Die Gabe von Epo (5 U/ml, 3 d) hatte weder unter Normoxie noch unter Hypoxie einen Einfluss auf die EpoR-Expression. Die Promotoraktivität der Reporterkonstrukte wurde durch Mutation der GATA-Bindungsstellen nicht verändert, jedoch bei mutierter Sp1-Bindungsstelle inhibiert. Ein Fragment der 5’-flankierenden Region (-449/-285), das ein Cluster von Bindungsstellen für unterschiedliche Transkriptionsfaktoren enthält, zeigte die stärkste Promotoraktivität und rekrutierte offenbar die RNA-Polymerase II. In unserem Modell spielen die GATA-Faktoren keine direkte Rolle für die EpoR-Genregulation in neuronalen Vorläuferzellen. Die EpoR mRNA-Expression wird eher durch einen Komplex aus verschiedenen Transkriptionsfaktoren reguliert, der an eine 5’ des minimalen Promotors liegende DNA-Region zu binden scheint. / Since the use of erythropoietin (Epo) as neuroprotective agent is currently intensively studied in preclinical and clinical trials, regulatory mechanisms of the erythropoietin receptor (EpoR) in neuronal cells are of particular interest. In this study, the transcriptional mechanisms of EpoR regulation were analyzed in human neuroblastoma-derived SH-SY5Y cells, which exhibit a neuronal phenotype. Considering that the hematopoietic transcription factor GATA-1 stimulates EpoR transcription in cooperation with Sp1 in erythroid progenitors, the role of other GATA family members expressed in neuronal precursor cells were studied. In vitro, GATA-2, -3 and -4 were found to bind to two consensus motifs within the EpoR 5’-flanking region (-274/-271 and -47/-44). In reporter gene assays, these regions showed an up to 4.8-fold induction if GATA-2, -3 or -4 were overexpressed. However, forced expression of GATA-2, -3 and -4 did not enhance endogenous EpoR mRNA expression. Under hypoxia (2% O2, 3 d), EpoR expression was significantly upregulated in SH-SY5Y cells (1.8-fold, p < 0.01), but not further increased by the additional overexpression of the GATA factors. Incubation of the SH-SY5Y cells with recombinant Epo (5 U/ml, 3 d) had no effect on the EpoR expression under normoxia or hypoxia. The promoter activities of the reporter constructs were not changed by mutations in the GATA sites, but abolished by mutations of Sp1 binding sites. A fragment (-449/-285) of the 5’-flanking region that contains a cluster of binding sites for various transcription factors showed strongest promoter activity and was obviously directing the recruitment of RNA polymerase II. We conclude that GATA factors do not play a major role in regulating EpoR expression in our model for neuronal precursor cells. EpoR mRNA expression is rather regulated by a complex of various transcription factors, which may bind to a region upstream of the minimal promoter.

Die Intensität verhaltensrelevanter Signale variiert oft über viele Größenordnungen. Gleichzeitig müssen sensorische Systeme in der Lage sein, über den gesamten relevanten Bereich feine Intensitätsunterschiede aufzulösen. Auf neuronaler Ebene ergibt sich bei Nutzung eines Feuerratencodes aus diesen Anforderungen ein grundsätzlicher Konflikt, da neuronale Antwortbereiche beschränkt sind. Eine Lösung, die in vielen Sinnessystemen beschrieben wurde, ist die Verschiebung von Intensität-Kennlinien, so dass der gesamte Antwortbereich des Neurons zur Verfügung steht, um schnelle Abweichungen vom Mittelwert zu kodieren. Diese Arbeit versucht anhand mathematischer Modelle zu beantworten, wie die Verschiebung von Kennlinien in einem neuronalen Netzwerk entstehen könnte. Ausgangspunkt ist eine Rezeptorpopulation mit Intensitätsbereichsaufteilung und einem begrenzten Verschiebungsbereich der Kennlinien von Einzelrezeptoren, die auf ein Output-Neuron konvergieren. Diese Organisation wurde vom auditorischen System der Grille inspiriert. Modelle, die auf einer Kombination aus einer sättigenden Nichtlinearität und Spike-Frequenz-Adaptation basieren, reproduzieren die Verschiebung der Kennlinien entlang der Intensitäts-Achse. Diese Modelle sind in der Intensitätsdiskriminierung dem Rezeptormodell und der Summe von Rezeptorantworten über große Intensitätsbereiche deutlich überlegen. Die Kennlinien dieser Modelle besitzen zudem weitere Eigenschaften, die in ihrer Kombination übereinstimmend in verschiedenen sensorischen Systemen beschrieben wurden: Insbesondere erklären sie eine zusätzliche scheinbare Verschiebung entlang der Antwortachse, unterschiedliche Steigungen der verschobenen Kennlinien, sowie Steigungsänderungen innerhalb einzelner Kennlinien. Die einfachen, abstrakt formulierten Modelle ermöglichen ein tieferes Verständnis adaptiver Mechanismen über das Modellsystem Grille hinaus. / Intensities of behaviourally relevant signals often vary over many orders of magnitude. At the same time, sensory systems need to ensure high sensitivity to minute intensity differences across the full intensity range. These demands conflict on the neuronal level due to the boundedness of neuronal response ranges. To solve this dilemma, intensity response curves in many sensory system were found to shift towards the actual mean intensity so that the full response range can be used to encode fast fluctuations around the slowly varying mean. Using mathematical models, this study approaches the question how shifts of intensity response curves might arise in small neural networks. The starting point is a population of receptors with stacked response thresholds and limited capacity of adaptive shift that converge onto one output neuron. This organization was inspired by the auditory system of the cricket. A combination of a static saturating non-linearity and spike-frequency adaptation reproduced the desired shift of response curves along the intensity axis. With respect to intensity discrimination, these models are superior to the receptor model and the sum of receptor responses over a wide range of absolute intensities. The response curves generated by these model also displayed details of response curve behaviour consistently observed in numerous experimental studies. In particular, they explain an apparent shift along the response axis, different slopes of the shifted response curves, and changes in the slope within individual response curves. The simple, abstract models allow for a deeper understanding of adaptive mechanisms beyond the auditory system of the cricket.

Das Ubiquitin-Proteasom-System sorgt in eukaryontischen Zellen für einen kontrollierten Abbau von Proteinen. Das 20S Proteasom ist als Multikatalytischer Protease Komplex der zentrale Bestandteil dieses Systems. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich gereinigtes 20S Proteasom aus HeLa-Zellen chromatographisch in Subtypen auftrennen lässt, die sich strukturell und in ihrer proteolytischen Aktivität unterscheiden. Nach Induktion der Zellen mit gamma-Interferon (gamma-IFN) werden Immuno-Proteasomen gebildet und es kommt zu einer Veränderung des Subtypen-Musters und der Aktivitäten. Unter dem Einfluss von gamma-IFN bilden sich hauptsächlich Mischkomplexe mit sowohl konstitutiven als auch Immuno-Untereinheiten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass in den Zellkompartimenten Cytoplasma, Zellkern und Microsomen von HeLaS3-Zellen unterschiedliche 20S Proteasom-Subtypen vorkommen. Dies war unter anderem auf eine unterschiedliche Glykosylierung einzelner proteasomaler Untereinheiten zurückzuführen. Die genaue Kenntnis von Struktur und Funktion der 20S Proteasom-Subtypen ist im Hinblick auf neue diagnostische und therapeutische Ansätze in der Humanmedizin von großem Interesse. / The Ubiquitin-proteasome system is responsible for the regulated protein degradation in eucaryotic cells. The 20S proteasome is as a multicatalytic protease the central complex of these system. This study has shown that it is possible to separate 20S proteasome subtypes from HeLa cells by chromatography. 20s proteasome subtypes differ in structure and proteolytic activity. The subtype-pattern and the activity are significantly changed after an induction of the cells with gamma-Interferon (gamma-IFN) under formation of immuno proteasomes. After gamma-IFN induction mainly mixed complexes have been formed with both constitutive and immuno subunits. Further it has been shown that in cell compartements cytoplasm, microsomes and nucleus of HeLaS3 cells different 20S proteasome subtypes are located. Among other things glycosylation of some subunits is responsible for that phenomenon. With regard to new strategies in diagnostic and therapy of human diseases the exactly knowledge of structure and function of the proteasome subtypes is a case of interest.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Auswirkungen von externen Störquellen und intrinsischer Variabilität auf die Verarbeitung und Erkennung von akustischen Signalen am Modellsystem der Feldheuschrecke Chorthippus biguttulus zu untersuchen. Damit sowohl die Gesangserkennung am sich verhaltenden Tier als auch die dieser Erkennung zugrunde liegende neuronale Verarbeitung untersucht werden konnte, wurde ein Weibchengesang verwendet, dessen zeitliches Muster durch zufällige Amplitudenmodulationen gestört wurde. Durch die Degradation mit verschiedenen Frequenzbändern konnte überprüft werden, ob bestimmte Modulationsfrequenzen die Signalerkennung stärker beeinflussen als andere. Mit zunehmender Störung der Gesangsstruktur kam es in den Verhaltenstests an Männchen zu einer Abnahme der Erkennungsleistung. Die Stärke der tolerierten Degradation war dabei in der Regel nicht unterschiedlich für die getesteten Degradationsbänder. Die Unterschiede in den neuronalen Antworten, welche entweder durch die artifizielle extrinsische Degradation oder durch interne Fehler in der auditorischen Verarbeitung verursacht wurden, konnten durch eine Spiketrain-Metrik quantifiziert werden. Diese Analyse zeigte, dass die Auswirkung der extrinsischen Signaldegradation von den Rezeptoren über die lokalen Interneurone zu den aufsteigenden Interneuronen abnahm, während es zu einem signifikanten Anstieg der intrinsischen Variabilität kam. Die Stärke der Degradation war dabei erneut nicht unterschiedlich für die getesteten Degradationsbänder. Durch die Bestimmung von neurometrischen Schwellen konnten die Grenzen der Signalerkennung der Männchen mit der Rauschtoleranz der einzelnen auditorischen Neurone verglichen werden. Die kritischen Degradationsstufen, die so ermittelt werden konnten, stimmten teilweise erstaunlich gut überein. Somit sind die Grenzen der Signalerkennung durch die Analyse der Antwortkapazitäten der ersten drei Verarbeitungsstufen relativ gut erklärbar. / The aim of this study was to investigate the effects of extrinsic and intrinsic noise sources on signal recognition and processing within the acoustic communication system of the grasshopper Chorthippus biguttulus. To test both - signal recognition of behaving animals and the underlying auditory processing mechanisms - a female song was used, whose temporal pattern was disturbed by random amplitude modulations. Due to the degradation with various modulation bands, it was possible to test if distinct modulation frequencies have more pronounced effects on signal recognition than others. Behavioural tests on males of Chorthippus biguttulus showed that progressive degradation of the song pattern induced a decrease in recognition performance. The strength of degradation tolerated generally was the same for different modulation bands. The differences between neuronal responses, which were either caused by the artificial extrinsic degradation or internal errors during auditory processing, could be quantified by a spiketrain metric. This analysis showed that the effect of extrinsic signal degradation was much more severe for receptors and local interneurons than for ascending interneurons, whereas there was a significant increase of intrinsic variability with higher levels of processing. The strength of the degradation was again not different for different modulation bands. Signal recognition could be compared with the noise tolerance of individual auditory neurons by determining neurometric thresholds. The average critical degradation levels, to some extend, matched the critical degradation level for behaviour. Thus, by means of analysing the response capacities of neurons from the first three levels of auditory processing, the limits of signal detection are relatively well explained.

Die Wanderung von Leukozyten aus dem Gefäßlumen läuft in einer Kaskade ab, die durch verschiedene Adhäsionsmoleküle vermittelt wird. Dabei wird der erste Kontakt der Leukozyten mit dem Endothel durch die Interaktion von L­Selektin mit seinen endothelialen Sialomucinliganden eingeleitet. Neben seiner Adhäsionsfunktion kann L­Selektin intrazelluläre Signalwege aktivieren und wird, induziert durch intrazelluläre Signale, an seinen cytoplasmatischen Serinresten durch Proteinkinase C (PKC) phosphoryliert. Über die Regulation dieser Serinphosphorylierung von L-Selektin ist nur wenig bekannt. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der cytoplasmatischen Interaktion von L-Selektin mit dem Proteinphosphatase 2A-Inhibitor PhapII und die Identifizierung noch unbekannter Interaktionspartner der cytoplasmatischen Domäne von L­Selektin. Es konnte gezeigt werden, dass das basische Duplett Lys-365/Arg-366 der cytoplasmatischen Domäne von L-Selektin essentiell für die Bindung von PhapII ist, die über den sauren C­Terminus von PhapII vermittelt wird. In einem Malachitgrün-basierten Phosphataseassay konnte gezeigt werden, dass die cytoplasmatischen Serinreste von L­Selektin durch Protein Phosphatase 2A (PP2A) dephosphoryliert werden. Ferner konnte in Jurkat-Zelllysaten PP2A als ein direkter Interaktionspartner von nicht phosphoryliertem LScyto identifiziert werden. Die Dephosphorylierung von LScyto konnte durch PhapII verhindert werden, was auf eine Regulation der Serinphosphorylierung durch PKC, PP2A und PhapII hindeutet. Mit dem Ziel, die Interaktion von PhapII mit L-Selektin durch Co-Kristallisation zu untersuchen, wurde PhapII rekombinant exprimiert und gereinigt. Mittels chromatographischer Verfahren konnte PhapII als ein Protein mit intrinsischer Unordnung in seiner Sekundärstruktur beschrieben werden. Die Deletion des sauren C-Terminus bzw. die Mutation an Serin-9 von PhapII zeigten einen Einfluss auf die Konformation von PhapII zu einer kompakteren Proteinstruktur hin. / Migration of leukocytes from the lumen occurs in a cascade mediated by different members of adhesion molecules. The first contact of leukocytes to endothelium is initiated by the interaction of L­selectin to its endothelial sialomucin ligands. Besides its role in cell adhesion, L­selectin can induce a set of intracellular signaling pathways and can be a target of serine phosphorylation by protein kinase C (PKC) induced by intracellular signals. But little information on regulation of this serine phosphorylation of L-selectin and therefore regulation of intracellular protein interactions is known. The aim of this thesis was to analyze the cytoplasmic interaction of L-selectin with the inhibitor of protein phosphatise 2A PhapII and searching for other unknown interaction partners of the cytoplasmic domain of L-selectin. Results show that the basic doublet Lys-365/Arg-366 of the cytoplasmic domain of L­selectin (Lscyto) is essential for binding to PhapII which is mediated by the acidic C­terminal tail of PhapII. Using malachite green based assay to detect free phosphate, cytoplasmic serine residues of L­selectin were dephosphorylated by protein phosphatase 2A (PP2A). In addition, it was possible to identify PP2A as a direct interaction partner of the non-phosphorylated domain of L­selectin in Jurkat T cell lysates. The dephosphorylation of Lscyto was prevented by PhapII and points the regulation of serine phosphorylation by PKC, PP2A and PhapII. For analysis of the interaction of PhapII with L-selectin by co-crystallography, PhapII was recombinantly expressed and purified. Using chromatographic techniques PhapII was observed to be a protein with an intrinsic disorder in its secondary structure. Deletion of the acidic C-terminus and in particular mutation of Serine-9 showed an effect on the conformation of PhapII to a globular and compact protein structure.