Sekundäre bakterielle Infektionen im Verlauf oder in Folge einer Infektion mit Influenza A Viren (IAV) steigern oftmals die Schwere des Krankheitsverlaufes, was besonders während der IAV Pandemien von 1918, 1968 und 2009 deutlich wurde. Genaue mechanistische Ursachen, welche dieser gesteigerten Kopathogenität zugrunde liegen wurden überwiegend in Tierversuchsmodellen adressiert und sind immunologisch unvollständig. Aufgrund organstruktureller und immunfunktioneller Speziesunterschiede ist ungewiss, inwieweit eine Übertragbarkeit der Daten zwischen Mensch und Maus besteht. Fokus der Arbeit bildete die Analyse potentieller IAV assoziierter Änderungen der angeborenen Immunität, welche sekundäre Pneumokokkeninfektionen in humanem ex vivo Lungengewebe begünstigen. Dafür wurden zentrale Zyto - bzw. Chemokine als Reaktion auf Einzelinfektionen mit dem saisonalen IAV Pan/99(H3N2) sowie Streptococcus pneumoniae D39 mit denen subsequenter viral-bakteriellen Koinfektion verglichen. Ausgelöst durch die antivirale Interferonantwort erfolgte die Reduktion der pneumokokkeninduzierten Bildung von IL-1β und GM-CSF auf translationaler und transkriptioneller Ebene. Vermutlich beeinflussen Typ I und II Interferone die IL-1β Bildung, welches über parakrine Wechselwirkungen an der GM-CSF Regulation beteiligt ist. Auf zellulärer Ebene verursachte IAV die Freisetzung von Typ I, II und III Interferonen aus primären humanen Alveolarepithelzellen vom Typ II. In humanen Alveolarmakrophagen unterdrückten Typ I und II Interferone die pneumokokkeninduzierte IL-1β Freisetzung. Folglich unterblieb die IL-1β-regulierte GM-CSF Sekretion aus Alveolarepithelzellen vom Typ II. Die Ergebnisse zeigen, dass influenzainduzierte Interferone durch die Unterdrückung der IL-1β regulierten Bildung von GM-CSF in humanem Lungengewebe beitragen. Damit unterstützt sie das Verständnis immunologischer Faktoren, welche diesem Krankheitsbild im Menschen pathophysiologisch zugrunde liegen können. / Secondary bacterial infections, which occur during or following an IAV infection, exaggerate the severity of the course of disease up to a lethal outcome, clearly recognizable during the fatal IAV pandemics from 1918, 1968 or 2009. Particular mechanisms underlying this exaggerated viral-bacterial copathogenity were almost solely addressed using animal models and are immunologically incomplete. Due to structural and immunofunctional interspecies differences the transferability of data between human and mice remains indeterminate. The study mainly purposed to investigate IAV associated modulations of innate immunity, which potentially facilitates secondary pneumococcal pneumonia in primary human ex vivo lung tissue. Hence secretion of central cyto- and chemokines initiated by single infection with the seasonal IAV Pan/99(H3N2) or the bacterium Streptococcus pneumoniae D39 were compared to subsequent viral-bacterial coinfection. In context of an antiviral interferon response the pneumococcal induced translation and transcription of IL-1β and GM-CSF were reduced. Probably type I and type II interferons affect generation of IL-1β, which participates in the regulation of GM-CSF by paracrine interactions. On a cellular basis the infection of primary human alveolar epithelial cells type II (AECII) with IAV triggered the release of interferon type I, II and III. In human alveolar macrophages type I and II interferons suppressed the pneumococcal induced release of IL-1β. Consequently, the IL-1β regulated generation of GM-CSF in AECII was impeded. The present study indicates, that influenza related induction of interferons suppresses the IL-1β related release of GM-CSF in human lung tissue. Thereby it takes part in contributing to pathophysiological comprehension of immunological factors underlying this copathogenity.

L. pneumophila, der Erreger der Legionärskrankheit, kodiert für eine Vielzahl lipolytischer Enzyme. Bis zu 17 verschiedenen Proteinen kann aufgrund von Sequenzhomologien oder experimenteller Analyse phospholipolytische Eigenschaft zugeschrieben werden. Neben sekretierten Formen wird eine besonders aktive zell-assoziierte Variante exprimiert, die Phospholipase A/Lysophospholipase A PlaB. Wie bereits gezeigt werden konnte, kodiert das plaB Gen für die hauptsächliche membranständige Phospholipase A von L. pneumophila mit Enzymaktivitäten, die die Aktivität sekretierter Proteine um das 100-fache übersteigen. Da PlaB zu keiner der bisher beschriebenen Phospholipasen Homologien aufweist, wurden in dieser Arbeit durch gezielte Mutagenese die katalytisch wichtigen Aminosäuren identifiziert. Dies ergab, dass PlaB zwar eine für Lipasen und Proteasen typische katalytische Triade aus Serin, Asparat und Histidin ausbildet, die umliegenden Motive sich aber deutlich von bisher beschriebenen Enzymklassen unterscheiden. Somit stellt PlaB das erste näher charakterisierte Mitglied einer neuen Familie phospholipolytischer Enzyme dar. Im Weiteren konnten für die Substratspezifität wichtige Aminosäurereste identifiziert werden. Dabei stellte sich heraus, dass die Fähigkeit zur Hydrolyse von cholinkettentragenden Substraten besonders suszeptibel gegenüber Mutationen war. Da im Vergleich zu nicht-pneumophila Stämmen, wie z. B. L. spiritensis, nur L. pneumophila in der Lage war, diese Lipide in hohem Maße umzusetzen, kann die Eigenschaft von PlaB, Phosphatidylcholin (PC) zu hydrolysieren, einen Virulenzvorteil für L. pneumophila bedeuten. Die Hypothese konnte durch Hämolyse-experimente bestärkt werden. Hier zeigten sich Mutanten mit reduziertem Potential zur Hydrolyse von PC weniger zytotoxisch gegenüber humanen Erythrozyten. Das zell-zerstörende Potential von PlaB könnte somit eine enorme Auswirkung auf die Virulenzeigenschaften von L. pneumophila haben. Wie in der vorliegenden Arbeit untersucht, bestätigten in vitro Experimente, dass PlaB die hauptsächliche Aktivität während einer Makrophageninfektion darstellt, die Deletion des Gens aber keine Auswirkungen auf das Replikationspotential der Bakterien hat. Ganz im Gegenteil dazu waren plaB Insertionsmutanten bei der Infektion von Meerschweinchen in ihrer Vermehrungsfähigkeit in der Lunge als auch in der Verbreitung der Erreger zur Milz der Tiere reduziert. Um den Grund des Defektes näher zu erörtern, wurde in einem Screen auf 40 verschiedene Entzündungsmediatoren die Sekretion von IL-8, MCP-1, RANTES und TIMP-2 als PlaB-abhängig identifiziert. Somit repräsentiert die zell-assoziierte Phospholipase A, PlaB, von L. pneumophila eine neue Klasse lipolytischer Enzyme und kann durch Hydrolyse eines breiten Substratspektrums, insbesondere durch Hydrolyse von PC, die Vermehrung und Verbreitung des Erregers im Wirtsorganismus unterstützen. / L. pneumophila, the causative agent of Legionnaires’ disease (LD) expresses numerous lipolytic enzymes. According to sequence homology or determined lipolytic activities, up to 17 open reading frames of the L. pneumophila genome may encode functional phospholipases. In addition to secreted and/or injected lipolytic enzymes, it was shown that the pathogen expresses a highly active and membrane-bound phospholipase A/lysophospholipase A with hemolytic activity, designated PlaB. As PlaB does not belong to any established bacterial or eukaryotic protein family of lipolytic enzymes nor does it show sequence homology to conserved motifs harboring the catalytically important amino acids, we analyzed putative catalytic centers using site-directed mutagenesis. This study shows that PlaB exhibits a catalytic triad of serine, aspartate and histidine residues, most commonly found within lipolytic and proteolytic enzyme families. However, surrounding motifs differ significantly from described ones. Thus, PlaB is the first representative of a new class of lipolytic enzymes. In addition, we described amino acids important for substrate specificity, revealing that the ability to hydrolyze phosphatidylcholine (PC) is severely susceptible to various mutations. Since PlaB of non-pneumophila strains, such as L. spiritensis, express comparable activities against glycerol-containing lipids, but are reduced in their hydrolytic potential to cleave choline-containing substrates, PC-targeting activity could be an important contribution to the pathogenicity of L. pneumophila, the most common cause of LD. The hypothesis was underlined by reduced hemolytic potential of L. spiritensis PlaB and PC-hydrolysis impaired mutants of L. pneumophila PlaB and is in accordance with PC being the major lipid in the outer leaflet of eukaryotic membranes. The cell destructive properties of PlaB may enhance bacterial pathogenicity in multiple ways. As depicted within this study, PlaB represents the major lipolytic activity present throughout host cell infections; however, gene deletion mutants retained their ability to multiply within several host cell infection systems. On the contrary, the plaB mutant strain was inhibited in replicating in the lung and disseminating to other organs in a guinea pig infection model. To elucidate the impact of PlaB on Legionella virulence we investigated 40 inflammatory factors secreted by lung epithelial cells upon Legionella infection and observed that IL-8, MCP-1, RANTES and TIMP-2 are released in a PlaB-dependent manner. Thus, PlaB represents a new family of lipolytic enzymes which could, according to the lipolytic profile and especially the ability to hydrolyse PC, contribute to replication and dissemination properties of a pathogen within a host cell, e.g. amoeba, or even more complex organisms such as guinea pigs or humans.

Mehr als 300 Millionen Menschen sind weltweit von Diabetes betroffen, die Mehrheit davon leidet an Typ-2-Diabetes. Typ-2-Diabetes ist durch eine Insulinresistenz charakterisiert, welche meistens durch Übergewicht und Adipositas verursacht wird. Diese Insulinresistenz kann zunächst durch eine erhöhte pankreatische Insulinsekretion kompensiert werden, jedoch können langfristig die pankreatischen beta-Zellen den erhöhten Insulinbedarf nicht mehr decken. Dies verursacht einen starken Anstieg der Blutglucosespiegel und stellt den Beginn der Typ-2-Diabetes Erkrankung dar. Neben genetischen Veränderungen sind Umweltfaktoren, wie erhöhte Nahrungsaufnahme und reduzierte Bewegung, wichtige Faktoren in der Pathogenese des Typ-2-Diabetes. Frühere Forschungsergebnisse zeigten eine wichtige Rolle von microRNA 375 (miR-375) im Wachstum und in der Funktion der Insulin produzierenden beta-Zellen. Die Genexpression von miR-375 ist in diabetischen Nagetieren und Menschen verändert, was auf eine wichtige Rolle dieser microRNA in der Pathogenese des Typ-2-Diabetes hindeutet. Gene, die durch miR-375 reguliert werden, wurden in den pankreatischen beta-Zellen beschrieben, jedoch ist der Mechanismus wie miR-375 das Wachstum und die Funktion der pankreatischen beta-Zellen beeinflusst noch nicht im Detail verstanden. Das Cell Adhesion Molecule 1 (CADM1) ist ein bekanntes Zielgen der miR-375 und vor allem im Gehirn als Regulator von Anzahl und Funktion der Synapsen bekannt. Da es außerdem in den pankreatischen beta Zellen exprimiert ist, könnte es auch dort an der Regulation von beta-Zellwachstum und –funktion beteiligt sein und die Glucose- und Energiehomöostase verändern. Ziel dieser Arbeit war es, in vollständig oder konditionell Cadm1-defizienten Mäusen den Einfluss von CADM1 in pankreatischen beta-Zellen und neuronalem Gewebe an der Regulation von Glucose- und Energiehomöostase zu untersuchen. / More than 300 million people world-wide are affected by diabetes, the majority suffering from type 2 diabetes. Type 2 diabetes is characterized by insulin resistance, usually caused by obesity and overweight. Enhanced pancreatic insulin secretion largely compensates insulin resistance for years. A failure of pancreatic beta-cells to meet increased insulin demands drastically increases blood glucose levels and marks the onset of type 2 diabetes. Besides environmental influences, mainly elevated food intake and reduced physical activity, also genetic mutations are important factors in the pathophysiology of type 2 diabetes. Recent literature highlights the role of microRNA 375 (miR-375) in the growth and function of pancreatic insulin-producing beta-cells. MiR-375 gene expression is regulated in diabetic humans and rodents, suggesting that this microRNA is involved in the pathogenesis of type 2 diabetes. Genes regulated by miR-375 have been described in pancreatic beta-cells. Nevertheless, the exact mechanisms how miR-375 regulates beta-cell growth and insulin secretion have not been understood. Cell adhesion molecule 1 (CADM1) is a known target of miR-375 and has mainly been described as regulator of synapse number and synaptic function in the brain. CADM1 is also expressed in pancreatic beta-cells and might regulate beta-cell growth and function and might be involved in the control of glucose and energy homeostasis. The aim of this work was to investigate whether CADM1 in pancreatic beta-cells or neuronal tissue contributes to the regulation of energy and glucose homeostasis by using total and conditional Cadm1 deficient mice. Total Cadm1 deficient (Cadm1KO) mice showed increased sensitivity to glucose and insulin as well as enhanced glucose-stimulated insulin secretion compared to littermate control mice. Elevated glucose-stimulated insulin secretion after Cadm1 depletion could be confirmed in an in vitro beta-cell model.

Circadiane Uhren sind endogene Oszillatoren, die tägliche Rhythmen in Physiologie, Metabolismus und Verhalten steuern. Auf molekularem Level wird die Dynamik der circadianen Oszillation über ein genregulatorisches Netzwerk aus transkriptionellen-translationalen Rückkopplungsschleifen gesteuert. Posttranslationale Modifikationen von Uhrproteinen sind für eine präzise Justierung der circadianen Periode essentiell. Dabei spielt die Phosphorylierung von Uhrproteinen für die Regulation von Aktivität, Stabilität und intrazellulärer Lokalisation eine wichtige Rolle. Bisher sind verschiedene Kinasen als Modulatoren der circadianen Uhr charakterisiert worden, jedoch ist eine funktionale Rolle von Protein Phosphatasen bisher nur unzureichend untersucht. In dieser Arbeit wurde mittels eines RNAi-basierten Screenings in oszillierenden humanen Zellen untersucht, ob sich die gezielte Depletion katalytischer Untereinheiten der Serin/Threonin-Phosphatasen auf die normale Oszillationsdynamik auswirkt und welche Rolle ausgewählte Phosphatase-Kandidaten für die posttranslationale Kontrolle des molekularen Oszillators spielen. Die RNAi vermittelte Depletion von Protein Phosphatase 4 führte gewebe- und speziesübergreifend zu einer signifikant kurzen circadianen Periode, während die Überexpression von wildtypischer Pp4c in einer stark reprimierten Amplitude resultierte. Mechanistische Untersuchungen zur funktionellen Relevanz von PP4c für die Regulation der circadianen Uhr zeigten, dass PP4c womöglich eine duale Rolle spielt: Einerseits ist PP4c in die direkte Aktivierung des Bmal1-Promotors über RRE-Elemente involviert. Anderseits wirkt PP4c inhibierend auf die CLOCK/BMAL1-vermittelte, E-Box getriebene Genexpression. Ein favorisiertes Modell fundiert auf der Vermutung, dass eine durch PP4c induzierte Modulation des Phosphorylierungsstatus von BMAL1 zu einem stabilen, aber transktiptionsinaktiven BMAL1 und damit zu einer verstärkten Repression der Uhrgentranskription führt. / Circadian clocks are endogenous oscillators that drive daily rhythms in physiology, metabolism and behavior. On the molecular level the dynamics of circadian oscillations are regulated by a transcriptional-translational gene-regulatory network. Posttranslational modifications of clock proteins are essential for the precise timing of an about 24 hour-period. Among these modifications, protein phosphorylation plays an important role in regulating activity, stability and intracellular localization of clock proteins. Several kinases were characterized as regulators of the circadian clock. However, the function of protein phosphatases, which balance phosphorylation events, in the mammalian clock mechanism is less well understood. By using a systematic RNAi-based approach in oscillating human cells, this work aimed to study the impact of catalytic subunits of Serine/Threonin-phosphatases on normal circadian dynamics and the functional role of potential candidates in the posttranslational control of the mammalian molecular oscillator. This study demonstrates, that genetic depletion of the catalytic subunit of protein phosphatase 4 results independently from tissue and species in a significant shorter period, whereas overexpression of wildtype PP4c results in a severely reduced amplitude rhythm. Mechanistic experiments to uncover the functional relevance of PP4c in the regulation of the circadian clock showed, that PP4c plays a dual role: Firstly, PP4 is involved in the direct activation of the Bmal1-promotor via RRE elements. Secondly, PP4c is inhibiting the CLOCK/BMAL1-mediated gene expression. A favored model is based on the assumption, that PP4c-induced modulation of the phosphorylation status of BMAL1 leads to a more stable and transcriptional inactive protein and thereby to a repression of the transcription of clock genes.

In dieser Arbeit werden verschiedene Aspekte der Bedeutung von Fettsäuren für Daphnien betrachtet. Für physiologische, ernährungs- und reproduktionsbiologische Untersuchungen wurden die Fettsäuren aus Daphnien, Seston bzw. Algen gaschromatographisch analysiert. Mit Daphnien wurde in batch- und Durchflusskulturen experimentiert. Aufgrund ihrer heterogenen Zusammensetzung enthielten sämtliche Sestonproben eine Vielzahl omega-6- und omega-3-Fettsäuren. Die durch die Veränderungen der Phytoplanktonzusammensetzung der Talsperre Bautzen und des Großen Vätersees (GV) zu erwartende Veränderungen der Fettsäuremuster des Sestons wurden nur selten gefunden. Gewässerspezifische Unterschiede der Fettsäuremuster konnten nicht nachgewiesen werden. Das Fettsäuremuster von Daphnien wird sehr stark von dem der aufgenommenen Nahrung bestimmt. Allerdings wird mit der Nahrung aufgenommene DHA vollständig in kürzer kettige omega-3-Fettsäuren umgewandelt. Dies stellt möglicherweise eine Anpassung an die Prädation durch Fische dar. Das Wachstum der juvenilen Daphnien war im GV 1998 während der gesamten Untersuchungszeit aufgrund qualitativer Eigenschaften der Nahrung limitiert. Jedoch konnte keine Fettsäure und auch kein weiterer bekannter Nahrungsqualitätsfaktor für die Limitation verantwortlich gemacht werden. Ob die Fettsäuren alpha-Linolensäure und/oder EPA die Transfereffektivität von Stoffen und Energie zwischen Seston und Daphnien beeinflussen, erscheint fraglich. Die Nahrungskonzentration und die Umgebungstemperatur bestimmen die Gelegegröße von Daphnien. Die saisonalen Veränderungen der spezifischen Fettsäurekonzentration adulter Daphnien [µg/Ind.] konnten im GV am besten durch Veränderungen der Dauer der Eientwicklungszeit und damit der Wassertemperatur erklärt werden. Die Daphnien hatten fast ausschließlich bei niedrigen Temperaturen große Gelege. / This work considers variable aspects on the implication of fatty acids for daphnids. Fatty acids from seston, algae, and daphnids were analysed by gas chromatography for investigations in respect to nutrition, physiology, and reproduction. Experiments with daphnids were carried out in batch and flow-through cultures. Due to their heterogenic composition, lake seston contained always a vast number of omega-6- and omega-3-fatty acids. Despite great differences in phytoplankton composition of Bautzen Reservoir and Lake Großer Väter, lake specific patterns of sestonic fatty acid composition were not detected. The fatty acid composition of daphnids is strongly influenced by their food. Nevertheless, nutritional DHA was transformed completely to shorter chained omega-3-fatty acids. This transformation is possibly an adaption against fish predation. The growth of juvenile daphnids was limited by food quality in Lake Großer Väter 1998. Neither fatty acids nor another known factor of food quality were responsible for this limitation. According to the results it seems questionable that alpha-linolenic acid and/or EPA are essential for daphnids. Further, it was demonstrated that food concentration and temperature determine clutch size in daphnids. In Lake Großer Väter the seasonal changes of specific fatty acid concentration [µg per individual] of adult daphnids could be explained by changes in the duration of egg development time which is determined by temperature. Large clutches were found nearly exclusively at low temperatures.

DNS-Methylierung ist ein zentraler epigenetischer Prozess, der essentiell für die Differenzierung embryonaler Stammzellen ist, über dessen Funktion in somatischen Zellen allerdings wenig bekannt ist. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden zwei Mausmodelle analysiert, um die Rolle der durch DNS Methyltransferase 1 (DNMT1) hergestellten DNS-Methylierung im adulten hämatopoetischen System zu untersuchen. Als erstes wurde ein „Knockout“-Modell gewählt, um DNMT1 im hämatopoetischen System zu eliminieren. Des Weiteren wurde eine Mausmutante mit reduzierter DNMT1 Expression analysiert. Die vollständige Entfernung von DNMT1 aus dem hämatopoetischen System adulter Mäuse resultierte in Zytopenie und Anämie, gefolgt vom raschen Tod aller Tiere. Die Analyse des Knochenmarks dieser Mäuse zeigte einen fast vollständigen Verlust von hämatopoetischen Stamm- sowie Vorläuferzellen. Dies zeigt, dass die durch DNMT1 erzeugte DNS-Methylierung essentiell für Homöostase und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen ist. Mäuse mit reduzierter DNMT1 Expression hingegen sind lebensfähig und zeigen einen niedrigen Grad an DNS-Methylierung in verschiedensten Geweben, einschließlich des hämatopoetischen Systems. Durch eine detaillierte phänotypische und funktionelle Analyse der hämatopoetischen Stammzellen zeigte sich, dass der veränderte DNS-Methylierungsgrad ein vermindertes Selbsterneuerungspotenzial zur Folge hat. Interessanterweise fehlen DNMT1 hypomorphen Mäusen lymphoide Vorläuferzellen sowie reife lymphoide Zellen, wohingegen myeloide und erythroide Zellpopulationen keine Veränderungen zeigten. Genomweite Expressionsanalysen von Stammzellen sowie myeloiden Vorläuferzellen zeigten, dass hypomethylierte Stammzellen eine verfrühte myeloerythroide Entwicklung vollziehen und liefern damit eine Erklärung für den Verlust des Selbsterneurungspotenzials und der lymphoiden Entwicklung. Diese Resultate identifizieren eine bis hierhin unbekannte Funktion von spezifischen DNS-Methylierungsgraden für die Steuerung von funktionellen Programmen wie Selbsterneuerung und Differenzierung in hämatopoetischen Stammzellen. / DNA methylation is one of the major epigenetic mechanisms which is known to play a role in embryonic stem cell fate, but its function in somatic stem cells is not well understood. In this thesis two different genetic mouse models were chosen to address the role of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) controlled DNA methylation in adult hematopoiesis. First, a conditional knockout approach was used to delete DNMT1 in the adult hematopoietic system. Second, DNMT1 hypomorphic mice with reduced DNMT1 expression were analyzed. Complete DNMT1 deletion in hematopoietic cells led to severe cytopenia and anemia causing rapid lethality of all animals. Bone marrow analysis revealed an almost complete absence of hematopoietic stem and progenitor cells in DNMT1 ablated primary mice as well as in secondary chimeric mice. These results indicated that DNMT1 controlled maintenance of DNA methylation is indispensable for HSCs preservation and differentiation. In contrast to complete DNMT1 deletion, mice with hypomorphic DNMT1 expression were viable, but showed low methylation levels in multiple tissues including the hematopoietic system. Detailed phenotypical and functional analysis of the hypomethylated hematopoietic stem cell (HSCs) compartment revealed an impaired homeostasis and self-renewal capacity. Intriguingly, mutant animals had profoundly reduced lymphoid cell compartments, whereas myeloid and erythroid compartments were unchanged. Expression profiling of stem and myeloid progenitor cells unexpectedly demonstrated that reduced DNA methylation forces the HSC to adopt a myeloid lineage identity. These results, showing the inability of hypomethylated HSCs to maintain an undifferentiated state, provided an explanation for their disturbed capability to self-renew and produce lymphocytes. Taken together, these findings suggest that distinct levels of DNA methylation are required to control different functional programs such as self-renewal and alternative lineage choices in HSCs, thus uncovering a previously unrecognized function for DNMT1 activity.

KCNE-Hilfsuntereinheiten assoziieren mit Spannungs-abhängigen K+-Kanälen und verändern dadurch deren subzelluläre Lokalisation, Regulation sowie deren biophysikalische Eigenschaften. Bei heterologer Expression interagiert KCNE3 mit mehreren Poren-bildenden K+-Kanal-Hauptuntereinheiten, deren Ströme dadurch stark modifiziert werden. Aufgrund dieser in vitro-Experimente wurden verschiedenste Funktionen von KCNE3 in den verschiedenen Geweben, wie Gehirn, Herz, Muskel, Kolon und Niere, vermutet. Außerdem wurden Variationen im kcne3-Gen mit menschlichen Skelettmuskelpathologien in Verbindung gesetzt (Abbott et al. 2001). In der gegenwärtigen Literatur wird die physiologische Funktion von KCNE3 eher als komplex und heterogen dargestellt. Auch die direkte Beteiligung von KCNE3 an Krankheiten ist immer noch spekulativ. Zur Untersuchung der physiologischen Funktion von KCNE3 in vivo sowie der potentiellen Rolle bei Krankheiten generierten wir ein kcne3-/- Mausmodell. Die vorliegende Arbeit unterstützt die kritische Rolle der KCNQ1/KCNE3-Kanäle beim Salz- und Flüssigkeitstransport über intestinale und respiratorische Epithelien. Insbesondere fanden wir für die KCNQ1/KCNE3-Heteromere eine basolaterale Lokalisation in Darm- und Trachea-Epithelzellen, wo sie die transepitheliale Cl--Sekretion über basolaterales Recycling von K+-Ionen sowie über Erhöhung der elektrochemischen Triebkraft für apikalen Cl--Austritt fördern. Da weder Veränderungen in der KCNQ1-Expressionsmenge noch in dessen subzellulärer Lokalisation festgestellt wurden, ist die durch KCNE3 verursachte Modifikation der KCNQ1-Kanaleigenschaften essenziell für die hier beschriebene physiologische Rolle im Intestinal- und Trachealtransport. Ferner wird von unserer Arbeit die postulierte Funktion von KCNE3-Heteromeren im Skelettmuskel, Herz und zentralen Nervensystem nicht unterstützt und erweckt somit erhebliche Zweifel über den Beitrag von KCNE3 zu menschlichen Krankheiten, die mit diesen Organen in Verbindung stehen. / When overexpressed in heterologous systems, KCNE3 is able to interact with several pore-forming K+ channel alpha subunits greatly modifying their currents. Based on these in vitro evidences, KCNE3 has been proposed to serve different roles in multiple tissues, including brain, heart, muscle, colon and kidney. Additional reports have also linked sequence variations in the KCNE3 gene to cardiac and skeletal muscle pathologies in human. Based on the literature, the overall picture of KCNE3 physiological function is rather complex and heterogeneous, and its direct involvement in pathologies is still speculative and far from being conclusively proven. In order to study the physiological role of KCNE3 in vivo and to address its potential pathological implications, we generated kcne3-/- mice. The present analysis of kcne3-/- mice strongly supports a crucial role of KCNQ1/KCNE3 channels in salt- and fluid secretion across intestinal and airway epithelia. In particular, we found that KCNQ1/KCNE3 heteromers are present in basolateral membranes of intestinal and tracheal epithelial cells where they facilitate transepithelial Cl- secretion through basolateral recycling of K+ ions and by increasing the electrochemical driving force for apical Cl- exit. Because the abundance and subcellular localization of KCNQ1 was unchanged in kcne3-/- mice, the modification of biophysical properties of KCNQ1 by KCNE3 is essential for its role in intestinal and tracheal transport. In addition, our work does not support the postulated role of KCNE3 heteromers in skeletal muscle, heart and CNS physiology, and raises considerable doubts concerning its implication in human pathologies which affect these tissues.

Während seiner normalen Funktion generiert das Gehirn starke elektrische Signale, die technisch gemessen werden können. Das schon seit über einem Jahrhundert bekannte Phänomen ermöglicht es die Signalverarbeitung im Gehirn räumlich und zeitlich zu beobachten. Heute versteht man die zellulären Prozesse die zur Generierung der elektrischen Signale in einzelnen Neuronen führen. Jedoch rekrutieren die meisten neuronalen Ereignisse große Populationen von Zellen, dessen Aktivität zeitlich und räumlich koordiniert ist. Diese Koordinierung führt dazu, dass ihre elektrische Aktivität auch weit von den Quellen gemessen werden kann, sodass die Beobachtung des Gehirns auch nicht invasiv auf der Schädeloberfläche mittels dem sogenannten Elektroenzephalogramm (EEG) möglich ist. Der zeitliche Verlauf des Signals hängt nicht nur von den Eigenschaften einzelner Zellen ab sondern auch von ihrer Wechselwirkung mit anderen Neuronen, die oft komplex oder gar nicht bekannt ist. Diese Komplexität verhindert die Auswertung der gemessen Signale im Bezug auf die Anzahl von aktiven Neuronen, die Art der Antwort (Inhibition, Exzitation), die Synchronisationsstärke und den Einfluss anderer aktiver Prozesse (wie zum Beispiel: Lernen, Aufmerksamkeit usw.). In dieser Arbeit werden die Zusammenhänge zwischen diesen mikroskopischen Parametern (einzelne Neurone) und ihrer makroskopischen Wirkung (EEG) experimentell, datenanalytisch und theoretisch untersucht. / During its normal function the brain generates strong and measurable electric signals. This phenomenon, which has been known for more than a century, makes it possible to investigate the signal processing in the brain. Nowadays the cellular processes taking part in the generation of the electric signals are well understood. However, most of the neuronal events recruit large populations of cells, whose activities are coordinated spatially and temporally. This coordination allows for summation of activities generated by many neurons leading to extracellular electric signals that can be recorded non-invasively from the scalp by means of electroencephalography (EEG). The temporal structure of the EEG signal does not depend only on the properties of single neurons, but also on their interactions that may be very complex. The complexity hinders the evaluation of the recoded signal with respect to the number of active neurons, the type of response, the degree of synchronisation and the contribution of other processes (such as, learning and attention). In the thesis, the relations between the microscopic (single-neuron) and their macroscopic (EEG) properties will be investigated by means of experimental, data-analytic and theoretical approaches.

Eine wichtige Eigenschaft der Plasmamembran eukaryotischer Zellen ist die stabile transversale Asymmetrie der Phospholipide. Sie wird energieabhängig durch die Aktivität einer Aminophospholipidtranslokase aufrechterhalten und gilt als wichtige Voraussetzung für die Homöostasis der Zellen. Die Plasmamembran einiger Säugerzellen weist zudem laterale Lipiddomänen auf, denen eine wesentliche Bedeutung bei der Signaltransduktion zugeschrieben wird. Während der Genese durchlaufen die Membranen der Säugerspermien intensive Veränderungen. Um die Bedeutung der Phospholipidasymmetrie für die Funktion der Spermien zu untersuchen, wurde die Lokalisation und Dynamik von Phosphatidylserin in der Zell- und Akrosommembran von Eberspermien im Verlauf von Kapazitation und Akrosomreaktion betrachtet. Unter Ausnutzung der selektiven, kalziumabhängigen Bindung von AnnexinV an endogenes Phosphatidylserin konnte dessen Lokalisation an morphologisch differenzierten Zellen verfolgt werden. Eine Markierung der Zellen mit NBD-markierten Phospholipidanaloga lieferte zudem Informationen zur Dynamik der Phospholipide in der Plasmamembran. Die Differenzierung der Zellen erfolgte entweder am Durchflusszytometer oder fluoreszenz- bzw. elektronenmikroskopisch. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen sowohl auf eine transversale als auch laterale Ungleichverteilung der Lipide in der Zell- und Akrosommembran während der Genese der Spermien hin. Neben der stabilen transversalen Phospholipidasymmetrie der Plasmamembran konnte erstmals eine zytoplasmatische Lokalisation von Phosphatidylserin auf der äußeren Akrosommembran nachgewiesen werden. Somit akkumulieren die beiden einander zugewandten zytoplasmatischen Monolayer von Plasmamembran und äußerer Akrosommembran Phosphatidylserin. Kapazitationsbedingt kommt es zu einer engen Wechselwirkung zwischen Plasmamembran und äußerer Akrosommembran. Die Ausbildung lateraler Membrandomänen, in denen Phosphatidylserin zytoplasmatisch akkumuliert, wird als Voraussetzung für diese enge Assoziation diskutiert. Weitere Hinweise auf eine funktionelle Bedeutung lateraler Membrandomänen lieferten die Arbeiten zur Isolation Triton-unlöslicher Lipiddomänen aus der Plasmamembran von Forellenspermien. / One of the essential qualities of cell membranes in Eucaryotae is a stable transverse phospholipid asymmetry. It is regulated and maintained by ATP-dependent action of an aminophospholipid translocase and is a major prerequisite for cell homeostasis. The plasma membranes of several mammalian cells show moreover lateral lipid domains, which are imputed to play a significant role in signal transduction. The membranes of mammalian spermatozoa undergo significant changes during genesis. The localisation and dynamics of phosphatidylserine in the cell as well as acrosome membranes of boar sperm cells was studied during capacitation and acrosome reaction to assess the relevance of lipid asymmetry for sperm function. The localisation of endogenous phosphatidylserine in morphologically differentiated cells was followed using the selective calcium depending binding of annexinV. Information on the transverse dynamics of phospholipids in the plasma membrane was obtained by labelling the cells with a NBD-phospholipid analogues. The morphological status of the cells was assessed by flow cytometry, fluorescence and electron microscopy. The results of this study indicate both a transversal and lateral inhomogenous distribution of lipids in the cell membrane as well as in the outer acrosome membrane during sperm genesis. The plasma membrane of boar sperm shows a stable transversal lipid asymmetry characterised by an accumulation of phosphatidylserine in the cytoplasmic monolayer. Moreover a cytoplasmic localisation of phosphatidylserine on the outer acrosome membrane could be detected for the first time. Therefore the two facing cytoplasmic leaflets of the outer acrosome and cell membrane contain phosphatidylserine. Applying microscopy substantiated the hypothesis that there are close interactions between the cell membrane and the outer layer of the acrosome membrane because of capacitation. The cytoplasmic accumulation of phosphatidylserine in lateral lipid domains is probably essential for the strong association of plasma and outer acrosome membrane finally leading to local fusions of both membranes. An indication for the functional meaning of lateral membrane domains in sperm cells was futher deduced from the isolation of Triton-insoluble lipid domains from membranes of trout sperm cells.

Apoptoseresistenz ist einer der Gründe für ein Versagen von Chemotherapie bei vielen Krebserkrankungen, darunter das Burkitt Lymphom. Um die molekularen Mechanismen der Apoptoseresistenz aufzuklären, wurde die Apoptoseinduktion in 15 Burkitt-Lymphom-Zelllinien nach Behandlung mit den Spindelgiften Taxol (Paclitaxel), Nocodazol und Vincristin untersucht. Interessanterweise entwickelten Zellen, die sich als resistent gegenüber Taxol- und Nocodazol-induzierter Apoptose erwiesen, nach Behandlung eine Polyploidie (>4N DNA), was eine inverse Relation von Apoptose und Polyploidie aufzeigt. In den sensitiven Zelllinien war die Taxol- und Nocodazol-induzierte Apoptose von Caspase-Aktivierung, Bid-Spaltung und Herunterregulation von Mcl-1 begleitet. Im Gegensatz zu den sensitiven Zelllinien wiesen die meisten apoptoseresistenten Zellen einen Verlust von Bax und Bak auf und waren durch einen anhaltenden mitotischen Arrest mit Auftreten eines >4N DNA-Gehalts nach Behandlung charakterisiert. Um weitere Einblicke in den Mechanismus der Spindelgift-induzierten Apoptose zu erhalten, wurde die Rolle der mitotische Kinase PLK1 (polo-like kinase) näher untersucht. Eine dominant-negative PLK1-Mutante induziert Apoptose. Allerdings zeigte eine zusätzliche Behandlung mit Spindelgiften keinen synergistischen Effekt, was darauf schließen lässt, dass sowohl Inhibierung von PLK1 als auch Mikrotubuli-destabilisierende Agenzien den gleichen Stress-Signalweg aktivieren. Andererseits unterstützte Überexpression von Wildtyp-PLK1 in Taxol behandelten Zellen die Zellzyklus-Progression. Dies deutet auf eine Verbindung zwischen Zelltodresistenz und genetischer Instabilität (Aneuplodie) hin. Inhibition von Apoptose in sensitiven Zelllinien durch Caspase-Inhibierung förderte Polypoidie, welche die inverse Relation bestätigte. Medikamente, welche die Caspase-Aktivierung unabhängig von Bax und Bak induzieren, könnten eine weitere Möglichkeit zur Behandlung von resistenten Burkitt-Lymphomen darstellen. / Apoptosis resistance is the major cause of chemotherapy failure in most kinds of cancers, including Burkitt lymphomas (BL). To elucidate molecular mechanisms regulating the development of apoptosis resistance, a panel of 15 BL cell lines was investigated for apoptosis induction upon treatment with microtubule inhibitors taxol, nocodazole and vincristine. Significant differences were observed in the extent of apoptosis induction among BL cell lines examined. Interestingly, cell lines exhibiting resistance to taxol- or nocodazole-induced apoptosis, showed development of polyploidy (>4N) and vice versa, displaying an inverse relationship between apoptosis and polyploidy induction. Further, in sensitive cell lines taxol-induced apoptosis was accompanied by caspase activation, Bid cleavage and Mcl-1 down-regulation. In contrast, most apoptosis resistant cell lines exhibited a loss of Bax and Bak expression and showed prolonged mitotic arrest with >4N DNA content upon treatment. To gain mechanistic insights into microtubule inhibitor-induced cell death, the role of the mitotic kinase PLK1 was addressed. Dominant negative PLK1 mutant induced apoptosis, however, failed to show synergism in induction of apoptosis in combination with microtubule inhibitors. This indicates that PLK1 inhibition and spindle toxins might trigger a similar mitotic stress pathway. Conversely, overexpression of wildtype PLK1 promoted cell cycle progression in cells treated with taxol. Remarkably, inhibition of apoptosis in sensitive cell lines by caspase inhibition promoted polyploidy confirming the inverse relationship between apoptosis and polyploidization. Considering targets to induce Bax/Bak independent caspase activation would be of great importance to avoid undesirable events leading to chromosomal imbalances in treating resistant cancers.