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Reproductive isolation and chemical communication in grasshoppers

Finck, Jonas 10 August 2016 (has links)
In dieser Arbeit identifizierte und quantifizierte ich zunächst mehrere Isolationsbarrieren zwischen den nah verwandten Feldheuschreckenarten Chorthippus biguttulus und C. mollis (Kapitel 2). Meine Ergebnisse deuten auf eine wichtige Rolle von chemischen Signalen bei der reproduktiven Isolation zwischen diesen Arten hin. Durch die Kombination von verschiedenen Ansätzen untersuchte ich die ultimaten und proximaten Ursachen von chemischen Signalen auf das Fortpflanzungsverhalten. Im dritten Kapitel zeigte ich, dass die kutikulären Kohlenwasserstoff Profile (CHC) von C. biguttulus und C. mollis art- und geschlechtsspezifisch sind. Mit Hilfe eines RNA-seq Ansatzes untersuchte ich transkriptionelle Unterschiede in Kandidatengenen, die für die Divergenz in den CHC Profilen zwischen den Arten und den Geschlechtern verantwortlich sein könnten. Ein solches Gen zeigte artspezifische Expression und trägt möglicherweise zur reproduktiven Isolation zwischen den Arten bei. Darüber hinaus fand ich Expressionsunterschiede zwischen den Geschlechtern in vier Kandidatengenen. Zwei von diesen Genen zeigten eine erhöhte Expression in Männchen, was eventuell in Verbindung mit dem höheren Anteil von dimethyl-verzweigten Kohlenwasserstoffen in Männchen steht. Ich fand keine Hinweise für positive Selektion in den Kandidatengenen, was vermuten lässt, dass die Unterschiede in CHC Profilen durch transkriptionelle Unterschiede entstehen. In Kapitel 4 erforschte ich mit Hilfe eines Bioassays, wie sich verschiedene CHC Signale auf das Balzverhalten von Männchen auswirkten. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass der Genfluss zwischen C. biguttulus und C. mollis durch verschiedene Barrieren unterbrochen ist und dass diese Feldheuschrecken multimodale Kanäle im Paarungsverhalten verwenden. Zusätzlich lassen meine Ergebnisse eine zentrale Rolle von kutikulären Kohlenwasserstoffen in der reproduktiven Isolation beider Arten und in der Artbildung vermuten. / In this thesis, I first conducted several experiments to identify and quantify reproductive isolation at multiple stages in the life history of the closely related species Chorthippus biguttulus and C. mollis (chapter 2). My results indicated a crucial role of chemical cues in the maintenance of species isolation. I combined multiple approaches to examine the ultimate and proximate causes of chemical cues on reproductive behavior in these species. In chapter 3, I demonstrated that the cuticular hydrocarbon (CHC) profiles of C. biguttulus and C. mollis provide species- and sex-specific cues. I used a RNA-seq approach to examine transcriptional differences of candidate genes, which might cause the divergence in CHC profiles between species and sex. One candidate gene showed species-specific transcriptional differences and may contribute to reproductive isolation. In addition, four candidate genes were differentially expressed between the sexes. Two of them exhibited a strong male-biased expression, which may be linked to higher proportions of dimethyl-branched CHCs in males. I found no evidence for positive selection acting on these genes, suggesting that differences in CHC profiles are presumably mediated at transcriptional level. In chapter 4, I developed a bioassay to determine if female CHCs act as chemical cues that induce courtship behavior in males. In summary, this thesis demonstrated that various reproductive isolating mechanisms reduce the gene flow between C. biguttulus and C. mollis and that in these species the courtship display consists of multimodal signals. In addition, my results suggest a key role of chemical cues in reproductive isolation and speciation.
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Applying systems biology methods to identify putative drug targets in the metabolism of the malaria pathogen Plasmodium falciparum

Huthmacher, Carola 27 December 2010 (has links)
Trotz weltweiter Bemühungen, die Tropenkrankheit Malaria zurückzudrängen, erkranken jährlich bis zu einer halben Milliarde Menschen an Malaria mit der Folge von über einer Million Todesopfern. Da zur Zeit eine wirksame Impfung nicht in Sicht ist und sich Resistenzen gegen gängige Medikamente ausbreiten, werden dringend neue Antimalariamittel benötigt. Um die Suche nach neuen Angriffsorten für Medikamente zu unterstützen, untersucht die vorliegende Arbeit mit einem rechnergestützten Ansatz den Stoffwechsel von Plasmodium falciparum, dem tödlichsten Malaria-Erreger. Basierend auf einem aus dem aktuellen Forschungsstand rekonstruierten metabolischen Netzwerk des Parasiten werden metabolische Flüsse für die einzelnen Stadien des Lebenszyklus von P. falciparum berechnet. Dabei wird ein im Rahmen dieser Arbeit entwickelter Fluss-Bilanz-Analyse-Ansatz verwendet, der ausgehend von in den jeweiligen Entwicklungsstadien gemessenen Genexpressionsprofilen entsprechende Flussverteilungen ableitet. Für das so ermittelte stadienspezifische Flussgeschehen ergibt sich eine gute Übereinstimmung mit bekannten Austauschprozessen von Stoffen zwischen Parasit und infiziertem Erythrozyt. Knockout Simulationen, die mit Hilfe einer ähnlichen Vorhersagemethode durchgeführte werden, decken essentielle metabolische Reaktionen im Netzwerk auf. Fast 90% eines Sets von experimentell bestimmten essentiellen Enzymen wird wiedergefunden, wenn die Annahme getroffen wird, dass Nährstoffe nur begrenzt aus der Wirtszelle aufgenommen werden können. Die als essentiell vorhergesagten Enzyme stellen mögliche Angriffsorte für Medikamente dar. Anhand der Flussverteilungen, die für die einzelnen Entwicklungsstadien berechnet wurden, können diese potenziellen Targets nach Relevanz für Malaria Prophylaxe und Therapie sortiert werden, je nachdem, in welchem Stadium die Enzyme als aktiv vorhergesagt wurden. Dies bietet einen vielversprechenden Startpunkt für die Entwicklung von neuen Antimalariamitteln. / Despite enormous efforts to combat malaria, the disease still afflicts up to half a billion people each year, of which more than one million die. Currently no effective vaccine is within sight, and resistances to antimalarial drugs are wide-spread. Thus, new medicines against malaria are urgently needed. In order to aid the process of drug target detection, the present work carries out a computational analysis of the metabolism of Plasmodium falciparum, the deadliest malaria pathogen. A comprehensive compartmentalized metabolic network is assembled, which is able to reproduce metabolic processes known from the literature to occur in the parasite. On the basis of this network metabolic fluxes are predicted for the individual life cycle stages of P. falciparum. In this context, a flux balance approach is developed to obtain metabolic flux distributions that are consistent with gene expression profiles observed during the respective stages. The predictions are found to be in good accordance with experimentally determined metabolite exchanges between parasite and infected erythrocyte. Knockout simulations, which are conducted with a similar approach, reveal indispensable metabolic reactions within the parasite. These putative drug targets cover almost 90% of a set of experimentally confirmed essential enzymes if the assumption is made that nutrient uptake from the host cell is limited. A comparison demonstrates that the applied flux balance approach yields target predictions with higher specificity than the topology based choke-point analysis. The previously predicted stage-specific flux distributions allow to filter the obtained set of drug target candidates with respect to malaria prophylaxis, therapy or both, providing a promising starting point for further drug development.
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Pharmaceutically active compounds might bioaccumulate and cause effects on the free – floating macrophyte

Wrede, Jenny 23 September 2015 (has links)
Pharmazeutisch aktive Stoffe (PhACs) sind in allen anthropogen beeinflussten Oberflächengewässern ubiquitär (> 1 µg/l) nachzuweisen. Mehr als 80 verschiedene PhACs und ihre Metaboliten konnten in Oberflächengewässern vor. Es wurden weltweit verschiedene Substanzen in Flüssen detektiert, welche sich in verschiedene Wirkklassen unterscheiden lassen: Schmerzmittel, Lipidsenker, Antiepileptika, Beta-Blocker (ß-Blocker), Beta-Agonisten, Hormontherapeutika und Antibiotika. Über den Verbleib der PhACs, ihre Akkumulation und ihre biologische Wirksamkeit in Makrophyten, ist bisher wenig bekannt. Ein Ziel dieser Arbeit besteht darin, dem freischwimmenden Makrophyten Ceratophyllum demersum (C. demersum), erstmalig die biologische Wirksamkeit von PhACs darzustellen. In der hier vorgestellten Arbeit wurden folgende Ergebnisse zur Klärung der Fragestellung herausgearbeitet: - Ob und wieviel von den jeweiligen PhACs akkumuliert und von den Makrophyten umgewandelt werden können? IBU und LNG weisen eine Aufnahme in dem Nicht-Ziel-Organismus C. demersum auf. Bei CBZ und MET hingegen kommt es zur Bioakkumulation in der Makrophyte. Die Formation von hydroxy-IBU (OH-IBU) und O-desmethyl MET (O-des MET) können in den freischwimmenden Makrophyte nachgewiesen werden. - Welche Auswirkungen PhACs auf Chlorophyll als Stressmarker haben? Die Chlorophyll Pigmente sind nicht stark beeinflusst worden. CBZ, IBU, LNG und MET wiesen eine Tendenz zur Inhibition auf, wobei die größte Sensitivität bei MET auftrat: - Ob die Enzyme der Zelldetoxifikation auf die Anwesenheit von PhACs reagieren? Die aktuelle Studie demonstriert Vorkommen von physikalischen Veränderungen während der oxidativen Antwort bei den freischwimmenden Makrophyten durch CBZ-, IBU-, LNG- und MET-Expositionen. Das Enzym mGST wurde nicht beeinträchtigt bei der niedrigeren Konzentration der getesteten PhACs. / Pharmaceutically active compounds (PhACs) are detected, in all anthropogenic impacted surface waters (> 1µg/l). More than 80 different PhACs and their metabolites are detected in aquatic ecosystems. PhACs from human medicine or veterinary reach the environment primarily through sewage treatment plants (STP). The relevant substances are analgesic, lipid lowering agents, anti-epileptic drugs, beta-blockers, hormone therapeutics and antibiotics. Therefore, the PhACs which were chosen to be analysed were Carbamazepine (CBZ), Ibuprofen (IBU), Levonorgestrel (LNG) and Metoprolol (MET). In comparison to the amount of available analytical data, little is known about their accumulation and the biologically potency in the aquatic environment. The aim of the study was to assess whether PhACs might cause effects on the aquatic non-target organism, the free-floating macrophyt Ceratophyllum demersum. The following hypotheses were used for clarification: - If and how much of the chosen PhACs are accumulated and metabolized? IBU and LNG were shown to be taken up by C. demersum. CBZ and MET demonstrated incidences of bioaccumulation in C. demersum. The formation of first step metabolites (OH-IBU and O-desmethyl MET) were shown in the submerged macrophyte species C. demersum. - Which effects have PhACs on chlorophylle pigments? In C. demersum, chlorophyll pigments were not significantly affected. The results indicated that PhACs (CBZ, IBU, LNG, and MET) can influence chlorophyll pigments, whereby C. demersum showed a higher sensitivity to MET - If cell detoxification enzymes of C. demersum reacts in response to PhACs? The study demonstrated the occurrence of physiological changes in the oxidative stress response of C. demersum due to CBZ, IBU, LNG, and MET exposure. The enzyme mGST was not strongly affected during the exposure with the low concentrations of the PhACs used.
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Der Einfluss der konstitutiven NF-κB Aktivität auf die aberrante AP-1 Aktivität beim Hodgkin-Lymphom

Ebert, Jan 25 November 2015 (has links)
Die Zellen des Hodgkin-Lymphoms sind, neben einer permanenten Aktivierung des NF-kB Signalweges, durch eine konstitutive AP-1 Aktivität gekennzeichnet. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Analyse der aberranten AP-1 Aktivität in Zellen des Hodgkin-Lymphoms. Von besonderem Interesse ist in diesem Zusammenhang der JUN Promotor, da c-Jun unter anderem die Fähigkeit besitzt seinen eigenen Promotor positiv zu regulieren (Autoregulation). Im Rahmen dieser Arbeit wurden Faktoren, die mit dem JUN Promotor in Zellen des Hodgkin-Lymphoms assoziiert sind, über verschiedene chromatographische Reinigungsschritte angereichert, mittels Massenspektrometrie identifiziert und hinsichtlich ihres Einflusses auf die c-Jun Expression analysiert. Dabei wurden die zwei Faktoren ATF-3, aus der Familie der AP-1 Proteine, und p52, aus der NF-kB Familie, hinsichtlich ihres Einflusses auf die Überexpression von c-Jun in Hodgkinzellen genauer untersucht. Die hier aufgeführten Ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis der Regulation der konstitutiven AP-1 Aktivität in den Hodgkinzellen bei. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei Faktoren identifiziert werden, die maßgeblich an der Regulation der Expression von c-Jun in Hodgkinzellen beteiligt sind. Eine besondere Rolle kommt dabei dem Transkriptionsfaktor p52 zu, da dieser unter anderem auch die Expression anderer Mitglieder der AP-1 Familie reguliert. Ein weiterer Befund dieser Arbeit, dass p50 und p52 die zentralen Komponenten der konstitutiven NF-kB Aktivität sind, rückt p52 in das Zentrum zukünftiger Forschung. Die Befunde dieser Arbeit belegen, dass die aberrante Aktivierung von AP-1 im Hodgkin-Lymphom nicht auf ein einzelnes Ereignis in der Zelle zurückzuführen ist, sondern das Ergebnis eines komplexen Zusammenspiels vieler Faktoren ist. / The cells of Hodgkin''s lymphoma are characterized by a permanent activation of the NF-kB signaling pathway and a constitutive AP-1 activation. The present study focused on the analysis of aberrant AP-1 activity in cells of Hodgkin''s lymphoma. Of particular interest in this context is the JUN promoter, since c-Jun has the ability to regulate its own promoter (autoregulation). In this work different JUN promoter associated factors were enriched through various chromatographic purification steps, identified by Mass spectrometry and analyzed in terms of its influence on the expression of c-Jun. The focus was on specific factors in cells of Hodgkin''s lymphoma. The two factors ATF-3 and p52, were analyzed in terms of their influence on the overexpression of c-Jun in cells of Hodgkin''s lymphoma. Another interesting finding of this study is, p50 and p52 are central components of the constitutive NF-kB activity. This puts p52 in the center of future research. The results presented here contribute to a better understanding of the regulation of the constitutive AP-1 activity in the Hodgkin cells. In this work two Factors (ATF3 and p52) could be identified, which are are involved in the regulation of the expression of c-Jun in Hodgkin cells. A special role is played by the transcription factor p52, which also regulates the expression of other members of the AP-1 family. The findings of this study also show that the aberrant activation of AP-1 in Hodgkin''s lymphoma is not due to a single event in the cell. It is rather a result of a complex interplay of many factors.
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Limnologische Charakterisierung ausgewählter Ackerhohlformen (Sölle) des nordostdeutschen Jungmoränengebietes als Grundlage von Schutzmaßnahmen

Haacke, Heike 28 July 1999 (has links)
Limnologische Charakterisierung ausgewählter Ackerhohlformen (Sölle) des nordostdeutschen Jungmoränengebietes als Grundlage von Schutzmaßnahmen* *) gefördert durch die Deutsche Bundesstiftung Umwelt und die FAZIT-Stiftung, Frankfurt a.M. 160 S.: 64 Abbn., 24 Tab., 3 gezeichnete Tafeln, 4 mikroskopische Tafeln Humboldt-Universität zu Berlin Institut für Biologie AG Ökologie Die Untersuchungen konzentrierten sich auf das Plankton von Söllen der Jungmorä nenlandschaft Nordostdeutschlands. Ziel war es, die qualitative und quantitative Phyto- und Zooplanktonstruktur verschiedener Sölle unter dem Gesichtspunkt der nterschiedlichen Landnutzung, des Wasserhaushaltes und des Stoffeintrages in zwei Untersuchungsgebieten zu erfassen, mit einem weitgehend ursprünglichen Forstsoll zu vergleichen und daraus Schlußfolgerungen für den Erhalt und den Schutz dieser Kleingewässer abzuleiten. Es wurden sieben repräsentative Sölle monatlich über drei Vegetationsperioden (1994-1997) untersucht. Neben dem Artenspektrum und dem Abun danzwechsel des Phyto- und Zooplanktons erfolgte eine Erfassung des Chlorophyll a -Gehaltes der Mikroalgenzellen, der hydrochemischen und physikalischen Grundparameter und der Pegelstände des Sollwassers. Trotz der großen Individualität der Untersuchungsgewässer konnten aus den Erg ebnissen die Sölle in drei Gruppen statistisch signifikant zusammengefaßt werden. Für deren Abgrenzung sind die Nährstoffverhältnisse (N oder P-Überschüsse, Nitrifikationsgrad), die Sauerstoffsättigungswerte und das Artenspektrum des Phyto- und Zooplanktons bedeutsam. Hohe Leitfähigkeit des Wassers besonders in den Söllen des Gebietes um Lietzen-Döbberin wird durch hohe Sulfat- und Chloridgehalte bedingt. Im Vergleich zu den Seen sind die Chlorophyll a -Konzentrationen als Biomasseäquivalent für die Mikroalgen in Relation zu den Phosphatgehalten auffallend gering. Aus den Ergebnissen lassen sich Maßnahmen zur Erhaltung und dem Schutz der Sölle ableiten. Es wird die konsequente Verminderung der externen Nährstoffeinträge durch die Schaffung und/ oder Pflege von Pufferzonen sowie gegebenenfalls die Umwidmung des Einzugsgebietes in Dauergrünland empfohlen. Weitere Maßnahmen, die auf die Reduzierung der internen Nährstoffreserven zielen, sind erst nach zusätzlichen Untersuchungen insbesondere zum Phosphorbindungsvermögen der Sedimente für die Sölle ableitbar. / Limnological characterization of selected ponded depressions of the north German young moraine site as a basis for conservation* *) sponsored by the Deutsche Bundesstiftung Umwelt and the FAZIT-Stiftung, Frankfurt a.M. 160 S.: 64 Abbn., 24 Tab., 3 graphic Tables, 4 microscope tables Humboldt-Universität zu Berlin Institut für Biologie AG Ökologie The main geographical feature of the ground and terminal moraines of northern Germany are the numerous small depressions, many of which are water-filled. They represent a typical geographical element of this region and in the German language are usually referred to as "Sölle" (Singular = "Soll"). These small bodies of water were created either glacially through the melting of dead-ice pieces (natural depressions or dead-ice depressions) or later (circa 12th or 13th century) in the course of the clearing of large tracts of forested land through the partial and permanent damming of depressions (pseudo depressions). The study concentrated on the plankton levels of ponded depressions in the recent moraines of northern Germany. The goal of the study was to record the qualitative and quantitative phytoplankton and zooplankton make-up of several different ponded depressions with consideration of the various land uses, management of water, and introduction of nutrients in two research areas and to compare these findings with a mostly unaltered forested ponded depression (ponded depression in a forested area) for the purpose of deriving conclusions about the preservation and protection of these small water ways. Seven representative ponded depressions were examined monthly over the span of three vegetation periods (1994-1997). In addition to the variety of vegetational species and the variation in amounts of phytoplankton and zooplankton, data about the amount of chlorophyll a in the micro algae cells, the hydro-chemical and physical ground parameters, and the water level of the ponds was recorded. In spite of the considerable uniqueness of each of the ponds under examination, the results of the study allowed for the classification of the ponded depressions into three statistically significant groupings.The proportions of nutrients (a surplus of N or P or the level of nitrification), the oxygen saturation values, and the vegetational spectrum of phytoplankton and zooplankton proved meaningful for the differentiation of the groupings. High conductivity of the water, especially in the ponds in the area around Lietzen-Döbberin, is caused by high levels of sulfate and chloride. In comparison to lakes, the concen trations of Chlorophyll a as a biomass equivalent for the micro algae are noticeably smaller in relation to the phosphate levels. The results of the research suggest measures for the preservation and protection of the ponded depressions. The intentional reduction of external nutrients through the creation of and/or care for buffer zones and, if necessary, the redesignation of areas zoned for development into permanent nature conservation zones is recommended. Further preservation measures, aimed at reducing the reserves of internal nutrients, will only be deduced after further study of the ponded depressions, especially in relation to the ability of the sediment to absorb phosphors.
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Arabidopsis root hair development in adaptation to iron and phosphate supply

Mueller, Margarete 28 June 2007 (has links)
Pflanzenwurzeln reagieren auf Phosphat- oder Eisenmangel mit einer vermehrten Wurzelhaarbildung, was eine Vergrößerung der absorptiven Oberfläche bewirkt. Die erhöhte Anzahl an Wurzelhaaren wird dabei auf verschiedene Weise gebildet. Phosphat-defiziente Arabidopsis-Pflanzen erhöhen die Anzahl an Wurzelhaarzellen, während sich unter Eisenmangel verzweigte Wurzelhaare entwickeln. Die Fe- und P-Homöostase wird durch systemische und lokale Signalwege reguliert. Der Einfluss dieser Signale auf die Fe- bzw. Psensitive Wurzelhaarentwicklung wurde mithilfe von split-root-Experimenten untersucht, die mit einem systemischen Mangel- oder Suffizienzsignal kombiniert wurden. Die Verzweigung der Wurzelhaare Fe-defizienter Pflanzen wurde durch ein dominantes Suffizienzsignal reprimiert, unabhängig von seiner lokalen oder systemischen Herkunft. Die Erhöhung der Wurzelhaarzahl bei P-Mangelpflanzen wurde durch ein dominantes Defizienzsignal induziert. Um herauszufinden, welches Entwicklungsstadium von dem jeweiligen Nährstoff beeinflusst wird, wurden Mutanten mit Defekten in frühen und späten Wurzelhaarentwicklungsstadien untersucht. Mutanten mit beeiträchtigter Wurzelhaar-Spezifikation wichen in ihrer Wurzelhaarzahl und –lokalisation vom Wildtyp ab, zeigten aber eine Fe- oder P-sensitive Veränderung. Die Gene aus frühen Entwicklungsstadien sind demnach essentiell für die Reaktion, sind aber nicht das direkte Ziel der Mangelsignale. Frühe Zelleigenschaften in der meristematischen Region waren durch die Eisen- oder Phosphatverfügbarkeit nicht verändert, was darauf hindeutet, dass die Wurzelhaarbildung erst in einem späteren Entwicklungsstadium durch die Nährstoffe beeinflusst wird. Mutanten mit Defekten in späteren Entwicklungsstadien zeigten kurze oder verformte Wurzelhaare unabhängig von der Nährstoffversorgung. Das Fe- oder P-Signal mündet also vor der Wirkung dieser Komponenten in die Wurzelhaarbildung ein. Das heisst, nachdem die korrekte Wurzelhaar-Position und -Anzahl in Anpassung an das Fe- oder P-Angebot festgelegt wurde, werden die Wurzelhaare unter allen Wachstumsbedingungen von einer gemeinsamen Maschinerie elongiert. Zur Identifikation potentiell neuer Gene, die die Wurzelhaarbildung in Anpassung an P-Mangel regulieren, wurden sechs Mutanten isoliert, die keine Wurzelhaare bei P-Mangel bilden, aber nach dem Transfer auf P-suffizientes Medium nicht beeinträchtigt waren. Eine dieser Mutanten, per2, wurde phänotypisch und genetisch charakterisiert. Neben der veränderten Wurzelhaarbildung zeigte per2 auch eine konstitutiv erhöhte Lateralwurzelbildung und eine erhöhte Anthozyan-Akkumulation bei P-Mangel. Laut epistatischen Analysen gehört die per2 Mutante zu einem Signalweg, der unabhängig von frühen Zellspezifikationsgenen wirkt. Der per2-Locus wurde innerhalb eines 87,5 kpb großen Abschnittes auf dem oberen Arm von Chromosom 3 kartiert. Mutanten die einen per2-ähnlichen Phänotyp zeigen, wurden bisher nicht beschrieben. Daher handelt es sich bei PER2 möglicherweise um ein neues Gen, das die Wurzelhaarbildung bei Phosphatmangel reguliert und weitere P-Mangelreaktionen beeinflusst. / Limitation of immobile nutrients, such as iron (Fe) and phosphate (P), induces the development of additional root hairs that lead to an increase of the absorptive surface of the root. The increased root hair frequency of Fe- and P-deficient Arabidopsis was realized by different strategies. Phosphate-deficient plants increased the number of root hairs while in Festarved plants root hairs were branched. The Fe and P starvation responses in plants are thought to be regulated by a systemic signaling mechanism that communicates the nutrient status of the shoot to the root and by a local signaling mechanism that perceives the Fe or P availability in the soil. The influence of local and systemic signals on the respective root hair phenotype was investigated in split-root experiments. This treatment was combined with either a nutrient-sufficient or -deficient shoot. The root hair branching typical of Fe-deficient plants only occured in the presence of both a local and a systemic Fe-deficiency signal. As a consequence, an Fe sufficiency signal acted dominantly to any deficiency signal, independent of its origin. The increased number of root hairs in P-deficient plants, conversely, was activated through either a local or a systemic P deficiency signal. Thus, the P deficiency signal acted dominantly to any sufficiency signal. To determine, which stage of root hair development was influenced by iron and phosphate, mutants with defects in different stages of root hair development were investigated for their root hair phenotype. Mutants affected in the early stages of root hair development, such as specification, displayed marked changes in the number and localization of root hairs. However, the nutritional signal was perceived and translated in this group of mutants. This indicates that the specification genes are involved in the nutrient-sensitive root hair formation, but may not be the direct targets. Early cell characteristics of root hairs in the late meristematic region of the root, like the expression of marker genes, were unaltered in plants adapted to Fe or P deficiency. This suggested the nutritional signal modulates root hair development after these characteristics have been established. Mutants with defects in the later stages of root hair development, such as root hair elongation, showed short or deformed root hairs in the proper position and frequency and were, thus, impaired independent of the Fe or P supply. Thus, the nutritional signal may enter the root hair developmental pathway around the stage of root hair initiation and bulge formation. Finally, six mutants were screened that did not form root hairs under P deficiency but developed normal, when the plants were transferred to P-sufficient medium. One of these mutants, per2 (phosphate deficiency root hair defective2), was characterized phenotypically and genetically. In addition to the impaired root hair growth, the per2 mutant displayed a constitutively high lateral root number and accumulated an increased amount of anthocyanins under P starvation. Epistatic analysis revealed that per2 action is independent of early cell specification genes. The per2 mutation was mapped to a 87.6 kbp region on the upper arm of chromosome 3 containing 19 genes. The per2 phenotype has not been described before. Thus, PER2 is a potential new gene involved in root hair development under phosphate deficiency.
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Mechanism and efficacy of a GD2-specific immunotherapy using NK cells

Seidel, Diana 27 February 2015 (has links)
Das Neuroblastom (NB) ist ein solider, extrakranieller Tumor neuroektodermalen Ursprungs, der sich im Kleinkindalter manifestiert. Ein etabliertes Zielantigen für die passive Immuntherapie beim NB ist das Disialogangliosid GD2. Aufgrund der geringen oder fehlenden Expression von MHC Klasse I Molekülen sowie der Tatsache, dass die Lyse von NB-Zellen durch verschiedene Mechanismen der natürlichen Zytotoxizität von NK-Zellen vermittelt werden kann, stellt eine auf NK-Zellen basierende Therapie einen vielversprechenden Ansatz zur Behandlung dieser Erkrankung dar. Auf dieser Grundlage wurde eine NK-Zelllinie generiert, die einen GD2-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimiert (NK-92-scFv(ch14.18)-zeta). Die Hauptbestandteile dieses CARs sind ein Einzelkettenantikörper, welcher die variablen Regionen des GD2-spezifischen Antikörpers ch14.18 enthält, und die CD3ζ-Kette als signaltransduzierende Komponente. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass NK-92-scFv(ch14.18)-zeta in der Lage sind, auch Chemotherapie-resistente GD2-positive NB-Zelllinien effektiv abzutöten und dass dabei die Interaktion des CARs mit GD2 den Hauptmechanismus darstellt. Die anti-tumorale Wirkung von NK-92-scFv(ch14.18)-zeta in vivo wurde in einem Chemotherapie-resistenten GD2-positiven Xenograft-Mausmodell gezeigt. Die wiederholte Applikation von NK-92-scFv(ch14.18)-zeta in Kombination mit IL-2 resultierte in einem signifikant verlangsamten Tumorwachstum und einem verbesserten Überleben. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen, dass GD2-spezifische NK-92 das Potential für eine zukünftige klinische Anwendung besitzen. Demnach stellt der Einsatz einer solchen GD2-spezifischen NK-Zelllinie, die unter GMP-Bedingungen expandiert werden kann und zu jeder Zeit in einer standardisierten Qualität verfügbar wäre, eine vielversprechende Alternative zur Behandlung von Hochrisikopatienten dar, deren Erkrankung nicht mehr auf die Standardtherapie anspricht. / Neuroblastoma (NB) is a solid extracranial childhood malignancy of neuroectodermal origin. The Disialoganglioside GD2 is an established antigen for passive immunotherapy of NB. Cellular therapy of NB with natural killer (NK) cells is especially appealing because MHC class I expression is absent or low in most NB, rendering this tumor sensitive to NK cell recognition. Additionally, natural cytotoxicity of NK cells, mediated by interaction of activating NK cell receptors and their respective ligands on tumor cells, has been shown to play a role in lysis of NB cells. It is therefore tempting to assume that a combination of passive immunotherapy with GD2-specific antibodies and adoptive transfer of NK effector cells would result in an improved NB therapy. To achieve this goal an NK cell line expressing a GD2-specific chimeric antigen receptor (CAR) was engineered: NK-92-scFv(ch14.18)-zeta. This CAR consists of a GD2-specific scFv-fragment, which was generated from ch14.18, and the CD3ζ-chain as intracellular signal-transducing domain. Within this thesis, GD2-specificity of NK-92-scFv(ch14.18)-zeta as well as efficacy towards GD2-expressing NB cell lines, including relapse cell lines that exhibit partial or multidrug resistance were demonstrated. Blocking the interaction between the CAR and GD2 resulted in almost complete abrogation of NK-92-scFv(ch14.18)-zeta-mediated lysis of GD2-positive NB cell lines in vitro, indicating that this interaction is the main mechanism of activation of NK-92-scFv(ch14.18)-zeta. Importantly, repeated application of NK-92-scFv(ch14.18)-zeta in combination with IL-2 significantly decreased tumor growth and prolonged survival of mice in an aggressively growing drug-resistant xenograft NB mouse model. These findings suggest that GD2-specific NK-92 has potential for a future clinical application as NB-specific effector cells that would be ready on demand in a standardized quality.
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Konstruktion und Charakterisierung einer lichtaktivierten Phosphodiesterase

Gasser, Carlos Fernando 03 December 2015 (has links)
Genetisch kodierte Photorezeptoren in Modellorganismen begründen die Optogenetik. Sie ermöglicht die nicht-invasive, reversible und räumlich-zeitlich präzise Perturbation von zellulären und physiologischen Signalprozessen durch Licht. Natürliche photoaktivierte Adenylylzyklasen (PACs) steigern die intrazelluläre Konzentration des Botenstoffs zyklischen Adenosinmonophosphats (cAMP) durch Blaulicht. Damit erlauben sie die optogenetische Analyse von cAMP-abhängigen Signalwegen. Diese Arbeit komplementiert PACs durch die synthetische rotlichtaktivierte Phosphodiesterase LAPD zur Degradation von cAMP und zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP). LAPD ist eine Chimäre aus dem photosensorischen Modul von Deinococcus radiodurans Bakteriophytochrom (DrBPhy) und der Effektordomäne der cAMP/cGMP-spezifischen H. sapiens Phosphodiesterase 2A (HsPDE2A). Die Fusionsstelle wurde von den helikalen Linkern zwischen Sensor- und Effektormodulen durch strukturelle Überlagerung abgeleitet. LAPD inkorporierte den Chromophor Biliverdin (BV) nach Expression in E. coli und Reinigung vollständig und entsprach spektral und photochemisch dem Wildtyp-DrBPhy. Durch Bestrahlung mit Rot- und Fernrotlicht (R bzw. FR) wurde LAPD in die metastabilen photochemischen Zustände Pfr (fernrot) bzw. Pr (rot) umgewandelt. Vollständig aktivierte LAPD katalysierte die Hydrolyse von cGMP und cAMP in derselben Größenordnung wie Wildtyp-HsPDE2A. LAPD degradierte cGMP und cAMP bei 6- bzw. 4-facher Steigerung von vmax unter R im Vergleich zu dunkeladaptiertem Enzym. Die Aktivität von R-adaptierter LAPD wurde durch FR reduziert. Die enzymatische Aktivität und Lichtregulation von LAPD-Linkervarianten waren abhängig von der Linkerlänge. LAPD degradierte lichtabhängig cGMP in einer PDE-Reporterzelle. Dabei genügte die endogene BV-Konzentration der Säugerzelle zur Sättigung des Lichteffekts. / Genetically encoded photoreceptors in model organisms establish optogenetics. It enables non-invasive, reversible, and spatio-temporally precise perturbation of cellular and physiological signalling by light. Natural photoactivated adenylate cyclases (PACs) increase the intracellular concentration of the second messenger cyclic adenosine monophosphate (cAMP) under blue light. Hence, PACs allow the optogenetic analysis of cAMP-dependent signalling. This work complements PACs with the synthetic red-light-activated phosphodiesterase LAPD for degradation of cAMP and cyclic guanosine monophosphate (cGMP). LAPD is a chimera made up of the photosensory module of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome (DrBPhy) and the effector domain of cAMP/cGMP-specific H. sapiens Phosphodiesterase 2A (HsPDE2A). The fusion site was derived from the helical linkers between sensor and effector modules via structural superposition. LAPD incorporated the chromophor biliverdin (BV) after expression in E. coli and purification quantitatively, and spectrally and photochemically resembled the wildtype DrBPhy. Upon irradiation with red and far-red light (R and FR, resp.), LAPD was converted to the metastable photochemical states Pfr (far-red) and Pr (red), respectively. Fully activated LAPD catalized the hydrolysis of cGMP and cAMP with rates similar to wildtype HsPDE2A. LAPD degraded cGMP and cAMP with 6- and 4-fold increase of vmax under R, respectively, as compared to the dark state. The activity of R-adapted LAPD was reduced upon irradiation with FR. Enzymatic activity and light regulation of LAPD linker variants depended on the linker length. LAPD light-dependently degraded cGMP in a PDE reporter cell line. Endogenous BV concentrations were sufficient to saturate the light effect in the mammalian cell, which enables a true optogenetic approach.
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Optimierung nukleärer Promotoren in Chlamydomonas reinhardtii

Kirchmayr, Anna 29 December 2015 (has links)
Die einzellige Grünalge C. reinhardtii dient als Modellorganismus und ist aufgrund des GRAS-Status, des schnellen, kostengünstigen Wachstums und der Möglichkeit posttranslationaler Modifikationen im Kerngenom, als Expressionssystem für beispielsweise orale Impfstoffe sehr interessant. Herausforderungen sind die im Vergleich zu konventionell verwendeten Expressionssystemen sehr geringen Expressionsraten im Kerngenom. Daher sollten in dieser Arbeit neuartige, teils induzierbare, Promotorkonstrukte verwendet und mittels Luciferase-Reporter auf ihre Expressionssteigerung hin getestet werden. Zunächst wurden ausgewählte Promotoren des Chlorella-Virus-1 (PBCV-1) gewählt, diese führten allerdings zu keiner Expression. Außerdem wurden synthetische, aneinandergereihte Hitzeschockelemente mit dem endogenen RBCS2-Promotor fusioniert und die Expressionsraten analysiert. Dabei ergab sich bei der Kombination aus dem synthetischen Hitzeschockelement in achtfacher Wiederholung (HSE8x) mit RBCS2 nach der Hitzeinduktion eine Steigerung der Expressionsrate um das bis zu dreifache. Die Basalexpression war hierbei bei HSE1x-RBCS2 am höchsten und erreichte Expressionslevels, welche um das fünffache höher lagen als die Positivkontrolle HSP70A-RBCS2. Mittels Chromatinimmunopräzipitation mit dem Antikörper gegen HSF1 konnte gezeigt werden, dass eine Bindung an das synthetische Hitzeschockelement vorliegt und deshalb die Expression über die konventionelle Hitzeschockantwort in Chlamydomonas reinhardtii funktioniert. Im Gegensatz zur Luciferase benötigen Fluoreszenzproteine als Reporter kein Substrat. Infolge dieses Vorteils und der Möglichkeiten der FACS-Analyse und Fluoreszenzmikroskopie wurde tagRFP als neuer Reporter in C. reinhardtii etabliert. Die Erhöhung der Expressionsrate durch neue Promotorkombinationen und die Anwendung von tagRFP als neuen Fluoreszenzreporter bedeuten wichtige Schritte in der Etablierung von C.reinhardtii als Expressionssystem für Produkte in der Biotechnologie. / The unicellular green alga C.reinhardtii which is used as a model organism could be an interesting expression system for oral vaccines. This is because the alga is generally regarded as safe, it shows fast growth rates and culturing is cheap. Furthermore it offers the possibility of posttranslational modifications. Challenges lie in the low expression rates in the nuclear genome when compared to other expression systems. Therefore the first step in this work was to test whether selected Chlorella virus PBCV-1 promoters, do lead to enhanced expression rates, but there was no detectable expression. Furthermore synthetic repeats of heat shock elements were used in combination with the endogenous RBCS2-promoter and analysed for expression rates via reporter measurements. The combination of synthetic heat shock elements in eightfold repeats in combination with RBCS2 enhanced expression rates of luciferase after heat shock up to threefold in comparison with the up to now strongest known promoter combination HSP70A-RBCS2. Basalexpression turned out to be best for the HSE1x-RBCS2 promoter and reached expression levels fivefold higher compared to HSP70A-RBCS2. To examine if the artificial heat shock elements (HSEs) are bound by the heat shock factor 1 in C. reinhardtii a ChIP assay with HSE8x-RBCS2 and the antibody of HSF1 of C. reinhardtii was done. It could be shown that HSF1 binds HSEs and therefore one can explain the heat shock inducibility of HSEs is regulated via the conserved heat shock response. In contrast to luciferase fluorescence reporters do not need substrate. Because of this advantage and the possibility of FACS analyses and fluorescence microscopy tagRFP was established as new reporter in C.reinhardtii. Enhancement of expression rates through new constitutive and inducible promoter combinations and the possible use of tagRFP as new fluorescence reporter are significant steps in establishing C.reinhardtii as expression system for products in biotechnology.
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Effect of plant-parasitic nematodes on rhizosphere interactions in oaks

Maboreke, Hazel Ruvimbo 16 May 2017 (has links)
Diese Arbeit untersucht die Reaktion der Stieleiche auf pflanzenparasitären Nematoden mittels RNA-Sequenzierung und Analyse von stabilen Isotopen und Fettsäuren. Einblicke in Rhizosphäreninteraktionen wurden über mutualistische Partner (Ektomykorrhizapilze, Rhizosphärenhelferbakterien), fungivore Collembolen und multitrophische Gemeinschaften gewonnen. Die Struktur und Biomasse der Mikroorganismen sowie die Fitness der Eichen wurden erfasst. Die Effekte wurzelfressender Nematoden auf die Eiche wurden durch das endogene rhythmische Wachstum des Baumes reguliert. Die Nematoden lösten eine stärkere Reaktion während des Sprosswachstumsschubs aus, u.a. Aktivierung von Abwehrmechanismen und Hemmung der Photosynthese, wohingegen beim Wurzelwachstumsschub pathogen bezogene Signale unterdrückt waren. Die Anwesenheit des Pilzsymbionten schwächte die Pflanzenabwehr und verbesserte die Stresstoleranz, was indirekt das Wachstum der Mikroorganismen förderte. Die Helferbakterien begünstigten den Mykorrhizapilz, was wiederum das Pflanzenwachstum stimulierte und dem negativen Effekt der Nematoden entgegenwirkte. Parasitäre Nematoden und fungivore Collembolen beeinflussten die Verteilung des pflanzlichen Kohlenstoffes unabhängig voneinander; Nematoden verringerten und Collembolen verbesserten die Allokation von Photoassimilaten in Gram-postiven Bakterien. Zudem war steigende trophische Diversität der Bodenfauna in der Rhizosphäre entscheidend für die Balance innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft, welche das Pflanzenwachstum fördert. Diese Arbeit stellt die Bedeutung der endogenen Ressourcenzuteilung von Pflanzen für unterirdische biotische Wechselbeziehungen heraus. Diese Pflanzenstrategie als bedeutender Faktor für Rhizosphärenprozesse sollte in zukünftige Studien Berücksichtigung finden. Die Einbeziehung der Hauptakteure in der Rhizosphäre ermöglicht zudem ein realistischeres Bild von Nematoden-Pflanzen Interaktionen und damit ein effektiveres Management. / This thesis investigated the response of Pedunculate oak to the plant-parasitic nematode Pratylenchus penetrans, using RNA-sequencing, stable isotope labelling and fatty acid analyses. Insight into rhizosphere interactions was gained by employing beneficial biotic partners (ectomycorrhizal fungi, rhizosphere helper bacteria), fungal grazers (Collembola) and multitrophic environments. Microbial biomass and community structure as well as oak fitness were assessed. The effects of root-feeding nematodes on oak were largely governed by the endogenous rhythmic growth of the tree. The nematodes triggered a stronger response during shoot flush, e.g. activation of multi-layered defence mechanisms and repression of photosynthesis, as compared to root flush where pathogen-related signalling was repressed. With the presence of the mycorrhizal symbiont plant defence was attenuated and stress tolerance enhanced, indirectly promoting the growth of rhizosphere microorganisms. The helper bacteria fostered the ectomycorrhizal fungus, which in turn stimulated plant growth, counteracting the negative effects of nematodes. Plant-parasitic nematodes and Collembola grazers had independent roles in plant carbon allocation patterns, with nematodes hampering whilst Collembola enhancing the flux of recent photoassimilates to Gram-positive bacteria. Lastly, increasing trophic diversity of the soil fauna in the rhizosphere of oaks was crucial for the maintenances of a microbial community equilibrium that promotes plant growth. In sum, this study highlights the importance of endogenous resource allocation pattern of plants in determining the outcome of belowground biotic interactions. Therefore such plant traits should be considered as important drivers for rhizosphere processes in future studies. Moreover, taking into account the rhizosphere main players in studies on parasitic nematode-plant interactions will result in a more realistic picture and thus more effective nematode management.

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