In dieser Arbeit wurde die Expression von XCR1 in B6XCR1lacZ+/+ Reporter Mäusen charakterisiert, die β-Galaktosidase unter der Kontrolle des XCR1-Promotors exprimieren. In Gewebeschnitten konnten wir zeigen, dass eine starke XCR1-Expression nur in lymphatischen Organen wie Milz, Lymphknoten und Thymus nachweisbar ist. In der Milz fanden sich XCR1+ Zellen vor allem in der Marginal Zone, aber auch in der roten Pulpa und der T-Zell-Zone. Durchflusszytometrische Analysen zeigten, dass XCR1 in der Milz ausschließlich von dendritischen Zellen DZ exprimiert wird, hauptsächlich von der CD8+DZ Subpopulation aber auch von einer Minderheit der CD4−CD8−DZ. In vivo migrierten diese XCR1+ Zellen nach Applikation von chemotaktischen oder inflammatorischen Substanzen: Die Injektion sowohl einer ATAC-sezernierenden Zelllinie als auch von LPS lösten nach 3-9 h eine Translokation der XCR1+Zellen in die T-Zell-Zone der Milz aus. Untersuchungen der Phagozytose-Aktivität ergaben, dass nur XCR1+CD8+DZ, aber keine anderen DZ Subpopulationen, injizierte allogene Zellen aufnahmen, und dass eine Transfektion dieser Zellen mit ATAC diese Phagozytose signifikant verstärkte. Daher konnten wir allogene Zellen, die intrazellulär Ovalbumin OVA exprimierten, für die selektive Applikation von Antigen auf XCR1+DZ verwenden. Diese selektive Antigen-Applikation induzierte eine starke antigenspezifische zytotoxische Antwort von endogenen T-Zellen, ohne dass es zur Produktion von OVA-spezifischen Antikörpern kam. In Abwesenheit von ATAC war diese endogene zytotoxische Aktivität verringert. Durch adoptivem Transfer und Aktivierung von Wildtyp- oder ATAC-defizienten OVA-spezifischen transgenen CD8+TZellen konnten wir bestätigen, dass ATAC für die Erzeugung einer optimalen zytotoxischen Antwort benötigt wird. Die selektive Applikation von Antigen auf CD8+DZ stellt daher eine vielversprechende Strategie dar, um optimierte Vakzinierungs-Ansätze für die Auslösung einer zytotoxischen Immunantwort zu entwickeln / The G protein-coupled receptor XCR1 has been described as the sole receptor for the chemokine ATAC. As contradictory data were published on the expression pattern of XCR1, its role in the immune system has not yet been defined. In this work, expression of XCR1 was characterized in B6.XCR1 lacZ+/+ reporter mice which express β galactosidase under the control of the XCR1 promoter. In tissue sections, strong expression of XCR1 was only detected in lymphoid organs like spleen, lymph nodes and thymus. In the spleen, XCR1+ cells were mainly found in the marginal zones, but also in the red pulp and the T cell zones. Flow cytometric analysis demonstrated exclusive expression of XCR1 on DC, mainly on the CD8+ DC subset, but also on a minority of CD4− CD8− DC. In vivo, these XCR1+ cells migrated in response to chemotactic or inflammatory stimuli: application of either an ATAC-expressing cell line or LPS induced within 3 9 h the translocation of XCR1+ cells to the T cell area of the spleen. When tested for phagocytic capacity, XCR1+ CD8+ DC, but not other DC subsets, specifically took up injected allogeneic cells, and transfection of these cells with ATAC significantly enhanced their endocytosis by XCR1+ CD8+ DC. Thus, we could employ allogeneic cells expressing OVA intracellularly to target antigen selectively to XCR1+ DC. This antigen targeting induced a strong antigen-specific cytotoxic response by endogenous T cells without a generation of OVA-specific antibodies. In the absence of ATAC, the endogenous cytotoxic activity was markedly diminished. Adoptive transfer and activation of wild type or ATAC-deficient OVA-specific CD8+ transgenic T cells confirmed that ATAC is required for the generation of an optimal cytotoxic response. Targeting of antigen to CD8+ DC via XCR1 may thus be a promising strategy for the development of new vaccination approaches aimed at optimizing the induction of cytotoxic T cells.

Das murine Norovirus ist ein neu entdecktes Mitglied der Familie Caliciviridae. Bislang wurden vier Virusstämme beschrieben und charakterisiert (MNV1-4). In dieser Arbeit wurde erstmals die Prävalenz von MNV bei Labormäusen in Deutschland untersucht. Daraufhin wurden die neu detektierten Virusstämme anhand ihrer morphologischen, phylogenetischen und pathogenen Eigenschaften charakterisiert. In 55% der untersuchten 82 Kotproben wurde mittels real-time PCR die Ausscheidung von MNV nachgewiesen. Morphologische Untersuchungen bestätigten das Vorhandensein intakter Viruspartikel in den Proben, die auch genetisch als MNVs charakterisiert wurden. Phylogenetisch wurden die Viren in vier genetische Cluster eingruppiert, die sich sowohl untereinander als auch von den Stämmen MNV1-4 deutlich unterscheiden. Die Relevanz der Subklassifizierung von MNV wurde durch unterschiedliche Wachstumskinetiken und IFN-beta-Sensitivitäten divergenter Stämme funktional bekräftigt. Zudem konnten, basierend auf Sequenzdaten aus zwei subgenomischen Bereichen, rekombinante Virusstämme identifiziert werden. Durch Kokultivierung von MNV-Isolaten wurde homologe Rekombination von Noroviren erstmals in vitro simuliert. Beobachtungen von natürlich und experimentell infizierten Mäusen zeigten, dass der Stamm MNV-M21 in den Tieren eine persistierende Infektion induziert. Serologische Untersuchungen verdeutlichten, dass die Persistenz unabhängig von einer intakten und protektiven Immunantwort stattfand. Bestimmungen der ORF2-Sequenzen zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Infektion gaben Hinweise auf Antigendrift der hypervariablen P2-Domäne. Innerhalb dieser Domäne ist eine zwischen murinen und humanen Noroviren konservierte Proteinsequenz lokalisiert. Die antigenen Eigenschaften dieses Peptids wurden genauer untersucht. Generierte Antiseren zeigten Kreuzreaktivitäten gegenüber verschiedenen Norovirus-Kapsidproteinen. Zudem waren Peptidantikörper in der Lage eine MNV-Infektion in vitro zu neutralisieren. / The murine norovirus is a newly discovered member of the familiy Caliciviridae. So far, four strains have been described and characterised (MNV1-4). This is the first study on the prevalence of MNV among laboratory mice in Germany. Thereupon the detected new strains have been characterised considering morphologic, phylogenetic and pathogenic properties. Using real-time PCR, shedding of MNV has been found in 55% of 82 investigated faeces samples. Morphologic investigations confirmed the presence of intact virus particles within the samples, which genetically also have been characterised as MNVs. Phylogenetically these viruses have been grouped into four genetic clusters, which could be distinguished from each other and from strains MNV1-4. Relevance of MNV subtyping has been functionally corroborated through different growth kinetics and Interferon-beta sensitivities of divergent strains. Based on subtyping in two different subgenomic regions, recombinant strains have been identified. By cocultivation of MNV isolates, homologous recombination of noroviruses in vitro has been simulated for the first time. Studies of naturally and experimentally infected mice showed that strain MNV-M21 induce a persistent infection. Serological testings confirmed that the persistence occured independently of an intact and protective immune response. Determination of ORF2 sequences at different time points of infection indicated antigenic drift of the hypervariable P2 domain. A protein sequence stretch, which is conserved between murine and human noroviruses, is located within this domain. The antigenic features of this stretch have been investigated. Generated antisera against this peptide were crossreactive with different norovirus capsid proteins and were able to neutralize MNV infection in vitro.

Neutralisierende Antikörper sind entscheidend in der Eindämmung der Virusinfektion, indem sie den Eintritt in die Wirtszelle hemmen bzw. die Aktivierung der Komplementkaskade initiieren. Distinkte wirtseigene Oberflächenrezeptoren für die Fc-Domäne von IgG (FcyR) sind für die Kommunikation von humoraler und zellulärer Immunantwort verantwortlich. Auch Mitglieder der Herpesviren kodieren für Fc-bindende Proteine, die Kandidaten für immunevasive Funktionen darstellen könnten. Der Nachweis der HCMV-kodierten Fc-bindenden Proteine gp34 und gp68 als Bestandteil der Virushülle lies auf eine immunevasive Funktion hinsichtlich neutralisierendem IgG und Komplement-vermittelter Virolyse schließen, wie für den HSV-1-kodierten FcyR gE beschrieben. Weder für gp34 noch für gp68 konnte in vitro ein hemmender Effekt auf Neutralisation und Virolyse beobachtet werden. In unserem Labor wurde jedoch gezeigt, dass gp34 und gp68 selektiv die IgG-abhängige Aktivierung zellulärer FcyR inhibieren. Die glykosylierungsunabhängige Ligandenbindung von gp34 und gp68 wies auf unterschiedliche Interaktionsmechanismen zwischen den zellulären und den viralen FcyR hin. Mithilfe eines mutierten Fc-Fragments konnte für gp68 eindeutig eine mit HSV-1 gE überlappende Bindestelle an IgG identifiziert werden. Die für die Ligandenbindung erforderlichen Aminosäuren 71-292 von gp68 binden Fc in einer 2:1 Stöchiometrie, wobei die N-, nicht aber die O-Glykosylierung des vFcyRs essentiell sind. Darüber hinaus formt gp34 auf infizierten Zellen und auf der Virushülle kovalente Homooligomere. gp34-Cysteinpunktmutanten auf Basis der für die Bindung notwendigen Aminosäuren 24-140 lassen vermuten, dass die Oligomerisierung Voraussetzung für die Fc-Bindung ist. Im Gegensatz zu gp68 scheint der Mechanismus der Fc-Bindung von gp34 einzigartig unter den bekannten Fcy-Rezeptoren zu sein. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass trotz redundanter Expression der HCMV-FcyR der Bindungs- und Wirkungsmechanismus selektiv ist. / Neutralizing IgGs play a key role in diminishing virus infectivity by inhibiting the entry into host cells. Additionally, IgG-bound particles may be inactivated by virolysis through the activation of complement. Surface receptors specific for the Fc domain of IgG represent host proteins, connecting humoral and cellular immune responses. Also members of the herpes virus family code for proteins with Fc binding properties, implying functions that could intervene with antibody-dependent effector mechanisms. The presence of gp34 and gp68 on the virion membrane raised the question whether they are able to inhibit neutralising IgG and complement-mediated virolysis. The HSV-1-encoded FcyR gE was described to affect neutralisation and virolysis. Despite extensive analysis, there were no implications found that gp34 or gp68 interfere with neutralising IgG or virolysis in vitro. However, our lab could demonstrate that gp34 and gp68 selectively inhibit the IgG-dependent activation of the different host FcyRs. In contrast to the cFcyRs Fc recognition by gp34 and gp68 occurs independently of N-linked glycosylation of IgG, which points to a different binding mechanism among host and viral FcyRs. By taking advantage of a mutated Fc fragment, overlapping binding regions of the HSV-1 gE and gp68 were identified. For gp68 the amino acids 71-292 including the N-glycans are strictly required for Fc binding in a 2:1 stoichiometry. Interestingly, gp34 forms covalently linked homo-oligomers in infected cells and on the virion. Based on the minimal binding domain comprising the amino acids 24-140 of gp34, targeted cysteine exchange mutants revealed that oligomer formation by gp34 is absolutely required for Fc binding. In contrast to gp68, the Fc binding characteristics of gp34 appears to be unique among the known FcyRs. These findings allow us to postulate that even if the HCMV-encoded FcyRs are redundantly expressed the mechanistic details and binding properties are selective.

Auf der Basis von Fossilien wird angenommen, dass die ersten Säugetiere nachtaktiv waren. Diese Arbeit untersucht diese Hypothese mit bioinformatischen und molekularbiologischen Techniken. Der Fokus liegt auf dem Rhodopsin, ein Sehpigment im Wirbeltierauge, das für Sehen unter schlechten Lichtverhältnissen verantwortlich ist. Zunächst wurde das Rhodopsin der monotrematen Echidna, einem basalen Säugetier, sequenziert und mit zwei Mutanten mit Mutationen an Positionen 158 und 169 in vitro exprimiert. Die biochemische und funktionelle Charakterisierung ergab, dass das Echidna-Rhodopsin farbpigment-typische Charakteristika aufweist, was auf eine Expression auch in Zapfen hindeutet. Dies ist die erste Charakterisierung eines Rhodopsins eines nachtaktiven Tieres. Dann wurden anzestrale Rhodopsinsequenzen für die Knotenpunkte Amniota, Mammalia und Theria mithilfe der Maximum-Likelihood-Methode berechnet. Die in vitro Expression und biochemische und funktionelle Charakterisierung zeigt funktionale und rhodopsin-typische Sehpigmente. Das Mammalia- und Theria-Rhodopsin zeigen eine hohe Meta II Halbwertszeit. Dieses Ergebnis wird als eventuelle Anpassung an Sehen unter schlechten Lichtverhältnissen interpretiert, wobei, aufgrund von Unstimmigkeiten in der Literatur, Schlussfolgerungen auf ökologisch-bedingte Anpassungen basierend auf einzelnen Funktionstests problematisch sind, da die visuelle Signalkaskade ein sehr komplexes und durch viele Proteine vernetztes System darstellt. Zuletzt zeigen Selektionsanalysen, dass das Rhodopsin entlang der Theria-Linie positive Selektion auf nicht-synonyme Substitutionen erfahren hat, was zu Anpassungen in einem Protein führt. Der Fossilbericht belegt entlang dieser Linie mehrere Einnischungsevents in neue Lebensräume. Entlang der Mammalia-Linie wurde positive Selektion auf synonyme Substitutionen gemessen, was zu einer Zunahme an Rhodopsin-Molekülen führt und damit eine Anpassung an Sehen unter schlechten Lichtverhältnissen darstellt. / Based on information from the fossil record, the first mammals are thought to have been nocturnal. This thesis investigates this popular hypothesis using bioinformatic and molecular techniques, focusing on the rhodopsin, a visual pigment in the vertebrate eye that is responsible for vision at low-light levels. First, the rhodopsin gene of the monotreme echidna, a basal mammal, was sequenced and successfully expressed in vitro, together with two mutants with substitutions at sites 158 and 169. Biochemical and functional analyses revealed that the echidna rhodopsin displays cone-like characteristics, likely due to being also expressed in cones. With the echidna being nocturnal, this thesis comprises the first characterisation of a rhodopsin of a nocturnal animal. Second, ancestral rhodopsin sequences for the tetrapod nodes Amniota, Mammalia, and Theria were inferred using Maximum likelihood estimates. All expressed pigments were successfully expressed in vitro, functional and rod-like. Mammalia and Theria rhodopsins display a high meta II half life time, a pattern that is usually interpreted to facilitate better vision at low-light levels. However, due to inconsistency in the available data, the result also suggests that, with the visual signaling cascade being a complex and interconnected system, erecting ecological interpretations based on single biochemical and functional reactions is problematic. Third, selective constraint analyses performed on a set of tetrapod rhodopsin sequences indicate that positive selection on non-synonymous sites, was acting along the branch leading to Theria. This result reflects the rapid diversification into modern ecological habitats during the Triassic and Jurassic, as indicated by the fossil record. In addition, positive selection on synonymous sites, leading to an increase of rhodopsin molecules, was found along the branch leading to Mammalia and suggests adaptations to vision at low-light levels.

Prolylcarboxypeptidase (PRCP, EC3.4.16.2) ist ein ubiquitär exprimiertes Enzym, mit höchster Expression im Maushirn. Es spaltet spezifisch die letzte carboxyterminale Aminosäure von Substraten, deren vorletzte Aminosäure ein Prolin ist. Seine bisher publizierten Substrate Angiotensin II (AngII) und alpha Melanocortin Stimulierendes Hormone (alphaMSH) legen eine Rolle von PRCP in der Entwicklung von kardiovaskulären und metabolischen Krankheiten nahe. Um die in vivo Funktion von PRCP zu studieren, wurde eine Knockout Maus generiert (PRCP-/-). Metabolischer Phänotyp: PRCP-/- Mäuse zeigten generell ein reduziertes Körpergewicht, selbst wenn sie über Monate mit einer Hochfettdiät versorgt wurden. Erhöhte Plasmaleptin Werte und Proopiomelanocortin (pomc) Expression in knockout Hypothalami wiesen auf eine wichtige Rolle von PRCP in der Regulation von Futteraufnahme und Energiehomöostase hin. Eines der Genprodukte von pomc ist alphaMSH, welches im Hypothalamus die Futteraufnahme terminiert. Die carboxyterminale Struktur dieses Neuropeptids erfüllt alle Voraussetzungen, um von PRCP gespalten zu werden. Zudem konnte prcp Promotoraktivität in den selben Hirnstrukturen gezeigt werden, in denen auch alphaMSH-Wirkung beschrieben wurde. Eine mögliche Funktion von PRCP wäre somit die Inaktivierung des Appetitzüglers alphaMSH im Hypothalamus. Kardiovasculärer Phänotyp: Zunächst erwiesen sich zirkulierende Ang-Peptide in PRCP-/- Mäusen als unverändert. Jedoch konnte ein erhöhtes Niveau des Degradationsproduktes Ang1-7 in der Niere gezeigt werden. Die Entdeckung einer erhöhten Enzymaktivität von Angiotensin Converting Enzyme 2 (ACE2) in PRCP-/- Nieren, wurde als Kompensation der fehlenden PRCP Aktivität in PRCP-/- Nieren interpretiert. bot einen Erklärungsansatz für dieses Ergebnisse. Es wird davon ausgegangen, daß ACE2 die fehlende PRCP Aktivität in knockout Mäusen kompensiert. Das es sich hierbei um eine lokale begrenzte Kompensation handeln muß, zeigten der erhöhte Blutdruck und Herzrate, sowie die milde Herzhypertrophie. Da spezifische prcp Promotoraktivität in Hirnnuclei gefunden wurde, die in die Kontrolle der Herzfrequenz und des Blutdrucks involviert sind, wird eine regulatorische Funktion von Hirnstamm-PRCP auf Herzrhytmus und Blutdruck vermutet. / Prolylcarboxypeptidase (PRCP, EC3.4.16.2) is an enzyme specifically cleaving the last carboxy-terminal amino acid from substrates containing a penultimate proline. Its known potential substrates are linked to cardiovascular and metabolic phenomenon. To analyse the in vivo function of this enzyme a PRCP knockout mouse was generated. Homozygous knockout mice are viable but show tendency of decreased life span. In mice prcp expression is present in all tissues tested with very specific localizations of prcp promotor activity to distinct brain areas within the cortex, hippocampus, hypothalamus and the brain stem. The metabolic phenotype of PRCP deficient mice is characterized by low body weight even when feeding the animals a high fat diet. The increased plasma leptin levels and elevated expression of proopiomelanocortin gene (pomc) found in knockout hypothalami suggests an involvement of PRCP in the regulation of food intake and energy homeostasis. One of the gene products of pomc is alpha-melanocortin stimulating hormone (alphaMSH) that is terminating feeding when released from hypothalamic POMC neurons. Its carboxy-terminal structure is fitting the cleavage preferences of PRCP. Prcp promotor activities are localized in arcuate nucleus and paraventricular nucleus, brain areas of known alphaMSH signalling, supporting a role of PRCP in the degradation of central alphaMSH. The impact of PRCP on angiotensin II (AngII) metabolism was studied by determining the level of AngII and its degradation product Ang1-7 in blood and tissues. But instead of increased AngII levels due to the missing degradation enzyme in knockout mice, Ang1-7 levels were increased in kidney. These results were explainable by the increased activity of angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) found in kidney. Probably ACE2 is compensating the lack of PRCP in the knockout mouse. Nevertheless, blood pressure and heart rate of PRCP knockout mice was increased. The mild hypertension was accompanied by mild hypertrophy of the hearts. Prcp promotor activity was found in brain stem an area important for regulation of blood pressure and heart rate suggesting that central PRCP regulates blood pressure.

Neben aktivierten Astrozyten weisen zahlreiche Zytokine und Wachstumsfaktoren, die in der Nähe amyloidogener Ablagerungen im Hirn des Alzheimer-Patienten auftreten, auf eine Alzheimer-assoziierte Neuroinflammation hin, die an der Ausprägung der Neurodegeneration ursächlich beteiligt sein kann. Bisher ist die Bedeutung aktivierter Astrozyten für die Alzheimer-Pathogenese wenig untersucht worden. Von besonderem Interesse war in diesem Zusammenhang das interzelluläre Adhäsionsmolekül ICAM-1, da es mit amyloidogenen Ablagerungen und Astrozyten assoziiert vorliegt. Um einen ersten Hinweis auf eine mögliche pathophysiologische Rolle des ICAM-1 in der Alzheimer-assoziierten Neuroinflammation zu erhalten, wurde im ersten Teil der vorliegenden Arbeit die astrozytäre ICAM-1-Expression in Abhängigkeit unterschiedlicher Mitogene untersucht, die für die Alzheimer-Pathogenese von Bedeutung sind. Aus diesen Untersuchungen ging hervor, daß Astrozyten, die mit den Zytokinen IL1[beta], TNF[alpha] und TNF[alpha] mit IFN[gamma] behandelt wurden, ihre ICAM-1-Expression verstärkten. Es konnte erstmals gezeigt werden, daß eine Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration durch Forskolin, Rolipram und Prostglandine die Zytokin-verstärkte ICAM-1-Expression verminderte. Allerdings konnte eine schon bestehende astrozytäre Aktivität durch cAMP-erhöhende Substanzen nicht beeinflußt werden. Im Rahmen weiterer Untersuchungen wurde in dieser Arbeit gezeigt, daß die astrozytäre ICAM-1-Expression nicht durch das Amyloid[beta]-Protein ausgelöst oder verstärkt wird, dagegen konditionierte Medienüberstände A[beta]-aktivierter Mikroglia einen starken Einfluß auf die astrozytäre Aktivität ausüben. Im zweiten Teil dieser Arbeit ist die Untersuchung aktivierter Astrozyten in der Alzheimer-assoziierten Amyloidogenese beschrieben, die im Zusammenhang mit der amyloidogenen Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins APP steht. Bisher standen Neurone als Hauptproduzenten des Amyloid [beta]-Proteins im Vordergrund der Alzheimer-Forschung. Da jedoch verschiedene Veröffentlichungen darauf hinweisen, daß Astrozyten ebenfalls eine direkte Rolle in der Entstehung der amyloidogenen Ablagerungen spielen können, wurde die amyloidogene APP-Prozessierung aktivierter Astrozyten untersucht. Neben vergleichenden Analysen der astrozytären und neuronalen APP-Prozessierung konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, daß sich die APP-Prozessierung aktivierter Astrozyten zugunsten des nicht-amyloidogenen Prozessierungsweges verlagert, d.h. aktivierte Astrozyten verringerten die Sekretion des A[beta]-Proteins. Ein charakteristisches Merkmal aktivierter Astrozyten ist eine verstärkte [alpha]-Sekretaseaktivität bei der APP-Prozessierung. Astrozyten, die mit den Zytokinen IL1[beta], TNF[alpha] und TNF[alpha] mit IFN[gamma] aktiviert wurden, akkumulierten nicht-amyloidogene C-terminale Fragmente, sekretierten verstärkt sekretorisches APP nach [alpha]-Sekretaseaktivität und zeigten eine verringerte A[beta]-Sekretion bei gleichzeitig verstärkter Sekretion des nicht-amyloidogenen p3-Fragmentes. Abschließend wurde die pathophysiologische Bedeutung der Astrozyten in der Alzheimer-Pathogenese im Zusammenhang mit den erzielten Ergebnissen aus dieser Arbeit und mit den Befunden anderer Forschungsgruppen diskutiert und ein Modell über die zellulären, neuroinflammatorischen Vorgänge in der Alzheimer-Pathogenese entwickelt. / Activated astrocytes, number of cytokines and growth factors are associated with amyloidogenic deposits in the brain of Alzheimer-patients, pointed to an Alzheimer-associated neuroinflammation, that could be involved in the progression of the neurodegeneration. So far the implication of activated astrocytes in the pathogenesis of Alzheimer's disease is not clear. In this connection the adhesion molecule ICAM-1 was of particularly interest, because it is associated with astrocytes and amyloidogenic deposits. To get insights in a possible pathophysiological role of ICAM-1 in the Alzheimer-associated neuroinflammation, in the first part of this thesis the astrocytic expression of ICAM-1 was investigated dependent on different mitogens, that are relevant to the pathogenesis of Alzheimer's disease. It was shown that the expression of ICAM-1 was enhanced in astrocytes treated with the cytokines IL1[beta], TNF[alpha] and the combination TNF[alpha] with IFN[gamma]. It was shown that an elevation of intracellular concentration of cAMP by forskolin, rolipram and prostaglandines results in an suppressed cytokine-stimulated ICAM-1 expression. But it was impossible to reduce an existing astrocytic activity by these cAMP-elevating agents. Within the scope of additional investigations it was shown that the expression of ICAM-1 was not induce by the amyloid [beta]-peptide, whereas the ICAM-1 expression was strongly enhanced by conditioned media of A[beta]-activated microglia. In the second part of this thesis the investigation of activated astrocytes in the Alzheimer-associated amyloidogenesis is described, the astrocytic processing of the amyloid precursor protein (APP). So far it is believed that the neurons are the main producers of the amyloid [beta]-peptide. But different publications pointed to the possibility that astrocytes could play a direct role in the generation of the amyloidogenic deposits. From this reason the amyloidogenic processing of APP was investigated in activated astrocytes. Besides comparative study of astrocytic and neuronal APP processing it was first shown that activated astrocytes practise more the non-amyloidogenic pathway of APP processing. A characteristic hallmark of activated astrocytes is an increased activity of [alpha]-secretase. Astrocytes that are activated by the cytokines IL1[beta], TNF[alpha] or TNF[alpha] with IFN[gamma] showed an accumulation of non-amyloidogenic C-terminal fragments, increased APP-secretion followed by [alpha]-secretase activity, decreased A[beta]-secretion and enhanced p3-secretion. In conclusion the pathophysiological role of astrocytes in the pathogenesis of Alzheimer's disease was discussed leading to a model of cellular neuroinflammatory events in the pathogenesis of Alzheimer's disease.

Der neuronale Zelluntergang bei einer Vielzahl von Krankheiten des ZNS, wie z.B. Morbus Alzheimer (AD) und Temporallappenepilepsie (TLE), wird mit oxidativem Stress sowie Fehlfunktionen von Kaliumkanälen in Verbindung gebracht. In dieser Studie soll die selektive neuronale Sensitivität auf oxidativen Stress durch die Messung der oxidativen Modulation von Kaliumströmen untersucht werden. Dabei werden sternförmige Neuronen der zweiten Schicht des entorhinalen Kortex (EC) (bei AD bereits früh geschädigt) mit pyramidalen Neuronen der dritten Schicht des EC (früh geschädigt bei TLE) sowie hippocampalen pyramidalen Neuronen der CA1 Region (bei AD und TLE erst spät geschädigt) miteinander verglichen. Mittels patch-clamp Ganzzellmessung zeigt diese Studie die differentielle Hemmung spannungsabhängiger transienter (IA) und „delayed-rectifier“ K+-Ströme (IK(V)) durch Arachidonsäure (AA) und Wasserstoffperoxid (H2O2). Die intrazelluläre Applikation von AA (1 pM) reduzierte IA in Neuronen des entorhinalen Kortex signifikant stärker verglichen mit Neuronen des CA1. ETYA imitiert diesen Effekt, dies schliesst die Metabolite der AA als Mediatoren des Effekts auf Kaliumkanäle aus. Weder AA noch ETYA reduzierten IK(V). Im Gegensatz dazu reduzierte H2O2 IA in Neuronen des CA1 effektiver als in Neuronen der Schichten II und III des entorhinalen Kortex. Die Reduktion des IA, vermittelt durch AA, wurde durch Radikalfänger (Glutathion, Ascorbinsäure, Vitamin E Analogon Trolox) blockiert. Dabei verstärkten manche dieser Antioxidantien den Effekt der AA, dies legt eine komplexere Modulation dieser Ströme in Schnitten verglichen mit Kulturen nahe. Dies sollte bei der Entwicklung antioxidativer Therapien von AD und TLE berücksichtigt werden. Bei der heterologer Expression von Kv1.4 und Kv4.2 in HEK-293 Zellen wurden funktionelle Kanäle gebildet und A-Typ Ströme ausgelöst. Diese Ströme wurden nach der Applikation von 1 pM AA stark reduziert. ROS scheinen neben ihrer zellschädigenden Wirkung physiologische Prozesse zu regulieren, indem sie eine Reihe von Signalwegen beeinflussen. Da spannungsabhängige Kaliumkanäle vielen wichtigen zellulären Funktionen zugrundeliegen, könnte die Modulation dieser Kanäle durch ROS einen Mechanismus für die Feinabstimmung zellulärer Prozesse darstellen. / Oxidative stress and dysfunction of potassium channels are believed to play a role in neuronal death in a number of CNS diseases (e.g. Alzheimer’s disease, epilepsy). The present study addresses selective neuronal vulnerability to oxidative stress by studying oxidative modulation of potassium channels in entorhinal cortex (EC) layer II stellate neurons (cell loss early in AD) and layer III pyramidal neurons (early damage in TLE), in comparison to hippocampal CA1 pyramidal neurons (late damage in TLE and AD). Using whole-cell patch-clamp, differential inhibition of transient IA and delayed rectifier K+-currents IK(V) by arachidonic acid (AA) and H2O2 was demonstrated. Intracellular AA (1 pM) reduced IA in EC neurons significantly stronger than in CA1 neurons. AA affected the voltage dependence of steady-state inactivation as well. ETYA mimicked the effect of AA, excluding its metabolites as mediators of IA modulation. Neither AA nor ETYA reduced IK(V). In contrast, a non-lipid oxidizing agent, H2O2 reduced IA more effectively and robustly attenuated IK(V) in CA1, compared to EC neurons. AA-mediated reduction of IA was blocked by free radical scavengers (glutathione, ascorbic acid, Trolox). Antioxidants did not simply inhibit AA and H2O2 effects. In particular, they even enhanced AA effects, suggesting more complex modulation of these currents in slices, compared to culture. Moreover, intracellular antioxidants, themselves, influenced maximal conductance and voltage-conductance characteristics of IA and IK(V). This should be considered in design of anti-oxidative therapies in AD and TLE. Heterologous expression of Kv1.4 and of Kv4.2 cDNA in HEK-293 cells formed functional channels and elicited A-type currents, which shared similar biophysical characteristics with native IA from the hippocampus. These currents were strongly decreased upon administration of 1pM AA, demonstrating that at least one of multiple sites for AA action is situated on the pore-forming alfa-subunit of the A-channel. In conclusion, beside contribution to cell damage, ROS may regulate physiological processes by acting on different signalling pathways. Since voltage-gated K+-channels underlie many important cellular functions modulation of these channels by ROS would represent a mechanism for fine tuning of cellular processes.

Der Hippocampus ist eine von zwei Gehirnregionen, in der zeitlebens kontinuierlich neue Nervenzellen gebildet werden. Er spielt eine wichtige Rolle bei der Gedächtniskonsolidierung und wird mit der funktionellen Entstehung neurodegenerativer Erkrankungen in Verbindung gebracht. Strukturveränderungen im erwachsenen Gehirn, die mit einer Depression einhergehen, sind laut Literatur auf einen geringen Serotoninspiegel und reduzierte hippocampale Neurogenese zurückzuführen. Selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRI) erhöhen die Serotoninkonzentration im synaptischen Spalt und üben einen positiven Effekt auf die adulte Neurogenese aus. In der vorliegenden Arbeit wird untersucht, wie Veränderungen in der Serotonin (5-HT)-Neurotransmission durch einmalige oder chronische Gaben von Fluoxetin und speziellen Agonisten und Antagonisten für die Serotoninrezeptoren 5-HT1a und 5-HT2 in der erwachsenen Maus die Proliferation und Differenzierung von neugebildeten Nervenzellen im Gyrus dentatus beeinflussen. Die Ergebnisse zeigen, dass ein konträres Agieren beider Rezeptoren zu einem ausgewogenen Serotoninspiegel führt. 5-HT1a- und 5-HT2c-Rezeptoren haben einen Einfluss auf das Überleben neugebildeter Nervenzellen, wobei sie unterschiedliche Entwicklungsstadien innerhalb der adulten Neurogenese kontrollieren. Die vorliegende Arbeit bekräftigt außerdem, dass die chronische Gabe von Fluoxetin die adulte Neurogenese steigert. / The hippocampus as one region with ongoing neurogenesis throughout life contributes to the formation of long-term memory and has also been implicated in the pathology of major depression. Studies suggest that depression might be due to decreased levels of serotonin and reduced neurogenesis in the adult brain and that the beneficial effects of selective serotonin reuptake inhibitors would require adult hippocampal neurogenesis. Here, I investigated how modulation of serotonergic neurotransmission by acute and chronic treatment with the antidepressant fluoxetine, and selective serotonin receptor agonists and antagonists in adult mice influences precursor cell activity during development. I focused on 5-HT1a and 5-HT2 receptors as major mediators of serotonin action. The present findings suggest that an opposed action of 5-HT1a and 5-HT2c receptor subtypes result in a balanced regulation of serotonin levels in the dentate gyrus. Both receptors differentially affect intermediate cell stages in adult hippocampal neurogenesis and play an important role in the survival of newly generated neurons. Furthermore, this study confirms that chronic fluoxetine treatment increases adult neurogenesis. In conclusion, the latency of onset of fluoxetine action can be explained by a balanced interplay of 5-HT1a and 5-HT2c receptor subtypes.

Die vorsätzliche Freisetzung von Variola Virus (VARV) und schwere Erkrankungen des Menschen durch zoonotische Affen- (MPXV) und Kuh- (CPXV) pocken Viren stellen nach wie vor eine Bedrohung für die Bevölkerung dar. Klassische Pockenimpfstoffe bergen die Gefahr einer schweren Erkrankung. Deshalb ist die Entwicklung neuer Impfstoffe und Therapeutika von entscheidender Bedeutung. Deren Wirksamkeit und Sicherheit muss zunächst in verschiedenen Tiermodellen bewiesen werden. Existierende Makakken-Primatenmodelle leiden unter sehr artifiziellen Bedingungen der letalen Krankheitsinduktion durch VARV oder MPXV. Aus diesem Grund wurde das Calpox Virus/Krallenaffen-modell etabliert, welches auf einem CPXV aus natürlich infizierten Neuweltaffen (Marmosets) basiert. Das neue Modell hat drei wesentliche Vorteile: Die Arbeit mit Calpox Virus kann unter Sicherheitsstufe 2 durchgeführt werden und ist folglich einfacher in der Handhabung. 2. Die intranasale (i.n.) Infektion von Marmosets (Krallenaffen; Callithrix jacchus) spiegelt den natürlichen Infektionsweg von VARV wieder. Infizierte Affen entwickelten Pocken ähnliche Symptome und verstarben innerhalb von 2-3 Tagen nach Auftreten erster Symptome. Hohe Viruslasten wurden im Blut, Speichel und allen untersuchten Organen nachgewiesen. 3. Die i.n. Titration des Calpox Virus ergab eine 50 % Affen-Infektions-Dosis (MID50) von 8.3x102 pfu. Diese ist um den Faktor 10000 niedriger als in anderen Pocken-Primatenmodellen. Neun bis zehn Wochen nach einer Immunisierung mit dem Lister-Elstree Impfstoff waren alle Krallenaffen gegen eine letale Dosis des Calpox Virus (10 MID50) geschützt. Damit konnte der Nutzen des Calpox Virus/Krallenaffen-modells für die Erforschung neuer Impfstoffe gezeigt werden. Das Calpox Virus/Krallenaffen-modell überwindet wesentliche Nachteile bestehender Primatenmodelle und ist somit ein geeignetes Model für die Evaluierung von neuen Impfstoffen, Impfstrategien und antiviralen Therapien. / The intentional re-introduction of Variola virus (VARV), the agents of smallpox, into the human population remains of concern today. Moreover, zoonotic infections with Cowpox (CPXV) and Monkeypox virus (MPXV) cause severe diseases in humans. Smallpox vaccines presently available can have severe adverse effects that are no longer acceptable. The efficacy and safety of new vaccines and antivirals have to be demonstrated by different animal models. The existing primate models, using VARV and MPXV, need very high viral doses that have to be applied intravenously to induce a lethal infection in macaque monkeys. To overcome these drawbacks, the main objective of this study was to develop a primate model in which a smallpox-like disease could be induced by a CPXV virus designated calpox virus which was isolated from a lethal orthopox virus (OPV) outbreak in New World monkeys (marmosets). The new non-human primate model has three major advantages: 1. Working with calpox virus is less challenging and can be done under bio-safety-level two. 2. Mimicking the natural route of VARV infection, intranasally infected marmosets (Callithrix jacchus) reproducibly developed clinical symptoms of an OPV infection and died within two to three days after onset of the first symptoms. High viral loads of calpox virus were detected in blood, saliva and all analyzed organs. 3. Intranasal titration of the virus resulted in a 50 % monkey infectious dose (MID50) of 8.3x102 pfu, a lethal infectious dose 10,000 lower than those used in any other primate model. Moreover, we showed the aptitude of the primate model for the testing of new vaccines since nine to ten weeks after immunization with Vaccinia virus Lister-Elstree marmosets were completely protected against intranasal challenge with 10 MID50 of calpox virus. As the calpox virus/marmoset model overcomes major limitations of current primate models it is suitable to evaluate new vaccines, new vaccination strategies and antiviral therapies.

In Tumoren führt die Deregulation von Proteinen der Bcl-2 Familie zur Apoptoseresistenz. Diese kann aus einem Verlust der pro-apoptotischen Proteine Bax bzw. Bak, einer Hochregulation von anti-apoptotischen Bcl-2 Proteinen oder aus einer Inaktivierung von BH3-only Proteinen heraus erfolgen. BH3-only Proteine sequestrieren anti-apoptotische Bcl-2 Proteine und induzieren dadurch die Aktivierung von Bax bzw. Bak. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, die Regulation von Apoptose durch das pro-apoptotische BH3-only-Protein Noxa zu untersuchen. Zusätzlich sollte der Mechanismus der Apoptoseinduktion durch niedermolekulare Bcl-2 Inhibitoren in Tumorzellen untersucht werden. Hier wird gezeigt, dass die putativen Bcl-2 Inhibitoren Gossypol, HA14-1 und zum Teil BH3I-2 unabhängig von Bax und Bak Zelltod induzierten. Dies weist darauf hin, dass die Apoptoseinduktion durch diese niedermolekularen Substanzen zumindest teilweise "off-target" ist, d.h. unabhängig von den Zielstrukturen der Bcl-2 Familie erfolgt. Eine andere Strategie zur Aktivierung des mitochondrialen Apoptosewegs ist die Expression von BH3-only Proteinen. Zunächst wurde die Expression putativer Spleißvarianten des Noxa-Gens auf mRNA- und Proteinebene durchgeführt. Hierbei wurde das bekannte BH3-only Protein Noxa als kurze Spleißvariante (NoxaS) und eine bisher unbekannte, lange Spleißvariante (NoxaL) gefunden. Zur funktionellen Analyse wurden konditionale Expressionsvektoren für beide Noxa-Varianten hergestellt. Die Expression von NoxaS führte zu einer differenziellen Aktivierung von Bak und/oder Bax. NoxaL hingegen verfügt über keine BH3-Domäne, induzierte aber dennoch Apoptose in einem Prostatakarzinom-Zelllinienmodell. Weitergehende Untersuchungen zeigten, dass es hier zu einer BH3-unabhängigen Aktivierung eines Bak-vermittelten Zelltod-Signalwegs kommt. Die vorliegende Arbeit liefert somit neue Erkenntnisse zur Zelltodregulation und experimentellen Apoptoseinduktion über BH3-unabhängige Signalmechanismen. / In many tumors deregulation of Bcl-2 family proteins lead to apoptosis resistance. This deregulation can occur through the loss of pro-apoptotic proteins Bax respectively Bak, through upregulation of anti-apoptotic Bcl-2 proteins or from the inactivation of BH3-only proteins. BH3-only proteins sequester anti-apoptotic Bcl-2 proteins and hereby activate Bax and Bak. Therefore aim of the present work was to study the regulation of apoptosis by the pro-apoptotic BH3-only protein Noxa. In addition the mechanism of apoptosis induction in different tumor cells by small molecular substances mimicking the function of BH3-only proteins ought to be investigated. Here we show that the putative Bcl-2 inhibitors Gossypol, HA14-1 and partly BH3I-2 induce cell death independent from Bax and Bak. This shows that the induction of apoptosis by these substances is at least partly off target, i.e. occurs independent of the target structures of the Bcl-2 family. Another strategy to activate the mitochondrial signaling pathway is the expression of BH3-only proteins. Initially the expression of putative splicing variants of the noxa gene was carried out on mRNA and protein level. Here the known NoxaS as short splicing variant (NoxaS) and an up to that point unknown long splicing variant (NoxaL) have been found. For functional analysis of the two splicing variants conditional expression vectors have been generated. The overexpression of NoxaS led to a differential activation of Bax and/or Bak. However NoxaL does not contain a BH3 domain but still induced apoptosis in a prostate carcinoma cell system. Advanced studies showed a BH3 independent activation of a Bak mediated cell death signaling pathway. The present work therefore provides new insights into cell death regulation and experimental apoptosis induction via BH3 independent signaling mechanisms.