Die vorsätzliche Freisetzung von Variola Virus (VARV) und schwere Erkrankungen des Menschen durch zoonotische Affen- (MPXV) und Kuh- (CPXV) pocken Viren stellen nach wie vor eine Bedrohung für die Bevölkerung dar. Klassische Pockenimpfstoffe bergen die Gefahr einer schweren Erkrankung. Deshalb ist die Entwicklung neuer Impfstoffe und Therapeutika von entscheidender Bedeutung. Deren Wirksamkeit und Sicherheit muss zunächst in verschiedenen Tiermodellen bewiesen werden. Existierende Makakken-Primatenmodelle leiden unter sehr artifiziellen Bedingungen der letalen Krankheitsinduktion durch VARV oder MPXV. Aus diesem Grund wurde das Calpox Virus/Krallenaffen-modell etabliert, welches auf einem CPXV aus natürlich infizierten Neuweltaffen (Marmosets) basiert. Das neue Modell hat drei wesentliche Vorteile: Die Arbeit mit Calpox Virus kann unter Sicherheitsstufe 2 durchgeführt werden und ist folglich einfacher in der Handhabung. 2. Die intranasale (i.n.) Infektion von Marmosets (Krallenaffen; Callithrix jacchus) spiegelt den natürlichen Infektionsweg von VARV wieder. Infizierte Affen entwickelten Pocken ähnliche Symptome und verstarben innerhalb von 2-3 Tagen nach Auftreten erster Symptome. Hohe Viruslasten wurden im Blut, Speichel und allen untersuchten Organen nachgewiesen. 3. Die i.n. Titration des Calpox Virus ergab eine 50 % Affen-Infektions-Dosis (MID50) von 8.3x102 pfu. Diese ist um den Faktor 10000 niedriger als in anderen Pocken-Primatenmodellen. Neun bis zehn Wochen nach einer Immunisierung mit dem Lister-Elstree Impfstoff waren alle Krallenaffen gegen eine letale Dosis des Calpox Virus (10 MID50) geschützt. Damit konnte der Nutzen des Calpox Virus/Krallenaffen-modells für die Erforschung neuer Impfstoffe gezeigt werden. Das Calpox Virus/Krallenaffen-modell überwindet wesentliche Nachteile bestehender Primatenmodelle und ist somit ein geeignetes Model für die Evaluierung von neuen Impfstoffen, Impfstrategien und antiviralen Therapien. / The intentional re-introduction of Variola virus (VARV), the agents of smallpox, into the human population remains of concern today. Moreover, zoonotic infections with Cowpox (CPXV) and Monkeypox virus (MPXV) cause severe diseases in humans. Smallpox vaccines presently available can have severe adverse effects that are no longer acceptable. The efficacy and safety of new vaccines and antivirals have to be demonstrated by different animal models. The existing primate models, using VARV and MPXV, need very high viral doses that have to be applied intravenously to induce a lethal infection in macaque monkeys. To overcome these drawbacks, the main objective of this study was to develop a primate model in which a smallpox-like disease could be induced by a CPXV virus designated calpox virus which was isolated from a lethal orthopox virus (OPV) outbreak in New World monkeys (marmosets). The new non-human primate model has three major advantages: 1. Working with calpox virus is less challenging and can be done under bio-safety-level two. 2. Mimicking the natural route of VARV infection, intranasally infected marmosets (Callithrix jacchus) reproducibly developed clinical symptoms of an OPV infection and died within two to three days after onset of the first symptoms. High viral loads of calpox virus were detected in blood, saliva and all analyzed organs. 3. Intranasal titration of the virus resulted in a 50 % monkey infectious dose (MID50) of 8.3x102 pfu, a lethal infectious dose 10,000 lower than those used in any other primate model. Moreover, we showed the aptitude of the primate model for the testing of new vaccines since nine to ten weeks after immunization with Vaccinia virus Lister-Elstree marmosets were completely protected against intranasal challenge with 10 MID50 of calpox virus. As the calpox virus/marmoset model overcomes major limitations of current primate models it is suitable to evaluate new vaccines, new vaccination strategies and antiviral therapies.

Die für die Vermehrung der Paramyxoviren notwendige Freisetzung des Virusgenoms in die Wirtszelle findet nach einer Verschmelzung der Virushülle mit der Zellmembran statt. Die Membranfusion wird durch eine Konformationsänderung des membranständigen Fusionsproteins (F-Protein) der Paramyxoviren vermittelt. Der Auslöser der Strukturumwandlung des F-Proteins ist bislang unbekannt. Man nimmt an, daß eine Wechselwirkung mit dem zweiten membranständigen Protein der Hämagglutinin-Neuraminidase (HN-Protein) die Strukturumwandlung des F-Proteins induziert. Das F-Protein kann jedoch auch in Abwesenheit des HN-Proteins eine Membranfusion vermitteln. Für das Verständnis des Mechanismus der F-proteinvermittelten Fusion ist die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur des F-Proteins notwendig. In der vorliegenden Arbeit wurden die F-Proteine der Paramyxoviren, Sendaivirus und Simianvirus 5, in fusionskompetenter Form isoliert und in kleine Lipidvesikel rekonstituiert, um deren Struktur mittels Kryoelektronenmikroskopie und Einzelpartikelanalyse aufzuklären. Die 3D-Struktur des Sendaivirus-F-Proteins konnte mit einer Auflösung von 16 Angström aufgeklärt werden. Es ist die erste 3D-Struktur des F-Proteins eines Paramyxovirus in der fusionskompetenten Form. Um geeignete Bedingungen herauszufinden, die das Auslösen der Konformationsänderung der F-Proteine bzw. das "Einfangen" von Strukturintermediaten während der Fusion ermöglichen, wurde das Fusionsverhalten von Sendaivirus und Simianvirus 5 bei unterschiedlichen Temperatur- und pH-Werten sowie in Anwesenheit von Lysolipiden mittels Fluoreszenzdequenchingassays untersucht. Ein signifikanter Anstieg der Fusionsaktivität der untersuchten Viren konnte durch eine Erhöhung der Temperatur erreicht werden. Mittels ESR-Spektroskopie unter Einsatz von spinmarkierten Lysolipiden konnte gezeigt werden, daß Lysolipide die proteinvermittelte Fusion von Hüllviren in einem späten lipidabhängigen Schritt hemmen. Diese Untersuchungen bilden damit eine Grundlage zur Aufklärung der 3D-Struktur des F-Proteins im fusionsaktiven Zustand. Desweiteren wurde die Rolle der transmembranalen und zytoplasmatischen Domäne des F-Proteins bei der Membranfusion und der Wechselwirkung mit dem HN-Protein mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Befunde der 3D-Strukturaufklärung und der fluoreszenzmikroskopischen Studien wurden unter anderem in Hinblick auf die Bedeutung der Wechselwirkung zwischen den F- und HN-Proteinen für die Fusion diskutiert. / Paramyxoviruses infect their host cells by fusion of the viral envelope with the cell membrane. The membrane fusion is mediated by a confomational change of a viral envelope glycoprotein called the fusion (F) protein. The trigger of the F protein conformational change is still unknown. It is suggested, that an interaction of the F protein with the second envelope glycoprotein hemagglutinin-neuraminase (HN) induces its conformational change. However the F protein can mediate membrane fusion in absense of HN. The knowledge of the three dimensional structure of the F protein is reqiured to understand the F mediated membrane fusion. In the present work the fusion competent form of the fusion proteins of the paramyxoviruses Sendai virus and Simian virus 5 were isolated and incorporated each of them into small lipid vesicles. The 3D-structure of the entire ectodomain of the Sendai virus F protein has been determined in fusion potential conformation by cryo electron microscopy of single molecules and 3D-reconstruction at a resolution of 16 Angström. To detect usefull conditions for triggering the conformational change of F, the fusion of Sendai virus and Simian virus 5 have been studied at different temperature and pH, respectively, using a fluorescence dequenching assay. A significant increase of virus fusion activity has been found due to temperature enhancement. Using ESR-spectroscopy and spin-labeled lysolipids it has been shown that lysolipids inhibit the protein mediated fusion of enveloped viruses at a late lipid-dependent intermediate. Thus lysolipids are capable to freeze a conformational intermediate of the F protein during fusion. Furthermore the role of the transmembrane and the cytoplasmic domain of the Sendai virus F protein for membrane fusion was investigated using fluorescence microscopy. The results of the fluorescence microscopy study and the detection of the 3D-structure have been discussed in view of the relevance of F-HN-interaction for membrane fusion.

Kanalrhodopsine (ChRs), lichtgesteuerte Ionenkanäle, vermitteln phototaktische Reaktionen in beweglichen Algen und sind als optogenetische Werkzeuge zur Manipulation der Zellaktivität mittels Lichts weit verbreitet. Viele Kationen- und Anionen-leitende ChRs (CCRs und ACRs) wurden aus kultivierbaren Chlorophyten- und Cryptophytenarten identifiziert. Die meisten mikrobiellen Organismen kann jedoch nicht kultiviert werden, was zu einem unvollständigen Bild der ChR-Vielfalt führt. Die Metagenomik öffnet die Tür für Erkenntnisse über die Verteilung von ChRs in unkultivierten Organismen. Diese Arbeit beschreibt die biophysikalische Charakterisierung von zwei Gruppen metagenomisch identifizierter ChRs. Die MerMAIDs (Metagenomically discovered marine, anion-conducting, and intensely desensitizing ChRs) sind eine neue ChR-Familie und zeigen nahezu komplette Photostrom-Inaktivierung unter Dauerlicht. Die Photoströme lassen sich durch einen Photozyklus erklären, der zur Akkumulation eines langlebigen und nicht-leitenden Photointermediats führt. Ein konserviertes Cystein ist für dieses Phänomen entscheidend, da seine Substitution zu einer stark reduzierten Inaktivierung führt. Die Prasinophyten ChRs, die große carboxyterminale Domänen aufweisen, wurden in großen, marinen Viren identifiziert, die sie von ihren beweglichen und einzelligen Grünalgen-Wirten durch lateralen Gentransfer übernommen haben. Heterolog exprimiert, sind die viralen ChRs nur nach Ergänzung von Transportsequenzen und carboxyterminaler Kürzung funktional. Die Grünalgen- und viralen ChRs sind Anionen-leitend mit nicht-inaktivierenden Photoströmen, wenn sie in Säugetierzellen exprimiert werden, obwohl die viralen Vertreter weniger leitfähig und zytotoxisch sind. Nichtsdestotrotz repräsentiert diese ChR-Gruppe die ersten Grünalgen- und Virus-ACRs. Diese Arbeit zeigt eine breite Verteilung der ACRs unter marinen mikrobiellen Organismen und die Bedeutung der Funktionsmetagenomik bei der Entdeckung neuer ChRs. / Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels mediating phototactic responses in motile algae and widely used as optogenetic tools to manipulate cellular activity using light. Many cation- and anion-conducting ChRs (CCRs and ACRs) have been identified from culturable chlorophyte and cryptophyte species. However, most microbial organisms cannot be cultured, resulting in an incomplete view of the diversity of ChRs. Metagenomics opens the door to gather insights on the distribution of ChRs in uncultured organisms. Here, the biophysical characterization of two groups of metagenomically identified ChRs is described. The MerMAIDs (Metagenomically discovered marine, anion-conducting, and intensely desensitizing ChRs) represent a new ChR family with near-complete photocurrent desensitization under continuous illumination. The photocurrents can be explained by a single photocycle leading to the accumulation of a long-lived and non-conducting photointermediate. A conserved cysteine is critical for this phenomenon, as its substitution results in a strongly reduced desensitization. The prasinophyte ChRs, harboring large carboxy-terminal extensions, were identified in marine giant viruses that acquired them from their motile and unicellular green algal hosts via lateral gene transfer. Expressed in cell culture, the viral ChRs are only functional upon the addition of trafficking sequences and carboxy-terminal truncation. The green algal and viral ChRs are anion-conducting and display non-desensitizing photocurrents when expressed in mammalian cells, though the viral representatives are less conductive and cytotoxic. Nonetheless, this group of ChRs represents the first green algal and viral ACRs. This thesis highlights a broad distribution of ACRs among marine microbial organisms and the importance of functional metagenomics in discovering new ChRs.