Ein wichtiges Merkmal der normalen Schwangerschaft ist die Toleranz des mütterlichen Immunsystems gegenüber den fremden fetalen Antigenen. Regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen) steigen während der frühen Schwangerschaft an und leisten einen entscheidenden Beitrag zur fetalen Toleranz. Allerdings sind die genauen Mechanismen ihres Anstieges und ihrer Wirkungsweise noch weitgehend ungeklärt. Erste Untersuchungen zeigten, dass die Anzahl an Treg-Zellen in der empfänglichen Phase des Estruszyklus in der Maus am höchsten war. Es kann vermutet werden, dass die erhöhte Anzahl an Treg-Zellen zum Zeitpunkt der Insemination eine frühe Erkennung von väterlichen Antigenen begünstigt und somit zur Vorbereitung des mütterlichen Immunsystems auf die Implantation des Embryos beiträgt. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass Alloantigene im Ejakulat den frühen Anstieg der Treg-Zellen in der Schwangerschaft bedingen und dass das in der Samenblasenflüssigkeit enthaltene Zytokin TGF-beta die Expansion der Treg-Zellen unterstützt. Diese Ergebnisse befürworten eine Alloantigen-vermittelte Expansion der Treg-Zellen während der frühen Schwangerschaft, die darüber hinaus durch TGF-beta begünstigt wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ebenfalls belegt werden, dass das Schwangerschaftshormon hCG einen entscheidenden Einfluss auf die Treg-Zellen im Verlauf der Schwangerschaft ausübt. Untersuchungen unter Verwendung von menschlichem Probenmaterial konnten deutlich zeigen, dass hCG die Migration von Treg-Zellen zu Trophoblasten vermittelt und zur Konvertierung von konventionellen T-Zellen in Treg-Zellen beiträgt. Darüber hinaus konnten Versuche im Mausabortmodell zeigen, dass die Applikation von hCG die Expansion und Funktion der Treg-Zellen entscheidend beeinflusst, wodurch das Auftreten von Aborten in Abortweibchen verhindert werden konnte. HCG vermittelt demnach die Generierung, Migration und Funktion der Treg-Zellen und trägt entscheidend zum erfolgreichen Verlauf der Schwangerschaft bei. / Normal pregnancy is characterized by the generation of maternal immune tolerance towards the foreign fetal antigens. Regulatory T cells (Treg cells) have been shown to increase in number during early pregnancy stages and to be essential for the establishment of fetal tolerance. However, the mechanisms and factors supporting their increase and function are not well defined. First investigations showed that Treg cells accumulated in the sexually receptive phase of the murine estrous cycle. Thus, it can be assumed that the accumulation of Treg cells around the time of insemination favours early recognition of paternal antigens and thereby prepares the maternal immune system for the implantation of the blastocyst into the maternal endometrium. Experiments investigating the increase of Treg cells during early pregnancy suggest that alloantigens present in the ejaculate mediated early Treg cell augmentation. Moreover TGF-beta, which represents a major component in the seminal fluid, provoked the proliferation of Treg cells. These results suggest that the early expansion of Treg cells is alloantigen-mediated and that seminal fluid-derived TGF-beta is involved in this expansion. Additionally it has been shown that the pregnancy hormone human Chorionic Gonadotropin (hCG) has an important impact on Treg cells during pregnancy. By using human samples it has been proven that hCG mediates the migration of Treg cells to trophoblast cells and supports the conversion of naïve T cells into Treg cells directly at the fetal-maternal interface. In mice, the application of hCG resulted in an increase in the number and function of Treg cells and thereby prevented abortion in a mouse abortion-prone model. Thus, hCG mediates the generation, migration and function of Treg cells and contributes to a successful pregnancy outcome.

Jede Zelle des Säugetierorganismus benötigt Eisen als Spurenelement für zahlreiche oxidativ-reduktive Elektronentransfer-Reaktionen und für Transport und Speicherung von Sauerstoff. Der Organismus unterhält daher ein komplexes Regulationsnetzwerk für die Aufnahme, Verteilung und Ausscheidung von Eisen. Die intrazelluläre Regulation in den verschiedenen Zelltypen des Körpers ist mit einer globalen hormonellen Signalstruktur verzahnt. Sowohl Eisenmangel wie Eisenüberschuss sind häufige und ernste menschliche Krankheitsbilder. Sie betreffen jede Zelle, aber auch den Organismus als Ganzes. In dieser Dissertation wird ein mathematisches Modell des Eisenstoffwechsels der erwachsenen Maus vorgestellt. In ihm wird die Flussbilanz des Eisens in den wichtigsten Zelltypen in Form von transmembranalen und intrazellulären kinetischen Gleichungen dargestellt, und es werden diese Zellmodelle mit dem zentralen Eisenaustausch-Kompartiment (Blutplasma) des Körpers integriert. Der Eisenstatus wird charakterisiert als Gehalt an labil gebundenen Eisen und an ferritin-gebundenen Eisen für jede Zelle. Der Stoffwechsel wird als Netzwerk von Flussdynamik formuliert. Der experimentelle Input in dieses Modells stammt von verschiedenen Quellen. Radioaktive Tracerdaten, gemessen am intakten Tier (Mausstamm C57BL6 – das am intensivsten studierte Tiermodell) unter varrierten physiologischen Bedingungen lieferten den experimentellen Hintergrund, von dem aus Clearance-Parameter durch numerisches Fitting ermittelt wurden. Es wird gezeigt, dass das Modell mit entsprechend adaptierten Parametersätzen die wichtigsten metabolischen und regulatorischen Ereignisse in Übereinstimmung mit den Messungen darstellen kann. In Zukunft soll die quantitative Übereinstimmung mit Daten aus weiteren genetischen Rekonstruktionen (globale und zell-spezifische knock-outs und konstitutive Expression relevanter Gene des Modellorganismus Maus) hergestellt werden. / Every cell of the mammalian organism needs iron as trace element in numerous oxido-reductive processes as well as for transport and storage of oxygen. The mammalian organism maintains therefore a complex regulatory network of iron uptake, excretion and intra-body distribution. Here a mathematical model of iron metabolism of the adult mouse is presented. It formulates the iron flux balance of the most important cell types of the organism in the form of transmembraneous and intracellular kinetic equations and integrates these cell models with the central exchange compartment (blood plasma) of the body. The iron status is represented as content of labile iron and of ferritin-bound iron in every cell type, and the metabolism is formulated as a network of flux dynamics. The experimental input into the model stems from different sources. Radioactive tracer data measured in the intact animal (mouse strain C57BL6 - the most intensively studied animal model) under various physiological conditions provided the experimental background from which clearance parameters could be obtained by numerical parameter fitting. Future research should render more precise the quantitative representation of genetic reconstructions (global and cell-type-addressed knock-out and constitutive expression of relevant genes of the model mouse strain).

Hydrogenasen sind essentielle Enzyme im mikrobiellen H2-Kreislauf und werden als vielversprechende Katalysatoren in biologisch basierten H2-Technologien angesehen. Ein entscheidender Nachteil vieler Hydrogenasen ist ihre hohe O2-Sensitivität. Die membrangebundene Hydrogenase (MBH) aus Ralstonia eutropha ist eines der wenigen Beispiele für Hydrogenasen, die in Gegenwart von O2 katalytisch aktiv sind. Die molekularen Ursachen dieser O2 Toleranz sind bislang ungeklärt. In bisherigen Studien wurde lediglich das [NiFe]-Zentrum und dessen Umgebung auf Faktoren untersucht, die die O2-Toleranz des Enzyms hervorrufen könnten. In dieser Arbeit wurde daher der Fokus auf die kleine Untereinheit der MBH gelegt, in der sich drei elektronentransferierende Fe-S Cluster befinden. Die ligandierenden Aminosäuren dieser Fe-S Cluster wurden mittels ortsspezifischer Mutagenese verändert und die resultierenden MBH-Varianten physiologisch, biochemisch, spektroskopisch und elektrochemisch charakterisiert. Dabei wurde gezeigt, dass die O2-Toleranz der MBH maßgeblich auf einer Modifikation eines dieser drei Fe-S Cluster beruht. In der direkten Umgebung des zum aktiven Zentrum nächstgelegenen Fe-S Clusters befinden sich sechs statt vier Cysteine, wie in O2 sensitiven [NiFe]-Hydrogenasen. Die beiden zusätzlichen Cysteine um dieses proximale Cluster wurden gegen Glycine ausgetauscht, die an der entsprechenden Position in O2-sensitiven Hydrogenasen zu finden sind. Der Austausch der zusätzlichen Cysteine führte in vivo und in vitro zu einer erhöhten O2 Sensitivität der MBH. In EPR-spektroskopischen Untersuchungen wurde beobachtet, dass diese MBH-Variante veränderte elektronische Eigenschaften aufweist. Statt des für O2-tolerante Hydrogenasen typischen EPR-Spektrums wurde ein Signal detektiert, welches in O2-sensitiven Hydrogenasen zu finden ist. Anhand der Ergebnisse wurde ein Modell erstellt, das erklärt, wie eine modifizierte Fe-S Clusterkette zur O2-Toleranz von Hydrogenasen beiträgt. / Hydrogenases are essential for H2 cycling in microbial metabolism and serve as valuable blueprints for H2-based biotechnological application. Like many metalloproteins, most hydrogenases are extremely oxygen-sensitive and prone to inactivation by even traces of O2. The O2-tolerant membrane-bound [NiFe]-hydrogenase of Ralstonia eutropha is one of the few examples that have established a mechanism enabling H2 uptake in the presence of ambient O2. The molecular mechanisms of this O2 tolerance are not yet unravelled. However, up to date, only the large subunit harbouring the [NiFe] active site has been in the focus of studies on O2 tolerance. In the present study, the role of the small subunit with its electron relay, consisting of three Fe-S clusters, was investigated. Amino acid residues involved in coordination of all three clusters were exchanged, and the resulting MBH variants were investigated with physiological, biochemical, electrochemical and spectroscopic methods. It is shown that the rare feature of O2 tolerance is crucially related to a modification of the electron transfer chain. The Fe-S cluster proximal to the catalytic centre is surrounded by six instead of the four conserved coordinating cysteines. Removal of the two additional cysteines renders the protein O2-sensitive in vivo and in vitro. Electron paramagnetic resonance spectroscopy of this MBH variant revealed a signal resembling the spectrum usually detected in O2-sensitive [NiFe]-hydrogenases. The data imply that the major mechanism of O2 tolerance is based on the reductive removal of oxygenic species guided by the unique architecture of the electron transport chain rather than a restricted access of O2 to the active site.

Mechanismen, die zur unterschiedlichen Pathogenität niedrig- und hochpathogener aviärer und humanpathogener Influenzaviren im Menschen beitragen, sind bisher nur ansatzweise verstanden. Auch sind Pathomechanismen, die der Middle East Respiratory Syndrome (MERS)-CoV-Infektion zu Grunde liegen, bisher weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde ein humanes ex vivo Lungenkulturmodell für die Untersuchung der Influenzavirus- und der MERS-CoV-Infektion etabliert. Dabei wurde die Replikationsfähigkeit und der Zelltropismus der Viren systematisch verglichen. Während hochpathogene aviäre, saisonale und pandemische Influenzaviren effizient in der humanen Lunge replizierten, konnten sich niedrigpathogene aviäre Viren und ein porcines Virus kaum vermehren. Alle Viren zeigten jedoch den gleichen Zelltropismus und infizierten im Alveolarepithel ausschließlich Typ II Zellen. Die unterschiedliche Pathogenität dieser Viren lässt sich daher nicht durch Unterschiede im Zelltropismus erklären. Gleichwohl konnte der humane und der aviäre Influenzavirusrezeptor sowohl auf Typ II als auch auf Typ I Zellen nachgewiesen werden. Niedrigpathogene aviäre Influenzaviren sind in der humanen Lunge durch die Freisetzung von zum größten Teil nicht infektiösen Viruspartikeln restringiert. MERS-CoV replizierte in humanem Lungengewebe mit ähnlicher Kinetik wie ein hochpathogenes H5N1 Virus. MERS-CoV Antigen war sowohl im Bronchialepithel, Alveolarepithel sowie im Endothel nachweisbar. Der funktionelle Rezeptors des MERS-CoV, die Dipeptidylpeptidase 4, wurde in allen infizierten Zelltypen sowie in Alveolarmakrophagen nachgewiesen. Die mikroskopische Analyse infizierter Gewebeproben weist zudem auf einen infektionsbedingten Alveolarschaden hin. Die Studie trägt wesentlich zum pathophysiologischen Verständnis pulmonaler Influenzavirus- und MERS-CoV-Infektionen bei. Das humane ex vivo Lungenkulturmodell stellt ein klinisch relevantes Modell zur Untersuchung respiratorischer Infektionen im Menschen dar. / Mechanisms contributing to the different pathogenicity of low and highly pathogenic avian and seasonal influenza viruses in humans are currently only partially understood. Furthermore, underlying pathological mechanisms of the Middle East Respiratory Syndrome (MERS)-CoV infection in humans are widely unknown. In this study a human ex vivo lung culture model was established, which allowed investigating influenza virus and MERS-CoV infection. Replication and cellular tropism of the different viruses were compared systematically. While highly pathogenic avian, seasonal and pandemic influenza viruses replicated efficiently, low pathogenic avian viruses and a porcine virus propagated poorly. However, all viruses showed the same cellular tropism and infected only type II cells within the alveolar epithelium. Therefore, the different pathogenicity of these viruses cannot be attributed to different cellular tropisms. Nevertheless, the human and the avian influenza virus receptor could be detected on type II and type I cells. Low pathogenic avian influenza viruses are restricted in the human lung by the release of mostly non-infectious progeny virus particles. The MERS-CoV replicated with similar kinetics to a highly pathogenic H5N1 virus in the human lung. MERS-CoV antigen was detected in the bronchial epithelium, alveolar epithelium and endothelium. The functional receptor of MERS-CoV, dipeptidylpeptidase 4, was found in all infected cell types and in alveolar macrophages. Microscopic analysis of infected tissue samples indicated an alveolar damage provoked by MERS-CoV infection. This study contributes substantially to the pathophysiological understanding of the pulmonary influenza virus and MERS-CoV infection. The human ex vivo lung culture model represents a clinically relevant model to investigate human respiratory infections.

Die Wüstenameise, Cataglyphis, orientiert sich vor allem mittels Wegintegration. Über einen Heimvektor, den sie aus Distanz und Richtung einzelner Wegabschnitte berechnet, kann sie auf dem kürzesten Weg zu ihrem Ausgangspunkt zurückkehren. Zur Bestimmung der zurückgelegten Strecken verwendet sie einen Schrittintegrator. Die Laufrichtung wird hauptsächlich über Himmelsinformationen (Polarisationsmuster, Sonnenstand und Spektral- und Intensitätsgradienten) definiert. In dieser Arbeit über die Orientierungsfähigkeit von Cataglyphis fortis wird die Rolle des Polarisationskompasses bei der Bestimmung der Laufrichtung untersucht. In verschiedenen Versuchen wurden der Polarisationskompass der Ameise mit Hilfe eines Polarisationsfilters gezielt manipuliert und künstliche Konfliktsituationen erzeugt. Die Richtungsbestimmung wurde vom Polarisationskompass dominiert, wenn allein die Information des Polarisationskompass und idiothetische Richtungsinformation zur Verfügung standen. Erfuhren die Ameise widersprüchliche Informationen von Sonnen- und Polarisationskompass, berechneten sie eine mittlere Heimlaufrichtung, was eine gemeinsame neuronale Verarbeitung der beiden Signale voraussetzt. Diese These wurde durch Transferexperimente gestützt. In einer weiteren Versuchsreihe wurde die Wahrnehmung des Polarisationsmusters durch direkte Manipulation der entsprechenden Region (DRA) im Ameisenauge untersucht. Standen der Ameise in beiden Augen die frontale oder caudale DRA zur Verfügung führte dies zu einem deutlichen Orientierungsverlust. Die intakte DRA eines Auges erlaubte eine zielgerichtete Fortbewegung, die jedoch von der Erwartungsrichtung abwich. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Studie, dass der Polarisationskompass die präziseste Richtungsinformation liefert und den Himmelskompass der Wüstenameise dominiert. / The desert ant, Cataglyphis, navigates predominantly by means of path integration. The information about the distance and direction of individual path segments is integrated into a home vector, which allows the ant to return to the starting point on the shortest way. The distances covered are determined by a stride integrator. The heading direction is inferred mainly via celestial cues: the sky’s polarization pattern, the position of the sun, and the spectral and intensity gradient. This thesis focuses generally on the orientation abilities of Cataglyphis fortis and particularly on the role of the polarization compass to determine the heading direction. In the experiments, the ant’s polarization compass was selectively manipulated using a polarization filter and artificial cue conflict situations were created. The ants relied exclusively on the polarization compass to determine their heading direction if only idiothetic information and information from the polarization compass were available. When the ants experienced contradicting information detected via the sun and the polarization compass systems, an intermediate homing direction was calculated, suggesting a combined neural processing of both signals. This statement was supported by transfer experiments. In a further series of experiments, the input part of the polarization compass was manipulated. Particular regions of the ant’s eye (DRA) that detect polarized light were occluded. Ants with only the frontal or caudal parts of the DRA became disoriented, whereas ants with the entire DRA of one eye were able to perform more precise paths, although deviated from the expected direction. Overall, the results from this thesis suggest that the polarization compass provides the most accurate directional information and dominates the celestial compass system of the desert ant.

In einem RT-PCR Ansatz aus neuronalen post mortem Gewebe des Menschen konnten EPB41 (Erythrozytäres Protein Bande 4.1) Spleißformen in verschiedenen Hirnregionen nachgewiesen werden. In einem weiteren RT-PCR Ansatz wurden höhermolekulare p4.1R-Spleißormen generiert, kloniert und zwei der erhaltenen Spleißformen (Klon 9 und Klon 13) charakterisiert. In einer In-situ-Hybridisierungsstudie an humanen Temporalkortex und Hippocampus konnten EPB41-Isoformen in fast allen Neuronen nachgewiesen werden. In immunhistochemischen Untersuchungen mit selbstgenerierten p4.1R spezifischen Antikörper wurden ebenfalls ausschließlich Neurone markiert. In proteinbiochemischen Untersuchungen konnte in verschiedenen humanen Hirnareale mit den p4.1R spezifischen Antikörpern eine 110 kDa und 120 kDa immunreaktive Bande nachgewiesen werden. In Experimenten an Primärkulturen von Rattenneuronen konnte eine Herunterregulation der p4.1R Proteine sowie der mRNA von p4.1R durch Verarmung des funktionellen Pools an G-Proteinen der Rho-Familie in der Zelle gezeigt werden. Die GTPasen der Rho-Familie regulieren unter anderem die Plastizität des Dendritenbaumes von Neuronen. / In a RT-PCR approach using human postmortem cerebral tissue from different brain regions several EPB41 (erythrocyte protein band 4.1) spliceforms could be generated. The amplificates were cloned and two of the highmolecular EPB41 spliceforms Klon 9 and Klon 13 were characterized. Klon 9 is a new spliceform, Klon13 is identical with EPB41 (accesion number AF156225). In an in situ hybridization study the EPB41 spliceforms were detected in almost all neurons of the temporal cortex and the hippocampus. Immunhistochemical localization of the p4.1R immunreactive proteins in human temporal cortex using p4.1R specific peptide antibodies, confirmed these results. The stning pattern of soma and dendrites of the neurones was punctuated. In Western Blot experiments a 110 kDa and 120 kDa p4.1R immunreactive proteinband was detected. A regulation of the protein 4.1R immunreactive proteins as well as the mRNA of protein 4.1 was found in experiments in which the functional pool of Rho GTPases in hippocampal primary neurones of the rat was manipulated.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der beiden cyanobakteriellen Phytochrome Cph1 und Cph2 untersucht. Dafür wurde zunächst das Wachstum von Mutanten mit einem inaktivierten cph1- bzw. cph2-Gen unter verschiedenen Lichtbedingungen analysiert. Das Wachstum aller Phytochrommutanten war unter Starklicht beeinträchtigt. Dahingegen wuchs die cph1-Mutante im FRL schlechter als der Wildtyp, während das Wachstum der cph2-Mutante im RL vermindert war. Eine cph1/cph2-Doppelmutante zeigte unter allen Lichtbedingungen eine Wachstumsreduktion, die der jeweiligen Einzelmutante ähnlich war. Die genaue Ursache für die Beeinträchtigung des Wachstums der Phytochrommutanten konnte nicht ermittelt werden. Die verschiedenen Aspekte der Photosynthese, wie Pigmentzusammensetzung, maximale Netto-Sauerstofffreisetzungsrate und 77K-Fluoreszenzemission, waren in den Phytochrommutanten nicht signifikant verändert. Bei Synechocystis sp. PCC 6803 konnte eine lichtgerichtete Bewegung beobachtet werden, wobei man aufgrund von Aktionsspektren der Motilität eine Funktion der Phytochrome oder phytochromähnlichen Proteine bei der Steuerung der phototaktischen Bewegung vermutet. Dem Cph1-Protein konnte hierfür keine Rolle zugeordnet werden. Dahingegen scheint der Photorezeptor Cph2 die lichtgerichtete Bewegung der Zellen in Richtung einer Blaulichtquelle zu inhibieren. Eine Interaktion mit einem klassischen Blaulicht-Rezeptor konnte ausgeschlossen werden. / The function of the cyanobacterial phytochromes Cph1 and Cph2 was investigated. At first, the growth of mutants with an inactivated cph1 or cph2 gene was analysed under different light conditions. The growth of all phytochrome mutants was affected under high-light conditions. However, the cph1 mutant grew slower than the wild type in far-red light, whilst the cph2 mutant revealed a reduced growth under red light conditions. A decreased growth of the cph1/cph2 double mutant was observed under all light conditions with a growth rate similar to the corresponding single mutant. The exact reason for the growth impairment of the phytochrome mutants could not be ascertained. Different aspects of photosynthesis (pigment composition, maximal net-oxygen evolution and 77K fluorescence emission) were not changed significantly in the phytochrome mutants. Synechocystis sp. PCC 6803 shows a movement towards a light source. Based on action spectra of motility phytochromes and phytochrome-like proteins are supposed to have a function in regulating the phototactic movement. An influence of the Cph1 protein in the phototactic movement was not demonstrated. Whereas, the Cph2 protein seems to be involved in the inhibition of the cell movement towards blue light. An interaction with a typical blue-light receptor was excluded.

Das Ubiquitin-Proteasom-System gewährleistet in eukaryontischen Zellen den regulierten Abbau der meisten intrazellulären Proteine und ist mit der Generierung von T-Zell-Epitopen grundlegend an der Immunantwort beteiligt. Wegen der Komplexität des Systems stand ein in vitro Verfahren zur 26S proteasomalen Prozessierung eines ubiquitinierten Modellsubstrates erstmals im Jahr 2000 zur Verfügung. In der vorliegenden Arbeit gelang es, diese von Thrower et al. publizierte Methode hinsichtlich einer größeren Proteinquantität zu optimieren und auf die in vitro Ubiquitinierung und Degradation von Proteinen anzuwenden, deren proteasomaler Abbau unter dem Aspekt der Epitopgenerierung immunologisch von besonderer Relevanz ist. Die biochemische und massenspektrometrische Analyse der 26S proteasomalen Degradation von penta-ubiquitinierten Derivaten des tumorassoziierten Glykoproteins Mucin1 zeigte erstens, dass die Prozessierung der Substrate zu einem 26S proteasomalen gating-Effekt führt, der von Substratbindung und -deubiquitinierung sowie von ATP-Hydrolyse abhängig ist. Zweitens ließ sich als Folge der Substratprozessierung eine Instabilisierung des 26S Proteasoms beobachten, die auf einen Assoziations-Dissoziations-Zyklus hindeutet. Drittens ergab die Untersuchung zum Einfluss des Proteasom-Aktivators PA28 auf den Abbau eines Mucin1-Polyepitops, dass PA28 eine erhöhte Quantität an 26S proteasomal generiertem Epitop verursacht. Viertens war unter Zuhilfenahme des Inhibitors clasto-Lactacystin und anhand der ubiquitinierten Mucin1-Derivate erstmals für ubiquitinierte Substrate nachweisbar, dass die proteasomale katalytische Untereinheit beta5 für die Proteindegradation durch den 26S-Komplex nicht essentiell ist. Das in der vorliegenden Arbeit etablierte Abbausystem hat zudem sein Potential unter Beweis gestellt, als ein in vivo-nahes in vitro Testsystem zu fungieren, um die Wirksamkeit von Proteasom-Inhibitoren sowie die Prozessierbarkeit von Polyepitop-Vakzinen zu bewerten. / The ubiquitin-proteasome pathway plays a major role in cellular protein degradation. By generating T-cell epitopes it contributes essentially to the immune response. The complexity of the system impeded the establishment of an in vitro approach that would make a detailed analysis of the protein degradation by the 26S proteasome possible. Finally, in 2000 Thrower et al. published an in vitro method enabling the synthesis and degradation of an ubiquitinated model substrate by the 26S proteasome. In the study presented here the approach of Thrower et al. was improved by scaling up and by the synthesis of substrates the degradation of which by the 26S proteasome is of great importance immunologically, mainly in regard to the generation of T-cell epitopes. In vitro synthesised penta-ubiquitinated versions of the tumor-associated glycoprotein mucin1 were processed by purified 26S proteasomes. The analysis of substrate degradation and product generation by biochemistry and mass spectrometry showed firstly, that substrate processing initiated a 26S proteasomal gating effect which depends on substrate binding to the proteasome, deubiquitination and proteasomal ATP-hydrolysis. Secondly, a disassembly of the 26S proteasome was observed following substrate processing which suggests a regulated association-dissociation cycle of the proteasome. Thirdly, supplementation of the degradation approach with the proteasome activator PA28 led to a higher quantity of epitope generated by the 26S proteasome out of a mucin1 polyepitope string. Fourthly, use of the proteasome inhibitor clasto-Lactacystin revealed, for the first time, that the catalytic proteasome subunit beta5 is not essential for the degradation of ubiquitinated protein substrates by the 26S proteasome. In addition, the in vitro approach established in the presented study has shown its potential to function as an in vivo-like system which helps to assess proteasome inhibitors and potential polyepitope vaccines.

In der vorliegenden Arbeit wird ein neuer Ansatz vorgestellt, um Lipiddomänen, die Bindungsorte peripherer und integraler Membranproteine darstellen können, zu charakterisieren. Insbesondere wurde die Analyse der Fluoreszenzlebenszeiten von NBD-markierten Lipidanaloga benutzt, um Lipiddomänen in Giant unilamellar vesicles (GUV) und darauf aufbauend, in der Plasmamembran von Säugerzellen zu untersuchen. Das typische Zeitfenster von Fluoreszenzlebenszeiten im Bereich von Nanosekunden ermöglicht es, auch sehr kurzlebige Lipiddomänen nachzuweisen. Mit Hilfe des Fluorescence lifetime imaging (FLIM) wurden für die liquid disordered (ld) und liquid ordered (lo) Domänen in GUV jeweils spezifische Werte für das Abklingen der Fluoreszenz gemessen. Sogar die Existenz von submikroskopischen Domänen in GUV konnte nachgewiesen werden. Die Fluoreszenzlebenszeit des Lipidanalogs C6-NBD-PC zeigte in der Plasmamembran von Säugerzellen eine breite Verteilung. Dies legt in Übereinstimmung mit FLIM-Experimenten an aus der Plasmamembran von HeLa-Zellen gewonnenen Giant vesicles nahe, dass in der Plasmamembran von Zellen eine Vielzahl verschiedener submikroskopischer Lipiddomänen existiert. Darauf aufbauend wurde die Fluoreszenzmikroskopie an GUV angewendet, um die Bindung von fluoreszenzmarkiertem alpha-Synuclein an mittels FLIM charakterisierte Lipiddomänen zu untersuchen. Die Experimente zeigten, dass das Protein mit hoher Affinität an negativ geladene Phospholipide unter der Vorraussetzung bindet, dass diese sich in ld Domänen befinden. Im Gegensatz dazu erfolgt keine Bindung wenn diese Lipide in lo Domänen lokalisiert sind. Im Vergleich zum wildtypischen alpha-Synuclein zeigte die Variante A30P eine geringere Affinität zur Membran, während die E46K-Variante eine stärkere Bindung zeigte. Dies deutet darauf hin, dass bei den erblichen Formen des Morbus Parkinson eine veränderte Assoziation des alpha-Synucleins mit der Membran eine Rolle spielen kann. / In the present study a novel approach to characterize lipid domains, which may provide binding sites for peripheral or integral membrane proteins, is demonstrated. In particular, analysis of fluorescence lifetimes of NBD-labeled lipid analogues was used to study lipid domains in Giant unilamellar vesicles (GUV) and – based on the GUV results – in the plasma membrane of mammalian cells. As fluorescence decays in a few nanoseconds it is possible to to detect also very short-lived lipid domains. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) revealed that the fluorescence decay of NBD-lipid analogues showed domain dependent decay times in the liquid disordered (ld) and the liquid ordered (lo) phase of GUV. Even the existence of submicroscopic domains in lipid membranes could be detected by FLIM. A broad distribution of the fluorescence lifetime was found for C6-NBD-PC inserted in the plasma membrane of mammalian cells. In agreement with FLIM studies on lipid domain forming Giant vesicles derived from the plasma membrane of HeLa-cells this may suggest that a variety of submicroscopic lipid domains exists in the plasma membrane of intact mammalian cells. Based on that, fluorescence microscopy was used on GUV to study the binding of fluorescently labeled alpha-synuclein at lipid domains previously characterized by FLIM. The experiments suggested that alpha-synuclein binds with high affinity to negatively charged phospholipids, when they are embedded in a ld as opposed to a lo environment. When compared with wildtype alpha-synuclein, the disease-causing alpha-synuclein variant A30P bound less efficiently to anionic phospholipids, while the variant E46K showed enhanced binding. This suggests that an altered association of alpha-synuclein with membranes may play a role in the inherited forms of Parkinson’s disease.

Das Bakterium Legionella pneumophila vermehrt sich in Alveolarmakrophagen und kann zu einer Pneumonie, der Legionärskrankheit, führen. Phospholipasen können zur bakteriellen Pathogenität beitragen, indem sie den Wirt durch Zerstörung von Lipidstrukuren schädigen, oder über die Generation von „second messengern“ immunmodulatorisch wirken. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die prominenteste zell-assoziierte und hämolytische Phospholipase A/Lysophospholipase A (PlaB) von L. pneumophila Corby charakterisiert und auf eine mögliche Virulenzassoziation hin untersucht. Die Bestimmung des Transkriptionsstartpunktes von plaB ermöglichte die Identifikation einer möglichen sigma70-Bindungsstelle. Die Transkriptionsrate ist relativ gering und nimmt zur stationären Phase hin ab, das Enzym ist vorwiegend exponentiell aktiv. Enzymatisch aktives PlaB-Protein ist zumindest zum Teil auf der oberflächenexponierten Seite der äußeren Membran lokalisiert. Der Transport des PlaB-Proteins ist nicht vom Tat-abhängigen Transport oder den Sekretionssystemen des Typ I, II oder IVB abhängig. Im Meerschweinchenmodell konnte eine Virulenzassoziation von PlaB nachgewiesen werden. PlaB-defiziente Bakterien zeigten eine geringere Replikationsrate in den Lungen und eine verminderte Kolonisierung der Milz. Vergleichende histologische Studien zeigten eine schwächer ausgeprägte Inflammation und Zerstörung der Lungen nach Infektion mit der plaB-Mutante. Somit handelt es sich bei PlaB um ein innerhalb der Spezies Legionella sehr weit verbreitetes Protein, welches in L. pneumophila Corby vorwiegend vor dem Eintritt in die stationäre Phase exprimiert wird. Enzymatisch aktives PlaB-Protein ist an der oberflächenexponierten Seite der äußeren Membran zu finden und spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Legionellen-Pneumonie. / The bacterium Legionella pneumophila replicates inside of alveolar macrophages and causes a severe pneumonia, the Legionnaires` disease. Bacterial phospholipases are well known virulence factors. Some cause cell lysis by pore formation, others generate second messengers and modulate the inflammatory response of the host. The aim of this work was to further characterize the major cell-associated hemolytic phospholipase A/lysophospholipase A activity (PlaB) of L. pneumophila Corby and to investigate a possible role of PlaB as virulence factor. Determination of the transcriptional start site of plaB allowed the identification of a possible sigma70-binding site. The transcription rate is relatively weak and decreases from exponential to stationary phase and enzymatic activity is most prominent in the exponential growth phases. Enzymatically active PlaB-protein is at least in parts localised on the surface-exposed side of the outer membrane. Studies with mutants of the Tat-dependent pathway and the type I, II, IVB secretion systems showed that these pathways are not involved in secretion of the PlaB-protein. Infection of guinea pigs revealed that PlaB plays an important role in proliferation of the bacteria in the lungs and dissemination to the spleen. Comparative histological studies revealed a less extensive inflammation and destruction of the lungs infected with the plaB-mutant strain. In summary, this work revealed that PlaB is a protein which is widespread within Legionella species. In L. pneumophila Corby, it is primarily expressed and active before stationary phase. Enzymatically active PlaB-protein is at least in parts located at the surface-exposed side of the outer membrane and contributes to the establishment of Legionnaires` disease.