In dieser Arbeit konnten mittels des BACTH-Systems Interaktionen des kompletten KdpD Proteins sowie der N-terminalen Domäne (KdpD1-395) mit den N- und C-terminalen (KdpD396-894) Domänen von KdpD nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde der Zusammenhang zwischen dem Interaktionsverhalten und den Phänotypen bestimmter Punktmutations- und Deletionsmutanten von KdpD untersucht, jedoch konnte eine solche Abhängigkeit nicht bestätigt werden. Die Lokalisation von KdpD-GFP wurde in dem kdpD-Teildeletionsstamm TKV2208 untersucht, in dem sich das Hybridprotein membrangebunden in einem gepunkteten Verteilungsmuster entlang des Zellkörpers nachweisen lässt. Besonders interessant ist das häufige Vorkommen spiralförmiger KdpD-GFP Strukturen, welche sich entlang des Zellkörpers zeigen. Daher wurde eine Beeinflussung der Lokalisation von KdpD-GFP durch MreB vermutet. Eine Behandlung der Zellen mit der Verbindung A22 veränderte die Proteinverteilung jedoch nicht. Daher ist anzunehmen, dass die KdpD-GFP Lokalisation in E. coli MreB-unabhängig erfolgt. Des Weiteren wurde eine Beeinflussung der Lokalisation des Hybridproteins durch das Penicillin-Bindeprotein 3 in Erwägung gezogen. Um diese Möglichkeit zu evaluieren wurde PBP3 mit Cephalexin spezifisch gehemmt. Jedoch konnte kein Unterschied zur vorher aufgeführten Lokalisation von KdpD-GFP beobachtet werden. Ein weiterer Aspekt der Lokalisationsstudien war, ob Cardiolipin einen Einfluss auf die KdpD-GFP Lokalisation hat. Für diese Fragestellung wurde der Stamm UE54 benutzt, welcher kein Cardiolipin synthetisieren kann. Es konnte gezeigt werden, dass Cardiolipin keinen Einfluss auf die Lokalisation von KdpD-GFP zu haben scheint. Darüber hinaus wurde die Abhängigkeit der KdpD-GFP Lokalisation von SecB und SecG mittels Deletionsmutanten getestet. Die Deletion dieser beiden Sec-Translokationsproteine führte jedoch zu keiner Veränderung der Lokalisation von KdpD-GFP.

Das Endoplasmatische Reticulum (ER) bildet ein ausgedehntes Netzwerk aus Membran-tubuli und abgeflachten Zisternen in der eukaryontischen Zelle. In dieser Arbeit wurde unter Verwendung eines Extraktes der Eier von Xenopus laevis ein in vitro System zur Bildung der polygonalen Membrannetzwerke des ER entwickelt. In diesem System wurde zum ersten Mal eine Mikrotubuliunabhängige Bildung der Membrannetzwerke des ER demonstriert und damit die Existenz Mikrotubuli-unabhängiger Mechanismen für ihre Bildung. Die Membrantubuli entstehen durch die Fusion kleiner Membranvesikel miteinander. Diese Fusion allein, die unabhängig von Cytosol ist, ist jedoch nicht ausreichend, da durch die Fusion in Abwesenheit von Cytosol lediglich große, kugelförmige Membranvesikel entstehen. Vielmehr ist eine unbekannte cytosolische Aktivität notwendig, damit die Fusion zur Bildung von Membrantubuli und Netzwerken führt. Mit dem in vitro System wurde die Voraussetzung für die Identifizierung dieser Mikrotubuli-unabhängigen, cytosolischen Aktivität geschaffen. Das Verhalten des ER in vitro ähnelt dem des ER in Zellen. Werden Zellen mit Calcium-Ionophoren behandelt, so deassembliert das ER, während in vitro die Bildung des ER durch hohe Konzentrationen von Ca2+ verhindert wird. In der Mitose deassembliert das ER in Abhängigkeit vom Zelltyp zu einem unterschiedlichen Ausmaß. Analog wird das ER in vitro zu einem unterschiedlichem Ausmaß gebildet, abhängig von der Art, in der die zugegebenen mitotischen Cytosole hergestellt wurden. Die Kernhülle hat Ähnlichkeit mit den abgeflachten Zisternen des ER und des Golgi-Apparates. In dieser Arbeit wurde die Bildung des Zellkerns in einem zellfreien System etabliert, das den für die ER-Bildung eingesetzten Extrakt verwendet. Einzelne Phasen bei der Bildung der Kernhülle wurden in einem vereinfachten Kernbildungssystem untersucht. Dabei wurde ein neuer Schritt in diesem Prozeß entdeckt: Das Abflachen von Chromatin-gebundenen Membranvesikeln auf der Oberfläche des Chromatins. Die hierfür verantwortliche Aktivität befindet sich in der cytosolischen Fraktion. Ohne Cytosol binden die Kernmembranvesikel an das Chromatin und fusionieren miteinander, die resultierenden großen Membranvesikel bleiben jedoch kugelförmig, flachen nicht ab und können keine Kernhülle bilden. Die Identifizierung der cytosolischen Faktoren, die an dem Abflachen der Membranen bei der Bildung der Kernhülle und der Bildung der Membrantubuli des ER beteiligt sind, sollte Hinweise auf die zugrunde liegenden Mechanismen geben und zeigen, ob verwandte Mechanismen an der Bildung ähnlicher Membranstrukturen in der eukaryontischen Zelle beteiligt sind.

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Im tropischen Trockenwald im Nordwesten Costa Ricas wurde der Verlauf der Regeneration von Sekundärwäldern untersucht. Neun Sukzessionsstufen, die seit unterschiedlichen Zeiträumen ohne erkennbare anthropogene Störungen wuchsen, waren Bestandteil dieser Untersuchungen. Analysiert wurden folgende Aspekte der natürlichen Sylvigenesis degradierter Trockenwaldareale. 1. Die aktuellen Vegetationsbestände der Untersuchungsflächen umfassten 328 Gefäßpflanzenarten aus 79 Familien und 247 Gattungen. Die höchste Artenvielfalt zeigte sich nach 15 Jahren mit 140 Arten. Die Diversität der Gehölzspezies war nach 20 Jahren am Höchsten. 2. Die potentielle Vegetation wurde anhand der Diasporen- und Keimlingsbanken untersucht. Insgesamt wurden 14567 Ausbreitungseinheiten in allen Flächen angetroffen. 122 Diasporenarten waren insgesamt vertreten. Wurden die jüngeren sekundären Flächen durch Nichtgehölze geprägt, beherrschten Gehölze die älteren Waldflächen. Die Artenvielfalt der Keimlingsbanken zeigt nach 10 Jahren einen sprunghaften Anstieg, wobei die Diversität sich in den drei ältesten Flächen auf etwa 50 Gehölzspezies einstellte. 3. Vorhandene Standortfaktoren, die Einfluss auf die natürliche Sylvigenesis nehmen, wurden analysiert. Die Pflanzenbedeckung zeigte während des Sukzessionsverlaufs ein prozentuales Absinken im Bodenbereich bei gleichzeitiger Zunahme des Anteils der Baumschichten. Die Temperaturdifferenzen in der Tag- und Nachtrhythmik senkte sich von etwa 24°C in den jüngsten Flächen auf 11°C im ältesten Waldstück. Die vorliegende Arbeit stellt umfassende Erkenntnisse über den komplexen Verlauf der Sylvigenesis innerhalb der Trockenwaldareale Costa Ricas zur Verfügung. Die gelieferten Ergebnisse sind ein Beitrag, die einer effektiveren Gestaltung der Renaturierungsmaßnahmen auch in anderen tropischen Waldformationen dienen können.

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In the presented studies, chitin synthase containing nanoparticles (chitosomes) from the yeast Saccharomyces cerevisiae lacking the chs3 gene were investigated. Two step centrifugations using sucrose gradients led to considerable purity of the chitosomal complexes. Chitin synthase I activity was determined via a previously described ELISA based WGA assay and a novel assay using the Streptomyces chitin binding protein CHB1, which provided good tools to follow the purification procedure. In collaboration, it could be shown that the complexes produce fibers in the presence of the substrates uridine-diphosphate-N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc) and N-acetylglucosamine (GlcNAc) and this reaction was inhibited by addition of chitin synthase inhibitor nikkomycin Z. These results demonstrate for the first time that CSI containing chitosomes can be gained. Investigation of the purified nanocomplexes with CSI activity led to the additional conclusion that proteins of the glycolytic pathway such as glyceraldehyde-3-phosphate (GAPDH isoform Tdh3), enolase (Eno1), pyruvate decarboxylase (Pdc1) and pyruvate kinase (Pyk1) are also concentrated around the peak of CSI activity. The presence of these proteins in the pure chitosomes was further verified via testing for their individual enzymatic activities and by antibody studies. The relative levels of GAPDH, Pdc1 and Pyk1 were found to be higher in comparison to enolase; however GAPDH and Pdc1 proteins had a broad distribution across the purification gradient and were also found in neighboring fractions of peak of CSI activity. In addition to these, two high molecular weight proteins showing similarity to glucan synthase and fatty acid synthase were also found in such fractions as analyzed via MALDI-MS. In future it will be worthwhile to ascertain the active functional relationships among the different proteins found in chitosomal preparations using immuno fluorescence co-localization studies.

Während bei Prokaryonten, Pflanzen und Pilzen der Transport von Zuckern über Membranen mit Hilfe von Disaccharid-Transportern erfolgt, ist bei Tieren, vor allem Säugern, nach der allgemein anerkannten Vorstellung nur der Transport von Monosacchariden bekannt. Die vorliegende Dissertation, in der ScrT, ein bislang unerforschtes Protein aus der Fruchtfliege Drosophila melanogaster untersucht und charakterisiert wurde, beinhaltet Daten, die diese Vorstellung in Frage stellen.Die Expression von ScrT in Hefestämmen ermöglichte das Wachstum auf einem Minimalmedium, das als einzige C-Quelle Saccharose enthält, und Tests mit radioaktiv (14C) markierter Saccharose belegten, dass Hefestämme, die das untersuchte Protein heterolog exprimieren, Transportaktivität für dieses Disaccharid aufweisen.Die mittels Immunhistochemie ermittelte in vivo-Lokalisation von ScrT führte zu unterschiedlichen Resultaten. Zum einen waren in den adulten Fruchtfliegen deutliche Signale im Mitteldarm zu erkennen. Zum anderen wurden vesikuläre Strukturen in Follikelzellen der Ovarien gefärbt. Diese offenbar Melanin enthaltenden Strukturen fanden sich auch im Chorion der abgelegten Embryonen. Somit scheint es sich bei diesen Vesikeln um Melanosomen oder funktionell analoge Organellen zu handeln, in deren Membran das untersuchte Protein lokalisiert ist und die sekretorisch bei der Bildung des Chorions an dieses abgegeben werden. Die Lokalisierung von ScrT in den Follikelzellen wurde mittels in situ-Hybridisierung bestätigt.Den vorliegenden Daten zufolge dürfte ScrT unter anderem den Eintritt von Saccharose in Melanosomen regulieren, wo das chemisch relativ inerte Disaccharid als kompatibler Osmolyt fungieren und das osmotische Gleichgewicht während der Polymerisation von Melanin ausbalancieren könnte. Im Einklang mit dieser Hypothese steht auch, dass Mutationen in MATP, dem menschlichen Ortholog von ScrT, zu einer bislang wenig erforschten Form des Albinismus (OCA4) führen.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der cytoplasmatischen Untereinheit KtrA des K - Transportsystems KtrAB aus V. alginolyticus. KtrA gehört zur Familie der KTN/RCK Proteine. Ligandenbindung an entsprechende Proteine oder Proteindomänen ist direkt mit der Regulation entsprechender Transportsysteme verbunden. Im Verlauf dieser Untersuchung wurde KtrA mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt und anstelle der erwarteten NAD(H)-Bindung, da die Aminosäuresequenz von KtrA den konservierten Rossman fold aufweist, eine ATP-Bindung festgestellt. Die Bindung von ATP führt zu einer Konformationsänderung des Proteins. Mittels Flowdialyse konnten Dissoziationskonstanten sowohl für ATP, als auch für andere Nukleotide ermittelt werden. Ebenfalls wurde gezeigt, dass ATP die Assemblierung des KtrAB-Komplexes unterstützt, sowohl unter denaturierenden, als auch unter nativen Bedingungen. Der Bedarf an ATP konnte letztlich durch Energiekopplungsexperimente in vivo bestätigt werden.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine mögliche Beteiligung der Protein-Translokase des Endoplasmatischen Retikulums aus Canis familiaris an der Vermittlung eines passiven Calcium-Ausstromes aus dem ER-Lumen untersucht. Der Sec61-Komplex konstituiert eine ionenpermeable Pore im Translokon des Endoplasmatischen Retikulums. Der Kanal zeigt eine hohe Dynamik im Schaltverhalten mit einer Vielzahl von Unterleitwerten, deren Mittelwerte gut mit publizierten Daten übereinstimmen. Zudem besitzt die Pore eine geringe Anionenselektivität in Experimenten mit KCl-Lösungen. Unter Verwendung von CaCl2- und MgCl2-Elektrolyten steigt diese deutlich an, was in vivo den Sec61-vermittelten, passiven Calcium-Ausstrom aus dem ER limitieren kann. Calmodulin (CaM) konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit als potenter Effektor des Sec61-Kanales identifiziert werden. Das Protein vermittelt ein Calcium-abhängiges, nahezu vollständiges Schließen des Kanals, während Calcium-freies ApoCalmodulin keinen Effekt auf den Offenzustand hat. Mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass ein IQ-Motiv als putative Calmodulin-Bindestelle im cytosolischen N-Terminus der Sec61alpha-Untereinheit Ca2 -CaM mit nanomolarer Affinität bindet, eine Interaktion mit ApoCaM hingegen erst bei wesentlich höheren Konzentrationen stattfindet. Die CaM-vermittelte, negative Feedback-Regulation des Sec61-Komplexes durch Calcium legt einen CDI- (calcium-dependent inactivation) Mechanismus nahe, der die Membranbarriere des Endoplasmatischen Retikulums auch in Anwesenheit des weiten Translokonkanals aufrecht erhält.Vergleichende Experimente haben zudem ergeben, dass der Sec61-Kanal aus Saccharomyces cerevisiae im Hinblick auf die grundsätzlichen elektrophysiologischen Eigenschaften übereinstimmende Charakteristika mit dem Komplex aus Canis familiaris zeigt.

Es erfolgte eine Analyse der Regulation der chloroplastidären NADP-MDH und deren Rolle als poising-Mechanismus in Arabidopsis thaliana. Es wurden WT-Pflanzen im Kurztag (KT) oder im Langtag (LT) angezogen und dann einer Überreduktion durch Erhöhung der bereitgestellten Energie unterzogen. In KT- und LT-Pflanzen konnten unterschiedliche Strategien ermittelt werden, um überschüssige Elektronen zu entsorgen. Während KT-Pflanzen redox-vermittelte Akklimatisierungssignale benutzen, um eine bessere Lichtnutzung und ein optimiertes Redox-poising zu erreichen, herrscht in LT-Pflanzen der Schutz vor oxidativem Schaden vor. Es erfolgte eine Charakterisierung von im KT angezogenen NADP-MDH-knock-out-Pflanzen. Da schon unter Kontrollbedingungen erhöhte Aktivitäten von antioxidativen Enzymen vorlagen, reagieren NADP-MDH-KO-Pflanzen wie Pflanzen, die Starklicht-Intensitäten ausgesetzt sind. Die Kapazität der NADP-MDH wird transkriptional reguliert. Um die Signale und Interaktionspartner zu identifizieren, die die verstärkte Transkription der NADP-MDH vermitteln, wurde der Promotorbereich des Enzyms analysiert. Es konnten insgesamt 39 Proteine identifiziert werden, die möglicherweise die verstärkte Transkription der NADP-MDH vermitteln. Unter anderem wurde die Bindung von cytosolischer GAPDH innerhalb der kodierenden Sequenz des NADP-MDH-Gens wahrscheinlich gemacht und in vitro verifiziert. Die Bindestelle der cytosolischen GAPDH wurde auf einen 257 bp umfassenden Bereich eingegrenzt. Es wird postuliert dass es sich um einen regulierten Promotor mit upstream- und downstream-Elementen, sowie mit cis-Elementen innerhalb der CDS handelt. Daher handelt es sich bei dem Gen der NADP-MDH um einen null-core- oder einen distinct-INR-Promotor.