Kaliumkanäle ermöglichen es, den geladenen Kaliumionen selektiv die hydrophobe Lipidphase von Zellmembranen zu passieren. Sie operieren in ihren Funktionen als Antagonisten von Natrium- und Kalziumkanälen, um die elektrische Erregbarkeit von Zellen zu kontrollieren. Im ZNS der Vertebraten existiert eine Vielzahl verschiedener Kaliumkanäle, welche die zeitliche Struktur von Aktionspotentialen festlegen. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden bisher unbekannte Kanäle aus den Familien der spannungsgesteuerten Kv1-/Kv3- und der kalziumsensitiven SK-/BK-Kaliumkanäle aus dem ZNS der Regenbogenforelle kloniert. Diese wurden durch heterologe Expression in Insekten- und Säugerzellen einer biophysikalischen und pharmakologischen Charakterisierung zugeführt. Gegen fünf der bekannten Kanäle wurden spezifische Antikörper hergestellt. Mit Hilfe immunhistochemischen und PCR-Techniken konnte die gewebetypische und entwicklungsspezifische Expression der Kaliumkanäle untersucht werden. Mit den in dieser Arbeit präsentierten Daten konnte die Grundlage für eine differentielle Betrachtung der funktionellen Bedeutung und des Expressionsmusters der entsprechenden Kaliumkanäle im nativen Kontext gelegt werden.

Im Rahmen der Arbeit Molekularbiologische Charakterisierung des Glukose Phosphotransferase System Regulators MtfA aus Escherichia coli wurde das als Mlc titration factor A charakterisierte Protein MtfA auf genetischer, biochemischer und physiologischer Ebene näher charakterisiert. Mit Hilfe von gezielten Austauschen konservierter Aminosäuren konnte im aminoterminalen Bereich eine leuzinreiche Dimerisierungsdomäne und im carboxyterminalen Bereich eine Mlc Wechselwirkungsdomäne identifiziert werden. Letzteres konnte mit Hilfe von Di-Hybrid Studien unabhängig bestätigt werden. Die EIIBGlc Domäne des Glukosetransporters vermag Mlc zu binden. Durch die Membranassoziation des Transporters kann Mlc von seiner Operatorsequenz durch Titration entfernt werden. Lösliches EIIBGlc bindet ebenfalls an Mlc. Es löst aber keine Inaktivierung des Repressors aus. MtfA dagegen liegt cytoplasmatisch vor und inaktiviert Mlc vermutlich über die Inhibierung seiner Tetramerisierung. Eine parallele Expression von MtfA und EIIBGlc zeigte einen inhibitorischen Einfluss von EIIBGlc auf die Wechselwirkung von MtfA und Mlc. Physiologische Untersuchungen von MtfA weisen auf einen Einfluss des Proteins auf das Chemotaxisverhalten von E.coli hin. Darüber hinaus konnte ein relativ schwacher mtfA-Promotor nachgewiesen werden. Im Rahmen von Wachstumskompetitionsversuchen wurde ein Wachstumsvorteil des MtfA Wildtyps im Vergleich zur Mutante beim Wachstum auf Glukose und bei 42°C beobachtet. Außerdem stellte sich bei diesen Versuchen ein Unterschied in der Regulation von MtfA in den Stämmen K-12 und LJ110 heraus. Dieser konnte im Rahmen von RT-RT PCR Studien sowie mittels Western-Blot Analysen bestätigt werden. Die erfolgreiche Reinigung des Proteins ermöglichte den Nachweis der Dimerisierung in verschiedenen biochemischen Analysen, sowie die Herstellung spezifischer Antikörper.

Zur Klärung der Frage, welche Rolle die Annexinen-homologen alpha-Giardine 14 und 19 tatsächlich im Lebenszyklus des humanpathogenen Darmparasits Giardia lamblia einnehmen, wurden verschiedene molekularbiologische und biochemische Untersuchungen durchgeführt. Die Untersuchungen im Falle des alpha14-Giardins ergaben, dass das Protein nur in gewissen Regionen der membranumgebenen Bereiche der Flagellen als Perlenschnur-ähnliche Verdickungen vorlag. Zusätzlich konnte sowohl eine Assoziation mit den Mikrotubuli des Axonems als auch mit der Plasmamembran nachgewiesen werden. Bei der Fahndung nach direkten Interaktionspartnern des alpha14 belegten verschiedene Methoden eine Wechselwirkung zwischen der Ankyrin-Domäne einer Ser/Thr-Kinase und dem alpha14. Auch konnte eine Phosphorylierung des Giardins eindeutig bestätigt werden. Weitere Eigenschaften des alpha14 waren die Fähigkeit der Oligomerisierung als auch die Bindung an Glykosaminoglykane. Infolgedessen könnte das alpha14-Giardin eine durch Phosphorylierung regulierte MAP-Funktion übernehmen und somit eine wichtige Rolle für die Dynamik oder Mobilität der Flagellen spielen. Das Hauptziel der im Falle des alpha19-Giardin durchgeführten Untersuchungen war die erste biochemische Charakterisierung des Proteins. Nach Bestätigung der Expression des alpha19-Giardins konnte mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers das Protein ausschließlich in den ventralen Flagellen von G. lamblia nachgewiesen werden. Im Weiteren wurde für das alpha19 der typischen Annexin-Charakter sowie eine Phosphorylierung bestätigt. Das Vorkommen des alpha19-Giardins in der Membranfraktion des G. lamblia-Rohextraktes sowie die Solubilisierung des Proteins durch Zugabe eines Detergenz gaben erste Hinweise auf eine Fettsäuremodifikation des N-Terminus des Proteins, in dem ein Sequenzmotiv für eine Myristoylierung vorliegt. Folglich könnte das Protein an membrandynamischen Prozessen innerhalb der ventralen Flagellen beteiligt sein.

Die mit der in dieser Arbeit entwickelten Rekonstitutionsmethode gemessenen Protonentranslokationsraten erreichen physiologisch relevante Werte und liegen ca. eine Größenordnung über Messungen, die mit vergleichbaren Methoden erzielt wurden. - Die Stöchiometrie der Untereinheit c ist in vitro vom Verhältnis der Untereinheiten a, b und c abhängig. Das bedeutet, dass bei einer Rekonstitution mit verringerter Menge an Untereinheit c Fo-Komplexe mit einheitlich weniger c-Untereinheiten entstehen. Das deutet darauf hin, dass der Fo-Komplex möglicherweise mit verschiedenen c-Stöchiometrien Protonen translozieren kann und dass die Stöchiometrie der Untereinheit c einen Einfluss auf die Protonentranslokationsrate des Fo-Komplexes haben könnte. - Die Stöchiometrie der Untereinheit c im FoF1-Komplex ist in vivo von der Expressionsrate ihres Gens weitgehend unabhängig. - Das unterschiedliche Verhalten der c-Stöchiometrie bei Variation der relativen c-Menge in vitro und in vivo legen einen Regulationsmechanismus in der Zelle nahe, der die Stöchiometrie der Untereinheit c je nach physiologischer Notwendigkeit einstellt und der unabhängig von der Expressionsrate der Untereinheit c arbeitet.

The KdpFABC complex is a P-type ATPase. Several features make the inducible Kplus-transporting ATPase a unique member of this enzyme family. Aspects of structure and function of KdpB, the catalytic subunit of the complex, were examined here. Site-directed mutagenesis of the charged residues aspartate 583 and lysine 586 in the putative transmembrane helix 5 of KdpB revealed that these charges are involved in the coupling of ATP hydrolysis to ion translocation. The binding of FITC was shown to be specific and the binding site is within the nucleotide-binding domain of KdpB, most probably at lysine 395. Modification of KdpB with FITC was affected by adenosine nucleotides. A Mg2plus-dependent hydrolysis of p-nitrophenolphosphate was observed, which was inhibited by micromolar concentrations of ortho-vanadate and FITC. Low concentrations of ATP stimulated pNPP hydrolysis, while higher concentrations of ATP were inhibitory. ADP, AMP and Pi inhibited the pNPP hydrolysis. The catalytic modules of KdpB were separately synthesized, purified and biochemically characterized. It was found that KdpBN was highly soluble and could be concentrated up to 1 mM and higher. Therefore, the KdpBN domain was used for further structural analysis using nuclear magnetic resonance spectroscopy. The KdpBN domain could be purified from cells grown in minimal medium with 15N-ammonium sulfate and 13C1-6 glucose as sole nitrogen and carbon sources, respectively. The purified, labeled KdpBN protein was applied to NMR analysis. High quality multidimensional NMR spectra were obtained (M. Haupt and H. Kessler, TU Munich, personal communication) and structure calculations leading to backbone assignments were carried out. An ortholog of the H4H5 domain of KdpB from the thermopilic archaeon Methanococcus jannaschii, Mj0968, was cloned, expressed, purified, and characterized.

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V-ATPasen sind eukaryotische Protonenpumpen, die viele sekundär aktive Transporte energetisieren und eine Reihe von intrazellulären Kompartimenten ansäuern. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde die Interaktion der V-ATPase aus Manduca sexta mit dem Aktin-Zytoskelett untersucht. Nachdem die Co-Lokalisation der V-ATPase mit F-Aktin in den apikalen Membranen der Gobletzellen immunzytochemisch festgestellt worden war, wurde auch die direkte Wechselwirkung zwischen der V-ATPase und den Aktinfilamenten durch Co-Pelletierungsstudien nachgewiesen. Mit Hilfe von Overlayblots wurde gezeigt, dass sowohl die Untereinheit B als auch Untereinheit C die Bindung an Aktin vermitteln. Co-Pelletierung der Aktinfilamente mit rekombinanter Untereinheit C wiesen eine direkte Interaktion zwischen beiden Proteinen nach. Mit rekombinanter Untereinheit C rekonstituierter V1-Komplex hatte eine deutlich höhere Affinität zu Aktinfilamenten als C-freier V1-Komplex. In Overlayblots wurde nachgewiesen, dass die Untereinheit C beide Formen (F- und G-) des Aktins bindet. Die Interaktion mit G-Aktin wurde mit NBD-markiertem Aktin quantifiziert, wobei sich Dissoziationskonstanten von 50-60 nM ergaben; eine Bevorzugung von ATP-Aktin gegenüber ADP-Aktin oder umgekehrt konnte nicht festgestellt werden. Die Untereinheit C beeinflusste die Dynamik des Aktin-Zytoskeletts dadurch, dass sie Aktinfilamente unabhängig vom pH stabilisierte und einen positiven Einfluss auf die Vernetzung von Aktinfilamenten hatte. Die auch im Fluoreszenzmikroskop nachgewiesene Fähigkeit zur Bündelung kann sowohl durch die zwei Aktinbindungsstellen in der Untereinheit C als auch durch ihre Di- und Oligomerisierung unter oxidierenden Bedingungen ermöglicht werden. Mit Hilfe von radioaktivem ATP wurde gezeigt, dass die Untereinheit C durch die Proteinkinase A phosphoryliert werden kann. Diesem Phänomen könnte eine große Bedeutung für die Regulation der Eigenschaften der Untereinheit C zukommen.

Die F-ATP-Synthase nutzt die elektrochemische Differenz des Protons über eine Membran zur Synthese von ATP. Sie setzt sich aus dem katalytisch aktiven F1-Teil und dem membranständigen FO-Teil zusammen. In FO wird durch die protonenmotorische Kraft (pmf) ein Drehmoment erzeugt, das zur Synthese von ATP in den 3 katalytischen Untereinheiten genutzt wird. Mechanisch gesehen besteht das Motorenzym aus einem Rotor, der sich gegen einen Stator dreht. Ein an FO gekoppeltes Actinfilament diente als Reporter für die Orientierung und Biegsamkeit der Rotoruntereinheiten. Das molekulare Koordinatensystem, gewonnen aus der Kristallstruktur der mitochondrialen F-ATP-Synthase, wurde mit den Koordinatensystem des aktiven Enzyms aus E. coli korreliert. Das ATP hydrolysierende Enzym wartet auf die Bindung von ATP, gefolgt von einem 80°-Schritt. Anschließend wird während des katalytischen Wartezustands ATP hydrolysiert, gefolgt von einem 40°-Schritt. Mittels einer Disulfidbrücke zwischen Rotor und Stator wurde das aktive Enzym in einer Orientierung festgehalten, die der Kristallstruktur entspricht. Diese Orientierung stimmt mit der Stellung des aktiven Enzyms sowohl im katalytischen Wartezustand als auch im ADP-inhibierten Zustand überein. In der Kristallstruktur sind 2 katalytische Zentren mit Nukleotiden besetzt. Dagegen sind im aktiven Enzym während der katalytischen Pause alle 3 katalytischen Zentren besetzt. Durch Schließen von Disulfidbrücken zwischen Rotor und Stator wurden die inneren Elastizitätsparameter des inhibierten und elastisch relaxierten Enzyms anhand des Ausschlags des Actinfilaments bestimmt. Der elastisch biegsame Bereich liegt zwischen den Angriffspunkten der thermodynamischen Kräft, d.h. der pmf in FO und dem Phophatpotential in F1. Die Energie des Drehmoments wird in den Rotoruntereinheiten elastisch gespeichert und anschließend für die Synthese von ATP genutzt. Die elastische Kopplung sorgt für eine hohe kinetische Effizienz und eine hohe Umsatzrate.

Die schnelle, sog. Saltatorische Erregungsleitung bei den Vertebraten wird durch eine kompakte, um das Axon gewickelte isolierende Schicht, dem Myelin, ermöglicht. Diese Myelinhülle wird von spezialisierten Gliazellen gebildet. Bei der Myelinisisierung wickeln sich deren abgeflachte Membranfortsätze mehrfach konzentrisch um die Axone und bilden nach Verdichtung die typische kompakte, multi-lammelare Struktur des Myelins. Innerhalb dieser Struktur unterscheidet man zwei unterschiedliche Bereiche: Die aus der extrazellulären Apposition gebildete Intraperiod Line und die aus der cytosolischen Apposition gebildete Major Dense Line . Ausschließlich innerhalb der Major Dense Line des ZNS der Fische findet man ein Protein, das nach seinem Molekulargewicht als 36K bezeichnet wird. Es ist nicht glykolisiert und scheint mit der Myelinmembran assoziiert zu sein. Immunologische Untersuchungen zeigten, dass 36K mit keinem der polyklonalen Antikörper gegen eines der bekannten Myelinproteine reagierte. Ebenso zeigten erste Datenbank-Analysen überraschenderweise keine Homologien zu den Myelinproteinen, sondern zu den NAD(P)(H)-abhängigen Oxidoreduktasen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde versucht über einen Dehydrogenase-Assay sowohl eine entsprechende Aktivität als auch ein mögliches Substrat zu identifizieren. Alternativ wurde für das membranassoziierte 36K, das neben IP1 & 2 und Basischen Myelinprotein (MBP) eines der Hauptmyelinproteine im ZNS der Fische darstellt, eine Funktion als Strukturprotein innerhalb der Major Dense Line vermutet. Aufgrund der Sequenzähnlichkeiten von 36K zu den NAD(P)(H)-abhängigen Oxidoreduktasen wurde dabei auch die Beeinflussbarkeit durch Nukleotide geprüft. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Dissertation erstmals versucht, Protein-Komplexe aus dem ZNS-Myelin nativ aufzutrennen und deren Komponenten zu identifizieren.

As shown in previous studies Streptomyces lividans enzymatically inactivates fusidic acid by specific esterase FusH giving rise to the 16ß-OH derivative, which sponaneously converts to the lactone.in this work it was shown that S. lividans further modifies fusidic acid and both derivatives, which resulted in several new related substances. The two intermediates (La, Lb) were isolated from the culture filtrate of S. lividans, which was grown in the presence of fusidic acid. The differences in their chemical structures indicate the involvement of multiple enzyme reactions related to hydroxylation, hydration, dehydrogenation and isomerization. Several enzymes were identified and two of them (FusG, FusB) were partially characterized. According to their characteristics and the structures of isolated intermediates, the identified enzymes which are involved in biotranformation are conceivably related to the ones implicated in ß oxidation. The biotransformation of fusidic acid and its derivatives by S. lividans is so far unique, since characterized substances La and Lb have not been found in either fusidic acid-producing or fusidic acid-resistant microorganisms.