SHIP2 (SH2 domain-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase type 2) est un enzyme de la famille des inositol polyphosphate 5-phosphatases qui déphosphoryle le PtdIns(3,4,5)P3, second messager intervenant dans différentes voies de signalisation cellulaire et impliqué dans de nombreux processus biologiques. La surexpression de SHIP2 en cellule, de même que son invalidation chez la souris, ont montré un rôle de cet enzyme dans le contrôle négatif de la cascade de signalisation de l’insuline et dans la sensibilité à cette hormone. Par ailleurs, plusieurs études de polymorphismes chez l’homme ont montré une association entre ce gène et le diabète de type2. La découverte au sein de notre laboratoire de la délétion d’un motif semblable à ceux présents dans les régions déstabilisatrices de type AU-riche dans la région 3’non codante (3’UTR) du gène SHIP2 chez des patients atteints de diabète de type 2, nous a conduit à explorer le rôle de cette région dans le contrôle de l’expression de SHIP2. Dans ce but, nous avons entrepris d’identifier des protéines capables de lier ce motif AU-riche et d’entraîner l’ARN de SHIP2 vers la dégradation, et ce par deux techniques distinctes : l’une in vivo chez la levure (le triple hybride) et l’autre in vitro, par l’intermédiaire d’une sonde ARN biotinylée. Malheureusement, aucune de ces deux techniques ne nous a permis d’identifier des protéines se liant à l’ARNm de SHIP2. D’autre part, l’analyse de souris génétiquement modifiées présentant dans la région 3’UTR de SHIP2 une mutation similaire à celle observée chez les patients diabétiques n’a pas montré une augmentation significative d’expression de SHIP2 comme on aurait pu s’y attendre. Malgré les différentes techniques mises en place, nous ne sommes pas parvenus à caractériser le rôle joué par le 3’UTR de SHIP2 sur le contrôle de son expression. Dans le but de caractériser l’effet d’une surexpression de SHIP2 et de déterminer si une surexpression de ce gène pouvait mimer le phénotype de diabète de type 2 observé au sein de la population, nous avons généré des souris transgéniques d’addition par transgenèse lentivirale. Deux axes phénotypiques majeurs ont été explorés chez ces souris : le métabolisme du glucose et la prise de poids consécutive à divers régimes alimentaire. Les souris transgéniques présentent un retard dans la captation du glucose en réponse à une surcharge en glucose, s’accompagnant d’un défaut de sécrétion d’insuline. Par contre, aucune altération de la sensibilité à l’insuline n’est observée suite à une injection de cette hormone. Cette absence d’altération de la sensibilité à l’insuline est également soutenue par le fait qu’aucune altération de la captation de glucose n’est observée chez des souris surexprimant le transgène spécifiquement dans le muscle squelettique. Les analyses de prise de poids des souris transgéniques ont révélé une résistance à l’obésité des mâles transgéniques lorsqu’ils sont soumis à un régime alimentaire riche en graisse. Par contre, aucune différence n’est observée sous régime alimentaire conventionnel ou faible en graisse. La plus faible prise de poids des souris transgéniques sous régime riche en graisse s’accompagnant d’une plus faible prise de nourriture, un rôle de SHIP2 dans la régulation du comportement alimentaire et de l’appétit n’est pas à exclure. En conclusion, la surexpression de SHIP2 chez la souris provoque une intolérance au glucose induite, en tout cas en partie, par une plus faible sécrétion d’insuline, ainsi qu’une résistance à l’obésité induite par un régime riche en graisse.

Les membres de la famille des 5-phosphatases d’inositols polyphosphates et de phosphoinositides sont des enzymes caractérisées par la présence de deux domaines catalytiques conservés qui hydrolysent un phosphate en position 5 sur un noyau inositol. SKIP (Skeletal Muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase), également appelée Pps (Putative PI 5-phosphatase) est un des derniers membres de la famille des 5-phosphatases à avoir été découvert à ce jour. Cette enzyme hydrolyse majoritairement le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) et le phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3). Les phosphoinositides (PtdIns) représentent environ 10% des lipides membranaires et sont impliqués dans de nombreuses cascades de signalisation cellulaire conduisant, entre autres, à la prolifération, l’apoptose, la différenciation, la sécrétion, le trafic vésiculaire et la mobilité cellulaire. Des études de surexpression de SKIP en cellules tendent à montrer que cette protéine pourrait jouer un rôle de régulateur négatif dans la formation du cytosquelette d’actine et/ou dans la voie de signalisation de l’insuline. Afin d’étudier in vivo la fonction de la protéine SKIP chez la souris, nous avons décidé de générer des souris transgéniques surexprimant cette protéine de manière conditionnelle. Dans ce but, nous avons infecté des embryons murins par des lentivirus porteurs d’un transgène SKIP et avons obtenu, après réimplantation des embryons infectés dans des femelles pseudogestantes, deux lignées de souris transgéniques. Celles-ci ont ensuite été croisées avec des souris exprimant la recombinase Cre de manière ubiquitaire afin de pouvoir activer la transcription de SKIP dans l’ensemble des organes. Des expériences de Western blot, de dosage d’activité 5-phosphatase ainsi que des PCR en temps réel sont venus confirmer la présence de la protéine transgénique et de son activité catalytique. L’ensemble des expériences qui ont été menées du point de vue phénotypique tend à montrer que dans notre modèle, la surexpression de SKIP ne provoque aucune anomalie évidente du point de vue anatomique, glycémique ou immunologique. Toutefois, des expériences concernant la physiologie rénale ont été réalisées sur base des résultats d’immunohistochimie et nous ont permis de détecter une anomalie dans les mécanismes de réabsorption d’eau ainsi que dans l’expression et la phosphorylation des canaux hydriques AQP2.

The phosphatidylinositol signaling pathway utilizes inositol-containing second messengers to mediate signaling events. The enzymes that metabolize phosphoinositides can in some cases serve to terminate the signaling actions of phosphoinositides. The inositol polyphosphate 5-phosphatases (5PTases) comprise a large protein family that hydrolyzes 5-phosphates from a variety of inositol phosphate and phosphoinositide substrates. I have examined the substrate specificity of the At5PTase11 protein from the model plant, Arabidopsis thaliana. The At5PTase11 gene (At1g47510) encodes an active 5PTase enzyme that can dephosphorylate the phosphoinositide substrates phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P2], phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PtdIns(3,5)P2], and phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate [PtdIns(3,4,5)P3]. In addition, the At5PTase11 gene is regulated by abscisic acid, jasmonic acid, and auxin, suggesting a role for phosphoinositide action in these signal transduction pathways. To further delineate the function of At5PTase11 in Arabidopsis thaliana, two independent T-DNA insertion mutant lines were isolated (At5ptase11-1 and At5ptase11-2). Analysis of At5ptase11 mutant lines revealed that At5ptase11 mutant seeds germinate slower compared to wild-type seeds. Moreover, At5ptase11 mutant seedlings demonstrated less hypocotyl growth when grown in the dark. These results indicate that At5PTase11 is required for the early stages of seed germination and seedling growth. Since there are 15 predicted 5PTases in Arabidopsis thaliana, a group of 5PTases have been analyzed to identify the 5PTases with similar substrate selectivity. At5PTase1 (At1g34120), At5PTase2 (At4g18010) and At5PTase3 (At1g71710) have been found to hydrolyze all four potential substrates, inositol 1,4,5-trisphosphate [Ins(1,4,5)P3], inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate [Ins(1,3,4,5)P4], PtdIns(4,5)P2, and PtdIns(3,4,5)P3. At5PTase7 (At2g32010) hydrolyzed PtdIns(4,5)P2, and PtdIns(3,4,5)P3 which is similar to the substrate selectivity of At5PTase11. In addition, At5PTase4 (At3g63240), and At5PTase9 (At2g01900) hydrolyzed only PtdIns(4,5)P2. These results indicate that there are different groups of Arabidopsis thaliana 5PTases based on the substrate selectivity. These results suggest that Arabidopsis thaliana 5PTases with similar substrate selectivity may have overlapping functions. In summary, the findings that At5PTase11 is a phospholipid-specific 5PTase and At5PTase11 functions in the early stages of seed germination and seedling growth indicate that 5PTases play important roles in plant growth and development. / Ph. D.

Le gène OCRL1, responsable du syndrome de Lowe de transmission récessive liée à l'X, code pour une PIP2 5-phosphatase associée à l'appareil de Golgi. 107 mutations du gène OCRL1 ont été identifiées chez 146 familles de syndrome de Lowe et 6 mutations ont été identifiées chez 23 patients atteints de maladie de Dent sans mutation du gène CLCN5. L'haplotypage de 18 familles a mis en évidence 3 cas de mosaïcisme germinal et somatique. L'activité PIP2 5-phosphatase fibroblastique des patients est très abaissée par rapport à des fibroblastes normaux. L'analyse par Western blot de la protéine OCRL1 montre une diminution variable de la quantité protéique et pas forcément corrélée à l'activité résiduelle de la protéine. L'analyse des transcrits d'OCRL1 montre qu'il existe une variabilité quantitative chez les patients mais également chez les témoins. Les premières études cliniques chez 55 patients atteints de syndrome de Lowe ne montrent pas de corrélation génotype-phénotype évidente.

Heidelberg, Univ., Diss., 2007.

The complete role of inositol signaling in plants and humans is still elusive. The plant Arabidopsis thaliana contains fifteen predicted inositol polyphosphate 5- phosphatases (5PTases, E.C. 3.1.3.36) that have the potential to remove a 5-phosphate from various inositol second messenger substrates. To examine the substrate specificity of one of these Arabidopsis thaliana 5PTases (At5PTases), recombinant At5PTase1 was obtained from a Drosophila melanogaster expression system and analyzed biochemically. This analysis revealed that At5PTase1 has the ability to catalyze the hydrolysis of four potential inositol second messenger substrates. To determine whether At5PTase1 can be used to alter the signal transduction pathway of the major drought-sensing hormone abscisic acid (ABA), plants ectopically expressing At5PTase1 under the control of a constitutive promoter were characterized. This characterization revealed that plants ectopically expressing At5PTase1 had an altered response to ABA. These plants have stomata that are insensitive to ABA, and have lower basal and ABA-induced inositol (1,4,5)-trisphosphate [Ins(1,4,5)P₃] levels. In addition, At5PTase1 mRNA and protein levels are transiently regulated by ABA. These data strongly suggest that At5PTase1 can act as a signal terminator of ABA signal transduction. Like the Arabidopsis At5PTase1, a human 5PTase, Ocrl, has the ability to catalyze the hydrolysis of a 5-phosphate from several inositol-containing substrates. The loss of functional Ocrl protein results in a rare genetic disorder known as Lowe oculocerebrorenal syndrome. To gather information concerning the specificity determinants of the Ocrl protein, a structure-function analysis of Ocrl was conducted using a vibrational technique, difference Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy. Upon the introduction of Ins(1,4,5)P₃ substrate, structural changes in carboxylic acid and histidine residues were observed. The net result of changes in these residues indicates that upon Ins(1,4,5)P₃ introduction, a carboxylic acid-containing residue is protonated, and a histidine residue is deprotonated. This interpretation supports the idea that the deprotonation of the histidine residue is concomitant with the coordination of a divalent cation upon Ins(1,4,5)P₃ introduction. This work allows for the proposal of a new model for the role of the active site histidine of OCRL. / Ph. D.

SHIP2 (SH2 domain-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase type 2) est un enzyme de la famille des inositol polyphosphate 5-phosphatases qui déphosphoryle le PtdIns(3,4,5)P3, second messager intervenant dans différentes voies de signalisation cellulaire et impliqué dans de nombreux processus biologiques.<p>La surexpression de SHIP2 en cellule, de même que son invalidation chez la souris, ont montré un rôle de cet enzyme dans le contrôle négatif de la cascade de signalisation de l’insuline et dans la sensibilité à cette hormone. Par ailleurs, plusieurs études de polymorphismes chez l’homme ont montré une association entre ce gène et le diabète de type2.<p>La découverte au sein de notre laboratoire de la délétion d’un motif semblable à ceux présents dans les régions déstabilisatrices de type AU-riche dans la région 3’non codante (3’UTR) du gène SHIP2 chez des patients atteints de diabète de type 2, nous a conduit à explorer le rôle de cette région dans le contrôle de l’expression de SHIP2.<p>Dans ce but, nous avons entrepris d’identifier des protéines capables de lier ce motif AU-riche et d’entraîner l’ARN de SHIP2 vers la dégradation, et ce par deux techniques distinctes :l’une in vivo chez la levure (le triple hybride) et l’autre in vitro, par l’intermédiaire d’une sonde ARN biotinylée. Malheureusement, aucune de ces deux techniques ne nous a permis d’identifier des protéines se liant à l’ARNm de SHIP2. D’autre part, l’analyse de souris génétiquement modifiées présentant dans la région 3’UTR de SHIP2 une mutation similaire à celle observée chez les patients diabétiques n’a pas montré une augmentation significative d’expression de SHIP2 comme on aurait pu s’y attendre.<p>Malgré les différentes techniques mises en place, nous ne sommes pas parvenus à caractériser le rôle joué par le 3’UTR de SHIP2 sur le contrôle de son expression.<p>Dans le but de caractériser l’effet d’une surexpression de SHIP2 et de déterminer si une surexpression de ce gène pouvait mimer le phénotype de diabète de type 2 observé au sein de la population, nous avons généré des souris transgéniques d’addition par transgenèse lentivirale.<p>Deux axes phénotypiques majeurs ont été explorés chez ces souris :le métabolisme du glucose et la prise de poids consécutive à divers régimes alimentaire.<p>Les souris transgéniques présentent un retard dans la captation du glucose en réponse à une surcharge en glucose, s’accompagnant d’un défaut de sécrétion d’insuline. Par contre, aucune altération de la sensibilité à l’insuline n’est observée suite à une injection de cette hormone. Cette absence d’altération de la sensibilité à l’insuline est également soutenue par le fait qu’aucune altération de la captation de glucose n’est observée chez des souris surexprimant le transgène spécifiquement dans le muscle squelettique.<p>Les analyses de prise de poids des souris transgéniques ont révélé une résistance à l’obésité des mâles transgéniques lorsqu’ils sont soumis à un régime alimentaire riche en graisse. Par contre, aucune différence n’est observée sous régime alimentaire conventionnel ou faible en graisse. La plus faible prise de poids des souris transgéniques sous régime riche en graisse s’accompagnant d’une plus faible prise de nourriture, un rôle de SHIP2 dans la régulation du comportement alimentaire et de l’appétit n’est pas à exclure.<p>En conclusion, la surexpression de SHIP2 chez la souris provoque une intolérance au glucose induite, en tout cas en partie, par une plus faible sécrétion d’insuline, ainsi qu’une résistance à l’obésité induite par un régime riche en graisse.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

To survive, an organism must constantly adjust its internal state to changes in the environment from which it receives signals. The signals set off a chain of events referred to signal transduction. Signal transduction systems are especially important in multicellular organisms, such as plants and animals, because of the need to coordinate the activities of hundreds to trillions of cells. Plants, in particular, have a special need for perceiving signals from their environment because of their static nature. As in the animal cell, the first steps in perception of a signal include signal interaction with a receptor, signal amplification through second messenger production, and signal termination through second messenger hydrolysis. Myo-inositol polyphosphate 5-phosphatases (5PTases) (EC 3.1.3.56) have unique signal terminating abilities toward the second messenger inositol trisphosphate (Ins (1,4,5)P3, InsP3). In Arabidopsis thaliana there are 15 members of the 5PTase family, the majority of which contain a single 5PTase catalytic domain. Four members of the Arabidopsis 5PTase family, however, have a unique protein domain structure, with additional N-terminal WD40 repeats that are implicated in protein-protein interactions. The research presented here focused on the identification of 5PTase interacting proteins and the characterization of their functional role in Arabidopsis. To accomplish this goal, I examined a 5PTase13-interacting protein, the sucrose (Suc) nonfermenting-1-related kinase, SnRK1.1, an important energy sensor that is highly conserved among eukaryotes. My identification of a 5PTase13:SnRK1.1 complex points to the novel interaction of this metabolic modulator and inositol signaling/metabolism. 5PTase13 , however, plays a regulatory role in other plant specific processes as well, since I also identified the Arabidopsis homolog (Atp80) of the human WDR48 (HsWDR48, Hsp80) as a novel protein interactor of 5PTase13. My results indicate that Atp80 is important for leaf emergence, development and senescence likely via a regulatory interaction with 5PTase13 and PINOID â binding protein (PBP1). / Ph. D.

Les phosphoinositides sont des phospholipides constituant des membranes cellulaires eucaryotes qui participent entre autres à la transmission de certains signaux extracellulaires dans le milieu intracellulaire. Désormais, un contrôle rigoureux et constant de leur métablisme par des enzymes est primordial pour assurer le bon fonctionnement de l'activité cellulaire. La 5-phosphatase SHIP2 est une enzyme capable d'hydrolyser certains de ces phosphoinositides dont le PtdIns(3,4,5)P3. Ce dernier, produit majoritaire d'une famille d'enzymes dénommées les PI(3)K, gouverne un large éventail de fonctions cellulaires dont la prolifération et le métabolisme énergétique. Deux souris knock-out pour SHIP2 ont été rapportées. La première présente une invalidation conjointe, accidentelle, des gènes INPPL1 et PHOX2A ;à l'état homozygote elle conduit à une létalité précoce. L'hétérozygote est viable et hypersensible à l'insuline. La seconde, caractérisée par l'invalidation unique d'INPPL1, est viable à l'état homozygote. D'un point vue phénotypique, cette souris ne montre pas d'altération majeure du métabolisme du glucose sous un régime conventionnel, mais un retard de croissance et une anomalie de la face. Elle est aussi protégée de l'obésité et de l'insulinorésistance induite par un régime riche en graisse.<p>Pour lever la controverse quant au rôle de SHIP2 in vivo chez la souris, le laboratoire hôte a généré un nouveau modèle, la souris SHIP2Δ/Δ, génétiquement modifiée pour exprimer une protéine SHIP2 tronquée dépourvue d'activité catalytique. L'analyse phénotypique de cette souris SHIP2Δ/Δ a permis de confirmer le retard de croissance et l'anomalie craniofaciale observés précédemment. Elle a aussi mis en évidence une réduction de la masse musculaire, de la masse adipeuse et une atrophie du tractus génital femelle. Le métabolisme du glucose et la sensibilité à l'insuline de la souris SHIP2Δ/Δ ne sont que peu affectés. Nous avons ensuite évalué la capacité du mutant SHIP2Δ à corriger l'insulinorésistance consécutive à une réduction de moitié de l'activité PI(3)K de classe IA in vivo chez la souris. L'expression du mutant SHIP2Δ sur ce fond génétique permet de rétablir un métabolisme glucidique normal mais cette récupération ne semble cependant pas s'opérer par la restauration de la phosphorylation de la PKB/Akt. D'autre part, les anomalies du développement de la souris SHIP2Δ/Δ sont maintenues sur ce fond génétique et accompagnées d'une hypertrophie cardiaque. Désormais, les effets de l'inactivation de SHIP2 in vivo chez la souris ne semblent pas être la seule conséquence d'une hyperactivation de la voie PI(3)K de classe IA suite à la perte d'une voie de dégradation du PtdIns(3,4,5)P3. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les membres de la famille des 5-phosphatases d’inositols polyphosphates et de phosphoinositides sont des enzymes caractérisées par la présence de deux domaines catalytiques conservés qui hydrolysent un phosphate en position 5 sur un noyau inositol. SKIP (Skeletal Muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase), également appelée Pps (Putative PI 5-phosphatase) est un des derniers membres de la famille des 5-phosphatases à avoir été découvert à ce jour. Cette enzyme hydrolyse majoritairement le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) et le phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3). Les phosphoinositides (PtdIns) représentent environ 10% des lipides membranaires et sont impliqués dans de nombreuses cascades de signalisation cellulaire conduisant, entre autres, à la prolifération, l’apoptose, la différenciation, la sécrétion, le trafic vésiculaire et la mobilité cellulaire.<p>Des études de surexpression de SKIP en cellules tendent à montrer que cette protéine pourrait jouer un rôle de régulateur négatif dans la formation du cytosquelette d’actine et/ou dans la voie de signalisation de l’insuline. <p><p>Afin d’étudier in vivo la fonction de la protéine SKIP chez la souris, nous avons décidé de générer des souris transgéniques surexprimant cette protéine de manière conditionnelle. Dans ce but, nous avons infecté des embryons murins par des lentivirus porteurs d’un transgène SKIP et avons obtenu, après réimplantation des embryons infectés dans des femelles pseudogestantes, deux lignées de souris transgéniques. Celles-ci ont ensuite été croisées avec des souris exprimant la recombinase Cre de manière ubiquitaire afin de pouvoir activer la transcription de SKIP dans l’ensemble des organes. Des expériences de Western blot, de dosage d’activité 5-phosphatase ainsi que des PCR en temps réel sont venus confirmer la présence de la protéine transgénique et de son activité catalytique.<p>L’ensemble des expériences qui ont été menées du point de vue phénotypique tend à montrer que dans notre modèle, la surexpression de SKIP ne provoque aucune anomalie évidente du point de vue anatomique, glycémique ou immunologique. Toutefois, des expériences concernant la physiologie rénale ont été réalisées sur base des résultats d’immunohistochimie et nous ont permis de détecter une anomalie dans les mécanismes de réabsorption d’eau ainsi que dans l’expression et la phosphorylation des canaux hydriques AQP2.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished