EN CASTELLANO:La toxoplasmosis es una de las más importantes zoonosis del ser humano. Esta ocasionada por Toxoplasma gondii un parásito coccidio apicomplejo de distribución cosmopolita.En este estudio se pretende determinar y analizar la seroprevalencia de anticuerpos, frente a este parásito, de tipo G y de tipo M en mujeres gestantes del Principado de Andorra y los anticuerpos de tipo G en los habitantes de las principales poblaciones de la comarca del Alt Urgell (Lleida), Bellver de Cerdanya y Martinet (Girona). En el estudio realizado en Andorra se han analizado un total de 1936 muestras de sangre, mediante la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI), de mujeres gestantes residentes en las siete parroquias que forman el principado obteniéndose las siguientes tasas de seroprevalencia de anticuerpos G: Andorra la Vella 43,9 %, Canillo 45 %, Encamp 47,4 %, Escaldes 52 %, La Massana 45,6%, Ordino 45 % y Sant Julià 42,9 %. La prevalencia global del principado se situó en el 45,9 %. La prevalencia global de anticuerpos M fue del 0,6 %. Agrupando la población analizada en grupos de edad se observa un significativo (p<0.05) aumento de la seroprevalencia con la edad. La seroprevalencia fué homogénea entre las siete parroquias analizadas (p=0.5274).Para realizar el estudio de la comarca del Alt Urgell se obtuvieron un total de 2603 muestras de pacientes atendidos en la Fundació Sant Hospital de la Seu d'Urgell, residentes en alguna de las seis principales poblaciones de la zona, de ambos sexos y de todas la edades. En este caso se analizaron exclusivamente los anticuerpos de tipo G, mediante la técnica de enzimoinmunoanálisis de micropartículas (MEIA). Las tasas de seroprevalencia fueron las siguientes: Bellver de Cerdanya 55,5 %, Coll de Nargó 44,4 %, Martinet 53,8 %, Oliana 53,9 %, Organya 48,6 % y la Seu d'Urgell 50,6 %. La prevalencia global de la comarca se situó en el 51,1 %. Se obtuvo una significativa mayor seroprevalencia del sexo masculino (p<0.05) con un 56,3 % frente al 44,4 % femenino y también un significativo aumento de la tasa de seroprevalencia con la edad (p<0.05), en la población menor de 16 años la prevalencia media fue del 37,7 % mientras que a partir de los 45 años pasó a ser del 64,3 %. No se observaron diferencias significativas entre las tasas de seroprevalencia de las distintas localidades analizadas tanto de manera global como comparando los distintos grupos de edad y sexos.Las características geográficas u ocupacionales de los habitantes de las localidades analizadas no fueron factores determinantes del grado de infección por Toxoplasma gondii. Al mismo tiempo, el ambiente rural o urbano no fue en ningún caso un condicionante de la tasa de seroprevalencia.Tanto en el Principado de Andorra como en el Alt Urgell y las poblaciones de Bellver de Cerdanya y Martinet, se observa una desprotección frente a Toxoplasma gondii, de la población femenina en edad fértil, cercana o superior al 50 %. En el segmento de edad más joven (menos de 16 años) esta desprotección puede llegar al 70 %. Por lo tanto, los análisis de control y las medidas preventivas son indispensables durante el embarazo, sobre todo en las gestantes seronegativas.

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Los muy interesantes y escasos cursos de agua de la Comunidad Autónoma de la Región de Murcia, y más concretamente, del Río Segura, están, como todos los de la cuenca Mediterránea, sometidos a un régimen climático marcadamente estacional que origina fluctuaciones sustanciales en el ecosistema fluvial poniendo a prueba las capacidades adaptativas de los organismos que los habitan. LOS CIPRINIDOS (PISCES: CYPRINIDAE) constituyen el grupo que mejor se ha desarrollado en estos ambiente inestables, en concreto BARBUS SCLATERI GUNTHER, 1868 es la especie endémica del sur y este peninsular cuya distribución incluye, entre otras, la cuenca del río Segura. Hasta el momento no existe información sobre las estrategias vitales de esta especie en la cuenca del río Segura. Por todo ello nos planteamos aportar los primeros datos sobre la Biología de B.SCLATERI estudiando sus estrategias de vida en un curso de agua inalterado desde un punto de vista de regulación hídrica (Ayna- Río Mundo) y en otro regulado por una central hidroeléctrica (La Graya – Río Segura). Las dos poblaciones estudiadas han presentado un patrón general en su estrategia de vida caracterizado por bajas tasas de crecimiento, pequeño número de clases de edad, maduración sexual temprana en la vida del individuo y desoves parciales, lo que favorece una alta fecundidad.

Las salmonelas no-tifoideas que causan actualmente infecciones en seres humanos son frecuentemente epidémicas y resistentes a los antimicrobianos (R), además de virulentas (V). La evolución de las bacterias en cuanto a la adquisición de determinantes-V y/o -R se debe,fundamentalmente, a la incorporación, a menudo secuencial, de piezas de ADN, cuya combinación origina nuevos elementos genéticos, que quedan inmediatamente sometidos a la selección natural en un ambiente cambiante.Los genes-V y -R pueden estar aislados, formando pequeñas agrupaciones (islotes) y/o en agrupaciones mayores (islas genómicas o de patogenicidad) y pueden ser de localización cromosómica o plasmídica. Los genes-R, una vez seleccionados, pueden mantenerse en las bacterias originarias y su descendencia o bien diseminarse entre bacterias más o menos relacionadas a través de los elementos genéticos móviles (EGMs) entre los que destacan el sistema integrón-casete génica, los transposones, los plásmidos y las islas gen.En la presente tesis se llevaron a cabo estudios de epidemiología molecular en 176 aislamientos de Salmonella enterica pertenecientes a tres serotipos no prevalentes, aunque causantes de alertas epidemiológicas: Hadar, Brandenburg y Ohio. Se determinó el impacto epidemiológico de los mismos, identificando los tipos endémicos y prevalentes en el Principado de Asturias y su posible presencia en otras áreas geográficas. Los subtipos fueron trazados mediante análisis de macrorrestricción genómica-PFGE y genotipos-R y -V. Como ejemplo tenemos que los subtipos prevalentes de Hadar se pueden considerar endémicos en España y uno de ellos causó un brote nacional asociado a la salsa de pollos asados comerciales en 2005. Los estudios de resistencia revelaron un amplio porcentaje de cepas con resistencia múltiple (RM) y una correlación entre ésta y la presencia de EGMs. En los tres serotipos se identificaron plásmidos-R, de tamaño variable (9-300 Kb) y diferentes genotipos-R, la mayoría de los cuales resultaron conjugativos. En aislamientos con RM de Brandenburg y Ohio, pero no de Hadar, se detectó un integrón de clase 1 (1600/dfrA1-aadA1), asociado a transposones de tipo Tn21 y estos, a su vez, a Tn9. En aquellos resistentes a tetraciclina se encontraron transposones de tipo Tn1721 y Tn10, portadores de los genes tet(A) y tet(B), respectivamente. Esta es la primera vez que se estudian los perfiles de genes-R en los plásmidos del serotipo Hadar y la organización de los EGMs implicados en la RM en los serotipos Brandenburg y Ohio. La determinación de los perfiles-V reveló pequeñas diferencias intra-serotipo en el caso de Hadar y Brandenburg (presencia/ausencia de sopE). Las variaciones inter-serotipo eran mayores: Hadar carecía de los genes agfA, sugR y rhuM, presentes en los otros dos serotipos, mientras que todos los aislamientos de Ohio presentaron un gen sugR delecionado y fueron negativos para sopE. Todos los aislamientos poseían las cinco islas de patogenicidad (SPI1-5) identificadas en la cepa tipo S. Typhimurium LT2.

Un gran nombre de soques de Oenococcus oeni aïllades de vins van ser analitzades per determinar si eren lisogèniques. Per això es va utilitzar la mitomicina C com agent mutagen inductor del cicle litic dels fags.Els resultats obtinguts demostres que quasi la mitat de le població de bactèries làctics analitzades son portadores d'un profag (lisogèniques) la qual cosa fa pensar que la lisogènia esta molt estesa entre les bactèries làctiques responsables de la fermentació Malolàctica. La sensibilitat de les diferents soques envers el fag es diferent en cada cas. Totes les soques son resistents a l'atac del seu propi fag. La morfologia dels fags es de una càpside isométrica, cua no contractil i sense especules. S'ha pogut identificar una soca indicatriu, sensible al 90% dels fags aïllats i que detecta la presència de fags en el vi durant la fermentació malolàctica. / A large number of strains of Oenococcus oeni (formerly Leuconostoc oenos) that had been isolated from wines were checked for lisogeny with mitomicyn C as inducer. As a result of this test, half of the strains proved to be lisogenic, suggesting that lisogeny is widespread among bacteria isolated from wines during malolactic fermentation. The sensitivity of bacteria to phages was very different, depending on the strain. All the lysogenic strains were resistant to infection by the temperate phage they released. Some phages infected none of the strains. Phages of O. oeni had a classical morphology, an isometric head, and a long striated tail. With the broadest host strain as an indicator, phages were detected in wines after malolactic fermentation.

El distrès oxidatiu és un desequilibri entre els sistemes oxidants i antioxidants. Aquests es poden alterar en diferents situacions fisiològiques i patològiques degut als RL. En aquest treball s'han estudiat: la insuficiència renal i el tractament amb eritropoetina, la malaltia pulmonar obstructiva crònica, la sèpsia i l'infart agut de miocardi. També l'embaràs i el tractament preventiu de l'anèmia amb ferro, l'envelliment, el gènere i l'estrès psicològic que provoca el període d'exàmens universitaris, juntament amb l'efecte de l'estil de vida en l'estrès oxidatiu.El distrès oxidatiu es quantifica amb la PDO (puntuació del distrès oxidatiu) i inclou la quantificació en sang dels següents biomarcadors: antioxidants de baix pes molecular [glutatió reduït (GSH)], enzims antioxidants [superòxid dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatió peroxidasa (GPx), glutatió reductasa (GR) i glutatió s-transferasa total, termoestable i % residual (T-GST, TS-GST i RGST)], productes de la peroxidació lipídica [substancies reactives a l'àcid tiobarbitúric (TBARS)], productes de la peroxidació proteica [glutatió oxidat (GSSG)] i marcadors de la susceptibilitat d'oxidació [hemòlisi].Hipòtesi: un model de puntuació global basat en biomarcadors indirectes és capaç de valorar el desequilibri entre els sistemes prooxidants i antioxidants tant en situacions de malaltia com fisiològiques, i permet detectar a què és degut el desequilibri en cada una de les situacions fisiopatològiques estudiades: a una major producció de RLO, a una disminució en la disponibilitat dels antioxidants, o a ambdues.Objectius: Definir, en la població sana, els rangs de normalitat pels biomarcadors sistèmics.Establir el pes dels biomarcadors estudiats en el model de puntuació global que ens ha de permetre valorar el grau de distrès oxidatiu en diferents situacions fisiològiques i patològiques. Aplicar el model de puntuació en diferents situacions fisiològiques i patològiques en desequilibri oxidatiu. I comparar la PDO amb un model estadístic de puntuació de discriminants.En individus control, la PDO es situa al voltant de zero punts, i en individus amb estrès oxidatiu, la PDO és superior a zero. Segons la PDO, els pacients amb IR no sotmesos a diàlisi tenen estrès oxidatiu, i aquest estrès es manté després de sis mesos de tractament amb EPO. També en tenen els pacients amb MPOC. En la sèpsia i l'IAM l'estrès oxidatiu apareix en el moment de l'ingrés hospitalari però no a les 24 i 48 hores, ni en el moment de l'alta. La PDO es manté als zero punts en homes i dones sans de tots els rangs d'edat. Les dones embarassades que prenen ferro tenen estrès oxidatiu a les 26 setmanes de gestació, i aquest és més elevat en les que no tenen anèmia. Els estudiants universitaris obtenen una PDO superior a zero abans i després dels exàmens universitaris, però l'estrès oxidatiu després és superior en els que no tenen hàbits de vida saludables.El test dels discriminants separara correctament els individus en grups utilitzant els paràmetres lligats al distrès oxidatiu i ens diu els biomarcadors que més s'alteren en cada situació estudiada. No obstant, ni indica quin dels grups té més estrès oxidatiu i quin és el grau d'estrès en cada individu, ni obté en un moment concret la puntuació d'estrès oxidatiu d'un sol individu.La PDO és un possible paràmetre clínic a tenir en compte a l'hora d'avaluar l'estrès oxidatiu de manera rutinària i individual, la seva aplicació és possible tant en el context de la malaltia com per al control d'altres situacions, com ara els efectes d'una vida no saludable. En tots dos casos, la informació que ens aporta el nostre mètode obre la porta a una possible prescripció de teràpia antioxidant, ja sigui de tipus farmacològica o dietètica. / Numerous factors are related to oxidative stress (OS) in humans, which is particularly common in individuals with psychological or health problems. The following blood biomarkers were used to determine the oxidative status of healthy individuals: antioxidant enzymes [glutathione Stransferase (GST), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR)], peptide peroxidation products and low molecular weight antioxidants [reduced and oxidized glutathione (GSH, GSSG), GSSG/GSH ratio], lipid peroxidation products [thiobarbituric acid reactive substances (TBARS)] and oxidizability measurements [haemolysis test]. The relationships between biomarkers were studied in a healthy group of individuals, and used to create a score of oxidative stress (SOS). SOS was clinically validated by applying it to a group of patients with chronic renal insufficiency (CRI), chronic obstructive pulmonary disease, sepsis, and acute myocardium infarction. SOS was also applyed in a various groups of healthy individuals and we studied the effect of sex, age, pregnancy, and lifestyle on oxidative stress. SOS was statistically validated with discriminating test. In conclusion, OS biomarkers were strongly related, and SOS was a useful clinical parameter for evaluating the effect of OS on the illness. This may be important in the future for preventing and treating OS with antioxidants.

Las terapias utilizadas actualmente para el tratamiento de infecciones fúngicas invasoras causadas por levaduras oportunistas están lejos de ser las óptimas. Estas infecciones afectan principalmente a pacientes inmunocomprometidos, dando lugar a tasas de mortalidad muy elevadas. Aunque varias especies de Candida son las responsables del mayor porcentaje de infecciones fúngicas invasoras causadas por levaduras oportunistas, otros géneros, como Cryptococcus, Trichosporon, Blastoschizomyces, Rhodotorula y Sporobolomyces ocasionan también infecciones de incidencia creciente y de difícil tratamiento, existiendo pocos estudios, tanto in vitro como in vivo, acerca de la eficacia de nuevos antifúngicos. El objetivo de la presente tesis es contribuir al desarrollo experimental de nuevos tratamientos o a la mejora de los tratamientos ya existentes. Para ello, se han realizado estudios in vitro para evaluar la eficacia in vitro de los antifúngicos, para posteriormente, comprobar la eficacia de los fármacos en modelos animales adecuados para cada estudio. Las diferentes cepas de Trichosporon asahii estudiadas han mostrado ser resistentes in vitro a los antifúngicos usualmente utilizados en los tratamientos de las infecciones diseminadas por levaduras (la anfotericina B y el fluconazol), siendo por el contrario sensibles a los nuevos triazoles, voriconazol, ravuconazol y albaconazol.. Además el voriconazol ha resultado eficaz en el tratamiento de la tricosporonosis diseminada experimental en el cobaya inmunodeprimido, sugiriendo su potencial utilidad en la terapia de las infecciones humanas producidas por T. asahii. También se ha estudiado la actividad de varias combinaciones de antifúngicos, obteniéndose con la combinación de micafungina y anfotericina B un 100% de interacciones sinérgicas in vitro frente a T. asahii. Esta asociación de antifúngicos ha mostrado una excelente eficacia en el tratamiento experimental de la infección diseminada producida por T. asahii en el ratón. Se ha desarrollado por primera vez un modelo animal de infección diseminada por Blastoschizomyces capitatus en el que se ha estudiado la eficacia del tratamiento con diferentes antifúngicos, clásicos y de reciente introducción. El fluconazol a dosis elevadas ha demostrado ser el tratamiento más efectivo de los ensayados frente a la infección experimental causada por B. capitatus. La combinación de la micafungina con la anfotericina B ha mostrado el mayor porcentaje de interacciones sinérgicas in vitro frente a 40 cepas estudiadas pertenecientes a las cuatro especies de Cryptococcus de mayor relevancia clínica. Se ha estudiado por primera vez el tratamiento con voriconazol en un modelo experimental de criptococosis cerebral en el ratón, demostrándose una eficacia excelente, lo que sugiere la potencial utilidad de este antifúngico en el tratamiento de la infección humana. Se ha evaluado la actividad in vitro de la micafungina combinada con la anfotericina B frente a 115 cepas pertenecientes a las siete especies de Candida de mayor importancia clínica. La disparidad de resultados obtenida en función del criterio de lectura de la CMI, evidencia la necesidad de definir los puntos de corte adecuados para la lectura de las pruebas de sensibilidad in vitro frente a combinaciones de antifúngicos cuando se utiliza la técnica del damero. Se ha estudiado la actividad in vitro de 8 antifúngicos y de las combinaciones de la micafungina con 5 de ellos frente a diferentes cepas de Rhodotorula glutinis y Sporobolomyces salmonicolor. Únicamente la anfotericina B, el ravuconazol y el albaconazol mostraron actividad in vitro frente a R. glutinis. Los triazoles itraconazol, voriconazol, ravuconazol y albaconazol y la terbinafina presentaron buena actividad in vitro frente a S. salmonicolor. Todas las combinaciones de antifúngicos estudiadas con excepción de la combinación de la micafungina con el fluconazol mostraron un alto porcentaje de interacciones sinérgicas frente a R. glutinis. La combinación de la micafungina con el itraconazol dio lugar al mayor porcentaje de interacciones sinérgicas frente a S. salmonicolor. / The conventional antifungal therapies commonly used for the treatment of systemic fungal infections due to opportunistic pathogenic yeasts are far to be the optimal. These infections affect mainly immunocompromised patients, causing high mortality rates. Although Candida spp. are the most common cause of fungal infections, other genera such as Cryptococcus, Trichosporon, Blastoschizomyces, Rhodotorula and Sporobolomyces, have also frequently reported. In general, these latter genera are less susceptible to conventional antifungal treatments and the number of in vitro and in vivo studies about the efficacy of new antifungal treatment against them is very scarce. The main objective of this thesis is to evaluate both in vitro and in animal models the efficacy of new therapeutical strategies. We have evaluated the in vitro activity of micafungin combined with amphotericin B against 115 strains belonging to the seven species of Candida most commonly found in clinical samples (20 of C. albicans, 20 of C. dubliniensis, 15 of C. glabrata, 20 of C. krusei, 10 of C. lusitaniae, 15 of C. parapsilosis and 15 of C. tropicalis).. When we used the MIC-2 endpoint criterion such combination showed synergism against all the species tested. We have evaluated the in vitro activity of micafungin combined with each of the following drugs: amphotericin B, fluconazole, itraconazole, voriconazole and ravuconazole, against 37 strains belonging to the four most clinically relevant species of Cryptococcus i.e. C. neoformans, C. gattii, C. albidus and C. laurentii. The combination micafungin with amphotericin B showed the best synergism, with 70% of synergistic interactions. Voriconazole showed an excellent activity in a murine model of central nervous system infection by Cryptococcus neoformans. We studied the efficacy of voriconazole administered at 10, 40 and 60 mg/kg/day, and amphotericin B administered at 1.5 mg/kg/day. All treatments significantly prolonged survival of mice infected with the three strains of C. neoformans tested with respect to the control group. In addition, all the treatments reduced significantly the fungal loads versus controls. However, the best results were obtained with voriconazole administered at 60 mg/kg/day. Trichosporon asahii is an opportunistic fungus usually resistant in vitro to the conventional antifungals used in systemic infections caused by yeasts. On the other hand, the new triazoles, voriconazole, albaconazole and ravuconazole, have shown an excellent activity. We have evaluated the efficacy of voriconazole in a guinea pig model of trichosporonosis by T. asahii. Voriconazole was effective in resolving such infection. asahii and may represent an important advance in the therapy of this disease. We studied also the efficacy of combined therapy against T. asahii infections. In an in vitro study we tested micafungin combined with five antifungal drugs against ten strains of T. asahii. The combination micafungin with amphotericin B showed 100% of synergistic interactions. With the other combinations tested (micafungin combined with fluconazole, itraconazole, voriconazole or ravuconazole) we obtained between 40 and 20% of synergistic interactions. We selected the combinations that showed the best results i.e, micafungin plus amphotericin B or fluconazole, in the same murine model. Both combinations were effective in prolonging the mean survival time and also significantly reducing the fungal load respect the control group, but only the combination of micafungin with amphotericin B was able to improve the results obtained with monotherapies. We established a reproducible murine model of disseminated blastoschizomycosis to evaluate the effectiveness of the most commonly used antifungal therapies against this infection. We evaluate the efficacy of amphotericin B at 1 and 3 mg/kg/day, fluconazole at 40 and 80 mg/kg/day, flucytosine at 60 mg/kg/day and voriconazole at 40 mg/kg/day, all them against two strains of B. capitatus. This study demonstrated the potential use of this murine model for evaluating therapies against systemic blastoschizomycosis and the highest efficacy of FLC administered at 80 mg/kg/day. Combined therapy has not yet been investigated in blastoschizomycosis and this could be a good alternative for those infections caused by azole-resistant isolates which are increasing among clinical yeasts in general. Since several cases of FLC failure in B, capitatus infections have been documented we decided to evaluate the efficacy of amphotericin B combined with voriconazole, flucytosine or micafungin, using the murine model developed in our previous study. In general, the combinations tested showed better results than the control group and their monotherapies, but they could not improve the efficacy of FLC at high doses. We have also studied the in vitro activity of eight antifungals (amphotericin B, fluconazole, itraconazole, voriconazole, ravuconazole, albaconazole, micafungin and terbinafine) and the interactions of micafungin with five antifungals (amphotericin B, fluconazole, itraconazole, voriconazole or ravuconazole) against 10 strains of Rhodotorula glutinis and 10 of Sporobolomyces salmonicolor. Only amphotericin B, ravuconazole and albaconazole showed low MIC values against R. glutinis. For this reason, we consider interesting the finding that all the antifungal combinations showed a high percentage of synergic interactions (60-80%) with the exception of micafungin plus fluconazole that only showed 20%. Against S. salmonicolor, the amphotericin B MICs were very variable with a 6-fold difference between the lowest and the highest values (0.25-16 mg/L). The best combination was micafungin plus itraconazole with 60% synergic interactions. The other combinations only showed 20-40% synergic interactions. Although these percentages are not so high as for the other species tested, some of these combined therapies could be helpful when amphotericin B fails.

Pseudallescheria es un género de ascomicetos caracterizado por ser polimórfico, ya que pueden presentar hasta tres formas morfológicamente diferentes, una forma sexual o teleomorfo y dos formas asexuales o anamorfos (sinanamorfos). Estas dos formas asexuales se clasifican en los géneros anamórficos Scedosporium y Graphium. Pseudallescheria boydi es la especie más importante del género debido a que es considerado un hongo patógeno emergente capaz de producir infecciones graves especialmente en pacientes inmnusuprimidos. Hasta la presente tesis, el anamorfo de P. boydii era Scedosporium apiospermum. En los últimos años, P. boydii ha sido objeto de diversos estudios moleculares que han mostrado su elevada variabilidad intraespecífica. Otros trabajos han puesto de relieve su variabilidad en cuanto a la respuesta a los antifúngicos así como la diferente virulencia que existe entre sus cepas. Todo ello hacía suponer que en lugar de una sola especie nos hallábamos frente a un complejo de especies. Por esta razón decidimos realizar un estudio molecular y morfológico utilizando numerosas cepas tanto clínicas como ambientales y de diferentes países. Gran parte de las cepas ambientales fueron aisladas por nosotros con la utilización del medio selectivo DRBC con benomilo. El análisis de secuencias parciales del gen de la &#946;-tubulina (dos loci) y la calmodulina y las regiones ITS del ADNr demostraron que P. boydii es un complejo de especies. El análisis combinado de las secuencias de los 4 loci nos permitió la distinción de 8 especies filogenéticas agrupadas en 4 clados diferentes. Los clados 1 y 2 fueron descritos como las nuevas especies Scedosporium aurantiacum y Pseudallescheria minutispora, respectivamente. El clado 5 consistió en 4 subgrupos incorporando las cepas tipos de P. boydii Pseudallescheria angusta, Pseudallescheria ellipsoidea y Pseudallescheria fusoidea. En el caso de los clados 3 y 4 fueron considerados únicamente como especies filogenéticas en este primer estudio. Posteriormente, para facilitar la identificación de estas 8 especies filogenéticas en laboratorios de microbiología clínica, se estudiaron las características morfológicas macro- y microscópicas mas representativas de todas ellas así como su respuesta a 59 pruebas fisiológicas. Para incrementar la robustez de los diferentes clados, aumentamos el número de nuevos aislados y de éstos se secuenció la región TUB del gen de la &#946;-tubulina, el cual previamente demostró ser el marcador molecular más informativo de los 4 evaluados. La combinación de estos estudios permitió distinguir fenotípicamente las mencionadas especies filogenéticas. La nueva especie Scedosporium dehoogii (previamente clado 3) fue descrita y Scedoporium apiospermum (previamente clado 4) y P. boydii fueron consideradas como dos especies diferentes. El nuevo nombre Scedosporium boydii fue propuesto para denominar al anamorfo de la última especie. Scedosporium dehoogii pudo ser separada del resto porque no crece a 40ºC y presenta conidioforos no ramificados. Aunque S. apiospermum fue morfológicamente indistinguible del anamorfo de P. boydii ambas especies pudieron ser separadas por su respuesta a las pruebas de la D-ribosa y por la presencia o ausencia de teleomorfo. Durante la búsqueda de nuevos aislados utilizando el medio DRBC suplementado con benomilo, aislamos un hongo interesante de suelo de Argentina que presentaba una morfología similar a la de Scedosporium. Un estudio más detallado a nivel genético y morfológico nos permitió ver que este hongo era diferente a las especies conocidas de éste y otros géneros relacionados, por lo que propusimos el nuevo género Parascedosporium. Su carácter distintivo es el desarrollo simpodial de los conidios a partir de células conidiógenas denticuladas. Este aislado resultó ser morfológicamente idéntico a Graphium tectonae, por lo que propusimos la nueva combinación Parascedosporium tectonae. El análisis filogenético de las secuencias de 4 regiones de los 3 genes ya trabajados en el primer estudio confirmó nuestra propuesta. En esta tesis también evaluamos la actividad in vitro de 11 antifúngicos (anfotericina B, albaconazol, fluconazol, itraconazol, ketoconazol, posaconazol, ravuconazol, voriconazol, terbinafina, micafungina y flucitosina) utilizando el método de microdilución del CLSI contra 84 aislados pertenecientes a las 8 especies que constituyen el complejo P. boydii. Encontramos diferencias significativas entre las especies, siendo Scedosporium aurantiacum la más resistente. En general, el voriconazol fue el antifúngico más activo, seguido del posaconazol. Otro objetivo de la presente tesis fue comparar la virulencia de alguna de las diferentes especies del complejo utilizando un modelo murino con animales inmunocompetentes e inmunosuprimidos. Se seleccionaron 2 inóculos diferentes, 5x104 conidia/mL (para los animales inmunosuprimidos) y 1x106 conidia/mL (para los animales inmunocompetentes). S. aurantiacum y S. dehoogii fueron significativamente las especies más virulentas, causando la muerte del 80% y 70% de los ratones inmunocompetentes, respectivamente, mientras que el resto de las especies sólo consiguió entre un 0% y un 20% de mortalidad. Finalmente, debido a que ninguna de las cepas estudiadas de la especie más común del complejo, S. apiospermum, había desarrollado la forma sexual, consideramos interesante determinar si se trataba de una especie heterotálica. Para ello, realizamos cruzamientos con 15 cepas de S. apiospermum en todas las combinaciones posibles, incluyendo cruzamientos consigo misma. Algunos cruzamientos entre distintas cepas produjeron ascomas fértiles, mientras que los cruzamientos con subcultivos de una misma cepa resultaron autoestériles. Las cepas pudieron separarse en dos diferentes "mating types". Corroboramos el bi-alelismo del sistema de cruzamiento heterotálico mediante cruzamientos entre las ascosporas de la progenie F1 de un cruzamiento positivo. Todos estos datos confirmaron que S. apiospermum es una especie heterotálica. / Pseudallescheria boydii is a ubiquitous ascomycetous fungus that causes a wide array of human infections that can affect practically all the organs of the body. These infections have been known for a long time, but in recent years, a marked increase in severe invasive infections has been noticed, mainly in immunocompromised hosts. They present a high mortality rate and are difficult to treat. One of the most typical features of this species, which is very rare in other pathogenic fungi, is its ability to develop sexual structures on routine culture media. Until the present thesis Scedosporium apiospermum was considered the anamorph of P. boydii. Recently, it had been demonstrated that high genetic variation exists within P. boydii and other authors had reported considerable differences with respect to growth and sporulation. All these data seemed to suggest that P. boydii was probably a species complex. For this reason we performed a morphological and molecular study involving numerous strains of clinical and environmental origins and from different countries. The analysis of partial sequences of the &#946;-tubulin (two loci) and calmodulin genes and the internal transcribed spacer region of the rDNA gene demonstrated that P. boydii is a species complex. A combined analysis of the sequences of the four loci of 60 strains from different origins showed 8 phylogenetic species within this species, grouped in 5 different clades. The clades 1 and 2 were described as the new species Scedosporium aurantiacum and Pseudallescheria minutispora, respectively. Clade 5 consisted of four subgroups incorporating the ex-type strains of P. boydii, Pseudallescheria angusta, Pseudallescheria ellipsoidea and Pseudallescheria fusoidea, respectively, and clades 3 and 4 remained unnamed. Later, in order to facilitate their identification in the clinical microbiology laboratories we tried to characterize phenotypically those 8 phylogenetic species. In order to increase the robustness of the different clades, we included in this study numerous fresh isolates identified by sequencing the TUB region of the &#946;-tubulin gene, which previously was revealed as the most informative molecular marker of the four evaluated. The most representative macro- and microscopic morphological features of all them were studied and their responses to 59 physiological tests were evaluated. The combination of these studies allowed us to distinguish phenetically the mentioned phylogenetic species. The new species Scedosporium dehoogii (previously clade 3) was described and Scedoporium apiospermum (previously clade 3) and P. boydii were considered two different species The new name Scedosporium boydii was proposed for the anamorph of the latter species. Scedosporium dehoogii can be separated from the rest because it does not growth at 40ºC and present unbranched conidiophores. Although S. apiospermum were morphologically indistinguishable from the anamorph of Pseudallescheria boydii both species can be separated by the response to D-ribose test and by the presence or absence of a teleomorph. During the study of fresh isolates recovered from different geographical areas we recovered an interesting Scedosporium-like fungus from Argentinean soil samples which was proven to be genetically and morphologically different from the known species of Scedosporium and relatives. Diverse morphological and molecular studies confirmed the uniqueness of such fungus and was proposed as the new genus Parascedosporium.. This genus is mainly characterized by producing sympodial conidia from denticulate conidiogenous cells. Further studies demonstrated that such isolate was identical to Graphium tectonae and thus the new combination Parascedosporium tectonae was proposed. In this thesis we also evaluated the in vitro activities of 11 drugs (amphotericin B, albaconazole, fluconazole, itraconazole, ketoconazole, posaconazole, ravuconazole, voriconazole, terbinafine, micafungin and flucytosine) by using the microdilution method following the CLSI guidelines against 84 isolates belonging to the eight species that constitute the Pseudallescheria boydii complex. We found significant differences among the species, with Scedosporium aurantiacum being the most resistant. In general, voriconazole was the most active drug, showing a total geometric mean MIC of 0.61 g/ml, followed by posaconazole. Another objective of the present thesis was to compare the virulence of the different species of the complex using a murine model of disseminated infection by these species. We used two different inocula, i.e., 5x104 conidia/ml and 1x106 conidia/ml, for each fungal strain tested. When mice were infected with the first inoculum animals were immunosuppressed while that those infected with the second inoculum were inmunocompetent. No significant differences in mortality rates were observed (p>0.05) among the species in the immunosupressed animals. In the case of inmunocompetent animals, S. aurantiacum and S. dehoogii were clearly the most virulent species of the complex both showed the highest mean mortality rate (80% and 70%, respectively, versus 0%-20% for the other species). Finally, since none of the strains studied of the most common species of the complex, S. apiospermum, never developed the sexual state we considered of interest to determine if it was a heterothallic species. For this purpose, 15 strains of this species were paired in all possible combinations, including self-pairings to corroborate this hypothesis. All strains were self-sterile and several combinations of strains produced fertile ascomata. The strains could separate in two groups of different mating types. We corroborated the bi-allelic heterothallic mating system suggested by these results with crosses among F1 progeny ascospores from one positive mating test. All these data confirmed that S. apiospermum is a heterothallic species.

Los cítricos son las especies frutales más importantes a escala mundial, siendo actualmente España el cuarto país productor. Esto contrasta con la escasez de estudios genéticos para su mejora, lo cual es debido a que presentan varios problemas, entre ellos su compleja biología reproductiva. Muchas especies de cítricos son apomícticas y sus semillas producen embriones nucelares que limitan el desarrollo de embriones zigóticos y por tanto, la construcción de familias segregantes. En los programas de mejora de cítricos y en los viveros es muy importante distinguir entre individuos zigóticos y nucelares para poder eliminar los genotipos no deseados. Normalmente, los isoenzimas se han empleado para determinar el origen genético de las plantas jóvenes. En el primer trabajo se propone el uso de marcadores microsatélites como una metodología alternativa y los comparamos con los isoenzimáticos para la distinción de plántulas zigóticas. Con objeto de facilitar el análisis de microsatélites se desarrolló también un protocolo rápido de extracción de ADN y un método de alta resolución y fácil revelado sin utilizar fluorocromos ni radioisótopos.Se emplearon dos familias segregantes: una derivada de un cruce interespecífico entre Poncirus trifoliata (L.) Raf. Var. "Flying Dragon" y el tangor "Ortanique" (Citrus reticulata (Blanco) x Citrus sinensis (L.) Osb.), familia PxO, la otra familia analizada fue obtenida por autofecundación de Fortunella crasifolia Swing., familia Fc.En el cribado de las plántulas PxO únicamente fue necesaria la utilización de un marcador microsatélite, ya que con éste se pueden distinguir los 4 alelos presentes en la población. En esta misma familia se analizaron otros microsatélites al igual que varios isoenzimas, y con todos se obtuvieron los mismos resultados, el 87% de los individuos de la familia son zigóticos. En familias obtenidas por cruzamiento entre especies muy distantes filogenéticamente, cualquier marcador codominante suele ser útil, sin embargo, cuando los parentales están genéticamente más relacionados, es más difícil encontrar variabilidad en cada locus. Por esto, la eficiencia de los microsatélites aumenta respecto a la de isoenzimas, debido a que presentan mayor grado de polimorfismos. Un caso extremo es la familia Fc, que esta formada por 106 individuos y fue generada por autofecundación. Se analizaron 5 microsatélites y 5 isoenzimas, y se encontraron 6 individuos zigóticos empleando los microsatélites, mientras que con los isoenzimas sólo se pudieron detectar 3 de los 6 observados con los microsatélites. Por tanto, la conclusión de este trabajo es que el empleo de microsatélites presenta mayor eficiencia que el de marcadores isoenzimáticos para identificar plántulas de origen sexual en los cítricos o, en general, plantas de origen desconocido.Una vez comprobada la gran utilidad que tienen los microsatélites en la mejora genética por su nivel de polimorfismo, rapidez, sencillez y gran repetibilidad que poseen, nos planteamos la obtención de nuevos microsatélites de cítricos. Con este objetivo se emplearon dos estrategias: la construcción de una genoteca de ADN genómico de P. trifoliata con fragmentos de pequeño tamaño, y la estrategia bioinformática consistente en cribar microsatélites empleando el programa FINDPATTERNS en todas las secuencias de cítricos incluidas en GenBank, en las cuales se buscaron todas las posibles repeticiones de di-, tri-, tetra- y pentanucleótidos. En total se obtuvieron 33 nuevos microsatélites, 6 en el cribado de la genoteca y el resto a partir de las secuencias de la base de datos. Estos nuevos marcadores se emplearon para la realización de mapas genéticos en tres familias segregantes:- Autofecundación de Poncirus trifoliata (var. Flying Dragon) - Citrus aurantium x Poncirus trifoliata (var. Flying Dragon)- Citrus volkameriana x Poncirus trifoliata (var. Rubidoux)Se construyó un mapa para cada uno de los parentales de cada familia, que poseen entre 48 y 120 marcadores, dependiendo de la heterozigosis de cada parental. El análisis comparativo entre genomas fue posible gracias al uso de los marcadores SSR principalmente, observándose varias reorganizaciones entre las distintas especies, así como entre las dos variedades de Poncirus trifoliata. Se observó que el orden de los marcadores en el mapa puede variar al bajar el LOD. Puesto que para futuros análisis genéticos lo más importante es que la ordenación sea la correcta, se prefirió construir los mapas a LOD alto a costa de dejar marcadores fuera de los grupos de ligamiento.Para la realización de los mapas de ligamiento también se usaron otros tipos de marcadores como los IRAPs, que aunque son menos informativos porque no son codominates, producen gran número de polimorfismos muy repetitivos con pocas combinaciones de cebadores y su distribución en el genoma es, en general, aleatoria.El análisis de segregación a nivel genómico puso de manifiesto la distorsión en la segregación en ciertas zonas concretas, que corresponderían a problemas gaméticos y/o zigóticos, es decir, presencia de factores letales.Una vez obtenidos los nuevos marcadores SSRs e IRAPs en cítricos, y sabiendo su localización genómica, nos propusimos utilizarlos para investigar sobre el origen de la variación molecular en el grupo de los mandarinos clementinos, debido a su importancia económica y por tratarse de un reto, ya que es una especie que se propaga vegetativamente, por lo que la variabilidad genética es muy limitada. En general, las nuevas variedades son detectadas por los propios citricultores mediante la identificación de mutaciones somáticas que afectan caracteres agronómicos, tales como la época de recolección.Se emplearon distintos tipos de marcadores con objeto de comparar su nivel de polimorfismo en una colección de 24 variedades. No se observó ningún polimorfismo al emplear SSR, por lo que la recombinación somática no debe ser una fuente importante de variabilidad en esta especie. Cuando se emplearon ISSRs, RAPDs y AFLPs, sólo un 2.4% de las combinaciones de cebadores produjeron polimorfismos, en comparación con los generados al emplear IRAPs (14.6%). Además, el diagrama evolutivo basado en estos últimos polimorfismos se ajusta bastante bien al origen conocido de algunas variedades.Por tanto, se concluye que los cambios en el ADN de los retrotransposones y las zonas adyacentes son más frecuentes que en el resto del ADN estudiado. Esto sugiere que los factores que provoquen la actividad de retrotransposones, como condiciones bióticas o abióticas de estrés, pueden ser una fuente importante de variabilidad genética a utilizar en programas de mejora de especies de propagación vegetativa, donde abunden los elementos de este tipo, como es el caso de los naranjos navel o los mandarinos clementinos. / Citrus are one of the major fruit crops in the world. Citrus represents a very wide set of species, but with long juvenile periods, a high level of apomixis and, generally high heterozygosity. This means that genetic studies on citrus are very costly, long and, therefore, scarce. In citrus breeding and genetics, it is very important to distinguish between zygotic and nucellar seedlings in order to eliminate unwanted genotypes. Usually, isozyme markers have been employed to determine the genetic origin of young plants. We propose the use of SSR markers as an alternative methodology and compare them with isozymes in this kind of screenings.Constructing genetic linkage maps would permit to compare the organization of different genomes and an efficient and continuous use of plant genetic resources to enrich the gene diversity of breeding programs, supported by markers at the selection stages.Five genetic linkage maps were constructed for the parents of three progenies. The number of polymorphic markers assayed ranged from 48 to 120, according to the heterozygosity of each parent. Focused on genome comparison, most of the markers were newly generated SSRs. IRAPs based on 4 retrotransposon sequences isolated from Citrus spp were also used to saturate the maps. Genomic reorganisations were observed when comparing the colinearity between Citrus and Poncirus, and also between P. trifoliata varieties.Clementines, due to their high quality, are one of the most important cultivated citrus mandarins. Genetic variability within this species is minimal when analysed by molecular markers, since the existing varieties have not been obtained through hybridisation, but through the selection of spontaneous mutations affecting traits of agronomic interest.Different kinds of markers based on primers of random sequence, simple sequence repeats and retrotransposon sequences that may reveal point mutations, somatic recombination and transposon activity, respectively, were used to compare the level of variability among 24 clementine varieties.Their ISSR, RAPD and AFLP analysis provided only two polymorphic bands. No variability was found by SSRs. The amplification of sequences adjacent to retrotransposons (IRAPs) yielded a higher number of polymorphisms (14.6 % versus 2.4 % for the previous mentioned marker types).