Aquesta tesi és una contribució al coneixement de les bases moleculars de la síndrome nefròtica idiopàtica concretament, la nefropatia membranosa idiopàtica i la síndrome nefròtica córtico-resistent (SNCR) o glomeruloesclerosis segmentària i focal (GESF). La primera part d’aquesta tesi presenta l’associació de determinades variants genètiques tan amb el risc de desenvolupar nefropatia membranosa idiopàtica com amb el curs clínic de la malaltia, en població espanyola. Els nostres resultats mostren que determinats al·lels en els gens HLA-DQA1 i PLA2R1 estan associats amb un major risc de desenvolupar nefropatia membranosa. A més, la combinació dels al·lels de risc per a aquests dos gens resulta en un risc encara més incrementat per a desenvolupar la malaltia. Per contra, no s’ha identificat cap associació significativa entre el nombre de copies en gens FCGR3A i FCGR3B i la susceptibilitat per desenvolupar nefropatia membranosa. Per primer cop, presentem evidència de la contribució d’al·lels de risc en els gens HLA-DQA1 i PLA2R1 en la predicció de la resposta al tractament immunosupressor i l’empitjorament de la funció renal. La segona part d’aquesta tesi es centra en la millora del diagnòstic genètic de la SNCR/GESF i l’estudi de les seves bases moleculars. En primer lloc, es va demostrar la idoneïtat de les tècniques de seqüenciació massiva per al diagnòstic genètic de la SNCR/GESF. A més, es van detectar pacients amb mutacions en un gen de la SNCR/GESF conjuntament amb COL4A3. Aquests pacients presentaven un fenotip més greu suggerint que mutacions en diferents gens que convergeixen en la barrera de filtració glomerular influencien en la severitat de la malaltia. El paper causal i modificador del gen TTC21B es va examinar en una cohort de pacients amb malaltia renal quística o glomerular. Els nostres resultats indiquen que la mutació p.P209L en homozigosi no és la única mutació d’aquest gen que causa GESF. A més, variants en heterozigosis en el gen TTC21B podrien agreujar el fenotip de pacients amb malalties renals quístiques o glomerulars. Finalment, s’ha desenvolupat un panell de gens associats amb malaltia renals com a eina diagnòstica per a malalties renals hereditàries quístiques i glomerulars, permetent el diagnòstic diferencial d’aquestes malalties, així com la identificació de variants estructurals, mutacions en mosaic i patrons d’herència complexes. Aquesta aproximació s’està utilitzant actualment en el diagnòstic genètic de rutina de pacients de tot Espanya i altres països, sent un clar exemple de recerca translacional. / This thesis is a contribution to the knowledge of the molecular bases of idiopathic nephrotic syndrome specifically, the idiopathic membranous nephropathy and steroid-resistant nephrotic syndrome (SRNS)/ focal segmental glomerulosclerosis (FSGS). The first part of this thesis is focused in the association of genetic polymorphisms with the risk to develop idiopathic membranous nephropathy and with its clinical course in the Spanish population. Our results showed that specific alleles within HLA-DQA1 and PLA2R1 genes are associated with a higher risk of idiopathic membranous nephropathy. In addition, the combination of the risk alleles for both genes results in an increased risk of disease development. In contrast, no significant association was found between copy number variants in FCGR3A and FCGR3B genes and susceptibility to idiopathic membranous nephropathy. For the first time, we presented evidence of the contribution of the risk alleles within HLA-DQA1 and PLA2R1 genes to predict response to immunosuppressive therapy and decline in renal function. The second part of these thesis focus on the improvement of SRNS/FSGS genetic testing and the study of its molecular bases. The suitability of massive parallel sequencing for genetic diagnosis of SRNS/FSGS was demonstrated. In addition, we detected patients with mutations in an SRNS/FSGS gene together with COL4A3 that showed increased disease severity, suggesting that mutations in different genes that converge in the glomerular filtration barrier influence disease severity. The causative and modifier role of TTC21B gene was examined in our cohort of cystic and glomerular patients. Our results showed that the homozygous p.P209L is not the only causative mutation of FSGS. Furthermore, heterozygous deleterious TTC21B variants may aggravate the phenotype of patients with glomerular and cystic kidney inherited kidney diseases. Finally, a kidney-disease gene panel was developed as a diagnostic tool for cystic and glomerular inherited kidney diseases, enabling the differential diagnosis of these diseases and the identification of mosaic mutations, structural variants and complex inheritance patterns. This approach is currently used in routine genetic diagnostic of patients from all over Spain and other countries, providing a nice example of translational research.

Competition for resources plays an important role in natural selection, creating winners and losers. Winners become socially dominant, obtain resources and so increase their fitness at the expense of losers. Provided they are heritable, phenotypic traits promoting competitive success will be inherited by subsequent generations. Thus, while resource dependent traits (e.g. growth) that rely on competitive outcomes are widely recognised as being under strong selection, this is also likely to be the case for those traits that determine competitive ability and social dominance. In addition, competition is expected to be an important source of stress, for example, harassment of subordinates by dominant individuals. Consequently individual fitness may depend not only on the ability to win resources, but also on the ability to cope with stress. This thesis proposes that social dominance is not just a simple consequence of body size or weaponry, but rather that the interplay between growth, repeatable behavioural characteristics (i.e. personality), and the ability to cope with social and environmental stressors are equally important factors. Thus the dynamic of dominance arises, a model that highlights the expectation of complex relationships between traits causal and consequent to social dominance. Here, empirical studies of Xiphophorus sp. are used to test each element in the model. First the concept of individual personality is explored, asking to what extent it is really stable over long periods of time (equivalent to lifespans). Next, the links between behaviour, physiological stress and contest outcome are considered and, using a repeated measures approach, the hypothesis that individuals differ in stress coping style is evaluated. Finally, using a quantitative genetic approach the additive genetic variance-covariance matrix (G) is estimated between behavioural and life history traits under experimentally manipulated levels of competition. In this way the contribution of genetic and environmental effects to the patterns of trait (co)variation that make up the dynamic of dominance is assessed.

Genomic microarray analysis is rapidly replacing conventional chromosome analysis by molecular karyotyping due to the significant increase in the power to detect causative CNVs. Here, we extensively validated the HumanHap550 and Human610-Quadv1_B Illumina platforms for potential diagnostic application by using patients with undiagnosed intellectual disability (ID). The first and foremost goal of our application study was to use these arrays for reliable genome wide detection of rare CNVs in patients of three different cohorts: 1) patients with unexplained intellectual disability 2) patients with unknown diffuse congenital hyperinsulinism (CHI) and 3) a family with a distinctive diagnosis of Holt-Oram syndrome (HOS). We showed that SNP-based arrays allow the detection of intragenic deletions and duplications. The identification of a disease-CNV affecting only a single gene allowed us to consider that particular gene as a candidate for intellectual disability. This was the case for three unrelated patients with moderate intellectual disability, global developmental delay, and severe speech and language disorders in which a de novo deletion encompassing solely the FOXP1 gene was detected. To prove further the causality of the FOXP1 deletion following-up investigations were based on a screening of the entire coding region of FOXP1 for nucleotide changes in a panel of 883 probands with intellectual disability. Eight non-synonymous coding changes, three synonymous and nine non-coding variants were identified. In addition to the de novo cases of ID, also patients suffering from an autosomal recessive form of ID were found in our cohort. We detected three partial heterozygous deletions of the COH1 gene at locus 8q22 which is mutated in Cohen syndrome. After sequencing the entire coding region and the exon/intron boundaries of COH1 we identified a stop mutation, a frameshift and two missense mutations in the remaining allele, respectively. Therefore, three compound heterozygous mutations were identified in the COH1 gene, thus providing a distinctive Cohen Syndrome diagnose to three unrelated patients of our ID cohort. We studied the genetic basis of a rare human autosomal disorder such as diffuse Congenital Hyperinsulinsm (CHI) in a cohort of 40 patients with inconspicuous mutation screening of ABCC8 and KCNJ11 genes. Chromosomal abnormalities detected by SNP oligonucleotide arrays accounted for 20% of the studied cases. The most interesting rearrangement was a 970kb deletion at the chromosomal band 1p31.1 which was found to encompass the PTGER3 and ZRANB2 genes and the last exon of the NEGR1 gene. We hypothesized that the haploinsufficiency of PTGER3 gene induces a 50% reduction of the stimulation by PGE2, thus diminishing the inhibition of glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) and resulting in elevated insulin secretion. The screening for point mutations in the candidate gene PTGER3 did not reveal any pathogenic variant neither in the second allele of the patient in which a de novo deletion was detected nor in a cohort of 39 unrelated patients with unexplained CHI. Instead we identified a novel polymorphic variant which was also detected in 18 individuals of our control cohort. CNV analysis in a family with both atypical Holt-Oram syndrome and additional mammary glands was performed allowing the detection of a contiguous heterozygous duplication at the chromosomal band 12q24.21. The maximal duplication size could be estimated as aproximately 345,6kb including the whole coding region of the TBX5 and TBX3 genes. Gene dosage assessment at specific genetic loci demonstrated the cosegregation of the duplication and the Holt-Oram syndrome/supernumerary mammary glands phenotype in this pedigree, this being a strong indicator of its pathogenecity. Up to date, this is the first report of a heterozygous duplication encompassing both TBX5 and TBX3 genes, and consequently the first report of a combined phenotype of Holt-Oram syndrome and supernumerary mammary glands.

Fibromyalgia (FM) is a highly disabling syndrome defined by a low pain threshold and a permanent state of pain. Widespread pain is accompanied by a constellation of symptoms such as fatigue, sleep disturbances and cognitive impairment, among others. The mechanisms explaining this chronic pain remain unclear. Nowadays, the most established/ plausible hypothesis underlying FM ethiopathogenesis is the existence of a dysfunction in pain processing, as supported by alterations in neuroimaging and neurotransmitters levels. The etiology of FM involves the interaction of environmental and genetic susceptibility factors. The genetic contribution to FM has been proven by the presence of a higher concordance of monozygotic than dizygotic twins as well as family aggregation. However, the individual genetic and environmental factors involved have not been identified. The aim of this thesis was to elucidate genetic susceptibility factors for fibromyalgia. We assessed this objective through three main approaches: the identification of FM clinically homogeneous subgroups with a two step cluster analyses, a genome-wide association study in order to evaluate the possible contribution of single nucleotide polymorphisms with Illumina 1 million duo array, and array comparative genomic hybridization experiments to identify regions varying in copy number that could be involved in FM susceptibility,using Agilent 2X400K platform. 48 variables were evaluated in 1,446 Spanish FM cases fulfilling 1990 ACR FM criteria. A partitioning analysis was performed to find groups of variables similar to each other. Variables clustered into three independent dimensions: “symptomatology”, “comorbidities” and “clinical scales”. Only the two first dimensions were considered for the construction of FM subgroups, classifying FM samples into three subgroups: low symptomatology and comorbidities (Cluster 1), high symptomatology and comorbidities (Cluster 2), and high symptomatology but low comorbidities (Cluster 3). These subgroups showed differences in measures of disease severity and were further implemented in genetic analysis. Genome-wide association study was performed in 300 FM cases and 203 controls. No SNP reached GWAS association threshold, but 21 of the most associated SNPs were chosen for replication in over 900 cases and 900 pain free-controls. Four of the strongest associated SNPs selected for replication showed a nominal association in the joint analysis. In particular, rs11127292 (MYT1L) was found to be associated to FM with low comorbidities. Array comparative genomic hybridization detected 5 differentially hybridized regions. They were followed up and one of these regions was validated though a multiplex PCR experiment. An intronic deletion in NRXN3 showed to be associated to female cases of FM and in particular those with low levels of comorbidities. Replication analysis showed a stronger association when considering only female cases and controls and low comorbidities. This enhance the importance of gender in FM etiopathogenesis and could be pointing to the existence of a different genetic background for FM in males and females highlights the importance of identifying FM homogeneous subgroups for the detection of FM genetic susceptibility factors. If the proposed FM candidate genes are further validated in replication studies, this would constitute a change in the FM ethiologycal concept, as several of these candidates are known neuropsychiatric disease associated genes (autism, addiction, mental disability). This would highlight a novel neurocognitive involvement in this disorder, currently considered musculoskeletal and affective. / La fibromialgia (FM) es una enfermedad de etiología desconocida que se caracteriza por dolor crónico generalizado, junto a una amplia constelación de síntomas acompañantes. La base etiopatogénica que explica este estado permanente de dolor es aún desconocida. Hasta la fecha la teoría más plausible es la existencia de una disfunción en la transmisión del dolor. Los estudios familiares han mostrado una considerable agregación familiar en FM,sugiriendo la importancia de los factores genéticos en el desarrollo de estos cuadros. Con la presente tesis se ha pretendido estudiar e identificar variantes del genoma (polimorfismos de base única (SNPs)- y variantes en el número de copia –CNVs) asociadas a FM, con el objetivo de profundizar en la etiología de la enfermedad. Para ello, se han llevado a cabo tres grandes aproximaciones: la identificación de subgrupos clínicos homogéneos de FM mediante un análisis de clusters, un estudio de genoma completo (GWAS) para el análisis directo de SNPs y experimentos de hibridación genómica comparada mediante arrays (aCGH) con el fin de identificar regiones variables en el número de copia asociadas a FM. El análisis de clusters ha permitido la identificación de tres subgrupos de FM en función de los niveles de sintomatología y de comorbilidad personal y familiar. Los resultados del GWAS indican una posible contribución del sistema nervioso central en el desarrollo de FM, ya que las enfermedades neurológicas aparecen como sobrerrepresentadas en el estudio de pathways realizado en los SNPs que presentaban mayor asociación, y un SNP en el gen MYT1L ha presentado asociación estadísticamente significativa con FM con niveles bajos de comorbilidad, poniendo de manifiesto la importancia de identificar subgrupos clínicamente homogéneos para la detección de factores de susceptibilidad genética para FM. Un CNV en el gen neurexina3 ha mostrado, asimismo, asociación en mujeres con FM, y en particular, en aquellas con bajos niveles de comorbilidad, siendo un nuevo argumento a favor de la implicación del SNC. La confirmación de las variantes detectadas en nuevas cohortes de fibromialgia supondría un giro conceptual de la enfermedad hacia una visión más neurocognitiva que osteomuscular.

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L'objectiu d'aquest treball és estimar amb quina freqüència es fixen i com es produeixen les inversions paracèntriques (les que no inclouen el centròmer) al gènere Drosophila. En primer lloc s'ha calculat quina és la taxa de fixació d'inversions entre les espècies D. melanogaster i dues espècies del grup repleta (D. repleta i D. buzzatii), que van divergir de D. melanogaster fa 40-62 milions d'anys. Per fer-ho s'ha analitzat l'organització molecular de tres regions cromosòmiques de D. melanogaster a les dues espècies del grup repleta. En total s'han localitzat 55 marcadors procedents de D. melanogaster als cromosomes de D. buzzatii i D. repleta. Els marcadors cartografiats en aquest treball s'han afegit als cartografiats prèviament al mateix cromosoma per formar un mapa físic del cromosoma 2 de D. repleta amb una densitat d'un marcador cada 219 kb. Les diferents regions analitzades no presenten diferències significatives en el nombre de punts de trencament que contenen, indicant que els punts de trencament es reparteixen homogèniament per tot el cromosoma. Extrapolant el comportament de les regions cromosòmiques analitzades a tot el cromosoma s'obté que el número mínim d'inversions fixades entre D. melanogaster i les dues espècies del grup repleta (D. repleta i D. buzzatii) és de 88±14 inversions (0,71 inversions fixades per milió d'anys). Aquest valor no és significativament diferent de l'obtingut amb la comparació dels 160 marcadors distribuïts per tot el cromosoma (114±14 inversions i una taxa de 0,92 inversions per milió d'anys). Aquests resultats mostren que la taxa d'evolució cromosòmica a Drosophila és superior a la de la majoria d'organismes analitzats.Posteriorment s'ha estudiat quin és el mecanisme que origina les inversions a les poblacions naturals. Anteriorment, s'havia demostrat que la inversió 2j, polimòrfica a D. buzzatii, es va originar per recombinació ectòpica entre dues còpies de l'element transposable del tipus Foldback Galileo. A més, els punts de trencament de la inversió són punts calents d'insercions d'elements transposables i mostren una gran inestabilitat genètica. Per comprovar el caràcter general o excepcional d'aquests resultats s'han caracteritzat molecularment els punts de trencament d'una altra inversió polimòrfica (2q7) de la mateixa espècie. Aquesta inversió també s'ha originat per recombinació ectòpica entre dues còpies de Galileo, i els punts de trencament de la inversió també mostren una gran inestabilitat genètica. La inestabilitat genètica descrita als punts de trencament de les inversions 2j i 2q7 es pot deure a la presència d'elements del tipus Foldback. Aquests elements tenen la capacitat de produir estructures secundàries, que s'ha demostrat que poden originar diferents tipus de reordenacions cromosòmiques. Aquestes estructures també augmenten la capacitat recombinogènica dels elements tipus Foldback, el que pot explicar la participació de Galileo en la generació de les dues inversions.Finalment s'ha estudiat la distribució cromosòmica dels elements transposables a D. buzzatii. L'anàlisi dels resultats ha permès establir que els elements transposables tendeixen a localitzar-se a les regions de baixa recominació, com les regions pericentromèriques o les regions incloses a les inversions cromosòmiques. També s'han localitzat els elements transposables BuT5 i Galileo exactament a les bandes on s'havia cartografiat els punts de trencament de les inverions 2z3 i 4s. Finalment, s'ha descrit una certa tendència dels elements transposables a localitzar-se a les bandes on s'han cartografiat els punts de trencament d'altres inversions descrites a altre espècies del complexe buzzatii, així com a coincidir diferents elements a les mateixes bandes cromosòmiques. Aquest resultat suggereix que la reducció de la recombinació no seria l'únic factor que provoca la seva acumulació als punts de trencament de les inversions. / The aim of this work is to estimate the frequency of fixation and to determine how paracentric inversions (those not including the centromere) arise in the genus Drosophila. First, we have calculated the fixation rate of inversions between D. melanogaster and two species of the repleta group (D. repleta and D. buzzatii), which diverged from D. melanogaster 40-62 millions years ago. To achieve this aim, we have analysed the molecular organization of three chromosomal regions of D. melanogaster in the two species of the repleta group. Overall, we have mapped 55 markers from D. melanogaster to the chromosomes of D. buzzatii and D. repleta. The markers mapped in this work have been added to those previously mapped in the same chromosome to complete a physical map of the chromosome 2 of D. repleta, with a density of one marker per 219 kb. The different regions studied do not show significant differences in the number of breakpoints, showing that the breakpoints are distributed homogenously over the chromosome. Extrapolating the results of the studied regions to the entire chromosome we obtained a value of 88±14 inversions fixed between D. melanogaster and the two species of the repleta group (0,71 inversions per million year). This value is not statistically different to that obtained with the comparison of 160 markers distributed along the chromosome (114±14 inversions and a rate of 0,92 inversions per million year). These results show that the evolution rate in Drosophila is higher than that of other organisms studied. Second, we have studied which is the mechanism that originates inversions in natural populations. It had been demonstrated previously that the 2j inversion, polymorphic in D. buzzatii, was originated through ectopic recombination between two copies of the Foldback element Galileo. Moreover, the breakpoints of the inversion have become hotspots for transposable elements insertions and show a high level of genetic instability. To check the generality or exceptionality of these results we have characterized at the molecular level the breakpoints of another polymorphic inversion (2q7) of the same species. This inversion has also been originated by ectopic recombination between two copies of Galileo and the breakpoints also show a high level of genetic instability. The genetic instability described in the breakpoints of 2j and 2q7 inversions is probably due to the presence of Foldback-like elements. These elements are capable of producing secondary structures that have been demonstrated to originate different chromosomal rearrangements. These structures also increase the recombinogenic capability of Foldback-like elements, which can explain the role of Galileo in generating the two inversions. Finally, we have studied the chromosomal distribution of some transposable elements in D. buzzatii. The analysis of the result have allowed us to establish that transposable elements tend to be localized in low recombination regions, such as the pericentromeric regions o those regions included in the chromosomal inversions. We have also localized precisely the transposable elements BuT5 and Galileo in the chromosomal bands where the breakpoints of inversions 2z3 and 4s have been mapped. Finally, we have detected a tendency of transposable elements to localize in the same chromosomal bands where the breakpoints of other chromosomal inversions described in different species of the buzzatii complex have been mapped. Besides that, transposable elements are often localized in the same chromosomal band. This result suggests that the reduction of recombination is not the only factor that produces its accumulation at the inversion breakpoints.

Los ensayos in vitro de transformación celular abarcan el proceso multifásico que va desde la conversión neoplásica hasta el establecimiento del fenotipo tumorigénico. En la presente tesis doctoral, el ensayo in vitro Balb/3T3, con una línea celular inmortalizada de fibroblastos de ratón, ha sido aplicado para determinar la citotoxicidad y el potencial carcinogénico de una serie de compuestos metálicos seleccionados por su interés ambiental, laboral y biomédico, adoptando una estrategia específica de trabajo en varias etapas. Esto ha implicado una optimización muy precisa del protocolo para determinar la reproducibilidad intralaboratorios del protocolo del ensayo y para asegurar la estabilidad de las condiciones experimentales de aplicación del ensayo Balb/3T3.Por consiguiente, después de la optimización del protocolo adoptado, el proyecto de tesis se desarrolló siguiendo una estrategia de cuatro etapas: a) determinación de la citotoxicidad a unas concentraciones de exposición fijadas (100 µM, 65 compuestos metálicos individuales). Esto permitió la selección de los compuestos metálicos que tendrían prioridad para las investigaciones subsiguientes; b) establecimiento de las relaciones dosis-efecto para 35 compuestos metálicos identificados como de primera prioridad en la etapa (a), para determinar los correspondientes valores de IC50 y un rango adecuado de concentraciones de exposición para ser utilizado en los pasos siguientes; c) determinación del potencial carcinogénico de los compuestos metálicos seleccionados a partir de la etapa (b); d) estudios sobre los mecanismos de transformación de las especies metálicas identificadas en la fase (c). En este contexto, una aproximación mecanística inicial fue la evaluación de la respuesta apoptótica inducida por los compuestos metálicos seleccionados en las células Balb/3T3. Este estudio sobre la apoptosis ha mostrado que se debería utilizar más de un ensayo para establecer inequívocamente la inducción de apoptosis por alguno de los compuestos metálicos en el sistema de ensayo escogido. Esto es debido a la complejidad del problema y a las dificultades para interpretar los datos experimentales. Por otra parte, los hallazgos sobre la respuesta apoptótica inducida por As(III), Cr(VI) y algunos compuestos de Pt sugieren la hipótesis de la existencia de una relación entre los procesos apoptótico, genotóxico y carcinogénico.Con respecto a los estudios mecanísticos y de metabolismo de los metales, los resultados obtenidos aplicando técnicas analíticas únicas y peculiares como el uso de radiotrazadores, espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo, y resonancia magnética nuclear han hecho posible obtener interesantes datos metabólicos sobre la entrada y el reparto intracelular de los metales incorporados en las células. Éste es un aspecto generalmente olvidado en los estudios in vitro a pesar de ser un punto clave para la interpretación mecanística de la citotoxicidad y de la actividad transformante inducidas por los compuestos químicos.Además, se encontró un buen nivel de concordancia al comparar los resultados obtenidos de la aplicación del ensayo Balb/3T3 con los modelos in vitro seleccionados de roedores y humanos.En conclusión, la presente tesis representa una importante contribución para hacer que la línea celular Balb/3T3 sea un valioso modelo in vitro para investigar la correlación entre absorción, biotransformación, citotoxicidad y potencial carcinogénico de los compuestos metálicos. Se puede afirmar que el ensayo Balb/3T3 tiene el potencial para ser adecuado para un estudio futuro de validación. / In vitro morphological cell transformation tests encompass the multi-step process from neoplastic conversion to the established tumorigenic phenotype. In the present PhD thesis the in vitro Balb/3T3 assay, an immortalised mouse fibroblast cell line, was applied for assessing cytotoxicity and carcinogenic potential of selected metal compounds of environmental, occupational and biomedical interest by adopting a specific multi-stage work strategy. This has involved a very accurate protocol optimisation in order to assess intralaboratory reproducibility of the test protocol and to assure stability of the experimental conditions in which the Balb/3T3 assay was applied.Therefore, after optimisation of the adopted protocol the present PhD project was carried out following a "four steps approach": a) determination of cytotoxicity at a fixed concentration exposure (100 µM, 65 individual metal compounds). This allowed the selection of metal compounds to which priority is given for subsequent investigations; b) setting of dose-effect relationships for 35 metal compounds identified as first priority in step (a), in order to establish the corresponding IC50 values and a suitable exposure range of concentrations to be used in the subsequent steps; c) determination of carcinogenic potential of selected metal compounds from step (b); d) mechanistic studies on transforming metal species as identified in step (c). In this context, an initial mechanistic approach was the evaluation of the apoptotic response induced by selected metal compounds on the Balb/3T3 cells. This study on apoptosis has shown that more than one assay should be used in order to establish unequivocally the induction of apoptosis by a metal compound on the selected test system. This is due to the complexity of the problem and the difficulties to interpret the experimental data. Moreover, the findings on the apoptotic response induced by As(III), Cr(VI) and some Pt-compounds suggest the hypothesis of an existing relationship among apoptotic, genotoxic and carcinogenic processes.With regard to mechanistic studies and metal metabolism, the results obtained applying unique and peculiar analytical techniques like the use of radiotracers, Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry and Nuclear Magnetic Resonance have made possible to get interesting metabolic data on uptake and intracellular repartition of metals incorporated into cells. This is an aspect generally neglected in in vitro studies although it is a key point for mechanistic interpretation of cytotoxicity and transforming activity induced by chemicals.In addition, a good level of concordance was achieved by comparing the results obtained from the application of the Balb/3T3 assay with selected in vitro rodent and human models.In conclusion, the present PhD project represents an important contribution to make the Balb/3T3 cell line as a valuable in vitro model to investigate correlation between uptake, biotransformation, cytotoxicity and carcinogenic potential of metal compounds. It is to state that the Balb/3T3 assay has the potential to be suitable for a future validation study.

Dada la importancia clínica de las quinolonas en el control de enfermedades infecciosas y las posibles implicaciones que puede tener el hecho de que estas moléculas sean agentes mutagénicos en bacterias, el presente estudio se ha centrado en profundizar en los mecanismos de mutagénesis, utilizando la ciprofloxacina como molécula modelo, y en determinar el potencial mutagénico de quinolonas de actual uso clínico.En lo que se refiere a los mecanismos de mutagénesis, se ha demostrado que para la mutagénesis inducida por ciprofloxacina, se requiere que las bacterias posean un sistema de reparación de escisión de nucleótidos (NER) funcional, descartándose que el operón moa, el cual codifica genes de biosíntesis de cofactores de molibdeno tenga algún papel en dicha mutagénesis.Estos resultados corroboran estudios anteriores, los cuales sugerían la participación del sistema NER en dicha mutagénesis, e indican que probablemente otros genes deleccionados en las cepas de ensayo de S. enterica Typhimurium TA104 y TA2659 distintos del uvrB, no deben tener un papel importante en la mutagénesis mediada por las quinolonas.Por otra parte, se ha demostrado que la ciprofloxacina puede generar alguna especie reactiva de oxígeno, probablemente el anión superóxido (O2-) y/o oxígeno singlete produciendo daño oxidativo, el cual no debe de ser preferentemente la lesión 8-oxoG.El conjunto de estos resultados indica que las quinolonas deben de producir diferentes tipos de lesiones en el DNA de las células bacterianas. Así, la interacción de la molécula de quinolona con el complejo DNA - DNA girasa debe generar un tipo de distorsión análoga a un enlace intercatenario, dando lugar a una lesión premutagénica. Dicha lesión puede ser procesada por el sistema NER y convertirse en una lesión mutagénica sobre la cual actuaría una DNA polimerasa tendente al error, análoga a MucAB y que introduciría una mutación. Este mecanismo de mutagénesis debe ser común a este tipo de moléculas. Por otra parte, los resultados obtenidos en mutantes soxRS indican que esta familia de compuestos también introducen lesiones oxidativas, las cuales deben de ser más relevantes en aquellas moléculas descritas como fototóxicas, como clinafloxacina, lomefloxacina y otras.Finalmente, y utilizando ensayos de retromutación en E. coli y S. enterica Typhimurium, se ha demostrado que las quinolonas de cuarta generación clinafloxacina, trovafloxacina y gemifloxacina son las que presentan mayor actividad mutagénica, mientras que levofloxacina y moxifloxacina son las que producen un menor número de revertientes en ambos sistemas de ensayo. El potencial mutagénico de cada quinolona debe de estar relacionado con su estructura molecular, permeabilidad de la bacteria y acumulación de las quinolonas. Así, se relaciona la baja capacidad de mutagénesis de la moxifloxacina en ambos ensayos con la presencia de un grupo metoxi en posición C-8, mientras que la ciprofloxacina es detectada como una molécula de elevada capacidad mutagénica en E. coli WP2 / pKM101 y de baja actividad en S. enterica Serov. Typhimurium. Es de señalar que la mutagénesis estudiada se manifiesta a dosis de quinolonas inferiores a la CMI de cada molécula en las cepas de ensayo. En atención a estos resultados se discute las posibles implicaciones de la exposición de las poblaciones de patógenos a bajas dosis de quinolonas y se propone este tipo de estudio como clave para el desarrollo de nuevas moléculas de esta familia de antimicrobianos, los cuales deberían presentar una mejor actividad antibacteriana junto a una baja capacidad de introducir mutaciones. / Given the clinic importance of the quinolones in the control of infectious diseases and their possible involvement in the bacterial mutagenesis, this study has been focused to gain insight into the mutagenesis mechanisms using ciprofloxacin as a model and by determining the mutagenic potential of quinolones in the current clinic administration.In reference to the mutagenic mechanisms, it has been shown that bacteria must own a functional nucleotide excision repair system (NER) for taking part the ciprofloxacin-induced mutagenesis. Furthermore, it has been rule out that moa operon, which codifies genes participating in the biosynthesis of molybdenum cofactors, has a role in such mutagenesis process.These results support early studies which suggested the participation of NER in the above mentioned mutagenesis and indicate that likely other deleted genes apart from uvrB in the tester strains TA104 and TA2659 of Salmonella typhimurium may not have an important role in the quinolones mediated mutagenesisOn the other hand, it has been demonstrated that ciprofloxacin can generate some reactive oxygen species (likely superoxid anion (O2-) and/or singlet oxygen) that produce oxidative damage. This damage may be not preferably the 8-oxoG lesion.All these results together indicate that quinolones have to produce different kinds of DNA lesions in bacterial cells. Thus the interaction of quinolone molecule with the DNA-DNA gyrase complex has to generate a type of distortion analogue to an interchain bond, giving rise to a premutagenic lesion. This lesion can be processed by the NER system and became a mutagenic lesion that could be bypassed by an error-prone DNA polymerase (as MucAB) introducing a mutation. Such mutagenic mechanism has to be common to that kind of molecules. On the other hand, results obtained in soxRS mutants indicate that this family of compounds introduces also oxidative damage which has to be more relevant in phototoxic molecules as clinafloxacin, lomefloxacin, among others.Finally, using retromutation assays in E. coli and S. enterica thyphimurium, it has been demonstrated that fourth-generation quinolones as clinafloxacin, trovafloxacin y gemifloxacin show the highest mutagenic activity, while levofloxacin and moxifloxacin produce a lower number of revertants in both assay systems. The mutagenic potential of each quinolone has to be related to its molecular structure, bacterial permeability and quinolone accumulation. That way the low mutagenic action of moxifloxacin is related to the presence of the metoxy group in C-8 position, while ciprofloxacin is detected as a high mutagenic activity molecule in E. coli WP2/pKM101 and of low mutagenic activity molecule in S. enterica Serov. typhimurium. It is important to mention that the studied mutagenesis appears at quinolone doses lower to the MIC of each molecule in the assay strains. Having in mind this results the possible implications of the pathogen population exposition to low doses of quinolones is discussed, and it is proposed that these studies are key for the development of new quinolone molecules, which should present both, a higher antibacterial and a low capability of mutagenic activities.

Las levaduras silvestres presentan una acusada inestabilidad cariotípica durante el crecimiento vegetativo. Hemos analizado alrededor de 500 cariotipos de derivados mitóticos y meióticos de la cepa vínica silvestre DC5, la cual presenta una frecuencia de inestabilidad cariotípica de 8.2x10-2 cambios/clon/generación. Un 70 % de los derivados meióticos de DC5 presentó una baja frecuencia de inestabilidad cariotípica, con una media de 5.8x10-4 cambios/clon/generación, sugiriendo que la inestabilidad cariotípica es un fenotipo de carácter dominante. Los derivados diploides con una baja tasa de inestabilidad cariotípica mitótica, también presentaron una baja tasa de inestabilidad cariotípica en meoisis, sugiriendo que los dos fenotipos están ligados. La cepa DC5 y alguno de sus derivados meióticos (tanto los de baja como los de alta frecuencia de variabilidad cariotípica) presentaron una manifiesta hipervariabilidad en el cromosoma XII, aunque esta no es un indicativo de inestabilidad genética. Los derivados cariotípicamente inestables, pueden dar lugar a derivados estables con una alta frecuencia.La inestabilidad genética de una cepa dificulta la posibilidad de aplicar programas de mejora genética en ésta para su aplicación industrial. La inestabilidad cariotípica es un fenómeno de carácter dominante, y que depende de pocos elementos genéticos. La disrupción del gen RAD52 en una cepa hipervariable, estabiliza parcialmente su cariotipo. Concretamente la disrupción de RAD52 elimina la recombinación subtelomérica y telomérica, no influye en la hipervariabilidad del cromosoma XII y reduce en un 30% la frecuencia de inestabilidad cariotípica. Por consiguiente, existen al menos tres mecanismos relacionados con la inestabilidad cariotípica en cepas salvajes, de los que dos son independientes de recombinación homóloga- RAD52. El mutante rad52 presentó un fitness industrial equiparable a la cepa salvaje, en la segunda fermentación del cava, en concreto en lo que a capacidad de fermentación vigorosa se refiere. El aislamiento físico y el análisis de algunas variantes de tamaño del cromosoma I en estas cepas, mostró como estas diferían en las regiones subteloméricas, permaneciendo el cuerpo central cromosómico de 150 Kb inalterado. El mapeo fino de dichas regiones subteloméricas, mostró grandes alteraciones en dos loci muy similares, FLO1 y FLO9. Estos loci se localizan en los brazos derecho e izquierdo del cromosoma I. Estos genes poseen secuencias repetidas internas. Algunas variantes del cromosoma I que carecen del gen FLO1 mostraron un evidencias de procesos recombinatorios en regiones del brazo derecho que contienen LTRs y Tys. Por lo tanto proponemos que las secuencias repetidas en algunas regiones subteloméricas de S.cerevisiae pueden jugar un papel la hipervariabilidad cariotípica. Algunas de dichas secuencias codifican proteínas de membrana y de interacción con el medio, por lo que la plasticidad subtelomérica puede implicar un mecanismo de adaptación a substratos específicos. Este patrón semi conservativo de reorganizaciones cromosómicas puede tener importantes implicaciones, tanto desde un punto de vista evolutivo como para diferentes procesos biotecnológicos. / Yeast strains isolated from the wild may show high rates of changes in their karyotypes during vegetative growth. We analysed over 500 karyotypes from mitotic and meiotic derivatives of strain DC5, which has a chromosome rearrangement rate of 8.2x10-2 changes/generation. About 70% of the meiotic derivatives of DC5 had low rearrangement rates, with an average of 5.8x10-4 changes/generation, suggesting that karyotype instability behaved as a dominant phenotype. Diploid derivatives with low karyotype variability in mitosis also had low rates of chromosomal rearrangement during meiosis, suggesting that the two phenotypes may be linked. DC5 and some of its meiotic derivatives (both with high and low karyotype variability) had chromosome XII hypervariable bands. Their distribution among the meiotic products indicates that they are not indicators for genetic instability. Karyotypically unstable yeast strains may give stable progeny at high rates. The genetic instability compromises their utility in genetic improvement projects for industrial purposes. Karyotype instability is a dominant trait, segregating among meiotic derivatives as if it depended upon only a few genetic elements. We show that disrupting the RAD52 gene in a hypervariable strain partially stabilizes its karyotype. Specifically, RAD52 disruption eliminated recombination at telomeric and subtelomeric sequences, had no influence on ribosomal DNA rearrangement rates, and reduced to 30% the rate of changes in chromosomal size. Thus, there are at least three mechanisms related to karyotype instability in wild yeast strains, two of them not requiring RAD52-mediated homologous recombination. When utilized for a standard sparkling-wine second fermentation, rad52 strains retained the enological properties of the parental strain, specifically its vigorous fermentation capability. Physical isolation and analysis of several chromosome I size variants of one of these strains revealed that they differed only in their subtelomeric regions, leaving the central 150 Kb unaltered. Fine mapping of these subtelomeric variable regions revealed gross alterations of two very similar loci, FLO1 and FLO9. These loci are located on the right and left arms, respectively, of chromosome I and encompass internal repetitive DNA sequences. Furthermore, some chromosome I variants lacking the FLO1 locus showed evidence of recombination at a DNA region on their right arm that is enriched in repeated sequences, including Ty LTRs. We propose that repetitive sequences in many subtelomeric regions in S. cerevisiae play a key role in karyotype hypervariability. As these regions encode several membrane-associated proteins, subtelomeric plasticity may allow rapid adaptive changes of the yeast strain to specific substrates. This pattern of semi-conservative chromosomal rearrangement may have profound implications, both in terms of evolution of wild strains and for biotechnological processes.

El establecimiento de clinas latitudinales para caracteres del polimorfismo de inversión y la morfología en poblaciones americanas de Drosophila subobscura, paralelas a las existentes en la región paleártica, sugieren la adaptación a condiciones ambientales análogas. Un factor climático que cambia con la latitud es la temperatura, por lo tanto este podría ser el agente causal de la formación de las clinas latitudinales. Por lo tanto, el objetivo principal de este trabajo fue estudiar los efectos de diferentes regimenes térmicos en el polimorfismo cromosómico de inversión, así como la variación en tamaño y forma del ala en Drosophila subobscura. Así, tres poblaciones replicadas de D subobscura derivadas de un stock endogámico de Puerto Montt (Chile) fueron mantenidas cada una a tres regimenes térmicos diferentes (correspondiendo a condiciones de frió la temperatura de 13°C, de óptimo a 18°C y de cálido a 22°C) por 2 años. Los resultados indican que el polimorfismo de inversión ha respondido rápido y consistentemente a la temperatura, Sin embargo, los cambios observados en las frecuencias de muchos ordenamientos cromosómicos no son consistentes con las predicciones basadas en las clinas latitudinales observadas en las poblaciones europeas de los últimos 30 años. Además, hay una rápida y consistente evolución termal de la forma del ala (pero no en tamaño), y las tasas de divergencia para forma del ala son tan rápidas o incluso mas rápidas que estas previamente estimadas para tamaño del ala a una escala continental. La conclusión es que la temperatura no es el agente causal de las clinas latitudinales.Por otro lado, muchas propiedades de los organismos muestran gran fuerza genética contra las perturbaciones ambientales. Los términos canalización y estabilidad del desarrollo fueron propuesto originalmente para describir la habilidad de un organismo para resistir las perturbaciones y para producir un posible fenotipo blanco a pesar del ruido de desarrollo aleatorio. En la segunda parte de este trabajo, se analizaron los efectos de la variación genética clinal (polimorfismo de inversión) en la asimetría del ala por los métodos aplicados de morfometría geométrica en el contexto de la genética cuantitativa, usando líneas isocromosómicas de Drosophila subobscura. En los análisis de tamaño en general, la estabilidad de desarrollo fue positivamente correlacionada con los niveles de heterocigosidad y el desarrollo a la temperatura optima. En los análisis de forma, las comparaciones totales por correlación de matrices indican que los niveles de variación inter o intra individual fueron pobremente correlacionados, un resultado que tiene soporte también, cuando se comparan los vectores de patrones descritos para la variación de posición de landmarks. La falta de similaridad fue básicamente debida a las discrepancias entre los componentes genético y ambiental de la variación interindividual. Los análisis han mostrado también una presencia baja de variación genética para la asimetría direccional. Finalmente, los resultados soportan fuertemente que la canalización ambiental y la estabilidad de desarrollo comparten mecanismos reguladores subyacentes, pero la canalización ambiental y genética no son funcionalmente lo mismo. Una explicación posible para esta falta de asociación es que la variación de la forma del ala en las poblaciones naturales de Drosophila está indirectamente relacionada con el fitness individual. / The establishment in American populations of Drosophila subobscura of parallel latitudinal clines, in the polymorphism of inversion and morphologic characters, to the existing ones in the paleartica region suggests adaptation to analogous environmental conditions. A climatic factor that changes with the latitude is temperature, maybe it's the causal agent in shaping of latitudinal clines. Therefore, the aim of this work was to study the effects of different thermal regimes on chromosomal inversion polymorphism, as well as variation in wing size and shape in Drosophila subobscura. Thus, three replicated populations of D. subobscura derived from an outbreed stock of Puerto Montt (Chile) were each kept at three different thermal regimes (corresponding to cold a temperature of 13°C, to optimal to 18°C and to warm to 22°C conditions) for 2 years.The results indicate that the polymorphism of inversion has responded fast and consistently to the temperature. However, the changes observed in the frequencies of many chromosomal arrangements are not consistent with the predictions based on the latitudinal clines observed in European populations in the last 30 years. In addition, there is a rapid and consistent thermal evolution of wing shape (but not size), and rates of genetic divergence for wing shape are as fast or even faster than those previously estimated for wing size to a continental scale. The conclusion is that the temperature isn't the causal agent of latitudinal clines.On the other hand, many properties of the organism show great robustness against genetic and environmental perturbation. The terms canalization and developmental stability were originally proposed to describe the ability of an organism to resist perturbations and to produce a predictable target phenotype regardless of random developmental noise. In the second part of this work, we have analyzed the effects of clinal genetic variation (inversion polymorphism) on wing asymmetry by applying the methods of geometric morphometrics in the context of quantitative genetics using isochromosomal lines of Drosophila subobscura. For the analysis of overall size, developmental stability was positive correlated with levels of heterozigosity and development at the optimal temperature. For analyses of shape, the overall comparisons by matrix correlations indicate that inter and intraindividual variation levels were poorly correlated, a result also supported when comparing the vectors describing patterns of variation of landmark position. The lack of similarity was basically due to discrepancy between the genetic and environmental components of the interindividual variation. The analyses have also underscored the presence of genetic variation for directional asymmetry. Finally, the results strongly support that environmental canalization and developmental stability share underlying regulatory mechanism, but environmental and genetic canalization are not functionally the same, maybe because the natural wing shape variation in Drosophila populations is loosely related to individual fitness.