Köln, Universiẗat, Diss., 2000.

Darmstadt, Techn. Universiẗat, Diss., 2003.

En este trabajo presentamos el resultado de los análisis antracológicos de las muestras de carbón obtenidas durante la primera fase del proyecto denominado Ocupació del sòl i formes del paisatge de muntanya als Pirineus orientals de l'Antiguitat a l'època medieval, dirigido por J. M. Palet (ICAC) y por S. Riera (SERP-UB). Las zonas estudiadas han sido por un lado, la vertiente meridional de la sierra del Cadí, concretamente el valle de la Vansa (La Vansa-Fórnols y Josa-Tuixén, Alt Urgell) localizado en el Parque Natural del Cadí-Moixeró y, por otro, el valle del Madriu situado en el municipio de Escaldes-Engordany (Andorra).Los estudios antracológicos tienen un papel primordial en el marco de este proyecto ya que los restos de carbones son particularmente abundantes y presentes en todas las estructuras. El objetivo de este trabajo, ha sido conocer y entender la dinámica y la relación de las poblaciones que ocuparon estos valles con el medio de alta montaña y en concreto con el medio forestal. Las estructuras documentadas han sido carboneras, hornos y estructuras ganaderas. Hemos documentado niveles de un amplio marco cronológico que discurre desde el Neolítico Antiguo hasta época moderna. Desde el Neolítico Antiguo hasta Época Moderna, las poblaciones ganaderas que suben a estas altitudes en busca de prados estivales, llevan a cabo una explotación del entorno leñoso inmediatamente cercano. El objetivo de estos pastores es la obtención de buenos prados y la madera se utiliza para la elaboración de hogares y construcción de estructuras. A partir de Época Romana, sobre todo en el Cadí, la actividad metalúrgica (al menos una parte de ella, como es la primera transformación del hierro) gana importancia y suponemos que el combustible utilizado es carbón, aunque no hemos documentado todavía ninguna carbonera de estas cronologías. Sin embargo, la mayoría de información obtenida sobre el uso del medio arbóreo ha sido debido a la gran cantidad de carboneras documentadas y datadas entre los siglos XIV y XVIII. Éstas están directamente relacionadas con las fraguas del entorno. La madera utilizada es el pino, abedul y abeto en estado verde. En este trabajo, además del tipo de madera utilizada, hemos podido comprender otros aspectos etnográficos de los carboneros a través del estudio de carboneros actuales.A pesar de la poca variabilidad de los resultados, hemos podido observar varias formaciones vegetales de los pisos montano y subalpino. El pino representa casi la totalidad de prácticamente todas las estructuras. Esto nos ha permitido realizar una serie de mediciones en la estructura de los fragmentos para poder observar si se podían distinguir los dos tipos de pino de montaña, el albar y el negro. La excepcional conservación del material estudiado nos ha permitido observar varios utensilios que conservaban claramente la morfología, como tapas de recipientes o un mango de algún tipo de utensilio. Hemos podido observar que los taxones utilizados para actividades que requieren una gran cantidad de materia prima, son los que se disponen en el entorno inmediato, en este caso el pino. También se realizaría la fabricación de objetos en los tiempos libres de pastores y carboneros con la madera del entorno, pero es muy posible también que transportaran consigo objetos realizados con otras especies provenientes de otro contexto, como el boj o el abeto.La alta montaña, al contrario de lo que se ha creído tradicionalmente, nunca ha sido un área marginal. En épocas en las que priorizan las actividades agrícolas, la ocupación de alta montaña no disminuye sino que vive una continuidad, puesto que este entorno ofrece una serie de recursos específicos muy apreciados desde la prehistoria (bosques, minerales y prados). / In this paper we present the results of the charcoal analyses obtained during the first stage of the project called Ocupació del sòl i formes del paisatge de muntanya als Pirineus orientals de l'Antiguitat a l'època medieval, directed by J.M. Palet (ICAC) and S. Riera (SERP-UB). The studied areas are two: southern slope of the Cadi mountain range, specifically Vansa valley (Vansa-Fórnols and Josa-Tuixén, Alt Urgell) located in the Cadi Natural Park, and Madriu valley, located in Escaldes (Andorra).Antracological studies have a fundamental role in the constitution of this project, since the charcoal residues are present and particularly abundant in all the structures. The objective of this work is to understand and learn the dynamics and relationship of the population that occupied these valleys with the high mountain and, in particular, with its forests. The recorded structures were charcoal kilns, furnaces and cattle constructions. We analysed levels from an ample chronological range; starting from Neolithic Antique and going all the way to Modern Age. From Neolithic Antique to Modern Age, cattle populations that rose to these altitudes searching for summer meadows collected wood from their immediate surroundings. The main purpose of these shepherds was to obtain good meadows to feed their cattle. The wood was solely used as building material for houses and other structures. During Roman times, mainly in Cadi, the metallurgical activity (at least one part of it, as it is the first transformation of the iron) gains importance. Although we still have not proved the existence of charcoal kilns during this period, we suppose that the fuel of choice for this purpose was coal. Nevertheless, the majority of data obtained regarding the use of wood belongs to the charcoal kilns identified and dated between the 14th and 18th centuries. These kilns are directly related to the ovens found in the surroundings. The type woods used for this purpose were freshly cut pine, birch and fir. In this paper, besides the type of wood that was used, we have been able to understand additional ethnographic aspects of the charcoal makers through the study of current charcoal producers. In spite of the little variability of the anthracological results, we have been able to observe several vegetal formations from mountain and sub-alpine stages. Pine represents almost the totality of practically all the structures. This has allowed us to take some measurements in the structure of the fragments in order to see if it's possible to distinguish in between the Pinus sylvestris and Pinus uncinata. The exceptional preservation of the charcoal samples has allowed us to observe several objects that conserved its morphology, such as: covers for containers or a handle for some type of tool. We have been able to observe that the taxa used for activities that require a great amount of raw material, are those obtained from the immediate surroundings (in this case pine). Although the manufacturing of objects would be performed during shepherds' and charcoal makers' free time with the wood from their immediate surroundings, it is very probable that they carried objects made with material from other settings, like boxwood or fir. The high mountain, unlike what it has traditionally believed, has never been a fringe area. During times when agricultural activities were considered a priority, the occupation of High Mountain not only does not decrease but stabilizes, since this surrounding offer a series of much appreciated specific resources since prehistory (i.e.: forests, minerals and meadows).

Under the Kyoto Protocol, reductions in emissions of several radiative gases can be credited against a carbon equivalent emissions cap. We investigate the economic implications of including other greenhouse gases and sinks in the climate change control policy using our revised and updated version of the Emissions Prediction and Policy Analysis (EPPA) model. In addition we amended our methane abatement curves based on different interpretations of estimates that substantial abatement of methane can be obtained at no cost. The inclusion of other greenhouse gases and CO2 sinks reduces the costs of achieving CO2 emissions reductions specified under the agreement. / Abstract in HTML and technical report in PDF available on the Massachusetts Institute of Technology Joint Program on the Science and Policy of Global Change Website. (http://mit.edu/globalchange/www/) / Includes bibliographical references (p. 7).

Se ha estudiado variabilidad genética en el musgo Funaria hygrometrica y su relación con los procesos de adaptación al cambio climático en la alta montaña Mediterránea de Sierra Nevada (España). Para ello se han secuenciado cuatro regiones del ADN (espaciadores nuclear ITS1 e ITS2, la región cloroplastidial rps3-rpl16 y la mitocondrial rpl5-rpl16). Asimismo se han usado dos técnicas de fingerprinting (microsatélites y AFLP). Se ha aplicado el método de exploración del genoma sobre los datos AFLP para detectar loci sometidos a selección. Se han desarrollado con éxito nuevos cebadores y/o se han modificado otros para mejorar la amplificación PCR en las regiones rps3-rpl16 e ITS. Los resultados obtenidos han mostrado una alta variabilidad genética y han revelado la existencia de dos linajes divergentes en Funaria hygrometrica. Asimismo, los niveles significativos de la prueba de Mantel han sugerido que Funaria hygrometrica posee una variación adaptativa a lo largo de Sierra Nevada. / The genetic variability in the common cord moss Funaria hygrometrica and its relation to climate change adaptation processes in Mediterranean high mountain of Sierra Nevada (Spain) were studied. Four DNA regions were sequenced (ITS1 and ITS2 nuclear spacers, rps3-rpl16 chloroplast DNA region, and rpl5-rpl16 mitochondrial intergenic spacer). Two fingerprinting techniques (microsatellites and AFLP) were used to complement the sequence data. A genome scan method was applied on the AFLP data in order to find loci under selection. New and/or modified primers were developed to improve the PCR amplification for the nuclear ITS spacer and the chloroplast rps3-rpl16 region. The results obtained showed a high genetic variability and revealed the existence of two divergent lineages of Funaria hygrometrica. Based on the statistical Mantel test, the significant levels of correlation suggested that Funaria hygrometrica possesses an adaptive variation along Sierra Nevada Mountains.

Agrobacterium tumefaciens es una bacteria fitopatógena causante de tumores en el cuello y raíces de muchas especies vegetales de interés económico. En los viveros e invernaderos es donde más daños produce, al aparecer episodios epidémicos que pueden impedir la comercialización de producciones enteras, porque las plantas afectadas por esta enfermedad no pueden ser comercializadas. Los estudios epidemiológicos y de dinámica de poblaciones del patógeno son poco abundantes y han incidido en aspectos del desarrollo y mantenimiento de la enfermedad producida por la bacteria. Aunque se ha señalado el predominio de cepas no patógenas frente a patógenas en ambientes en los que las cepas productoras de la enfermedad verían favorecido su mantenimiento, apenas se ha investigado la pérdida del poder patógeno en aislados de tumores. Por tanto, en esta memoria se ha pretendido ampliar el conocimiento sobre la aparición de cepas no patógenas a partir de cepas patógenas en tumores de diversas especies vegetales, huéspedes habituales y no habituales. El objetivo era comprobar si este fenómeno se presenta en la mayoría de cepas de A. tumefaciens, y si existen interacciones con plantas o de otro tipo que favorezcan su aparición. En primer lugar, se ha puesto a punto un método de identificación de cepas individuales de A. tumefaciens, por medio de un sistema de RAPDs, que emplea iniciadores inespecíficos, y que se ha comprobado que es eficaz para diferenciar entre cepas del género Agrobacterium sp. En segundo lugar, se han llevado a cabo varios experimentos de inoculación de diversos huéspedes vegetales y, de los tumores producidos, se han aislado colonias de las que se ha estudiado el fenotipo patógeno, para comprobar la frecuencia de aparición de este fenómeno y estudiar los cambios que a nivel molecular habían sufrido. También se han llevado a cabo experimentos in vitro, mediante siembras sucesivas en un medio general, para ver si la pérdida del fenotipo patógeno se produce de forma espontánea. El sistema de identificación mediante RAPDs ha permitido comprobar que, en el análisis de más de 5.000 colonias no patógenas procedentes de los aislamientos realizados en los tumores, solo siete de estas colonias se correspondía con la que previamente se había inoculado en alguno de los huéspedes. El resto eran cepas de Agrobacterium no patógenas de las que se desconoce su origen. Los resultados de este trabajo muestran por tanto, que el fenómeno de la pérdida del poder patógeno se produce, en las condiciones y cepas estudiadas, de forma muy escasa. La caracterización molecular de los mutantes ha mostrado que 6 de 7 presentan cambios en su plásmido Ti. Entre ellos, inserciones de elementos transponibles en genes de virulencia o mutaciones puntuales. El caso más llamativo es el de dos mutantes que presentan grandes cambios en su plásmido Ti, con un tamaño doble del de la cepa salvaje. El resto de mutantes presenta variaciones en el tamaño o número de plásmidos respecto a las cepas parentales. Los cambios ocurridos parecen implicar grandes reorganizaciones en el genoma de los mutantes, no sólo a nivel del plásmido Ti. / Agrobacterium tumefaciens is the agent of crown gall in many plants of economic interest. The losses are important in greenhouses and nurseries, because of outbreaks that do not allow the marketing of entire productions. Studies on epidemiology are scarce, and they have focused on several aspects about the spread and maintenance of the disease. Although it has been noticed the predominance of non pathogenic strains against pathogenic in environments where the tumorigenic strains would be favored, few studies have been developed on the loss of pathogenicity. The goal was to increase the knowledge about the appearance of nonpathogenic strains from pathogenic bacteria in tumors produced in different plant species, to see whether this phenomenon occurs in the majority of A. tumefaciens strains, and if they exist interactions with plants that could increase these changes. An identification system to distinguish strains of A. tumefaciens by a RAPD procedure has been set up, and it has proved its validity. Several inoculation experiments on different hosts have been performed, and from the tumors produced, colonies were isolated and analyzed to see the phenotype pathogen, to determine the frequency of this phenomenon and study the changes they could have undergone. In vitro experiments of successive incubations in a general medium have been performed as well, to examine if this loss of pathogenicity takes place spontaneously. The identification system by RAPDs has established that among more than 5.000 nonpathogenic colonies isolated from the tumors, only seven correlated with the strains previously inoculated in the hosts. The results obtained in this work have shown that the loss of pathogenicity takes place, in the conditions and with the strains studied, very scarcely. The molecular characterization of the mutants has shown that 6 out of 7 found have changes in the Ti plasmid. Among them, the insertion of DNA sequences (IS) into virulence genes or point mutations. In two of the mutants, the alterations have affected the Ti plasmid that it duplicates the size of the parental strain. The changes seem to be due to rearrangements in the genome of the mutants, and in the plasmid.

Los objetivos de la presente tesis doctoral son describir la composición taxonómica de las larvas de peces que habitan las aguas del Mar Menor, conocer la distribución espacial y la dinámica temporal del ictioplancton en la laguna, analizar los factores ambientales que determinan dicha distribución y dinámica y, finalmente, valorar el papel de la colonización larvaria a través de los canales de comunicación con el mar abierto y las corrientes en la estructura del poblamiento ictiológico. METODOLOGÍA: El trabajo se ha llevado a cabo en el Mar Menor, laguna costera ubicada en el SE de la península ibérica, en el extremo oriental de la Región de Murcia. Se establecieron en la misma 20 localidades de muestreo donde se recogió material en 1997 y desde 2006 a 2012. Adicionalmente, durante 2009 y 2012 se sumaron 8 estaciones para estudiar la influencia del Mediterráneo adyacente, ubicándolas en la bocana interior de los tres canales de comunicación con el mar abierto y en el propio Mediterráneo. El diseño experimental de muestreo permite el análisis de las escalas espacio-temporales de variabilidad del poblamiento y de las condiciones ambientales. El material trabajado en la presente memoria proviene de un total de 3.342 muestras tomadas con arrastres sub-superficiales (0,5–2 m de profundidad), diurnos, circulares y con una duración de 7 minutos, utilizando una red de plancton estándar, de forma cónica, equipada con un flujómetro. Todos los huevos y larvas de peces fueron separados y contados, y éstas últimas fueron identificadas hasta especie. El análisis de las escalas de variabilidad se ha realizado mediante Permanova y para el estudio de la estructura del poblamiento y las variables ambientales que lo explican se han utilizado regresiones múltiples y análisis multivariantes de ordenación. RESULTADOS: Se colectaron un total de 55.262 huevos y se han examinado 185.135 especímenes de larvas y postlarvas de peces, pertenecientes a 24 familias, 48 géneros y 69 especies. De éstas, 15 especies son exclusivas de la laguna. En el Mediterráneo la riqueza de especies llega a 100, existiendo 46 que no penetran en la laguna como larvas. Las familias más abundantes han sido Gobiidae (64,49%), Engraulidae (16,76%), Blenniidae (16,54%) y Atherinidae (1,11%). A su vez, las especies dominantes fueron Gobius niger (34,65%), Engraulis encrasicolus (16,76%), Gobius paganellus (15,26%), Pomatoschistus marmoratus (8,72%), Parablennius pilicornis (7,83%), Salaria pavo (6,55%), Aphia minuta (2,96%), Gobius cruentatus (1,63%), Parablennius gattorugine (1,48%) y Gobius cobitis (1,08%). De las especies estudiadas, 23 (23,7%) son residentes en el Mar Menor o típicamente lagunares, 27 (27,8%) son migradoras o pobladores cíclicos regulares, 12 (12,4%) son pobladores ocasionales o irregulares y 28 (28,9%) son visitantes extraviados o esporádicos. La densidad media anual total de larvas de peces en la laguna fue de 613,27 (± 37,02) individuos por 1000 m3, muy superior a la encontrada en el Mediterráneo adyacente, de 126,05 (± 13,51) individuos por 1000 m3. CONCLUSIONES: El poblamiento ictioplanctónico lagunar muestra gran variabilidad espacio-temporal. Un 41,3% del poblamiento lagunar varía de un año a otro. No obstante, su dinámica presenta un ciclo estacional claro, con dos picos de abundancia, en primavera y en otoño. La mayoría de las especies de interés pesquero de las familias Mugilidae, Sparidae o Clupeidae en el ictioplancton lagunar solo aparecen testimonialmente, con abundancias relativas medias inferiores al 0,03%, indicando que su penetración en la laguna ocurre principalmente en fases juveniles La distribución espacial está relacionada principalmente con los patrones de circulación de la laguna y con la colonización a través de los canales de comunicación con el mar abierto a la que se superponen las condiciones tróficas asociadas a la entrada de nutrientes por la rambla del Albujón. Existe un importante componente aleatorio en la dinámica del poblamiento que probablemente forma parte de los mecanismos homeostáticos del ecosistema lagunar. La elevada riqueza y diversidad de especies acumuladas y la gran proporción de especies ocasionales y extraviadas sugieren un papel muy importante de los mecanismos de lotería competitiva. / The objectives of this thesis are to describe the taxonomic composition of larval fish that inhabit the waters of the Mar Menor, knowing the spatial distribution and temporal dynamics of ichthyoplankton in the lagoon, analyze the environmental factors that determine this distribution and dynamics and finally assess the role of larval colonization through the channels of communication with the open sea and the currents in the structure of ichthyological settlement. METHODOLOGY: The study has been conducted in the Mar Menor coastal lagoon located in the SE of the Iberian Peninsula at the eastern end of the Region of Murcia. Material was collected in 20 sampling sites in 1997 and from 2006 to 2012. Additionally, during 2009 and 2012, 8 stations, located in the inner mouth of the three channels of communication with the open sea and in the Mediterranean, were added to study the influence of the adjacent open sea. The experimental sampling design allows the analysis of the spatio-temporal scales of variability of the assemblage and environmental conditions. A total of 3,342 samples were analyzed. They were collected using diurnal, circular subsurface tows (0.5-2 m deep), with a duration of 7 minutes, using a standard plankton net, equipped with a flowmeter. All eggs and fish larvae were removed and counted, and the latter were identified to species. The analysis of the scales of variability was performed using PERMANOVA. The study of the structure of the assemblage and the environmental variables that explain it has been made by using multiple regression and multivariate ordination analysis. RESULTS: A total of 55,262 eggs were collected and 185 135 specimens of fish larvae and post-larvae, belonging to 24 families, 48 genera and 69 species, were examined. Of these, 15 species are unique to the lagoon. In the Mediterranean species richness reaches 100, 46 of them do not penetrate the lagoon as larvae. The most abundant families were Gobiidae (64.49%), Engraulidae (16.76%), Blenniidae (16.54%) and Atherinidae (1.11%). In turn, the dominant species were Gobius niger (34,65%), Engraulis encrasicolus (16,76%), Gobius paganellus (15,26%), Pomatoschistus marmoratus (8,72%), Parablennius pilicornis (7,83%), Salaria pavo (6,55%), Aphia minuta (2,96%), Gobius cruentatus (1,63%), Parablennius gattorugine (1,48%) and Gobius cobitis (1,08%). 23 (23.7%) of the studied species are resident in the Mar Menor lagoon, 27 (27.8%) are migratory or regular cyclical residents, 12 (12.4%) are occasional or irregular residents and 28 (28.9%) are marine stragglers or casual visitors. The total annual average density of fish larvae in the lagoon was 613.27 (± 37.02) individuals per 1000 m3, much higher than that found in the adjacent Mediterranean that reach 126.05 (± 13.51) individuals/1000 m3. CONCLUSIONS: The lagoon ichthyoplankton shows large spatial and temporal variability. 41.3% of the lagoon assemblage varies from year to year. However, their dynamics presents a clear seasonal cycle, with two abundance peaks in spring and autumn. Most species of commercial interest of the families Mugilidae, Sparidae or Clupeidae are present in the lagoon ichthyoplankton just in testimony with relative abundances lower to 0.03%, indicating that penetration into the lagoon occurs mainly as juveniles. The spatial distribution is mainly related to the circulation patterns of the lagoon and to the colonization through the channels of communication with the open sea. Overlapping to this act the trophic conditions associated with nutrient inputs from the Albujón watercourse. There is a substantial random component in the assemblage dynamics which is probably part of the homeostatic mechanisms of the lagoon ecosystem. The high richness and diversity of species and accumulated large proportion of occasional and straggler species suggest an important role of the mechanisms of competitive lottery.

Calcium ion (Ca2+) and protons (H+) are both regarded as second messengers, participating in plant growth and stress mechanisms. However, H+ signals in plant physiology are less well investigated compared to Ca2+ signals. If interconnections between these two second messengers exist remains to be uncovered because appropriate imaging tools to monitor Ca2+ and H+ simultaneously in the same cell as well as accurate bioinformatics analysis remain to be developed. To overcome this problem and unravel the role and possible interconnection of Ca2+ and H+ in plants, a new biosensor named CapHensor was developed and optimized to visualize intracellular Ca2+ and H+ changes simultaneously and ratiometrically in the same cell. The CapHensor consisted of an optimized green fluorescent pH sensor (PRpHluorin) and an established red fluorescent Ca2+ sensor (R-GECO1) that were combined in one construct via a P2A sequence. A P2A self-cleavage site between the two sensors allowed to express equal amounts but spatially separated sensors, which enabled artifact-free and ratiometric imaging of cellular Ca2+ and pH side-by-side. The function of the CapHensor was verified in pollen tubes, since they possess standing Ca2+ and pH gradients. We found better imaging quality and the signal-to-noise ratio to be enhanced in live-cell imaging when two R-GECO1 proteins were fused in tandem within the CapHensor construct. To guarantee exclusive subcellular localization and avoid mixed signals from different compartments, Nuclear Export Sequence (NES) and Nuclear Localization Sequence (NLS) were used to target PRpHluorin and R-GECO1 to distinct compartments. After optimization and verification its function, CapHensor was successfully expressed in different cell types to investigate the role of Ca2+ and H+ signals to control polar growth of pollen tube, stomatal movement or leaf defense signaling. Results obtained in the past indicated both Ca2+ gradients and pH gradients in pollen tubes play roles in polar growth. However, the role and temporal relationship between the growth process and changes in Ca2+ and pH have not been conclusively resolved. Using CapHensor, I found cytosolic acidification at the tip could promote and alkalization to suppress growth velocity in N. tabacum pollen tubes, indicating that cytosolic H+ concentrations ([H+]cyt) play an important role in regulation pollen tubes growth despite the accompanied changes in cytosolic Ca2+ concentrations ([Ca2+]cyt). Moreover, growth correlated much better with the tip [H+]cyt regime than with the course of the tip [Ca2+]cyt regime. However, surprisingly, tip-focused [Ca2+]cyt andII [H+]cyt oscillations both lagged behind growth oscillations approximately 33 s and 18 s, respectively, asking for a re-evaluation of the role that tip [Ca2+]cyt may play in pollen tube growth. Live-cell CapHensor imaging combined with electrophysiology uncovered that oscillatory membrane depolarization correlated better with tip [H+]cyt oscillations than with tip [Ca2+]cyt oscillations, indicative for a prominent role of [H+]cyt to also control electrogenic membrane transport. Using CapHensor, reading out cellular movement at the same time enabled to provide a precise temporal and spatial resolution of ion signaling events, pointing out a prominent role of [H+]cyt in pollen tube tip growth. For leaf cells, a special CapHensor construct design had to be developed, containing additional NES localization sequences to avoid overlapping of fluorescense signals from the nucleus and the cytosol. Once this was achieved, the role of Ca2+ and pH changes in guard cells, another typical single-cell system was investigated. Cytosolic pH changes have been described in stomatal movement, but the physiological role of pH and the interaction with changing Ca2+ signals were still unexplored. Combining CapHensor with the here developed technique to monitor stomatal movement in parallel, the role of Ca2+ and H+ in stomatal movement was studied in detail and novel aspects were identified. The phytohormone ABA and the bacterial elicitor flagellin (flg22) are typical abiotic and biotic stresses, respectively, to trigger stomatal closure. What kind of Ca2+ and H+ signals by ABA and flg22 are set-off in guard cells and what their temporal relationship and role for stomatal movement is were unknown. Similar [Ca2+]cyt increases were observed upon ABA and flg22 triggered stomatal closure, but [H+]cyt dynamics differed fundamentally. ABA triggered pronounced cytosolic alkalization preceded the [Ca2+]cyt responses significantly by 57 s while stomata started to close ca. 205 s after phytohormone application. With flg22, stomatal closure was accompanied only with a mild cytosolic alkalization but the [Ca2+]cyt response was much more pronounced compared to the ABA effects. Where the cytosolic alkalization originates from was unclear but the vacuole was speculated to contribute in the past. In this thesis, vacuolar pH changes were visualized by the dye BCECF over time, basically displaying exactly the opposite course of the concentration shift in the vacuole than observed in the cytosol. This is indicative for the vacuolar pH dynamics to be coupled strongly to the cytosolic pH changes. In stomatal closure signalling, reactive oxygen species (ROS) were proposed to play a major role, however, only very high concentration of H2O2 (> 200 µM), which resulted in the loss of membrane integrity, induced stomatal closure. Unexpectedly, physiological concentrations of ROS led to cytosolic acidificationIII which was associated with stomatal opening, but not stomatal closure. To study the role of [H+]cyt to steer stomatal movement in detail, extracellular and intracellular pH variations were evoked in N. tabacum guard cells and their behaviour was followed. The results demonstrated cytosolic acidification stimulated stomatal opening while cytosolic alkalization triggered stomatal closure accompanied by [Ca2+]cyt elevations. This demonstrated pH regulation to be an important aspect in stomatal movement and to feed-back on the Ca2+-dynamics. It was remarkable that cytosolic alkalization but not [Ca2+]cyt increase seemed to play a crucial role in stomatal closure, because more pronounced cytosolic alkalization, evoked stronger stomatal closure despite similar [Ca2+]cyt increases. Increases in [Ca2+]cyt, which are discussed as an early stomatal closure signal in the past, could not trigger stomatal closure alone in my experiments, even when extremely strong [Ca2+]cyt signals were triggered. Regarding the interaction between the two second messengers, [Ca2+]cyt and [H+]cyt were negatively correlated most of the times, which was different from pollen tubes showing positive correlation of [Ca2+]cyt and [H+]cyt regimes. [Ca2+]cyt elevations were always associated with a cytosolic alkalization and this relationship could be blocked by the presence of vanadate, a plasma membrane H+-pump blocker, indicating plasma membrane H+-ATPases to contribute to the negative correlation of [Ca2+]cyt and [H+]cyt. To compare with guard cells, cytosolic and nuclear versions of CapHensor were expressed in N. benthamiana mesophyll cells, a multicellular system I investigated. Mesophyll cell responses to the same stimuli as tested in guard cells demonstrated that ABA and H2O2 did not induce any [Ca2+]cyt and [H+]cyt changes while flg22 induced an increase in [Ca2+]cyt and [H+]cyt, which is different from the response in guard cells. I could thus unequivocally demonstrate that guard cells and mesophyll cells do respond differently with [Ca2+]cyt and [H+]cyt changes to the same stimuli, a concept that has been proposed before, but never demonstrated in such detail for plants. Spontaneous Ca2+ oscillations have been observed for a long time in guard cells, but the function or cause is still poorly understood. Two populations of oscillatory guard cells were identified according to their [Ca2+]cyt and [H+]cyt phase relationship in my study. In approximately half of the oscillatory cells, [H+]cyt oscillations preceded [Ca2+]cyt oscillations whereas [Ca2+]cyt was the leading signal in the other half of the guard cells population. Strikingly, natural [H+]cyt oscillations were dampened by ABA but not by flg22. This effect could be well explained by dampening of vacuolar H+ oscillations in the presence of ABA, but not through flg22. Vacuolar pH contributes to spontaneous [H+]cyt oscillations and ABA but not flg22 can block the interdependence of naturalIV [Ca2+]cyt and [H+]cyt signals. To study the role of [Ca2+]cyt oscillations in stomatal movement, solutions containing high and low KCl concentrations were applied aiming to trigger [Ca2+]cyt oscillations. The triggering of [Ca2+]cyt oscillations by this method was established two decades ago leading to the dogma that [Ca2+]cyt increases are the crucial signal for stomatal closure. However, I found stomatal movement by this method was mainly due to osmotic effects rather than [Ca2+]cyt increases. Fortunately, through this methodology, I found a strong correlation between cytosolic pH and the transport of potassium across the plasma membrane and vacuole existed. The plasma membrane H+-ATPases and H+-coupled K+ transporters were identified as the cause of [H+]cyt changes, both very important aspects in stomata physiology that were not visualized experimentally before. Na+ transport is also important for stomatal regulation and leaves generally since salt can be transported from the root to the shoot. Unlike well-described Ca2+- dependent mechanisms in roots, how leaves process salt stress is not at all understood. I applied salt on protoplasts from leaves, mesophyll cells and guard cells and combined live-cell imaging with Vm recordings to understand the transport and signaling for leaf cells to cope with salt stress. In both, mesophyll and guard cells, NaCl did not trigger Ca2+-signals as described for roots but rather triggered Ca2+ peaks when washing salt out. However, membrane depolarization and pronounced alkalinization were very reliably triggered by NaCl, which could presumably act as a signal for detoxification of high salt concentrations. In line with this, I found the vacuolar cation/H+ antiporter NHX1 to play a role in sodium transport, [H+]cyt homeostasis and the control of membrane potential. Overexpression of AtNHX1 enabled to diminish [H+]cyt changes and resulted in a smaller depolarization responses druing NaCl stress. My results thus demonstrated in contrast to roots, leaf cells do not use Ca2+-dependent signalling cascades to deal with salt stress. I could show Na+ and K+ induced [H+]cyt and Vm responses and Cl- transport to only have a minor impact. Summing all my results up briefly, I uncovered pH signals to play important roles to control pollen tube growth, stomatal movement and leaf detoxification upon salt. My results strongly suggested pH changes might be a more important signal than previously thought to steer diverse processes in plants. Using CapHensor in combination with electrophysiology and bioinformatics tools, I discovered distinct interconnections between [Ca2+]cyt and [H+]cyt in different cell types and distinct [Ca2+]cyt and [H+]cyt signals are initiated through diverse stimuli and environmental cues. The CapHensor will be very useful in the future to further investigate the coordinated role of Ca2+ and pH changes in controlling plant physiology. / Kalziumionen (Ca2+) und Protonen (H+) werden beide als Botenstoffe angesehen, die am Pflanzenwachstum und an Mechanismen zur Stressbewältigung beteiligt sind. In der Pflanzenphysiologie sind H+-Signale jedoch im Vergleich zu Ca2+-Signalen weniger gut untersucht. Die Frage, ob zwischen diesen beiden Botenstoffen Zusammenhänge bestehen, muss noch geklärt werden, da geeignete bildgebende Verfahren zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Ca2+ und H+ Signalen sowie eine genaue bioinformatische Analyse noch entwickelt werden müssen. Um dieses Problem zu überwinden und die Rolle und möglichen Zusammenhang von Ca2+ und H+ Signalen in Pflanzen zu entschlüsseln, wurde ein neuer Biosensor namens CapHensor entwickelt und optimiert, um intrazelluläre Ca2+- und H+-Veränderungen gleichzeitig und ratiometrisch zu untersuchen. Der CapHensor bestand aus einem optimierten grün fluoreszierenden pH-Sensor (PRpHluorin) und einem etablierten rot fluoreszierenden Ca2+-Sensor (R-GECO1), die über eine P2A-Sequenz in einem Konstrukt kombiniert wurden. Eine sogenannte P2A-„self-cleavage site“ zwischen den beiden Sensoren ermöglichte die Expression gleicher Mengen, aber räumlich getrennter Sensoren, was eine artefaktfreie und ratiometrische Darstellung von zellulärem Ca2+ und pH nebeneinander ermöglichte. Die Funktion des CapHensors wurde in Pollenschläuchen verifiziert, da diese einen ständigen Ca2+- und pH-Gradienten aufweisen. Wir stellten fest, dass die Qualität der Bildaufnahmen und das Signal-Rausch-Verhältnis bei der Bildgebung in lebenden Zellen verbessert wurden, wenn zwei R-GECO1-Proteine innerhalb des CapHensor-Konstrukts translational fusioniert wurden. Um eine ausschließliche zytosolische Lokalisierung zu gewährleisten und gemischte Signale aus verschiedenen Kompartimenten zu vermeiden, wurden sogenannte „Nuclear Export Sequence“ (NES) und die „Nuclear Localization Sequence“ (NLS) verwendet, um PRpHluorin und R-GECO1 in unterschiedlichen Kompartimente zu lokalisieren. Nach der Optimierung und Überprüfung seiner Funktionsweise wurde CapHensor erfolgreich in verschiedenen Zelltypen exprimiert, um die Rolle von Ca2+- und H+-Signalen bei der Kontrolle des polaren Wachstums von Pollenschläuchen, die Stomabewegung oder Abwehrmechanismen der Blätter zu untersuchen. Die in der Vergangenheit erzielten Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl der Ca2+-Gradient als auch der pH-Gradient in Pollenschläuchen eine Rolle beim polaren Wachstum spielen, wobei dem Ca2+-Gradient zum Teil die Hauptrolle zugesprochen wird. Die Rolle und die zeitlicheVI Beziehung zwischen dem Wachstumsprozess und den Veränderungen von Ca2+ und pH sind jedoch noch nicht abschließend geklärt. Mit Hilfe von CapHensor fand ich heraus, dass eine zytosolische Ansäuerung an der Spitze die Wachstumsgeschwindigkeit in N. tabacumPollenschläuchen fördern und eine Alkalisierung die Wachstumsgeschwindigkeit unterdrücken kann, was darauf hindeutet, dass die zytosolische H+-Konzentration ([H+]cyt) trotz der damit einhergehenden Veränderungen der zytosolischen Ca2+-Konzentration ([Ca2+]cyt) eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Wachstums von Pollenschläuchen spielt. Außerdem korrelierte das Wachstum viel besser mit dem [H+]cyt-Verlauf an der Spitze als mit dem Verlauf des [Ca2+]cytSignals. Überraschenderweise hinkten jedoch sowohl die [Ca2+]cyt- als auch die [H+]cytOszillationen an der Spitze den Wachstumsoszillationen um etwa 33 s bzw. 18 s hinterher, so dass die Rolle von [Ca2+]cyt an der Spitze für das Wachstum des Pollenschlauchs neu bewertet werden muss. Die CapHensor-Bildgebung an lebenden Zellen in Kombination mit Elektrophysiologie ergab, dass die oszillierende Membrandepolarisation besser mit den [H+]cyt-Oszillationen an der Spitze korrelierte als mit den [Ca2+]cyt-Oszillationen, was darauf hindeutet, dass [H+]cyt auch eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des elektrogenen Membrantransports spielt. Mit Hilfe des CapHensors und dem gleichzeitigen Auslesen der Zellbewegungen konnte eine präzise zeitliche und räumliche Auflösung der Ereignisse erzielt werden, was auf eine herausragende Rolle von [H+]cyt beim Wachstum der Pollenschlauchspitze hinweist. Für den Einsatz des CapHensors in Blattzellen musste ein spezielles CapHensor-Konstrukt entwickelt werden, das zusätzliche NES-Lokalisierungssequenzen enthielt, um eine Überlappung der Fluoreszenzsignale aus dem Zellkern und dem Zytosol zu vermeiden. Nachdem dies erreicht war, wurde die Rolle von Ca2+- und pH-Änderungen in Schließzellen, einem gut beschriebenen Einzelzellsystem, untersucht. Veränderungen des zytosolischen pH-Werts wurden bei der Bewegung von Stomata in früheren Studien beschrieben, aber die physiologische Rolle dieser Veränderungen und die Interaktion mit sich verändernden Ca2+-Signalen waren noch unerforscht. Der Einsatz von CapHensor zusammen mit der von mir entwickelten Technik zur parallelen Erfassung der Stomatabewegung hat unser Verständnis der Rolle von Ca2+ und H+ bei der Stomatabewegung erheblich verbessert. Das Phytohormon ABA und der bakterielle Elicitor Flagellin (flg22) sind typische abiotische bzw. biotische Stressfaktoren, die das Schließen der Stomata auslösen. Welche Art von Ca2+- und H+-Signalen in den Schließzellen durch ABA und flg22 ausgelöst werden und in welchem zeitlichen Zusammenhang sie stehen und welche Rolle sieVII für die Bewegung der Stomata spielen, war bisher unbekannt. Bei der durch ABA und flg22 ausgelösten Schließung der Stomata wurde ein Anstieg von [Ca2+]cyt beobachtet, aber die Dynamik von [H+]cyt unterschied sich grundlegend und zeigte eine andere Dynamik. ABA löste eine ausgeprägte zytosolische Alkalisierung aus, die der [Ca2+]cyt-Antwort um 57 s deutlich vorausging, während die Spaltöffnungen erst ca. 205 s danach anfingen zu schliessen. Bei Flg22 ging das Schließen der Spaltöffnungen nur mit einer leichten zytosolischen Alkalisierung einher, aber die Ca2+-Reaktion war im Vergleich zur ABA-Reaktion viel ausgeprägter. Woher die zytosolische Alkalisierung stammt, war unklar, aber in der Vergangenheit wurde spekuliert, dass die Vakuole dazu beiträgt. In dieser Arbeit wurden vakuoläre pH-Änderungen mit Hilfe des Farbstoffs BCECF über die Zeit verfolgt, wobei die Konzentrationsverschiebung in der Vakuole im Grunde genommen genau den umgekehrten Verlauf aufwies als im Zytosol beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die Dynamik des vakuolären pH-Wertes stark an die Änderungen des zytosolischen pHWertes gekoppelt ist. Aus der Literatur ist bekannt, dass reaktive Sauerstoffspezies (ROS) bei der Signalgebung für das Schließen der Stomata eine wichtige Rolle spielen. Als ich jedoch definierte H2O2-Mengen auf die Zellen applizierte, führten nur unphysiologosch hohe H2O2-Konzentrationen (> 200 µM), die zu einem Verlust der Membranintegrität führten, zum Schließen der Stomata. Unerwarteterweise führten physiologische Konzentrationen von ROS zu einer Ansäuerung des Zytosols, die mit der Öffnung der Stomata, aber nicht mit der Schließung der Stomata in Verbindung gebracht wurde. Um die Rolle von [H+]cyt bei der Steuerung der stomatären Bewegung im Detail zu untersuchen, wurden extrazelluläre und intrazelluläre pH-Änderungen in N. tabacumSchließzellen hervorgerufen um deren Verhalten bei pH-Änderungen zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine zytosolische Ansäuerung die Öffnung der Stomata stimuliert, während eine zytosolische Alkalisierung die Schließung der Stomata auslöst, begleitet von einem Anstieg von [Ca2+]cyt. Dies beweist, dass die pH-Regulierung ein wichtiger Aspekt der stomatären Bewegung darstellt und auf die Ca2+-Dynamik einwirkt. Bemerkenswert war, dass die zytosolische Alkalisierung und nicht der Ca2+-Anstieg eine entscheidende Rolle bei der Schließung der Stomata zu spielen schien, da eine stärkere zytosolische Alkalisierung trotz eines ähnlichen [Ca2+]cyt - Anstiegs eine stärkere Schließung der Stomata hervorrief. Erhöhungen von [Ca2+]cyt, die in der Vergangenheit als frühes Stomataschließungssignal diskutiert wurden, konnten in meinen Experimenten den Stomataschluß nicht allein auslösen, selbst wenn extrem starke Ca2+-Signale ausgelöst wurden. Was die Interaktion zwischen den beiden Botenstoffen anbelangt, so warenVIII [Ca2+]cyt und [H+]cyt meist negativ miteinander korreliert, was sich von den Pollenschläuchen unterschied, die eine positive Korrelation zwischen [Ca2+]cyt und [H+]cyt aufwiesen. Ca2+- Erhöhungen waren immer mit einer Alkalisierung des Zytosols verbunden, und diese Beziehung konnte durch die Anwesenheit von Vanadat, ein H+-Pumpen Blocker blockiert werden, was darauf hindeutet, dass die H+-ATPasen der Plasmamembran zu der negativen Korrelation von [Ca2+]cyt und [H+]cyt beitragen. Im Vergleich zu den CapHensor-Reaktionen bei Schließzellen wurden zytosolische und Zellkern-lokalisierende Versionen von CapHensor in Mesophyllzellen von N. benthamiana, einem von uns untersuchten multizellulären System, exprimiert. Die Reaktionen der Mesophyllzellen auf die gleichen Stimuli wie bei den Schließzellen zeigten, dass ABA und H2O2 keine Veränderungen von [Ca2+]cyt und [H+]cyt hervorrufen, während flg22 einen Anstieg von [Ca2+]cyt und [H+]cyt bewirkt, der sich von der Reaktion in Schließzellen unterscheidet. Damit konnte ich eindeutig nachweisen, dass Schließ- und Mesophyllzellen in Bezug auf [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Änderungen sehr unterschiedlich auf dieselben Stimuli reagieren, ein Konzept, das zwar schon früher vorgeschlagen, aber noch nie so detailliert für Pflanzen nachgewiesen wurde. Ein Phänomen, das seit langem in Schließzellen beobachtet wird, dessen Funktion oder Ursache aber noch nicht verstanden ist, sind regelmäßige Ca2+-Oszillationen, die spontan auftreten. Interessanterweise wurden zwei Populationen von oszillierenden Schließzellen anhand ihrer [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Phasenbeziehung identifiziert. Bei etwa der Hälfte der oszillierenden Zellen gingen die [H+]cyt-Oszillationen den [Ca2+]cyt-Oszillationen voraus, während in der anderen Hälfte der Schließzellenpopulation [Ca2+]cyt das vorangehende Signal war. Auffallend ist, dass die natürlichen [H+]cyt-Oszillationen durch ABA gedämpft wurden, nicht aber durch flg22. Dieser Effekt lässt sich gut durch die Dämpfung der vakuolären H+-Oszillationen in Gegenwart von ABA erklären, aber nicht durch flg22, das ich mit BCECF sichtbar gemacht habe. Es zeigte sich, dass sowohl der vakuoläre pH-Wert zu spontanen [H+]cyt-Oszillationen beiträgt als auch, dass ABA, nicht aber flg22, den Zusammenhang der natürlichen [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Signale blockieren kann. Um die Rolle der [Ca2+]cyt-Oszillationen bei der Bewegung der Stomata zu untersuchen, wurden Lösungen mit hohen und niedrigen KCl-Konzentrationen verwendet, um [Ca2+]cyt-Oszillationen auszulösen. Das Auslösen von Ca2+-Oszillationen nach dieser Methode wurde in Studien vor zwei Jahrzehnten etabliert, und die Ergebniss daraus haben zu dem Dogma geführt, dass der Anstieg von [Ca2+]cyt das entscheidende Signal für die Schließung von Stomata ist. Ich habe jedoch herausgefunden, dass die Bewegung der Stomata mit dieser Methode hauptsächlich auf osmotischeIX Effekte und nicht auf die Auswirkungen der [Ca2+]cyt-Erhöhungen zurückzuführen waren. Glücklicherweise fand ich mit dieser Methode heraus, dass es eine starke Korrelation zwischen dem zytosolischen pH-Wert und dem Kaliumtransport über die Plasmamembran und die Vakuole gibt. Die H+-ATPasen der Plasmamembran und die H+-gekoppelten K+-Transporter wurden als Ursache für die pH-Änderungen identifiziert, beides sehr wichtige Aspekte in der Stomaphysiologie, die zuvor nicht experimentell sichtbar gemacht werden konnten. Der Transport von Natriumionen (Na+) ist für die Regulierung der Stomata und der Adaption von Blättern bei Salzstress wichtig, da Salz von der Wurzel zum Spross transportiert werden kann. Im Gegensatz zu den gut beschriebenen Ca2+-abhängigen Na+-Transportmechanismen in den Wurzeln ist überhaupt nicht bekannt, wie Blätter Salzstress verarbeiten. Ich habe Salz auf Protoplasten von Blättern, Mesophyllzellen und Schießzellen appliziert und „Live-Cell-Imaging“ mit Aufzeichnungen der Membranspannung kombiniert, um den Transport und die Signalreizweiterleitung bei Salzstress in Blättern zu verstehen. Sowohl in Mesophyll- als auch in Schließzellen löste NaCl keine Ca2+-Signale aus, wie sie für Wurzeln beschrieben wurden, sondern führte beim Auswaschen von Salz zu [Ca2+]cyt-Transienten. Eine Membrandepolarisation und eine ausgeprägte Alkalisierung wurden jedoch sehr zuverlässig durch NaCl ausgelöst, was vermutlich als Signal für die Entgiftung von hohen Salzkonzentrationen dienen könnte. Im Einklang damit konnte ich zeigen, dass der vakuoläre Kationen/H+-Antiporter NHX1 eine Rolle beim Natriumtransport, der zytosolischen pH-Homöostase und der Kontrolle des Membranpotenzials spielt. Die Überexpression von AtNHX1 ermöglichte es, [H+]cyt-Veränderungen zu vermindern und führte zu einer geringeren Depolarisationsreaktion unter NaCl-Stress. Meine Ergebnisse zeigen somit, dass Blattzellen im Gegensatz zu Wurzeln keine Ca2+-abhängigen Signalkaskaden nutzen, um mit Salzstress umzugehen, und ich konnte zeigen, dass Na+ und K+ die [H+]cyt- und Membranspannungs-Reaktionen auslöst und der Cl--Transport nur einen geringen Einfluss hat. Zusammenfassend habe ich festgestellt, dass pH-Signale eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Wachstums von Pollenschläuchen spielen, sowie bei der Bewegung der Stomata und der Entgiftung der Blätter durch Salz beteiligt sind. Meine Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass pH-Änderungen ein wichtigeres Signal für die Steuerung verschiedener Prozesse in Pflanzen sein könnten als bisher angenommen. Durch den Einsatz des CapHensors in Kombination mit elektrophysiologischen und bioinformatischen Methoden konnte ich feststellen, dass in verschiedenen Zelltypen unterschiedliche Zusammenhänge zwischen [Ca2+]cyt und [H+]cyt bestehenX und dass unterschiedliche [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Signale durch verschiedene Stimuli und Umweltreize ausgelöst werden. Der CapHensor wird in Zukunft sehr nützlich sein, um die koordinierte Rolle von Ca2+- und pH-Änderungen bei der Steuerung der Pflanzenphysiologie weiter zu untersuchen.

El desarrollo de biocombustibles de segunda generación, es decir producidos a partir de cultivos energéticos ricos en celulosa o lignina, ofrece la oportunidad de evitar la competencia con la producción de alimentos y de utilizar materias primas para explotar suelos marginales (Idris et al., 2012). El objetivo general de esta tesis fue caracterizar el comportamiento de las gramíneas perennes Panicum virgatum L. (C4), Miscanthus x giganteus (C4) y Arundo donax L. (C3), para la producción de bioenergía en ambiente Mediterráneo. Para lograr estos objetivos, se llevaron adelante tres experimentos: 1) Las tres especies se pusieron a crecer en invernadero bajo condiciones óptimas, y luego se colocaron en cámaras de ambiente controlado para realizar un marcaje isotópico con (13C) y (15N) durante 3 días. 2) Las tres especies se pusieron a crecer en un terreno de suelo ubicado en los Servicios de Campos Experimentales de la Universidad de Barcelona, se marcaron dos áreas (A y B). Cada área se dividió en 3 parcelas (una por cada especie), trasplantándose 16 plantas/parcela. El área A correspondió al tratamiento condiciones de regadío consistente en 50 mm H2O mes-1, durante los meses de verano (junio, julio, agosto y septiembre). Y el área B correspondió al tratamiento condiciones de secano, no tuvo riego suplementario, sólo recibió agua de lluvia precipitada. Se tomaron medidas de altura, peso seco, área foliar, fotosíntesis, fluorescencia etc., y de la composición isotópica de la materia orgánica y del CO2 respirado por cada órgano de la planta. 3) Dos ensayos de germinación se realizaron con semillas de Panicum virgatum L. (en cámaras de germinación). El primero consistió en buscar un método práctico para la ruptura de la dormición de las semillas y en el segundo, evaluar el proceso de germinación en condiciones de salinidad (ClNa) y déficit hídrico (Polietilenglicol) y además se analizaron cambios a nivel anatómico en la raíz emergida. En condiciones óptimas, las tres gramíneas perennes presentaron altas tasas de crecimiento relativo y mayor desarrollo del sistema subterráneo. Arundo donax presentó mayores tasas de asimilación de CO2 y este comportamiento se tradujo en una mayor producción de biomasa. El enriquecimiento en 13C luego del marcaje, tanto en la MOT como en el CO2 respirado en órganos como tallo y rizoma sugieren que estos órganos se comportararon como sumideros de C y N. En condiciones de ambiente Mediterráneo, y sin riego suplementario durante los meses de verano hubo menor crecimiento y producción de biomasa en las tres gramíneas perennes, mostrando el efecto limitante del agua en la productividad. Sin embargo, la especie Arundo donax L. que presentó mayor producción de biomasa que las especies C4, por lo que en ambiente Mediterráneo esta especie parece ser una buena candidata como cultivo energético. La falta de agua en la parcela secano, no provocó cambios en el rendimiento cuántico máximo del fotosistema II (Fv/Fm) indicando que ni los procesos de transporte electrónico ni fotofosforilacion son afectados, pero si afectó al proceso de carboxilación del ciclo de Calvin ya que los parámetros fotosintéticos (como Asat, gs, Vc,max y Jmax) se vieron disminuidos y estó provocó menor producción de biomasa. El método pre-germinativo “prechilling” a 5 ºC durante 14 días, fue el método más eficaz para romper la dormición y favorecer el aumento del porcentaje de germinación. Las plántulas de Panicum virgatum L. fueron más tolerantes a la salinidad que al déficit hídrico, donde longitud y grosor de la radícula, se vieron más afectados. La formación de aerénquima en la corteza y el engrosamiento de las paredes de la endodermis en la radícula de la plántula, podrían contribuir a la tolerancia bajo condiciones de salinidad y déficit hídrico. / The second-generation biofuels, produced from rich energy crops cellulose or lignin, offers the opportunity to avoid competition with food production and used raw materials to exploit marginal land. The objective of this thesis was to characterize the behavior of perennial grasses Panicum virgatum L. (C4), Miscanthus x giganteus (C4) and Arundo donax L. (C3), for the production of bioenergy in Mediterranean environment. Three experiments were carried out: 1) Species were grown in the greenhouse under optimal conditions, and then placed in controlled environment chambers to isotopic labeling with 13C and 15N. 2) Species were transplanted in two areas (A and B) on soil; each area was divided into 3 plots (one for each species). The area A was treatment irrigated (50 mm H2O month-1 during summer months). And the area B treatment rainfed only received water rain. Height, dry weight, leaf area, photosynthesis, fluorescence etc. were measured, and the isotopic composition of organic matter and CO2 respired by organs of the plant were analyzed. 3) Two tests of germination were performed with seeds of Panicum virgatum L. The first to find a practical method for breaking dormancy and the second, evaluate the germination in salinity and water deficit conditions. In optimal condition, species showed high relative growth rates and greater development of the underground system, but Arundo donax L. had higher rates of CO2 assimilation and production of biomass that C4. 13C enrichment after labeling in stem and rhizome suggests that these organs were sinks for C. In Mediterranean environment without supplemental irrigation there was less biomass production in the three perennial grasses, showing the limiting effect of water on productivity. However, Arundo donax L. showed higher biomass production than C4 species. In rainfed, the maximum quantum yield of photosystem II (Fv/Fm) was not affected indicating was affected the process of carboxylation and Calvin cycle because photosynthetic parameters were diminished. The method "prechilling" at 5° C for 14 days, was the most effective to break dormancy and increase germination percentage. Switchgrass seedlings were more tolerant to salinity because length and thickness of the radicle were most affected by water deficit. Anatomical changes in the cortex and thickening of endodermis in radicle could contribute to tolerance under conditions of salinity and water stress.

L’objectiu general d’aquesta tesi és aprofundir en el coneixement de les regles de construcció de comunitats vegetals de les maresmes costaneres mediterrànies, prenent com a cas d’estudi les maresmes del delta del Llobregat. Concretament, al llarg de quatre capítols intentem determinar quins són els gradients ambientals que condicionen la distribució de les espècies i les comunitats vegetals, i com aquests afecten la distribució dels trets funcionals de les plantes i les relacions interespecífiques. Per fer-ho hem instal·lat 45 punts de mostreig sobre les tres comunitats de maresma dominants al delta del Llobregat (canyissars, jonqueres i salicornars). Aquests punts de mostreig s’han repartit en quatre localitats diferents, que pretenen recollir tot el ventall de situacions on viuen aquestes comunitats. A cada punt de mostreig hem realitzat un inventari fitosociològic, hem mostrejat periòdicament paràmetres de l’aigua freàtica (conductivitat i alçada) i del sòl (concentració de sals). Per cada planta trobada en el conjunt dels inventaris hem obtingut un seguit de trets funcionals (àrea foliar específica, producció de llavors, etc...). A més, en 20 d’aquests punts de mostreig hem realitzat un experiment de competència interespecífica entre Juncus acutus i Phragmites australis. Les comunitats de maresma estudiades són pauciflores i altament monoespècifiques. Es tracta de comunitats dominades per cinc espècies; J. acutus, J. maritimus, Spartina versicolor, P. australis i Arthrocnemum fruticosum. La presència d’aquestes espècies bé determinada principalment per la capacitat de tolerar de forma eficaç els estressos biològics imposats per tres gradients ambientals; alçada de l’aigua freàtica, conductivitat de l’aigua freàtica i balanç iònic del sòl. Aquestes gradients determinen també la presència i abundància de certs trets funcionals de les plantes de maresma, concretament l’àrea foliar especifica i el pes de les llavors. Si més d’una espècie pot tolera unes condicions abiòtiques concretes, aquestes espècies coexisteixen temporalment i trobem interaccions interespecífiques. En la majoria d’aquests casos, s’imposen les relacions de tipus competitiu i aquella espècie que és capaç de créixer més i més ràpid acaba excloent combativament a les altres. En algunes situacions concretes, les espècies trobem fenòmens de facilitació o exclusió mútua i les espècies poden coexistir juntes llargs períodes de temps . Per bé que no ho hem estudiat directament, els resultats obtinguts en aquesta tesi ens fan pensar que en la majoria de casos la coexistència d’espècies és poc estable al llarg del temps. Factors com l’atzar, l’efecte fundador o la herbívora determinen, que una de les espècies acabi excloent a la resta. / The objective of this thesis is to improve the knowledge of plant community assembly rules in Mediterranean coastal marshes, taking as a case study of the Llobregat delta marshes. Specifically, over four chapters, we try to determine the environmental gradients that determine the distribution of species and plant communities, and how these affect the distribution of plant functional traits and the interspecific relationships. To do this we have installed 45 sampling points on the three dominant salt marsh communities in the Llobregat delta (reeds, rushes and shrubby chenopods formations). These sampling points were distributed in four different locations, which aim to collect the full range of situations in which these communities live. At each sampling point, we done a phytosociological relevé, we periodically measured groundwater parameters (conductivity and height) and soil (salt concentration). For each plant found in all the inventories we have obtained a series of functional traits (specific leaf area, seed production, etc...). In addition, 20 of these points we have performed a sampling of interspecific competition between Phragmites australis and Juncus acutus. Marsh communities studied show species paucity and are highly monospecific. These communities dominated by five species; J. acutus, J. maritimus, Spartina versicolor and P. australis Arthrocnemum fruticosum. The presence of these species either mainly determined by the ability to effectively tolerate the stresses imposed three biological environmental gradients; height of the water table, groundwater conductivity and soil ionic balance. These gradients determine the presence and abundance of certain plant functional traits of marsh plants, more exactly specific leaf area and seed weight. If more than one species can tolerate a set of abiotic conditions, these species coexist and they experience interspecific interactions. In most of these cases, these relationships are competitive, and the species that is able to grow faster excludes competitively the others. In some situations, the interspecific interactions are facilitative or lead to a mutual exclusion, therefore species can coexist together for long periods of time. Although we have not directly studied, the results obtained in this thesis suggest that in most cases the coexistence of species is not stable over time. Factors such as founder effect, herbivorous or stochasticity determine which one species excludes the other end. / El objetivo general de esta tesis es profundizar en el conocimiento de las reglas de construcción de comunidades vegetales de las marismas costeras mediterráneas, tomando como caso de estudio las marismas del delta del Llobregat. Concretamente, a lo largo cuatro capítulos, intentamos determinar cuáles son los gradientes ambientales que condicionan la distribución de las especies y las comunidades vegetales, y cómo estos afectan a la distribución de los rasgos funcionales de las plantas y las relaciones interespecíficas. Para ello hemos instalado 45 puntos de muestreo sobre las tres comunidades de marisma dominantes en el delta del Llobregat (carrizales, juncales y salicorniares). Estos puntos de muestreo se han repartido en cuatro localidades diferentes, que pretenden recoger todo el abanico de situaciones donde viven estas comunidades. En cada punto de muestreo hemos realizado un inventario fitosociológico, hemos muestreado periódicamente parámetros del agua freática (conductividad y profundidad) y del suelo (concentración de sales). Por cada planta encontrada en el conjunto de los inventarios hemos obtenido una serie de rasgos funcionales (área foliar específica, producción de semillas, etc...). Además, en 20 de estos puntos de muestreo hemos realizado un experimento de competencia interespecífica entre Juncus acutus y Phragmites australis. Las comunidades de marisma estudiadas son paucifloras y altamente monoespecíficas. Se trata de comunidades dominadas por cinco especies; J. acutus, J. maritimus, Spartina versicolor, P. australis y Arthrocnemum fruticosum. La presencia de estas especies bien determinada principalmente por la capacidad de tolerar de forma eficaz los estreses biológicos impuestos por tres gradientes ambientales; produndidad del agua freática, conductividad del agua freática y balance iónico del suelo. Estas gradientes determinan también la presencia y abundancia de ciertos rasgos funcionales de las plantas de marisma, concretamente el área foliar específica y el peso de las semillas. Si más de una especie puede tolera unas condiciones abióticas concretas, estas especies coexisten temporalmente y encontramos interacciones interespecíficas. En la mayoría de estos casos, se imponen las relaciones de tipo competitivo y aquella especie que es capaz de crecer más y más rápido termina excluyendo combativament a las otras. En algunas situaciones concretas, las especies encontramos fenómenos de facilitación o exclusión mutua y las especies pueden coexistir juntas largos períodos de tiempo. Aunque no lo hemos estudiado directamente, los resultados obtenidos en esta tesis nos hacen pensar que en la mayoría de casos la coexistencia de especies es poco estable a lo largo del tiempo. Factores como el azar, el efecto fundador o la herbívora determinan, que una de las especies termine excluyendo al resto.