El cáncer de mama es el más frecuente en las mujeres de todo el mundo. Existen evidencias epidemiológicas y, sobretodo, experimentales de que los factores ambientales, especialmente los nutricionales, tienen un papel en la etiología y desarrollo de esta enfermedad. Por otra parte, se ha descrito el adelantamiento de la pubertad como factor de riesgo de cáncer de mama, así como que el momento en que se produce la menarquia viene determinado, en gran parte, por el estado nutricional del individuo. El objetivo de este trabajo ha sido estudiar los efectos moduladores de las dietas hiperlipídicas de aceite de maíz (M20), rica en PUFA n-6, y de aceite de oliva virgen extra (mO20), rica en MUFA n-9 y compuestos bioactivos, administradas desde la etapa prepuberal o la edad adulta, sobre la maduración sexual y la carcinogénesis mamaria experimental, así como algunos de los mecanismos moleculares por los cuales se podrían ejercer dichos efectos. Se ha utilizado como soporte experimental el modelo de tumores mamarios inducidos en ratas hembra Sprague-Dawley con el carcinógeno químico 7,12-dimetilbenz(a)antraceno. Los resultados de este trabajo muestran un efecto diferencial de las dietas hiperlipídicas sobre el peso y la masa corporal de los animales, que aumentaron por efecto de la dieta M20. Por el contrario, la dieta mO20 no modificó estos parámetros, y según los resultados obtenidos podría ser debido, al menos en parte, a que favorecería la disipación de la energía disminuyendo, por tanto, su almacenamiento. Por otro lado, ambas dietas hiperlipídicas adelantaron el inicio de la pubertad, aunque el efecto fue superior en el caso de la de aceite de maíz, observándose clínica, morfológica y molecularmente, una maduración sexual a edad más temprana. Asimismo, la caracterización morfológica y molecular de la glándula mamaria reveló un posible aumento de la susceptibilidad a la transformación neoplásica por efecto de les dietas hiperlipídicas, principalmente la M20, que aumentó el número de estructuras epiteliales indiferenciadas, parámetros relacionados con la proliferación celular e índices de estrés oxidativo. En cuanto al estudio de la carcinogénesis, se ha constatado que la dieta rica en aceite de maíz ejerció un claro efecto estimulador, fundamentalmente promotor, de la carcinogénesis mamaria experimental que se manifestó en un menor tiempo de latencia, mayor número de animales afectados, y el elevado contenido y volumen tumorales, así como unas características tumorales de mayor grado histopatológico, necrosis tumoral y reacción estromal. Por su parte, la dieta rica en aceite de oliva mostró una influencia similar a la de la dieta normolipídica en una primera fase del estudio, mientras que para períodos más largos se observó un débil efecto estimulador. A pesar de ello, los adenocarcinomas de los animales alimentados con dicha dieta fueron de menor histopatológico de malignidad que los de la dieta M20. En relación a los mecanismos mediante los cuales las dietas ejercerían sus efectos se hallaría la disminución de la capacidad antioxidante en glándula mamaria, aunque dicha situación no se observó en tumores. Por otra parte, la determinación del perfil de expresión génica mediante microarrays mostró un efecto diferencial de ambas dietas. Así, la dieta rica en aceite de maíz, pero no la de aceite de oliva, disminuyó la expresión de genes implicados en la respuesta inmunitaria y la apoptosis tanto en glándula mamaria como en tumores. En conclusión, los datos obtenidos muestran una clara influencia de la dieta rica en PUFA n-6 sobre la maduración sexual y la carcinogénesis mamaria experimental, mientras que la rica en aceite de oliva virgen extra muestra un efecto más parecido a la dieta control normolipídica, y pone de relevancia la trascendencia de los hábitos dietéticos desde edades tempranas. / Breast cancer is the most common malignancy in women worldwide. Several epidemiological and, mainly, experimental evidences have shown that environmental factors, especially nutritional ones, have a role in the etiology and development of this disease. Furthermore, advance of puberty have been described as a risk factor for breast cancer, as well as that time of menarche is determined, largely, by the nutritional status. The aim of this work was to study the modulatory effects of diets high in corn oil (M20), rich in n-6 PUFA, and extra virgin olive oil (mO20), rich in n-9 MUFA and bioactive compounds, administered from prepuberty or in adulthood, on sexual maturation and experimental mammary carcinogenesis, as well as some of the molecular mechanisms by which such effects could be exerted. The experimental model of mammary tumors chemically induced with 7,12-dimethylbenz(α)anthracene (DMBA) in the female Sprague-Dawley rat has been used. The results of this work showed a differential effect of these high fat diets on body weight and mass, which were increased by the M20 diet. On the contrary, the diet rich in olive oil (mO20) did not modify such parameters, and the data obtained indicate that this could be due, at least in part, to an effect on energy dissipation therefore decreasing its storage. Moreover, both high fat diets advanced puberty onset, such effect being stronger by the high corn oil diet. Thus, animals fed the M20 diet showed clinical, morphological and molecular parameters of earlier sexual maturation. Furthermore, morphological and molecular characterization of the mammary gland suggested an increase in the susceptibility to neoplastic transformation by both high fat diets, especially the M20, which increased the number of undifferentiated epithelial structures, parameters related to cell proliferation, and oxidative stress indexes. In relation to the carcinogenesis study, results indicated that the high corn oil diet exerted a clear stimulating effect on experimental breast cancer, mainly in the promotion stage. Such effect was observed by the lower latency time, higher number of tumor-bearing animals, and the increased tumor yield and volume, in addition to the anatomopathological characteristics (higher histological degree, necrosis and stromal reaction). On the other hand, the diet rich in olive oil had a similar influence than the low fat control diet in the first stages of the study, whereas for longer periods it showed a weak stimulatory effect. Nevertheless, adenocarcinomas from animals fed the high olive oil diet displayed a lower histopathological degree of tumor malignancy than those from the M20 diet. In relation to the mechanisms by which high fat diets could exert their effects we found a decrease in the antioxidant capacity in the mammary gland, although such decrease was not observed in adenocarcinomas. Moreover, determination of gene expression profile by microarrays revealed a clear differential effect of the high fat diets. Thus, the diet rich in corn oil, but not high olive oil diet, decreased the expression of genes related to immune response and apoptosis, both in mammary gland and in tumors. In conclusion, the results of this work showed a clear influence of the diet rich in n-6 PUFA on sexual maturation and experimental mammary carcinogenesis, whereas the diet rich in extra virgin olive oil had an effect similar to that of the low fat control diet, highlighting the importance of dietary habits from an early age.

Pendent / El objetivo principal de este trabajo es la aplicación de técnicas de inoculación de platnas de abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii (Mirb.)Franco) con hongos ectomicorrícicos seleccionados para las condiciones españolas, con el objetivo de mejorar la calidad de planta de reforestación. Primeramente se ha realizado un proceso de selección de hongos por hábitat, especie asociada, capacidad de crecimiento en cultivo y formación de micorrizas in vitro. Sobre un total de 48 cepas probadas pertenecientes a 36 especies, se han seleccionado 32 cepas en 24 especies por su capacidad micorrícica en cultivo puro. Las técnicas de inoculación de plantas producidas en contenedor han incluïdo inóculo vegetativo, miceli incluído en gel de alginato e inóculo de esporas aplicados a distintas dosis. El inóculo vegetativo de Hebeloma crustuliniforme, Laccaria bicolor, L. laccata y Lyophyllum decastes ha resultado efectivo en la formación de ectomicorrizas, con dosis óptimas variables. La producción de micelio incluído en gel de alginato ha mostrado un grado variable de tolerancia de determinados hongos a las concentraciones elevadas de CaCI2 utilitadas para polimerizar el alginato y al almacenamiento en frío. La formación de micorrizas con este tipo de inóculo se obtuvo únicamente con L. bicolor que resultó efectivo a bajas dosis de aplicación. El inóculo de esporas se obtubo principalmente a partir de hongos hipogeos de fructificación regular en plantaciones adultas de abeto de Douglas. Los esporocarpos de Rhizopogon subareolatus y Melanogaster ambiguus proporcionaron un elevado número de esporas que fueron efectivas en la formación de ectomicorrizas a dosis relativamente bajas. Adicionalmente, se ha iniciado el desarrollo de técnicas de inoculaciones dobles con hongos ectomicorrícicos seleccionados. los resultados in vitro han permitido determinar la capacidad colonizadora relativa y la inducción de la formación de raíces cortas de distintas especias de hongos. Los resultados obtenidos en estas condiciones indican que L. Bicolor y R. subareolatus son hongos de elevada capacidad competitiva.Las inoculaciones mixtas en condiciones de contenedor han resultado en una proporción variable de plantas con dos hongos simbiontes coexistiendo en el mismo sistema radicular, dependiendo de la concentración inicial de cada hongo. Finalmente, se ha iniciado el desarrollo de bioensayos con el objetivo de determinar la infectividad natural de suelos de plantación y su receptividad a las distintas especies de hongos introducidas. Los resultados se discuten en relación a su aplicabilidad en el proceso de selección de hongos adaptados a las condiciones ecológicas de las zonas a repoblar.

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG) / The diversity of life forms around us is astounding: a walk in the woods, or even down the street, shows us organisms of different morphologies: two legs, four legs, wings; different capacity of interaction with our environment: plants photosynthesizing while bacteria break down our garbage. How can life take on so many forms? While there is some increase of genes when comparing the most simple eukaryotes to the most complex ones it is clear that organism complexity is not the result of the number of genes. Therefore is has been postulated that the complexity of an organism arises from the complexity of its gene regulation, rather than the number of genes. This regulation must come then from the non-gene part of the genome. We now know that genes constitute but a small portion of genomes, (about 5% of the human genome). The advent of whole-genome sequencing has enabled us to get a more complete picture of what is in a genome, and with that has come the surprise that a significant part of all genomes characterized is constituted of transposable elements (TEs). Transposable elements are mobile genetic sequences, meaning that they have the capacity to change their position within the genome of a single cell. The goal of my dissertation has been to investigate the role of TEs in plants and their impact on gene and genome evolution. For this I have taken two approaches. The first is a study in the newly sequenced genome of Cucumis melo, an important crop plant in Spain. In the context of this project I have characterized the transposon landscape in the genome, and identified TE related polymorphisms between seven different varieties. This project has of interest the fact that this is an important plant for agriculture and domestication is a particularly relevant evolutionary context in which to study the impact of transposons, as the lines analyzed come from different geographic and selection backgrounds. In the context of this project I have developed a pipeline for genome annotation, and a software for detection of polymorphisms using next-generation paired-end sequencing data. This yielded insight into the dynamics of transposon evolution in this genome, and the selective forces that have shaped the transposon landscape. To our knowledge this is the first analysis that uses polymorphic TEs to investigate differential chromosomal distribution of recent and old transposons, and thus revealing at an intra-species scale the timeline of selection. The results obtained are promising for studying the contribution of mobile elements to the evolution of two genetically similar yet phenotypically different cultivated varieties. In order to study the impact of transposition on gene regulation, I investigated MITE families which have amplified a transciption factor binding site (TF BS) in the model plant Arabidopsis thaliana. This project focuses on the potential impact on gene regulation networks of the redistribution of this TFBS, a phenomenon that has been described for various master TF in animals but not yet to my knowledge in plants. This study combines in silico analysis with molecular data such as microarrays and ChIP, and is a striking example of one of the many manners in which TEs can impact gene regulation. The work in this dissertation highlights the contradictory nature of transposable elements: on one hand, they are invasive, and on the other, are the source of essential innovations. Here we provide insight as to the functions they play in plant genome evolution.

En esta tesis doctoral se desarrollan diferentes aproximaciones al estudio de plantas vasculares de interés para la conservación en la Cordillera Cantábrica, con el objetivo de generar información aplicable a las estrategias de conservación en el territorio. En la primera parte se aborda la biodiversidad vegetal y las prioridades de conservación, estudiando (1) la riqueza florística y de hábitats y su grado de exclusividad o amenaza; (2) la caracterización de áreas de endemicidad en el conjunto de las montañas del noroeste peninsular; (3) los patrones de rareza y hábitat en las plantas orocantábricas amenazadas a escala nacional; y (4) metodologías para el establecimiento de prioridades de conservación a una escala biogeográfica. En la segunda parte se evalúan cuatro plantas prioritarias, estudiando (5) la aplicación de modelos de predicción del área de ocupación potencial de Empetrum nigrum subsp. nigrum como ejemplo de planta relícta boreoalpina; (6) alternativas para evaluar la variabilidad poblacional de Senecio boissieri como herramienta para la definición de unidades de conservación intraespecíficas en plantas orófilas; (7) la implicación de la fragmentación del hábitat en la viabilidad poblacional de Aster pyrenaeus, planta ligada a bordes forestales; y (8) la utilización de una planta indicadora, Centaurium somedanum, como medida de aproximación a la variabilidad y conservación de ecosistemas ligados a fuentes carbonatadas.

Dinoflagellates are one of the most abundant and diverse groups of microalgae. Many dinoflagellates are covered with cellulose plates, whereas others lack these plates and are hence referred to as athecate or unarmoured. Unarmoured species have been historically poorly characterized because they deform when fixed with traditional methods. Most unarmoured genera are included within the order Gymnodiniales and are differentiated by morphological characters, but the recent combination of morphological observations with phylogenetic data concludes that molecular phylogenies do not support the "classical" morphological criteria used to distinguish the genera. It is also known that the order Gymnodiniales is not monophyletic. Consequently, the taxonomy of dinoflagellates has shifted to a combination of morphology and molecular information. The widespread use of molecular techniques has enabled detailed studies on the systematics of a lot of groups. Although many dinoflagellates are not easily cultivable and cannot be sequenced by standard techniques, the single-cell PCR technique has allowed obtaining sequences from a single cell by taking advantage of the large copy number of the ribosomal genes. Extensive identifications of dinoflagellates present in the NW Mediterranean Sea were carried out between the 1960s and 1980s. However, the diversity of unarmoured dinoflagellates was not suitably characterized because of the use of fixed samples and the lack of molecular tools. This thesis studies the diversity of dinoflagellates belonging to the Gymnodiniales order from the Catalan coast, as a representative site of the NW Mediterranean Sea. This thesis presents a revision of their taxonomy by combining morphological studies of live specimens with the respective phylogenetic information. Given that the phylogeny of most of the studied organisms had not been previously determined and the evidence that Gymnodiniales is not monophyletic, a secondary objective was to study the phylogenetic relationships of species. The D1-D2 region of the LSU rDNA sequence was selected to conduct the SC-PCR, but SSU rDNA sequences were obtained when necessary. The combination of morphological and molecular data has led to the identification of 58 unarmoured species belonging to the order Gymnodiniales. Ten morphospecies are detected for the first time in the Mediterranean Sea, and eight, for the first time along the Catalan coast (Chapter 1 and 2). Additionally, the application of single-cell PCR has resulted in the sequencing of 43 unarmoured species, 25 of them for the first time (Chapters 1 and 2). It has also allowed the detection and characterization of species previously undescribed, resulting in the erection of two new species: Gymnodinium litoralis (Chapter 3) and Polykrikos tanit (Chapter 4). Additionally, the toxic species Cochlodinium polykrikoides was detected for the first time along the Catalan coast. Most populations formed a newly differentiated ribotype, but others were included within a previously known one, demonstrating their coexistence in the Mediterranean Sea (Chapter 5). Finally, a Ceratoperidinium specimen was sequenced for the first time and a new phylogenetic clade was obtained, along with other unarmoured dinoflagellates, including Ceratoperidinium margalefii, Gyrodinium falcatum, which was transferred to the genus Ceratoperidinium, three Cochlodinium species, and two Gymnodinium-like organisms. This resulted in the emendation of the Ceratoperidiniaceae family and the genus Ceratoperidinum (Chapter 6). The correct identification of the species has allowed to conclude that there is a high diversity of unarmoured dinoflagellates in the Catalan coast, and to discuss the implications on the distribution and biogeography of the species at a Mediterranean level, as C. polykrikoides (Chapter 5), or globally, as for Gyrodinium spirale (Chapter 2) / Les dinoflagel•lades són un dels grups més abundants i diversos de microalgues. Moltes espècies estan cobertes amb plaques de cel•lulosa, mentre que d’altres que no en tenen són conegudes com a atecades o nues. Les espècies atecades han estat generalment mal caracteritzades ja que es deformen quan són fixades amb mètodes tradicionals. La majoria de gèneres atecats s'inclouen dins l’ordre Gymnodinials i es distingeixen per caràcters morfològics, però la combinació recent d'observacions morfològiques amb dades filogenètiques conclou que les filogènies moleculars no suporten els criteris morfològics clàssics utilitzats per distingir els gèneres. També es coneix que l’ordre Gymnodinials no és monofilètic. Per tant, la correcta taxonomia de dinoflagel•lades requereix una combinació d’informació morfològica i molecular. L'ús generalitzat de tècniques moleculars ha permès estudis detallats sobre la sistemàtica de molts grups. Tot i que moltes dinoflagel•lades no són fàcilment cultivables i no es poden seqüenciar mitjançant tècniques estàndards, la tècnica de single-cell PCR ha permès obtenir seqüències a partir d'una sola cèl•lula, aprofitant el gran nombre de còpies dels gens ribosòmics que les dinoflagel•lades contenen. Entre els anys 1960 i 1980 es van dur a terme identificacions extensives de les dinoflagel•lades existents al litoral català. Tanmateix, no es va caracteritzar adequadament la diversitat de dinoflagel•lades atecades degut a l’ús de mostres fixades i la manca d'eines moleculars. Aquesta memòria presenta l'estudi de la diversitat d'espècies de l’ordre Gymnodinials a la costa catalana com a representativa del NO del Mar Mediterrani, entre els anys 2010-2013. L'estudi presenta una revisió de la seva taxonomia pel que s'han combinant estudis morfològics d’exemplars vius amb la corresponent informació filogenètica. Atès que la filogènia d’alguns dels organismes estudiats no s'havia determinat amb anterioritat i l'evidència que l’ordre Gymnodinials no és monofilètic, el segon objectiu ha estat estudiar les relacions filogenètiques de les espècies. Es va seleccionar la regió D1-D2 del 28s rDNA per dur a terme els anàlisis amb SC-PCR, però també es van obtenir seqüències del 18s rDNA quan ha estat necessari. La combinació de les dades morfològiques i moleculars ha permès la identificació inequívoca de 58 espècies atecades pertanyents a l’ordre Gymnodinials. D’aquestes, es detecten deu morfoespècies per primera vegada a la mar Mediterrània, i vuit per primera vegada al litoral català (Capítols 1 i 2). A més, l'aplicació de la SC-PCR ha permès seqüenciar 43 espècies atecades, 25 de les quals per primera vegada (Capítols 1 i 2). També ha permès la detecció i caracterització d’espècies no descrites prèviament, que ha resultat en la descripció de les noves espècies Gymnodinium litoralis (Capítol 3) i Polykrikos tanit (Capítol 4). A més, es va detectar per primera vegada l'espècie tòxica Cochlodinium polykrikoides al litoral català. La majoria d’aquests organismes pertanyien a un nou ribotip, però d’altres quedaren inclosos en un ribotip ja conegut, demostrant la seva coexistència al Mar Mediterrani (Capítol 5). Finalment, es va seqüenciar per primera vegada un espècimen del gènere Ceratoperidinium i es va obtenir un nou grup filogenètic, juntament amb d’altres dinoflagel•lades atecades, incloent Ceratoperidinium margalefii, Gyrodinium falcatum, que va ser transferit al gènere Ceratoperidinium, tres espècies de Cochlodinium, i dos organismes semblants a Gymnodinium. Això va donar lloc a l'esmena de la família Ceratoperidiniaceae i del gènere Ceratoperidinum (Capítol 6). La correcta identificació de les espècies ha permès concloure que la costa catalana presenta una gran diversitat de dinoflagel•lades atecades, i discutir les implicacions en la distribució i biogeografia de les espècies a nivell de la Mediterrània, com el cas de C. polykrikoides (Capítol 5), o global, com el cas de Gyrodinium spirale (Capítol 2)

La intensificación de la producción agrícola en los últimos cuarenta años ha provocado un notable aumento de la cantidad de alimento producido, a costa de provocar un elevado coste medio ambiental. Como problemas comunes asociados a las prácticas agrarias implantadas con el modelo actual de agricultura intensiva se encuentran la eutrofización y pérdidas de biodiversidad, lixiviación de nitratos y contaminación de las aguas subterráneas, degradación de la estructura del suelo, enfermedades incontroladas y contaminación por pesticidas, etc. Además, este modelo de producción generalmente genera desequilibrios nutricionales, lo cual no es sostenible a largo plazo.Por ello, es conveniente adaptar la agronomía a unas prácticas que sean compatibles con el uso sostenible de los recursos naturales. Como respuesta a esta necesidad de formas más sostenibles de producción agrícola ha surgido la agricultura ecológica y más recientemente, la producción integrada. El principal objetivo de estos modelos de producción es desarrollar sistemas agrícolas que sean más sostenibles en términos agronómicos, ambientales y económicos, así como asegurar la producción de alimentos de elevada calidad de forma respetuosa con el medio ambiente.El presente trabajo está enmarcado en el seno de un proyecto europeo denominado VEGINECO, cuyo propósito es el desarrollo, ensayo, evaluación y comparación de prototipos agrarios de hortícolas basados en técnicas de manejo de producción integrada y ecológica.El objetivo fundamental de este estudio ha sido el cálculo de los balances simplificados de nutrientes y de materia orgánica a lo largo de una rotación de cultivos hortícolas en sistemas de producción integrada y ecológica durante tres años, con la finalidad de aportar una información útil que permita ajustar el abonado a las necesidades nutritivas reales de los cultivos, evitando así los excesos que se suelen cometer en la agricultura intensiva, que suponen un gasto innecesario para el agricultor y que son una importante fuente de contaminación ambiental. Por ello, se ha evaluado la idoneidad de los balances de nutrientes (N, P, K y Mg) y de materia orgánica para su empleo como indicadores de sostenibilidad de los agrosistemas y posibles herramientas para el cálculo de la fertilización.A su vez, se ha comparado la evolución de éstos balances teóricos con la de los contenidos de nutrientes asimilables en el suelo, con el fin de comprobar si existe una relación directa entre ellos.Este estudio podrá servir de orientación para futuras reconversiones a sistemas de agricultura más sostenibles, ya que con el rendimiento de la cosecha obtenida también incluido en el presente trabajo, además de evaluar el efecto del manejo sobre la producción, se podrá tener una idea aproximada de la cuantía de las extracciones de nutrientes que ocasionan los cultivos en diferentes zonas de la Comunidad Valenciana, permitiendo así cuantificar las necesidades de fertilización de los cultivos hortícolas en estos sistemas de producción integrada y ecológica. / The intensification of agricultural production over the last forty years has strongly increased the amount of food obtained, although it has also had as a consequence a high environmental cost. Eutrophication and biodiversity losses, nitrate leaching and groundwater pollution, degradation of soil structure, uncontrolled diseases and pesticides contamination are common problems associated with conventional cropping systems. For this reason, it is important to consider the convenience of using management practices compatibles with the sustainable use of resources. Two more sustainable ways of production are organic farming and more recently integrated production organic. This work was included in the large-scale EU project VEGINECO, which focused on research into horticultural systems to develop, test, evaluate and compare prototypes of integrated and ecological vegetable farming systems.The main objective of this study was to calculate simplify macronutrients (N, P, K, Mg) and organic matter balances for integrated and organic systems during three years in a crop rotation. These results could give an important information to improve fertilization programmes, adjusting the inputs to the real nutrient requirements and avoiding the common surpluses in intensive agriculture. Furthermore, these additionally inputs increase unnecessary costs to the farmers and they are an important focus of environmental pollution. For this reason, it has been consider the convenience of using nutrient balances as environmental indicators and as tools for nutrient management.Additionally, these theoretic balances were compared to the evolution of available nutrient reserves in soil systems to prove if there is any direct relation between them.This study could be very useful to get further information about patterns of respectful agriculture, due to with the results of crop production included in this experience, moreover we can evaluate the effects of the management in production, we can determinate the absorption of nutrients on some species of vegetables in different areas of Valencian Community, as advisory criteria for the nutrient necessities in crops in integrated and organic systems.

The study of desiccation tolerance of lichens, and of their phycobionts in particular, has been mainly focused on the antioxidant system that protects the cell against photo-oxidative stress produced during dehydration and rehydration. However, desiccation tolerance cannot be achieved in lichen phycobionts with antioxidant activity alone. The main objective of the thesis was to expand the knowledge of the poorly understood desiccation tolerant mechanisms. The first chapter presents an introduction to the subject of the thesis, based on the available background information, and explains the rationale of the thesis. The aim of the chapter 2 was to establish the optimal growing conditions for the isolated phycobiont Trebouxia erici Ahmadjian (SAG 32.85 = UTEX 911) and to determine how these working procedures could modify the results of further experiments. We concluded that cellulose-acetate discs for agar cultures should be inoculated with 14-day-old liquid cultures, and growth under irradiance of 30 mol m-2 s-1 PAR at 20 ºC. Experiments should be carried out with 21day-old algal discs. The experiments carried out in third chapter were designed on one hand, to determine the grade of desiccation tolerance of the isolated lichen phycobiont T. erici, and on the other hand, we studied the response of some protective mechanisms. The results showed that both long desiccations and rapid drying produced greater membrane damage and lower recovery of metabolic and photosynthetic activity than after brief desiccations and slow drying, respectively. Photosynthesis was never recovered totally neither after rapid nor slow drying. Classical mechanisms involved in the protection of the cell against oxidative stress were present in hydrated algae although were not enhanced during dehydration/rehydration. Likewise, in T. erici, dehydrins were also constitutively expressed. However, a slow drying time was required for activating the conformational change in the photosystem II which protect against photoinhibition in desiccation state. In the fourth chapter we decided to carry out proteomic and genetic expression analyses of the changes associated with desiccation and rehydration in the isolated phycobiont Trebouxia erici, in order to find out other proteins that may be involved on desiccation tolerance mechanisms of phycobionts. Proteomic analysis showed that desiccation caused up-regulation of around 19 proteins and down-regulation of 43 proteins. Among the proteins up-regulated during drying were found: a putative cation transport protein; a protein with an F-box domain; a cell division cycle 48 protein; -tubulin protein; a 90 kDa Heat shock protein. We observed that five Hsp90 and two -tubulin genes were activated during dehydration and mRNA was accumulated until the cell was completely dried. In the fifth chapter we investigated the role of the NO in the biochemical interaction between lichen symbionts and whether the NO may increase the endurance of lichenized phycobionts under desiccation. Rehydration of the lichen R. farinacea caused the release of NO together with a high production of ROS. The amount of NO detected decreased significantly with the addition of c-PTIO. In the isolated phycobionts, scavenging of the self produced NO caused a decrease in the recovery of photosynthetic activity after dehydration, probably due to the higher levels of photo-oxidative stress. The aim of the work presented in the sixth chapter was to determine the effect of cell ageing in desiccation resistance of T. erici. Phycobiont capacity to recover photosynthesis activity after desiccation was inversely related with cell ageing, suggesting that desiccation tolerance is age-dependent. The results presented in this thesis demonstrate that desiccation tolerance of T. erici is achieved by a complex system of constitutive and induced mechanisms. Moreover, some factors such as drying rate, desiccation duration, lichenization and ageing may alter the recovery capacity of T. erici after desiccation. / El estudio de la tolerancia a la desecación de los líquenes, y de sus fotobiontes en particular, ha sido principalmente enfocado hacia los sistemas antioxidantes que protegen a la célula frente al estrés fotoxidativo. Sin embargo, la tolerancia a la desecación no puede ser alcanzada solamente con sistemas antioxidantes. Por esta razón, el objetivo principal de esta tesis fue profundizar en el conocimiento de los mecanismos de tolerancia a la desecación en fotobiontes liquénicos. El fotobionte liquénico Trebouxia erici Ahmadjian mostró ser tolerante a la desecación incluso cuando es cultivado separado de su compañero micobionte. Sin embargo, la resistencia a la desecación dependió de la velocidad de deshidratación, del tiempo de desecación y del envejecimiento del cultivo. Tasas de deshidratación altas, largos periodos de desecación y cultivos viejos redujeron la capacidad de recuperación. Esto es debido a que la tolerancia a la desecación del fotobionte se consigue por un lado mediante mecanismos de protección celular que son constitutivamente expresados como, enzimas antioxidantes, xantofilas o proteínas LEA, junto con la activación Mientras que por otro, existen mecanismos que se activan durante la deshidratación, como son de la síntesis de proteínas implicadas en el transporte, la protección de membranas y proteínas, el citoesqueleto, el ciclo celular y el marcaje y la degradación de proteínas. Aunque los fotobiontes liquénicas tienen sus propios mecanismos para resistir la desecación, en la relación simbióntica la tolerancia a la desecación podría ser aumentada por otros mecanismos. Nuestros estudios con el liquen Ramalina farinacea Ach. y fotobiontes aislados mostraron que el gas bioactivo oxido de nitrógeno (NO) es liberado principalmente por el hongo durante la rehidratación del talo, el cual podría tener un papel importante en la maquinaria antioxidante del fotobionte durante las primeras fases de la rehidratación.

El grupo Boletus edulis incluye cuatro especies que poseen gran importancia económica por su valor gastronómico: Boletus aereus, Boletus edulis, Boletus pinophilus y Boletus reticulatus. Las Cistaceae son plantas características de las primeras etapas sucesionales, ecológicamente importantes por su papel como reservorio de inóculo de hongos ectomicorrícicos ante perturbaciones ecológicas. Los carpóforos del grupo Boletus edulis son recolectados en algunas regiones de la España Central, en zonas de matorral en las que se producen fuegos recurrentes y que están dominadas por Cistus ladanifer. Esta asociación abre una nueva vía de desarrollo rural sostenible. Describir sus estructuras, comprobar la viabilidad de la asociación en condiciones de laboratorio y calcular su área potencial son pasos previos que permitirán desarrollar su explotación. Los objetivos específicos son: 1. Realizar la descripción de las ectomicorrizas de Boletus edulis y Cistus ladanifer. 2. Comprobar la capacidad de las especies del grupo Boletus edulis para formar ectomicorrizas con Cistus sp. en condiciones de laboratorio, y realizar sus descripciones. 3. Definir el área potencial en la que la asociación entre Boletus edulis y Cistus ladanifer es capaz de producir carpóforos en la España peninsular. La metodología utilizada es: 1. Las ectomicorrizas naturales de Boletus edulis y Cistus ladanifer han sido descritas en base a los estándares de la especialidad. La identificación del simbionte fúngico fue confirmada mediante la comparación de secuencias de la región ITS del rDNA. 2. Ectomicorrizas de Boletus aereus, Boletus edulis y Boletus reticulatus con Cistus sp. fueron sintetizadas en condicones de laboratorio utilizando tubos de síntesis rellenos con turba-vermiculita esterilizada y solución de nutrientes durante 4-5 meses. Las ectomicorrizas se describieron utilizando los estándares anato-morfológicos. 3. Modelos de distribución de especies basados en variables climáticas con corrección litológica fueron utilizados. Los parámetros utilizados incluyen 19 localizaciones en las que Boletus edulis es capaz de producir carpóforos en asociación con Cistus ladanifer. Los resultados obtenidos son: 1. La ectomicorriza formada entre Boletus edulis y Cistus ladanifer tiene los rasgos típicos de los Boletales: blanquecina, con el manto plectenquimatoso, estructuras en forma de anillo y rizomorfos con hifas diferenciadas. Las células de la superficie de los rizomorfos ampulosas, con terminación clavada; y la disposición de sus hifas, ligeramente retorcidas, son otros carateres adicionales. Ninguna hifa tiene fíbulas. 2. Se sintetizaron in vitro micorrizas de Boletus aereus, Boletus edulis y Boletus reticulatus con Cistus albidus y Cistus ladanifer. No se consiguió la formación de micorrizas de Boletus pinophilus. Las micorrizas formadas son todas muy similares, con los rasgos típicos de los Boletales. 3. El nicho climático de Boletus edulis y Cistus ladanifer es mesotérmico, Mediterráneo y húmedo. Los suelos son fuertemente ácidos, con textura limosa, pobres en materia orgánica y con humus oligotrófico. De acuerdo con la curva de presencia predicha / esperada, el 16,3 % del área potencial, 1.785 km2, son considerados óptimos para la asociación entre Boletus edulis y Cistus ladanifer en la España peninsular. Las conclusiones son: 1. Boletus edulis es capaz de producir ectomicorrizas y carpóforos en asociación con plantas hospedantes no habituales. Esta situación favorece el mantenimiento del reservorio de inóculo en el suelo para etapas de sucesión posteriores y puede ser una estrategia de dispersión para asegurar su variación genética. 2. La micorrización controlada y la instalación de plántulas inoculadas puede ser una forma viable y prometedora para explotar este tipo de simbiosis con beneficios económicos. Para conseguirlo, es necesario realizar más investigación y determinar métodos de inoculación apropiados con cepas compatibles, la persistencia de las ectomicorrizas en campo, y los factores que desencadenan la producción de carpóforos. 3. Aunque algunos modelos regionales para ectomicorrizas han sido desarrollados en los últimos tiempos, el conocimiento de la distribución y la organización de la comunidad se encuentra todavía en sus inicios. / The Boletus edulis species complex includes four species: Boletus aereus, Boletus edulis, Boletus pinophilus, and Boletus reticulatus, that have the great economic importance all around the world for their edibility. Cistaceae are plants belonging to primary succession stages, that are ecologically important because they may act as a reservoir of ectomycorrhizal fungi inoculum after a forest disturbance. Boletus edulis sporocarps are regularly observed in certain regions of Central Spain, which have recurrent fires and are dominated exclusively by Cistus ladanifer. Its productive association opens a new way of sustainable rural development. To describe its structures, to check the viability of the association under laboratory conditions and also its realized niche and climatic suitability are previous steps that will allow us to arise a new way to exploiding it. The particular aims of this work are: 1. To provide a detailed description of the ectomycorrhiza of Boletus edulis on Cistus ladanifer. 2. To test the ability of the Boletus edulis species complex to form ectomycorrhizae with Cistus sp. under controlled conditions as well as provide detailed anatomical descriptions of those ectomycorrhizae. 3. To define the realized niche of the ectomycorrhizal association where Boletus edulis produces sporocarps associated with Cistus ladanifer in peninsular Spain. Methods followed are: 1. Detailed anato-morphological description based on standars and identification of the fungal symbiont by ITS rDNA sequence comparison of wild Boletus edulis ectomycorrhiza on Cistus ladanifer has been performed. 2. Ectomycorrhizae of Boletus aereus, Boletus edulis, and Boletus reticulatus were synthesized under laboratory conditions using synthesis tubes filled with a mixture of sterilized peat-vermiculite and nutrient solution for 4-5 months. The ectomycorrhizae formed were described based on standard characters. 3. Species distribution models based on climatic variables and corrected under lithological criteria were used. Parameters have been obtained from various sources including 19 sites where Boletus edulis sporocarps are sure to fruit in pure Cistus ladanifer scrublands. Reached results are: 1. Boletus edulis and Cistus ladanifer ectomycorrhiza has traits typical of Boletales: whitish with plectenchymatous mantle in plan view forming ring-like structures and rhizomorphs with highly differentiated hyphae. The inflated, smooth cystidia-like clavate end-cells on the surface of the rhizomorphs and their slightly twisted external hyphae are additional characterizing features. Not all hyphae have clamps. 2. Ectomycorrhizae of Boletus aereus, Boletus edulis, and Boletus reticulatus were synthesized in vitro with Cistus albidus and Cistus ladanifer. Nevertheless, no Boletus pinophilus ectomycorrhizae where formed. The formed ectomycorrhizae were very similar, with typical traits of Boletales. 3. The climatic niche of Boletus edulis and Cistus ladanifer could be considered as mesothermal, Mediterranean and humid. Soils are strongly acid, with loam texture, low in organic matter, and in an oligotrophic mull form. According to the presence/expected curve, 16.3 % of the potential area, 1,785 km2, is considered to be optimal for this association in peninsular Spain. Conclusions are: 1. Boletus edulis is able to produce ectomycorrhizae and sporocarps in association with unusual host plants. This situation would favour the maintenance of soil inoculum reservoria for successional stages and this fact may be a dispersion strategy to assure genetic variation. 2. Controlled mycorrhization and outplanting of inoculated seedlings might be a feasible and promising way to exploit this symbiosis providing economic benefits. To accomplish this, further research is needed to determine the appropriate inoculation methods with compatible strains, the persistence of ectomycorrhizae on outplanted, inoculated seedlings, and the factors triggering sporocarps production. 3. Although some regional models around ectomycorrhizae have been developed over the last few years, our understanding of the distribution and community organization of ectomycorrhizal fungal communities is still in its infancy.

Introducción: El conocimiento cada vez mayor sobre la relevancia funcional de los pequeños RNAs endógenos (esRNAs) como riboreguladores ha estimulado la identificación y caracterización de estas moléculas en numerosos eucariotas. En el hongo basal Mucor circinelloides, un patógeno oportunista humano, se han descrito esRNAs que regulan la expresión de muchos genes que codifican proteínas. En la biogénesis de estos esRNAs participan una RNasa III denominada Dicer, una proteína Argonauta y dos RNA polimerasas dependientes de RNA (RdRP). Además de participar en esta ruta canónica de silenciamiento mediado por RNA, los genes rdrp de M. circinelloides están implicados en la producción de una nueva clase de esRNA, que son independientes de Dicer. Estos esRNAs muestran un sesgo muy fuerte en la polaridad de las cadenas y una distribución aleatoria de tamaños, lo que sugiere que son productos de degradación de RNAm endógenos. El objetivo global de esta tesis es caracterizar esta posible ruta de degradación de RNAm, identificar la RNasa implicada y utilizar los mecanismos de silenciamiento de Mucor para realizar un análisis funcional a escala genómica. Estos objetivos globales se concretan en los siguientes: Objetivos: i) Análisis de la función de la ruta independiente de Dicer y dependiente de RdRp en la regulación de la expresión génica. ii) Identificación in silico de RNasas de M. circinelloides candidatas a participar en la ruta de degradación independiente de Dicer. iii) Análisis del papel de los genes candidatos en la producción de esRNAs independientes de Dicer y dependientes de RdRP. iv) Construcción de genotecas genómicas para el análisis funcional de genes mediante RNA de interferencia (RNAi), utilizando vectores de silenciamiento para identificar secuencias de M. circinelloides con un posible papel en patogénesis. v) Generación de mutantes nulos de los genes candidatos para confirmar el fenotipo e investigar su papel en la patogénesis de Mucor. Métodos: El análisis de la función génica se llevó a cabo mediante manipulaciones genéticas in vitro e in vivo. Estas incluyen métodos para aislar, amplificar y analizar la expresión de genes específicos y para la transformación genética de células vivas. Se construyeron genotecas de DNA genómico en vectores de silenciamiento con promotores duales para el análisis funcional del genoma y la identificación de genes candidatos con un posible papel en la patogénesis de Mucor. Se utilizaron análisis fenotípicos para evaluar las funciones de los genes candidatos en el crecimiento, la morfogénesis y la virulencia de este hongo. Resultados: Los análisis de expresión demostraron que la nueva ruta independiente de Dicer y dependiente de RdRP regula la expresión génica mediante la degradación específica de RNAm por una RNasa previamente desconocida. Esta ruta regula principalmente genes conservados implicados en metabolismo y procesos de señalización celular, tales como los requeridos para la biosíntesis del grupo hemo, y controla las respuestas a señales ambientales específicas. La búsqueda en el genoma de Mucor identificó varias RNasas candidatas, y el análisis funcional de los mutantes nulos correspondientes permitió identificar una nueva proteína, R3B2, que es específica de hongos basales. Esta RNasa III participa tanto en la ruta no canónica de degradación independiente de Dicer, como en la ruta canónica de silenciamiento dependiente de Dicer, lo que pone de manifiesto su papel crucial en la biogénesis y función de los esRNAs reguladores. Se ha utilizado el mecanismo canónico de silenciamiento para llevar a cabo el análisis funcional a escala genómica en Mucor, para lo cual se construyeron dos genotecas genómicas basadas en RNAi. La introducción de estas genotecas en M. circinelloides permitió identificar varios transformantes con fenotipos anormales. Los análisis moleculares y de silenciamiento demostraron que dos genes específicos fueron los responsables de las alteraciones fenotípicas estudiadas. El análisis fenotípico de los mutantes nulos correspondientes confirmó el papel de dichos genes en la morfogénesis y patogénesis de M. circinelloides. Conclusiones: Se ha identificado y caracterizado una nueva ruta no canónica de silenciamiento, independiente de Dicer y dependiente de RdRP, que regula la expresión génica mediante la degradación de RNAm específicos. La RNasa implicada en esta ruta, denominada R3B2, presenta una arquitectura de dominios única, es específica de hongos basales y también está implicada en el mecanismo canónico de RNAi. Estos resultados asignan un nuevo papel para las proteínas RdRP en un proceso de degradación de RNA que podría representar el primer paso en la evolución del RNAi. Se ha desarrollado con éxito un procedimiento para realizar análisis funcional a gran escala utilizando RNAi, lo que ha permitido identificar dos genes que participan en la morfogénesis de Mucor. El gen mcmyo5 codifica una miosina de clase V que juega un papel esencial en la morfogénesis y la patogénesis de Mucor. El gen mcclasp codifica una proteína CLASP, que también participa en la morfogénesis, pero no juega ningún papel importante en la patogénesis de Mucor. / The increasing knowledge on the functional relevance of endogenous small RNAs (esRNAs) as riboregulators has stimulated the identification and characterization of these molecules in numerous eukaryotes. In the basal fungus Mucor circinelloides, an emerging opportunistic human pathogen, esRNAs that regulate the expression of many protein coding genes have been described. These esRNAs share common machinery for their biogenesis consisting of an RNase III endonuclease Dicer, a single Argonaute protein and two RNA-dependent RNA polymerases. Besides participating in this canonical dicer-dependent RNA interference (RNAi) pathway, the M. circinelloides rdrp genes are involved in the production of a novel dicer-independent esRNA class, which showed a very strong strand bias, being exclusively sense to the mRNAs, and a random spread of size distribution, suggesting that they are degradation products of endogenous mRNAs. The overall objective of this thesis is to characterize this putative mRNA degradation pathway, identify the RNase involved and use the Mucor silencing mechanisms for whole-genome functional analysis. These global objectives are specified in the following: Objectives: i) Functional analysis of the rdrp-dependent dicer-independent pathway in the regulation of gene expression. ii) In silico identification of M. circinelloides candidate RNases to be involved in the dicer-independent degradation pathway. iii) Functional studies of the candidate genes in the production of rdrp-dependent dicer-independent esRNAs. iv) Construction of genomic libraries for functional analysis by knocking-down genes using silencing vectors to identify M. circinelloides sequences with putative roles in pathogenesis. v) Generation of null mutants for each candidate gene to confirm the phenotype and investigate their roles in Mucor pathogenesis. Methods: in vivo and in vitro genetic manipulations were used to analyze gene functions. These include methods to isolate, amplify and analyze the expression of specific genes and genetic transformation of living cells. Genomic DNA libraries were constructed in silencing vectors containing dual promoters for whole-genome functional analysis and identification of candidate genes with a possible role in Mucor pathogenesis. Phenotypic analyses were used to evaluate the functions of candidate genes in growth, morphogenesis and virulence of this fungus. Results: Expression analysis demonstrated that the new rdrp-dependent dicer-independent pathway regulates gene expression by promoting the specific degradation of mRNAs by a previously unknown RNase. This pathway mainly regulates conserved genes involved in metabolism and cellular processes and signaling, such as those required for heme biosynthesis, and controls responses to specific environmental signals. Searching the Mucor genome for candidate RNases to participate in this pathway, and functional analysis of the corresponding knockout mutants identified a new protein, R3B2, which is only found in basal fungi. This RNase III-like protein participates in both the rdrp-dependent dicer-independent non-canonical pathway and the canonical dicer-dependent RNAi pathway, highlighting its crucial role in the biogenesis and function of regulatory esRNAs. RNAi was applied to carry out whole-genome functional analysis in Mucor. Two RNAi-based genomic libraries were constructed. Introduction of these libraries into M. circinelloides identified several transformants with abnormal phenotypes. Silencing and molecular analyses demonstrated that two specific genes were responsible for the phenotypic alterations. Phenotypic analyses of the corresponding disruption mutants revealed the role of those genes in M. circinelloides morphogenesis and pathogenesis. Conclusions: A novel non-canonical RNA silencing mechanism promoting mRNA degradation in M. circinelloides has been identified and characterized. This pathway is rdrp-dependent dicer-independent and regulates gene expression by degrading specific mRNAs. The RNase involved in this pathway, R3B2, presents unique domain architecture and it is also involved in the canonical dicer-dependent RNAi pathway. Our results expand the role of RdRPs in gene silencing and reveal the involvement of these proteins in a new RNA degradation process that could represent the first step in the evolution of RNAi. A new approach for large-scale functional genomics using RNAi has been successful developed in M. circinelloides. Two genes that participate in Mucor morphogenesis have been identified. Gene mcmyo5 encodes a Myosin class V protein that plays an essential role in Mucor morphogenesis and pathogenesis. Gene mcclasp encodes a CLASP protein, which is also involved in morphogenesis, but does not play any significant role in Mucor pathogenesis.

El zinc es un micronutriente esencial para las plantas, pero tóxico a concentraciones elevadas. La mayoría de las plantas adaptadas a suelos metalíferos excluyen el exceso de metales de sus tejidos. Sin embargo, algunas plantas denominadas hiperacumuladoras toleran y acumulan en parte aérea concentraciones de metales extremadamente altas. Una de las hipótesis más aceptadas que explica la adquisición de este rasgo relaciona una elevada concentración de metales con una mayor resistencia a patógenos y herbívoros (hipótesis de la defensa metálica). De hecho, existen evidencias de que altas concentraciones de metal en planta pueden ser tóxicas para microorganismos fitopatógenos (hipótesis de la defensa elemental), incluso a niveles por debajo del umbral de hiperacumulación (hipótesis de la mejora defensiva). No obstante, el Zn podría sobre o subregular compuestos orgánicos relacionados con el sistema inmune de la planta, acentuando la respuesta al estrés (hipótesis de los efectos conjuntos) o ahorrando costes metabólicos (hipótesis de la compensación). En esta tesis se examinó la hipótesis de la defensa metálica en plantas hiperacumuladoras y no hiperacumuladoras inoculadas con hongos necrotróficos. Para ello se consideraron el efecto directo tóxico del Zn y la interacción con las defensas orgánicas, estableciéndose tres patosistemas con plantas creciendo en distintas concentraciones de Zn: Noccaea caerulescens inoculada con Alternaria brassicicola y Arabidopsis thaliana inoculada con Alternaria o Botrytis cinerea. En el caso de Arabidopsis, se emplearon cuatro mutantes con defectos metabólicos en la respuesta al estrés: npr1, pad1, coi1 y etr1. Además, se localizaron en los Pirineos poblaciones naturales de plantas del género Noccaea, que fueron identificadas y caracterizadas con vista a futuros experimentos de campo. El Zn mejoró la resistencia de Noccaea a Alternaria, y se correlacionó negativamente con algunas de las defensas orgánicas. A pesar de que el SA, JA, ABA y las expresiones de varios genes marcadores de las rutas del SA, JA y JA/Et fueron inducidos por igual 24 horas tras la inoculación con Alternaria, una semana más tarde el Zn y las rutas de señalización de estrés se correlacionaron negativamente. Asimismo, se encontró una compensación entre el Zn y los glucosinolatos en hoja, pero, por el contrario, una semana después de la inoculación con Alternaria la concentración de glucosinolatos se vio incrementada en las hojas infectadas con mayor concentración de Zn. Las plantas de A. thaliana silvestres tratadas con Zn fueron más resistentes a Alternaria, pero no claramente a Botrytis. Arabidopsis silvestre y los mutantes de las rutas de señalización de estrés acumularon concentraciones similares de Zn en hoja, descritas como tóxicas para Alternaria, pero no para Botrytis. El Zn amplificó la expresión de los genes relacionados con las rutas de señalización del SA y del JA/Et en respuesta a la infección por Alternaria. Sin embargo, los cambios en las concentraciones de SA, JA, ABA y ACC no fueron responsables de las diferencias en la resistencia a Alternaria. Los mutantes tratados con Zn no fueron más resistentes a ninguno de los patógenos o incluso más susceptibles a Botrytis. Como el Zn no compensó su defecto metabólico, se sugiere que las defensas orgánicas activadas por el Zn tuvieron un papel más importante contra Alternaria que el Zn como defensa inorgánica. Las plantas de tres poblaciones de suelos no metalíferos de los Pirineos hiperacumularon Zn y Cd y fueron identificadas como Noccaea brachypetala según características morfológicas. Además, creciendo en hidroponía, presentaron diferencias fenotípicas, lo cual sugiere que existen diferencias genéticas subyacentes puestas de manifiesto en la expresión de genes de trasportadores de metales en respuesta a Zn y Cd exógenos. El uso de estas poblaciones para estudios de campo se ve limitado por su fragilidad y dificultad de acceso. / Zinc is an essential plant micronutrient but it can be toxic in elevated concentrations. Most of the plants adapted to metalliferous soils exclude metals from their tissues. However, some plants so-called hyperaccumulators are able to tolerate and accumulate extremely high metal concentrations in their shoots. Among the most accepted hypothesis to explain the acquisition of this trait is that heavy metals protect the plant against pathogens and herbivores (metal defense hypothesis). In fact, Zn and other heavy metals may be toxic for the attacking pathogens at high concentration in plant (elemental defense hypothesis). Metals have been accounted even for improving plant disease resistance below hyperaccumulation levels, thus being a possible explanation for the acquisition of the trait (defensive enhancement hypothesis). Nonetheless, other organic compounds related to the plant immune system, have been reported to be up or under regulated in response to Zn, thus enhancing the stress response (joint effects hypothesis) or saving metabolic cost to the plant (trade-off hypothesis). In this thesis the metal defense hypothesis was tested in metal and non-metal hyperaccumulating species inoculated with necrotrophic fungi. Both direct metal toxicity and indirect metal-induced enhancement of organic defenses were considered. For this purpose three pathosystems were established with plants growing at different Zn concentrations. The pathosystems were: Noccaea caerulescens infected with Alternaria brassicicola and Arabidopsis thaliana infected with Alternaria or Botrytis cinerea. In the case of A. thaliana, npr1, pad1, coi1 and etr1, four stress response defective mutants, were also used. Moreover, natural occurring populations of the genus Noccaea were located in the Pyrenees. Plants were identified and their Zn and Cd accumulation ability characterized with a view to future field experiments. Zn improved Noccaea resistance to Alternaria, leading to a trade-off between the metal and some of the organic-based defenses. Although SA, JA, ABA and the expression of SA, JA and JA/Et pathways marker genes were evenly induced by Alternaria 24 hours after the inoculation, one week later Zn and the hormone signaling showed a negative correlation. A trade-off was also reported between leaf glucosinolates and Zn, but, in contrast, one week after the inoculation glucosinolates concentration increased in the infected leaves with higher Zn concentration. A. thaliana WT Zn-treated plants were more resistant to Alternaria attack, but the Zn effect was not clear against Botrytis. A. thaliana WT and the stress signaling defective mutants concentrated similar leaf Zn values, that were accounted to be potentially toxic for Alternaria, but not for Botrytis. Zn amplified the expression of genes related to the SA and JA/Et signaling pathway in response to A. brassicicola infection. However, changes in the endogenous concentrations of SA, JA, ABA and ACC, were not reported to be responsible for the differences in the resistance to Alternaria. Zn-treated A. thaliana stress response defective mutants were not more resistant to none of the pathogens when Zn was applied or even more susceptible to Botrytis. As Zn did not compensate their metabolic defects, it is suggested that the plant organic defenses activated by the enhanced Zn levels against Alternaria played a more important role than Zn as a direct inorganic defense. The plants from four non-metalliferous Noccaea populations in the Eastern Pyrenees were identified attending to morphological characters as Noccaea brachypetala and they were reported to be Zn and Cd hyperaccumulators. Moreover, plants form three populations differed in the rosette shape while growing hydroponically, suggesting underlying genetic differences that were patent in the heterogeneous expression patterns of metal transporter genes in response to Zn and Cd supply. The populations were fragile and of difficult accessibility, which limits their use for field studies in metal hyperaccumulation and defense.