As algas pardas filamentosas (Phaeophyceae) constituem um grupo essencialmente marinho com morfologia extremamente simples. A identificação taxonômica dessas algas é bastante difícil quando empregados apenas caracteres morfológicos devido à grande plasticidade fenotípica que apresentam. No Brasil, nenhum estudo sistemático foi feito com seus representantes empregando-se dados moleculares. Neste contexto, a diversidade de algas pardas filamentosas dos gêneros Acinetospora, Asteronema, Bachelotia, Ectocarpus, Hincksia e Feldmannia foi investigada pela primeira vez no Brasil sob uma abordagem molecular, complementada com dados morfológicos. As coletas abrangeram a região sudeste do Brasil, incluindo a área de ressurgência dos litorais do Rio de Janeiro e Espírito Santo, que abriga quase que a totalidade de táxons de algas pardas filamentosas citadas para o país. Foi utilizado o marcador mitocondrial do tipo DNA Barcode, COI-5P e o marcador plastidial para inferências filogenéticas, o rbcL. Os estudos moleculares e morfológicos permitiram identificar 10 táxons para o litoral sudeste brasileiro: oito da ordem Ectocarpales: Acinetospora filamentosa, \"Feldmannia\" irregulares, \"Feldmannia irregulares\" 1, \"Feldmannia irregulares\" 2, \"Feldmannia\" mitchelliae, \"Hincksia\" conífera e Hincksia sandriana (família Acinetosporaceae) e Ectocarpus fasciculatus (família Ectocarpaceae) e dois da ordem Scytothamnales: \"Asteronema\" breviarticulatum (família Asteronemataceae) e Bachelotia antillarum (família Bachelotiaceae). A família Acinetosporaceae não é monofilética e se dividiu em dois agrupamentos, Acinetosporaceae 1, que incluiu a maioria dos representantes brasileiros e a espécie tipo da família, Acinetospora crinita, e para o qual o nome da família deve ser retido; e Acinetosporaceae 2, que incluiu os autênticos gêneros Feldmannia, Hincksia e Pylaiella com suas respectivas espécies-tipo, Feldmannia lebelli, Hincksia hincksiae e Pylaiella litorallis, respectivamente, e para o qual, uma nova família deverá ser proposta. Hincksia sandriana foi a única espécie estudada que se agrupou no clado do autêntico gênero Hincksia e é citada pela primeira vez para o Brasil, constituindo um caso de introdução recente. Para os demais representantes agrupados em Acinetosporaceae 1, excluindo Acinetospora, um novo gênero para a ciência deverá ser proposto. Os táxons \"H.\" conífera, \"F.\" irregulares, \"F. irregulares\" 1, \"F. irregulares\" 2 e \"F.\" mitchelliae não pertencem aos autênticos gêneros Feldmannia e Hincksia, já que não se agruparam com as respectivas espécies-tipo dos gêneros, e, portanto, devem ser transferidos para o novo gênero. As análises com os dois marcadores moleculares demonstraram que \"F.\" irregulares, \"F. irregulares\" 1 e \"F. irregulares\" 2, previamente citados sob uma única espécie (F. irregulares), representam três entidades taxonômicas independentes. Sequências do COI-5P de F. irregulares da Itália, considerada próxima à localidade tipo (Mar Adriático), confirmaram que parte do material analisado deve ser mantido sob o epíteto irregulares, enquanto duas novas espécies devem ser propostas para a ciência para acomodar \"F. irregulares\" 1 e \"F. irregulares\" 2. As análises moleculares com o COI-5P dividiu \"F.\" mitchelliae em três agrupamentos com alta divergência genética e variabilidade morfológica indicando que \"F.\" mitchelliae forma um complexo. Uma sequência de \"F.\" mitchelliae procedente dos EUA (Carolina do Norte), próxima à localidade tipo (Massachusetts), gerada no presente estudo, confirmou que o material brasileiro deve ser descrito sob o epíteto mitchelliae, porém acomodado sob um novo gênero. Nossos resultados moleculares demonstraram claramente que o gênero Acinetospora não é monofilético. Acinetospora filamentosa é citada pela primeira vez para o Oceano Atlântico e foi revelada por meio de dados moleculares, tanto pelo COI-5P quanto pelo rbcL. A espécie Acinetospora crinita referida previamente para o litoral sudeste do Brasil não foi recoletada neste estudo. Diferenças morfológicas nas estruturas pluriloculares entre as duas espécies e ausência de monosporângios em A. filamentosa, descritos como típico apenas para A. crinita, confirmaram a ocorrência de A. filamentosa para o Atlântico. Nossos resultados com o rbcL revelaram que a família Asteronemataceae não é monofilética. O táxon \"Asteronema\" breviarticulatum se agrupou com Asterocladon lobatum, espécie tipo do gênero, e deve ser alocado na família Asterocladaceae, assim como transferido para o gênero Asterocladon propondo-se uma combinação nova para resolver o posicionamento taxonômico dessa espécie. A alta divergência genética verificada para os marcadores COI-5P e rbcL demonstraram que Bachelotia antillarum é uma espécie críptica. A utilização da ferramenta molecular no estudo de algas pardas filamentosas na região sudeste do Brasil foi fundamental para desvendar a sua diversidade, que comprovadamente estava subestimada, assim como melhor delimitar seus gêneros e espécies e revelar espécies crípticas. Os dados aqui apresentados são pioneiros e constituem uma fonte relevante de informação sobre a taxonomia e sistemática deste grupo de algas pardas. Mais investigações por meio de uma ampla revisão, especialmente da família Acinetosporaceae, uma maior amostragem no litoral brasileiro e inclusão de mais gêneros de algas pardas filamentosas nas análises podem ainda mudar o panorama da classificação desse grupo / Filamentous brown algae (Phaeophyceae) constitute an essentially marine group that display an extremely simple morphology. The taxonomic identification of these algae is very difficult when based only on morphological characters, due to the high incidence of phenotypic plasticity. In Brazil, no systematic study using molecular data has investigated their representatives. In this context, this study aims to investigate the diversity of filamentous brown algae of the genera Acinetospora, Asteronema, Bachelotia, Ectocarpus, Hincksia and Feldmannia for the first time in Brazil, applying the molecular approach coupled with morphological data. The sampling sites covered the southeastern region of Brazil, including the upwelling area of the Rio de Janeiro and Espírito Santo coasts, which include almost all the filaments of brown algae mentioned for the country. The DNA barcode mitochondrial marker, COI-5P, and the plastid marker for phylogenetic inferences, rbcL, were sequenced. The molecular and morphological studies allowed the recognition of 10 taxa on the Brazilian southeastern coast, out of which eight taxa correspond to the order Ectocarpales, and two to the order Scytothamnales. Ectocarpales is represented by the families Acinetosporaceae (Acinetospora filamentosa, \"Feldmannia\" irregularis, \"Feldmannia irregularis\" 1, \"Feldmannia irregularis\" 2, \"Feldmannia\" mitchelliae, \"Hincksia\" conifer and Hincksia sandriana), and Ectocarpaceae (Ectocarpus fasciculatus). The order Scytothamnales, in turn, includes the families Asteronemataceae (\"Asteronema\" breviarticulatum) and Bachelotiaceae (Bachelotia antillarum) The Acinetosporaceae family is non-monophyletic and was divided into two clusters: Acinetosporaceae 1 for which the family name should be retained, included the type species of the family (Acinetospora crinite) and most of the Brazilian representatives; and Acinetosporaceae 2 for which a new family should be proposed, included the genera Feldmannia, Hincksia and Pylaiella represented by their respective type species, Feldmannia lebelli, Hincksia hincksiae and Pylaiella litorallis. Hincksia sandriana was the only species studied that grouped in the clade of the authentic genus Hincksia. Besides, this is the first record of H. sandriana for Brazil, which constitutes a case of recent introduction. For the other representatives of Acinetosporaceae 1, except Acinetospora, a new genus for science should be proposed. The taxa \"H.\" conifer, \"F.\" irregularis, \"F. irregularis\" 1, \"F. irregularis\" 2 and \"F.\" mitchelliae do not belong to the authentic genera Feldmannia and Hincksia, since they did not group with the respective generitypes. Therefore, should be transferred to the new genus. Analyzes applying both molecular markers showed that \"F.\" irregularis, \"F. irregularis\" 1 and \"F. irregularis\" 2, previously cited as a single species (F. irregularis), constitute three independent taxonomic entities. COI-5P sequences of F. irregularis from Italy, close to the type locality (Adriatic Sea), demonstrate that part of the analyzed material should be maintained under the epithet irregularis, whereas two new scientific species should be proposed to accommodate \"F. irregularis \"1 and \" F. irregularis \"2. COI-5P molecular analyzes divided \"F.\" mitchelliae into three clusters with high genetic divergence and morphological variability indicating that \"F.\" mitchelliae corresponds to a species complex. A sequence of \"F. mitchelliae from the United States (North Carolina), near the type locality (Massachusetts), obtained and included in the present study, confirmed that the Brazilian material should be described under the epithet mitchelliae and transferred to a new genus. Our molecular results have clearly demonstrated that the genus Acinetospora is non-monophyletic. Acinetospora filamentosa is for the first time mentioned for the Atlantic Ocean and was revealed by molecular data, both by COI-5P and rbcL. The species Acinetospora crinite recorded on the southeastern coast of Brazil was not collected in this study. Morphological differences in plurilocular structures between two species and absence of monosporangia in A. filamentosa, described as typical only for A. crinite, confirmed the occurrence of A. filamentosa for the Atlantic. Our results with the rbcL revealed that the family Asteronemataceae is non-monophyletic. \"Asteronema\" breviarticulatum was grouped with Asterocladon lobatum, the type species of the genus, and should be transferred to the genus Asterocladon and to the family Asterocladaceae. Consequently, a new combination should be proposed to solve taxonomic placement of this species. The high genetic divergence observed for the COI-5P and rbcL markers demonstrated that Bachelotia antillarum is a cryptic species. The use of the molecular tool in the study of filamentous brown algae in the southeastern region of Brazil was fundamental to uncover their diversity, previously underestimated, as well as to allow a better delimitation of their genera and species. The innovative data presented here constitute a relevant source of information to the taxonomy and systematics of filamentous brown algae. More investigations through a broad review, especially of the Acinetosporaceae family, a wider sampling in the Brazilian coast and the inclusion of more genera of filamentous brown algae in the analyses can still change the classification scenario of this group

O câncer de ovário é a quinta maior causa de óbitos relacionados ao câncer em mulheres em todo o mundo, com pacientes tendo taxas de sobrevivência extremamente baixas. MicroRNAs (miRNAs) são RNAs não codificadores em torno de 22 ribonucleotídeos que desempenham um papel crítico na regulação da expressão gênica em praticamente todos os processos biológicos. Os miRNAs induzem o silenciamento de seus alvos através da repressão de tradução ou clivagem de mRNA. Neste trabalho verificamos que o miR-450a e o miR-450b-5p, dois miRNAs pouco explorados em tumores ginecológicos, foram regulados de forma negativa no câncer de ovário e nas linhagens de câncer de colo do útero. O objetivo deste trabalho foi verificar a hipótese de que tanto o miR-450a como o miR- 450b-5p atuam como supressores tumorais em cânceres de tecido reprodutivo. Para testar esta hipótese, utilizamos ensaios in vitro e um modelo xenográfico in vivo. Usando um vetor de expressão lentiviral, miR-450a e miR-450b-5p foram superexpressos de forma estável nas linhagens A2780, OVCAR-3 e SKOV-3 (linhagens tumorais de ovário) e C33 e SiHa (linhagens tumorais de câncer cervical). A taxa de anoikis foi analisada nas células submetidas a placas de baixa aderência durante 24 horas: a superexpressão de miR-450a resultou em menor viabilidade nas linhagens SiHa, OVCAR-3, A2780 e SKOV-3. Em relação à proliferação celular, as células A2780 que superexpressam o miR-450a proliferaram a uma taxa maior em comparação com as células controle. No entanto, no ensaio clonogênico essas células apresentaram menor número de colônias que eram visivelmente maiores. Por outro lado, o miR-450b diminuiu a taxa de proliferação na linhagem SKOV-3, o que foi corroborado no ensaio clonogênico. Também foram medidas as taxas de migração e invasão celular usando ensaio transwell. A superexpressão de miR-450a ou miR-450b-5p resultou em maior potencial de migração da linha celular C33, mas menor taxa de migração e invasão nas linhagens A2780 e SKOV3. Na linhagem OVCAR-3, a superexpressão do miR-450a aumentou o número de células capazes de invadir, já o miR-450b-5p induziu uma maior taxa de migração. A superexpressão do miR-450b-5p na linhagem SiHa resultou em menor potencial de invasão em comparação com o grupo controle correspondente. Após estes ensaios in vitro, decidimos continuar nossa análise apenas com células A2780 e SKOV-3, que apresentaram um padrão mais parecido nos ensaios. No ensaio in vivo, as células A2780 transduzidas foram injetadas intraperitonealmente em camundongos imunodeficientes de 9-11 semanas e, após 4 semanas, o peso de tumores recuperados foi comparado. Neste modelo xenográfico de câncer de ovário, verificamos que ambos os miRNAs diminuíram o crescimento tumoral, o que corrobora nossos ensaios in vitro. Também verificamos que a maioria dos alvos diretos encontrados por meio do método do PAR-CLIP e aqui validados do miR-450a estão relacionados ao metabolismo energético nas mitocôndrias (TIMMDC1, ACO2, ATP5B), além dos genes PAPSS1, CITED2, MAML1 e VIM, o marcador canônico do processo de EMT. O alvo direto para miR-450b, ME1, também está relacionado ao metabolismo energético. Até o momento, nossa análise verificou que o miRNAs miR- 450a e miR-450b-5p são comprovadamente relevantes para o processo tumorigênico de tumores epiteliais de ovário e agem como supressores tumorais principalmente pela regulação de genes que atuam no metabolismo energético. / Ovary cancer is the fifth largest cause of cancer-related deaths for women worldwide, with patients presenting extremely low 5-year survival rates. MicroRNAs (miRNAs), non-coding RNAs around 22 ribonucleotides long, play a critical role in gene expression regulation in virtually all biological processes. miRNAs induce gene silencing of their targets through translation repression or mRNA cleavage. We showed that miR-450a and miR-450b-5p, two functionally underexplored miRNAs in gynecologic tumors, were downregulated in ovarian cancer and cervical cancer cell lines. The aim of this work was to verify the hypothesis that both miR-450a and miR- 450b-5p display tumor suppressor functions in reproductive tissue cancers. For this purpose, we utilized in vitro assays and an in vivo xenographic model. Using a lentiviral expression vector, miR-450a and miR-450b-5p were stably overexpressed in A2780, OVCAR-3 and SKOV-3 (ovarian cancer cell lines) and C33 and SiHA (cervical cancer cell lines). The anoikis rate was analyzed in those cells submitted to low adherence plates for 24 hours: miR-450a overexpression resulted in lower viability in SiHa, OVCAR-3, A2780 and SKOV-3 cells. Regarding to cell proliferation, A2780 cells overexpressing miR-450a proliferated at higher rate compared to the control counterpart. However, these cells presented fewer but noticeable larger colonies at the clonogenic assay. On the other hand, miR-450b decreased the proliferation rate in SKOV-3, what was corroborated in the clonogenic assay, wherein the number of colonies were reduced at the same cell line. We also measured cell migration and invasion rates using transwell assays. Overexpression of miR-450a or miR-450b-5p resulted in higher migration potential of C33 cell line but lower migration and invasion rates in A2780 and SKOV3 cell lines. In OVCAR-3 cell line, miR-450a overexpression caused an increase in number of invaded cells and miR-450b-5p overexpressed cells migrated in higher number than control group. The overexpression of miR-450b-5p in SiHa cell line resulted in lower invasion potential compared to correspondent control group. After these in vitro experiments, we decided to continue our analysis only with A2780 and SKOV-3 cells, which had the most similar pattern. In the in vivo assay, transduced A2780 cells were injected intraperitoneally in 9-11 weeks immunodeficient mice and the weight of dissected tumors were compared after 4 weeks. In this in vivo xenographic model of ovarian cancer, we verified that both miRNAs impaired tumor growth, which corroborates our in vitro assays. We also verified that most of the direct targets found through PARCLIP technique validated in this work for miR-450a are related to energetic metabolism in mitochondria (TIMMDC1, ACO2, ATP5B) besides PAPSS1, CITED2, MAML1 and VIM, the canonical marker of EMT. The direct target for miR-450b, ME1, is also related to energetic metabolism. To date, our analysis points to the scenario of miR-450a and miR-450b-5p playing functions like tumor suppressors proven to be relevant to the tumorigenic process of ovarian epithelial tumors. Additionally, they do that mostly by regulating genes responsible by the energetic metabolism.

As algas pardas filamentosas (Phaeophyceae) constituem um grupo essencialmente marinho com morfologia extremamente simples. A identificação taxonômica dessas algas é bastante difícil quando empregados apenas caracteres morfológicos devido à grande plasticidade fenotípica que apresentam. No Brasil, nenhum estudo sistemático foi feito com seus representantes empregando-se dados moleculares. Neste contexto, a diversidade de algas pardas filamentosas dos gêneros Acinetospora, Asteronema, Bachelotia, Ectocarpus, Hincksia e Feldmannia foi investigada pela primeira vez no Brasil sob uma abordagem molecular, complementada com dados morfológicos. As coletas abrangeram a região sudeste do Brasil, incluindo a área de ressurgência dos litorais do Rio de Janeiro e Espírito Santo, que abriga quase que a totalidade de táxons de algas pardas filamentosas citadas para o país. Foi utilizado o marcador mitocondrial do tipo DNA Barcode, COI-5P e o marcador plastidial para inferências filogenéticas, o rbcL. Os estudos moleculares e morfológicos permitiram identificar 10 táxons para o litoral sudeste brasileiro: oito da ordem Ectocarpales: Acinetospora filamentosa, \"Feldmannia\" irregulares, \"Feldmannia irregulares\" 1, \"Feldmannia irregulares\" 2, \"Feldmannia\" mitchelliae, \"Hincksia\" conífera e Hincksia sandriana (família Acinetosporaceae) e Ectocarpus fasciculatus (família Ectocarpaceae) e dois da ordem Scytothamnales: \"Asteronema\" breviarticulatum (família Asteronemataceae) e Bachelotia antillarum (família Bachelotiaceae). A família Acinetosporaceae não é monofilética e se dividiu em dois agrupamentos, Acinetosporaceae 1, que incluiu a maioria dos representantes brasileiros e a espécie tipo da família, Acinetospora crinita, e para o qual o nome da família deve ser retido; e Acinetosporaceae 2, que incluiu os autênticos gêneros Feldmannia, Hincksia e Pylaiella com suas respectivas espécies-tipo, Feldmannia lebelli, Hincksia hincksiae e Pylaiella litorallis, respectivamente, e para o qual, uma nova família deverá ser proposta. Hincksia sandriana foi a única espécie estudada que se agrupou no clado do autêntico gênero Hincksia e é citada pela primeira vez para o Brasil, constituindo um caso de introdução recente. Para os demais representantes agrupados em Acinetosporaceae 1, excluindo Acinetospora, um novo gênero para a ciência deverá ser proposto. Os táxons \"H.\" conífera, \"F.\" irregulares, \"F. irregulares\" 1, \"F. irregulares\" 2 e \"F.\" mitchelliae não pertencem aos autênticos gêneros Feldmannia e Hincksia, já que não se agruparam com as respectivas espécies-tipo dos gêneros, e, portanto, devem ser transferidos para o novo gênero. As análises com os dois marcadores moleculares demonstraram que \"F.\" irregulares, \"F. irregulares\" 1 e \"F. irregulares\" 2, previamente citados sob uma única espécie (F. irregulares), representam três entidades taxonômicas independentes. Sequências do COI-5P de F. irregulares da Itália, considerada próxima à localidade tipo (Mar Adriático), confirmaram que parte do material analisado deve ser mantido sob o epíteto irregulares, enquanto duas novas espécies devem ser propostas para a ciência para acomodar \"F. irregulares\" 1 e \"F. irregulares\" 2. As análises moleculares com o COI-5P dividiu \"F.\" mitchelliae em três agrupamentos com alta divergência genética e variabilidade morfológica indicando que \"F.\" mitchelliae forma um complexo. Uma sequência de \"F.\" mitchelliae procedente dos EUA (Carolina do Norte), próxima à localidade tipo (Massachusetts), gerada no presente estudo, confirmou que o material brasileiro deve ser descrito sob o epíteto mitchelliae, porém acomodado sob um novo gênero. Nossos resultados moleculares demonstraram claramente que o gênero Acinetospora não é monofilético. Acinetospora filamentosa é citada pela primeira vez para o Oceano Atlântico e foi revelada por meio de dados moleculares, tanto pelo COI-5P quanto pelo rbcL. A espécie Acinetospora crinita referida previamente para o litoral sudeste do Brasil não foi recoletada neste estudo. Diferenças morfológicas nas estruturas pluriloculares entre as duas espécies e ausência de monosporângios em A. filamentosa, descritos como típico apenas para A. crinita, confirmaram a ocorrência de A. filamentosa para o Atlântico. Nossos resultados com o rbcL revelaram que a família Asteronemataceae não é monofilética. O táxon \"Asteronema\" breviarticulatum se agrupou com Asterocladon lobatum, espécie tipo do gênero, e deve ser alocado na família Asterocladaceae, assim como transferido para o gênero Asterocladon propondo-se uma combinação nova para resolver o posicionamento taxonômico dessa espécie. A alta divergência genética verificada para os marcadores COI-5P e rbcL demonstraram que Bachelotia antillarum é uma espécie críptica. A utilização da ferramenta molecular no estudo de algas pardas filamentosas na região sudeste do Brasil foi fundamental para desvendar a sua diversidade, que comprovadamente estava subestimada, assim como melhor delimitar seus gêneros e espécies e revelar espécies crípticas. Os dados aqui apresentados são pioneiros e constituem uma fonte relevante de informação sobre a taxonomia e sistemática deste grupo de algas pardas. Mais investigações por meio de uma ampla revisão, especialmente da família Acinetosporaceae, uma maior amostragem no litoral brasileiro e inclusão de mais gêneros de algas pardas filamentosas nas análises podem ainda mudar o panorama da classificação desse grupo / Filamentous brown algae (Phaeophyceae) constitute an essentially marine group that display an extremely simple morphology. The taxonomic identification of these algae is very difficult when based only on morphological characters, due to the high incidence of phenotypic plasticity. In Brazil, no systematic study using molecular data has investigated their representatives. In this context, this study aims to investigate the diversity of filamentous brown algae of the genera Acinetospora, Asteronema, Bachelotia, Ectocarpus, Hincksia and Feldmannia for the first time in Brazil, applying the molecular approach coupled with morphological data. The sampling sites covered the southeastern region of Brazil, including the upwelling area of the Rio de Janeiro and Espírito Santo coasts, which include almost all the filaments of brown algae mentioned for the country. The DNA barcode mitochondrial marker, COI-5P, and the plastid marker for phylogenetic inferences, rbcL, were sequenced. The molecular and morphological studies allowed the recognition of 10 taxa on the Brazilian southeastern coast, out of which eight taxa correspond to the order Ectocarpales, and two to the order Scytothamnales. Ectocarpales is represented by the families Acinetosporaceae (Acinetospora filamentosa, \"Feldmannia\" irregularis, \"Feldmannia irregularis\" 1, \"Feldmannia irregularis\" 2, \"Feldmannia\" mitchelliae, \"Hincksia\" conifer and Hincksia sandriana), and Ectocarpaceae (Ectocarpus fasciculatus). The order Scytothamnales, in turn, includes the families Asteronemataceae (\"Asteronema\" breviarticulatum) and Bachelotiaceae (Bachelotia antillarum) The Acinetosporaceae family is non-monophyletic and was divided into two clusters: Acinetosporaceae 1 for which the family name should be retained, included the type species of the family (Acinetospora crinite) and most of the Brazilian representatives; and Acinetosporaceae 2 for which a new family should be proposed, included the genera Feldmannia, Hincksia and Pylaiella represented by their respective type species, Feldmannia lebelli, Hincksia hincksiae and Pylaiella litorallis. Hincksia sandriana was the only species studied that grouped in the clade of the authentic genus Hincksia. Besides, this is the first record of H. sandriana for Brazil, which constitutes a case of recent introduction. For the other representatives of Acinetosporaceae 1, except Acinetospora, a new genus for science should be proposed. The taxa \"H.\" conifer, \"F.\" irregularis, \"F. irregularis\" 1, \"F. irregularis\" 2 and \"F.\" mitchelliae do not belong to the authentic genera Feldmannia and Hincksia, since they did not group with the respective generitypes. Therefore, should be transferred to the new genus. Analyzes applying both molecular markers showed that \"F.\" irregularis, \"F. irregularis\" 1 and \"F. irregularis\" 2, previously cited as a single species (F. irregularis), constitute three independent taxonomic entities. COI-5P sequences of F. irregularis from Italy, close to the type locality (Adriatic Sea), demonstrate that part of the analyzed material should be maintained under the epithet irregularis, whereas two new scientific species should be proposed to accommodate \"F. irregularis \"1 and \" F. irregularis \"2. COI-5P molecular analyzes divided \"F.\" mitchelliae into three clusters with high genetic divergence and morphological variability indicating that \"F.\" mitchelliae corresponds to a species complex. A sequence of \"F. mitchelliae from the United States (North Carolina), near the type locality (Massachusetts), obtained and included in the present study, confirmed that the Brazilian material should be described under the epithet mitchelliae and transferred to a new genus. Our molecular results have clearly demonstrated that the genus Acinetospora is non-monophyletic. Acinetospora filamentosa is for the first time mentioned for the Atlantic Ocean and was revealed by molecular data, both by COI-5P and rbcL. The species Acinetospora crinite recorded on the southeastern coast of Brazil was not collected in this study. Morphological differences in plurilocular structures between two species and absence of monosporangia in A. filamentosa, described as typical only for A. crinite, confirmed the occurrence of A. filamentosa for the Atlantic. Our results with the rbcL revealed that the family Asteronemataceae is non-monophyletic. \"Asteronema\" breviarticulatum was grouped with Asterocladon lobatum, the type species of the genus, and should be transferred to the genus Asterocladon and to the family Asterocladaceae. Consequently, a new combination should be proposed to solve taxonomic placement of this species. The high genetic divergence observed for the COI-5P and rbcL markers demonstrated that Bachelotia antillarum is a cryptic species. The use of the molecular tool in the study of filamentous brown algae in the southeastern region of Brazil was fundamental to uncover their diversity, previously underestimated, as well as to allow a better delimitation of their genera and species. The innovative data presented here constitute a relevant source of information to the taxonomy and systematics of filamentous brown algae. More investigations through a broad review, especially of the Acinetosporaceae family, a wider sampling in the Brazilian coast and the inclusion of more genera of filamentous brown algae in the analyses can still change the classification scenario of this group

Background: Acute kidney injury (AKI) is a highly prevalent clinical disorder with significant mortality and no current treatment. The Burns Lab has previously shown that endothelial colony forming cells (ECFCs) release exosomes highly enriched in pro-survival micro-RNA-486-5p. In our mouse model of AKI, intravenous (i.v.) injection of ECFCs or their exosomes protects against kidney ischemic injury, associated with reduction in PTEN, a target of miR-486-5p. Mechanisms mediating recruitment and retention of exosomes are unclear. The interaction of CXC chemokine receptor type 4 (CXCR4) with stromal cell-derived factor (SDF)-1α promotes ECFC adhesion and migration in hypoxic endothelial cells. Whether exosomal miR-486-5p is critical to the prevention of ischemic injury is unclear. The current study aimed to investigate biodistribution and targeting mechanisms of ECFC-derived exosomes, to investigate the delivery and therapeutic potential of miR-486-5p alone, and to determine whether sex differences alter the treatment efficacy. Methods: ECFC-derived exosomes were isolated from cultured media by differential centrifugation and characterized using nanoparticle tracking analysis and immunoblot. Kidney ischemic injury was induced in male and female FVB mice by bilateral renal vascular clamping (30 min). Exosomes (20 µg) or Invivofectamine-mimic complex containing miR-486-5p (1mg/kg) were injected at the start of kidney reperfusion via tail vein. Organs were removed and assays were performed to identify structure and function. In vitro cell studies were also used when necessary. Results: ECFC-derived exosomes preferentially target the ischemic kidney, its endothelium and tubular epithelium, which correlates with increases in miR-486-5p. The transfer of exosomes may be mediated by macropinocytosis by target cells. The SDF-1α/CXCR4 axis plays a role in targeting exosomes to the site of injury. miR-486-5p alone has a similar therapeutic efficacy in preventing ischemia/reperfusion injury as ECFC-exosomes in the mouse model of AKI. Both male and female mice respond to both therapies, however female mice are protected against ischemia reperfusion injury. Conclusions: These results suggest that the protective effects of ECFCs or their exosomes in ischemic AKI may be largely mediated by pro-survival miR-486-5p. These data provide further support for the promising therapeutic potential of ECFC-derived exosomes and miR-486-5p in human AKI.

none

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第22343号 / 医博第4584号 / 新制||医||1042(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 武藤 学, 教授 妹尾 浩, 教授 佐藤 俊哉 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第18856号 / 医博第3967号 / 新制||医||1007(附属図書館) / 31807 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 野田 亮, 教授 小川 誠司, 教授 松田 道行 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

As neoplasias induzidas pela forma oncogênica da KRAS são doenças muito comuns, para as quais não existem terapias efetivas. Uma inibição direta da KRAS falhou em ensaios clínicos e esforços intensos tem sido feitos para identificar alvos de KRAS importantes para a oncogênese. Uma via promissora regulada por KRAS, que tem sido pouco explora a é a via dos microRNAs (miRNAs). Nossa meta foi identificar miRNAs regulados pela KRAS em células pulmonares e pancreáticas, que possam contribuir para o fenótipo oncogênico. Para alcançar esta meta nós usamos duas abordagens: (1) Nós investigamos o miRNA 486-5p como um alvo de KRAS em câncer de pâncreas e de pulmão. A expressão deste miRNA havia sido correlacionada positivamente com a presença de mutações em KRAS em pacientes portadores de câncer de cólon; (2) Nós usamos uma plataforma de microarranjo para identificar miRNAs diferencialmente expressos entre células humanas primárias imortalizadas pulmonares ou pancreáticas e suas linhagens isogênicas transformadas por KRAS. Na primeira abordagem, conseguimos mostrar que a expressão do miRNA 486-5p está correlacionada ao status de KRAS em células primárias pulmonares, mas não em células primárias pancreáticas. Além disso, geramos células pulmonares tanto com ganho e perda de função de KRAS e demonstramos que KRAS regula a expressão do miRNA 486-5p. Também de terminamos uma correlação negativa entre a expressão de KRAS e a expressão do alvo do miRNA 486-5p FoxO1, um supressor tumoral. Para avaliar como o miRNA 486-5p afeta as propriedades oncogênicas induzidas por KRAS, nós transfectamos oligonucleotídeos inibitórios para o miRNA 486-5p em células pulmonares positivas para mutações em KRAS. A inibição da expressão do miRNA 486-5p levou a uma redução da clonogenicidade e viabilidade celulares. Esta redução não está associada a um aumento de morte celular, mas a uma redução da proliferação celular. Interessantemente, a transfecção de oligonucleotídeos mímicos do miRNA 486-5p em células pulmonares negativas para mutações em KRAS ou em células com perda de função de KRAS por RNAi levou a um aumento da proliferação e clonogenicidade. Estes dados indicam que o miRNA 486-5p, não só é um alvo de KRAS em câncer de pulmão, mas também age como um oncomiR contribuindo para a proliferação celular induzida por KRAS. Na nossa segunda abordagem, nós identificamos 17 miRNAs com expressão aumentada e 3 com expressão diminuída em células primárias pancreáticas expressando KRAS oncogênica. Destes, 9 miRNAs foram foram também identificados por metanálise de dados de microarranjo publicados comparando amostras tumorais pancreáticas com amostras não tumorais. Apesar do experimento de microarranjo com as linhagens primárias pulmonares não ter produzido resultados estatisticamente significativos após a correção por FDR, uma tendência à expressão diferencial foi observada para vários miRNAs e nós validamos por qPCR a expressão diferencial dos miRNAs 720 e 139-3p. Em conclusão, nós conseguimos identificar miRNAs regulados pela KRAS tanto em células pulmonares, quanto pancreáticas. Um melhor entendimento das suas funções biológicas, bem como dos alvos por eles regulados nestes contextos, pode revelar novas vias para a exploração terapêutica. / KRAS-induced lung cancer is a very common disease, for which there are currently no effective therapies. Direct targeting of KRAS has failed in clinical trials and intense efforts are underway to identify KRAS targets that play a crucial role in oncogenesis. One promising KRAS-regulated pathway that has so far been overlooked is the micro RNA (miRNA) pathway. Our goal was to identify miRNAs regulated by oncogenic KRAS in lung and pancreatic cells that could contribute to the oncogenic phenotype. In order to achieve this goal we used two different approaches: (1) We investigated miRNA 486-5p as a KRAS target in lung and pancreatic cancer. The expression of this miRNA had been correlated to the presence of KRAS mutations in colon cancer patients; (2) we used a microarray platform to identify differentially expressed miRNAs between immortalized human primary pulmonary or pancreatic epithelial cell lines and their isogenic K-Ras-transformed counterparts. In our first approach, we were able to show that mi486-5p expression correlates with KRAS status in lung primary cells, but not in pancreatic primary cells. Furthermore, we generated lung cancer cells with either gain-of-function or loss-of-function of KRAS and demonstrated that KRAS regulates miRNA 486-5p in these cells. We also found, in all lung cell models analyzed, a negative correlation between expression of KRAS and expression of miR-486-5p target FoxO1, a tumor suppressor. In order to evaluate how miR-486-5p affects KRAS-induced oncogenic properties, we transfected miR-486-5p inhibitor oligonucleotides into KRAS-positive lung cancer cell lines. Inhibition of miR-486-5p expression leads to reduced clonogenic growth and viability. This reduction is not associated with increased cell death, but with decreased cell proliferation. Interestingly, transfection of miR-486-5p double-stranded RNA mimic oligonucleotides in to KRAS negative lung cancer cell lines or into cells with loss-of-function of KRAS by RNAi leads to enhanced proliferation and clonogenicity. These results indicate, not only that miR-486-5p is a KRAS target in lung cancer, but also that miR-486-5p acts as an oncomiR contributing to KRAS-induced cell proliferation. In our second approach, we identified 17 upregulated microRNAs and 3 downregulated microRNAs in the primary pancreatic cell line expressing KRAS. Of these, 9 miRNAs were also identified by a metanalysis of published microarray datasets comparing pancreatic cancer patient samples to non-cancerous pancreatic tissues. Even though our array experiment in the primary pulmonary cells did not produce statistically significant results after FDR correction, differential expression trends were seen for many miRNAs and we validated miRNAs 720 and 139-3p as differentially expressed. In conclusion we were able to identify miRNAs regulated by KRAS both in lung and pancreatic cancer cells. Further understanding of their biological function, as well as the targets they regulate in these settings, could uncover novel pathways for therapy design.

O gênero Hypnea Lamouroux (1813) e particularmente a espécie H. musciformis (Wulfen) J.V.Lamouroux apresentam grande importância ecológica e econômica como matéria prima para a produção de carragenana, com ampla distribuição geográfica em águas tropicais e sub-tropicais ao redor do mundo. No entanto, a identificação das espécies de Hypnea com base apenas em dados morfológicos é dificultada devido à plasticidade fenotípica presente neste grupo e sua morfologia relativamente simples. Em vista disso, diversas ferramentas de estudo para delimitar espécies dentro do gênero e sua distribuição geográfica foram utilizados neste trabalho, para testar duas hipóteses principais: 1) Hypnea musciformis forma um complexo de espécies proximamente relacionadas, mas com distribuição geográfica distinta e 2) Os variantes morfológicos \"musciformis\" e \"nigrescens\" de H. pseudomusciformis que ocorrem na costa Brasileira correspondem a uma única espécie biológica. Com base em marcadores moleculares e análises morfológicas, confirmamos a ocorrência de nove espécies diferentes na costa do Brasil: H. brasiliensis, H. cervicornis, H. edeniana, H. flava, H. pseudomusciformis, H. platyclada, H. spinella, H. yokoyana e H. wynnei. E duas espécies não descritas, Hypnea sp.1 e Hypnea sp2. Além disso, dados de cruzamento com linhagens distintas de H. pseudomusciformis indicam a separação em duas espécies, sendo H. pseudomusciformis restrita ao Sudeste e Sul do país e H. sp. 5 restrita ao Nordeste, elevando o número total de espécies do país para 12. Análises filogeográficas mostram que H. musciformis possui distribuição ao longo do Hemisfério Norte, enquanto que H. pseudomusciformis possui distribuição ao longo do Hemisfério Sul. Além disso, foram detectados fortes padrões de estrutura genética e foram reconhecidas distintas zonas filogeográficas marinhas: a província do Uruguai, a província do sul do Brasil, a província do Rio de Janeiro, a província do leste do Brasil e a província do norte do Brasil. O grau de isolamento genético e distinção entre essas províncias variou consideravelmente. A maior diversidade genética foi encontrada na região de ressurgencia de Cabo Frio, no estado do Rio de Janeiro, uma região conhecida pela presença de um número diversificado de habitats microclimáticos distintos. Esses resultados corroboram a hipótese 1. Para testar a hipótese 2, foram coletados indivíduos das duas variantes morfológicas de H. pseudomusciformis, \"musciformis\" e \"nigrescens\" que foram cultivados in vitro nas mesmas condições. O histórico de vida de ambas as variantes morfológicas foi completado em aproximadamente 121 dias. Quando cultivados in vitro, as diferenças morfológicas entre as variantes \"musciformis\" e \"nigrescens\" foram atenuadas. O conteúdo de pigmentos fotossintetizantes (clorofila a, carotenóides e ficobiliproteínas), proteínas solúveis totais e capacidade antioxidante (DPPH, ABTS, capacidade de redução de Folin-Ciocalteu, FRAP e capacidade de quelação de ferro) também foram analisados para amostras dessas duas variantes morfológicas coletadas no campo e cultivadas in vitro. A variação \"nigrescens\" coletada no campo apresentou mais ficobiliproteínas, proteínas solúveis totais e apresentou maior atividade antioxidante para os ensaios ABTS e Folin-Ciocalteu do que a variação \"musciformis\". As amostras em cultura de ambas as variações morfológicas não mostraram diferenças significativas nos pigmentos e atividade antioxidante, exceto para aloficocianina, que foi maior em \"musciformis\". Estes dados indicam que as diferenças encontradas entre \"musciformis\" e \"nigrescens\" são principalmente devidas a pressões ambientais e representam um exemplo de plasticidade fenotípica. Além disso, foram realizados experimentos de cruzamento in vitro entre gametófitos de \"musciformis\" e \"nigrescens\". Esses cruzamentos resultaram na formação de cistocarpos, que após a liberação dos esporos, originaram novos tetrasporófitos, que posteriormente ficaram férteis liberando tetrásporos que se desenvolveram em novos gametófitos, confirmando os dados moleculares que mostram que essas variantes pertencem à mesma espécie biológica, corroborando a hipótese 2 / The genus Hypnea Lamouroux (1813) and particularly H. musciformis (Wulfen) J.V.Lamouroux present great economic and ecological importance as source for the production of carrageenan, with a wide geographic distribution in tropical and sub-tropical waters around the world. However, the identification of Hypnea species based only on morphological data is hampered by phenotypic plasticity and its relatively simple morphology. In this work, several approaches were used to study species of the genus Hypnea, based on two hypothesis: 1) The species H. musciformis is a complex of closely related species, but with a distinct geographic distribution. 2) The morphological variants \"musciformis\" and \"nigrescens\" of H. pseudomusciformis occurring on the Brazilian coast correspond to a single biological species. Based on DNA barcode molecular markers and morphological analyzes, we confirmed the occurrence of nine different species for the genus Hypnea on the coast of Brazil: H. brasiliensis, H. cervicornis, H. edeniana, H. flava, H. pseudomusciformis, H. platyclada, H. spinella, H. yokoyana and H. wynnei. And two undescribed species, H. sp.1 and H. sp2. In addition, cross-breeding tests were made within two linaeges of H. pseudomusciformis , the resultus indicate the segregation in two distint species, with H. pseudomusciformis restrict to Southeast and South of the country and H. sp. 5 to Northeast, elevating the total number of species to 12. Phylogeographic analyzes show that H. musciformis is distributed in the Northern Hemisphere of the planet, while H. pseudomusciformis is distributed in the Southern Hemisphere. In addition, strong patterns of genetic structure were detected and distinct marine phytogeographic zones were recognized: the province of Uruguay, the province of southern Brazil, the province of Rio de Janeiro, the province of eastern Brazil and the province of northern Brazil. The degree of genetic isolation and distinction between these provinces varied considerably. The greatest genetic diversity was found in Cabo Frio, in the state of Rio de Janeiro, a upwelling region known for the presence of a diverse number of distinct microclimatic habitats. These results corroborate hypothesis 1. To test hypothesis 2, individuals of the two morphological variants of H. pseudomusciformis, \"musciformis\" and \"nigrescens\" were collected and kept under the same in vitro culture conditions. The life history of both morphological variants was completed in approximately 121 days. When cultured in vitro, the morphological differences between the \"musciformis\" and \"nigrescens\" variants were attenuated. The content of photosynthetic pigments (chlorophyll a, carotenoids and phycobiliproteins), total soluble proteins and antioxidant capacity (DPPH, ABTS, reduction capacity of Folin-Ciocalteu, FRAP and iron chelation capacity) were also analyzed for samples of these two morphological variants collected in the field and from in vitro cultures. The \"nigrescens\" variation collected in the field showed more phycobiliproteins, total soluble proteins and presented greater antioxidant activity for ABTS and Folin-Ciocalteu than the \"musciformis\" variation. Samples maintained in vitro of both morphological variations did not show significant differences in pigment and antioxidant activity, except for allophycocyanin, which was higher in \"musciformis\". These data indicate that the differences found between \"musciformis\" and \"nigrescens\" are due to environmental pressures and represent an example of phenotypic plasticity. In addition, in vitro crossing experiments were performed between gametophytes of \"musciformis\" and \"nigrescens\". These crossings generated cystocarps and, after the spores were released, new tetrasporophytes were observed, which later produced tetraspores that germinated forming new gametophytes, confirming the molecular data that show that these variants belong to the same biological species, corroborating the hypothesis 2

Le gène Egfl7 codant une protéine majoritairement sécrétée par les cellules endothéliales a été découvert au sein du laboratoire. Ce gène a la particularité d’héberger dans sa séquence intronique deux microARNs complémentaires nommés miR126-3p et miR-126-5p. Les microARNs sont de petites séquences de 20 à 25 nucléotides régulant l’expression de leurs cibles en se fixant sur leurs ARNm pour induire leur dégradation ou l’inhibition de leur traduction. L’expression endothéliale et les fonctions du microARN miR126-3p (microARN principal du duplex miR126-3p/126-5p) ont déjà été très largement abordées alors que celles de miR126-5p (microARN secondaire du duplex) restent inconnues. Les objectifs de notre étude ont donc été d’établir le patron d’expression de miR-126-5p lors du développement vasculaire et de caractériser ses fonctions dans les cellules endothéliales. Par hybridation in situ, miR-126-5p a été détecté dans les vaisseaux sanguins embryonnaires de souris principalement dans les cellules endothéliales. Cette spécificité endothéliale a été retrouvée dans différents organes tels que le cœur et les poumons et est maintenue in vitro. L’inhibition et la surexpression de miR-126-5p dans des cellules endothéliales veineuses (HUVEC) in vitro n’affectent pas les capacités de prolifération, de migration ou d’organisation en pseudocapillaires de ces cellules. En revanche, l’inhibition de miR-126-5p dans les HUVECs entraine une répression de l’adhérence des leucocytes à la surface d’un tapis de cellules endothéliales ainsi qu’une augmentation de la transmigration de monocytes à travers une monocouche endothéliale. A l’inverse, sa surexpression génère des phénotypes opposés. Des analyses in silico de recherche de cibles pour miR-126-5p en lien avec le recrutement leucocytaire ont permis d’identifier une protéine participant à la transmigration des leucocytes in vitro et in vivo nommée ALCAM. A l’aide de test de transactivation, nous avons pu démontrer que miR-126-5p était capable de se fixer au 3’UTR de l’ARNm d’ALCAM afin de réprimer l’expression de la protéine. De plus, l’augmentation de la transmigration induite par la chute d’expression de miR-126-5p dans les cellules endothéliales est inhibée suite au blocage direct de la protéine ALCAM montrant ainsi que l’effet répresseur de miR-126-5p sur ce mécanisme est établi via ALCAM. Une étude par microarray, réalisée sur des HUVECs où miR-126-5p a été inhibé, a permis d’identifier une seconde cible pour miR-126-5p nommée SetD5 pour laquelle aucune fonction n’est connue à ce jour. Des tests de transactivation ont permis de confirmer que SetD5 était une cible de miR-126-5p. De plus, l’effet de miR-126-5p sur l’adhérence des leucocytes aux cellules endothéliales est directement lié à la modulation d’expression de ce gène. Enfin, l’analyse de l’inhibition de miR-126-5p in vivo a permis de montrer que notre microARN d’intérêt contrôle effectivement les expressions d’ALCAM et de SetD5. Cependant, alors que miR-126-5p régule uniquement l’expression d’ALCAM dans les poumons, celle de SetD5 est sous le contrôle de miR-126-5p dans la rétine.Nos travaux ont donc permis de mettre en évidence l’expression endothéliale de miR-126-5p et d’identifier deux de ses cibles lui permettant de jouer un rôle dans le recrutement des leucocytes au niveau de l’endothélium. / The Egfl7 gene which was identified within the laboratory codes for a protein mainly secreted by endothelial cells. This gene harbors in its intronic sequence two complementary microRNAs named miR-126-3p and miR-126-5p. MicroRNAs are 20-25 nucleotides-long non coding RNAs which repress protein expression through binding to a complementary sequence of their target mRNAs, leading to mRNA degradation or translation inhibition. Endothelial expression and functions of miR-126-3p (The main miRNAs of the miR-126-3p/miR-126-5p duplex) was widely described while those of miR-126-5p remain unknown. The goal of our study was to establish the expression of miR-126-5p during the vascular development and to characterize its functions in endothelial cells. By in situ hybridization, miR-126-5p was detected in mouse embryonic vessels mainly in endothelial cells. This miR-126-5p endothelial specific expression was also found in different organs such as in the heart or lungs and is maintained in vitro. The inhibition and overexpression of miR-126-5p in vein endothelial cells (HUVECs) did not affect HUVECs proliferation, neither their migration nor their ability to form pseudocapillaries in vitro. On the other hand, miR-126-5p inhibition in HUVEC led to a repression of leukocyte adhesion onto endothelial cells as well as an increase of leukocyte transmigration across an endothelial cell monolayer. Interestingly, opposite phenotypes were observed after miR-126-5p overexpression. In silico analyses of miR-126-5p targets led to identify ALCAM as a potential mRNA transcript that could be regulated by miR-126-5p and which was already involved in leukocyte transmigration in vitro and in vivo. By transactivation assays, we showed that miR-126-5p was able to bind the 3’UTR of ALCAM mRNA and to repress ALCAM protein expression. Furthermore, endothelial cell treatment with an ALCAM blocking antibody abolished the effect of miR-126-5p inhibition on leukocyte transmigration indicating that miR-126-5p controls this process via ALCAM. A microarray analysis performed on HUVEC after miR-126-5p inhibition allowed the identification of another target for miR-126-5p named SetD5, a gene with unknown function. Transactivation assays confirmed that SetD5 is a target for miR126-5p. Furthermore, we showed that miR-126-5p controls leukocyte adhesion onto endothelial cells by regulating SetD5 expression. Finally, the inhibition of miR-126-5p in vivo demonstrated that miR-126-5p controls ALCAM and SetD5 expression in mouse. However, while miR-126-5p exclusively regulates ALCAM expression in lungs, SetD5 expression is controlled by miR-126-5p in the retina.In this study, we demonstrated that miR-126-5p is a functional microRNA expressed in endothelial cells. We identified two targets for this microRNA indicating that miR-126-5p participates in the control of leukocyte trafficking onto endothelial cells.