Chemokine-induced macrophage recruitment into the vascular wall is an early pathological event in the progression of atherosclerosis. Macrophage activation and chemotaxis during cell recruitment are mediated by chemokine ligation of multiple G- protein coupled receptors. The Regulator of G-Protein Signalling-l (RGS-l) acts to down-regulate the response to sustained chemokine stimulation. Studies in this laboratory have shown Rgsl is up-regulated in atherosclerotic ApoE1- mice in association with atherosclerotic plaque progression and published findings have reported that RGS 1 is highly expressed in leukocytes. However an in vivo role for RGS-l in macrophage function or in atherosclerosis has not been investigated. This thesis aimed to address the hypothesis that RGS 1 has an important role in atherosclerosis and modulates the inflammatory response by controlling chemokine signalling and macrophage chemotaxis to atherosclerotic plaques. To investigate the role of RGS 1 in macrophage function and the development of atherosclerosis, Rgsrl- mice were characterised on the ApoE1- background. Flow cytometric analysis of leukocytes in blood, spleen and bone marrow indicated Rgsrl- ApoE1- mice had no significant differences in the numbers of monocytes or lymphocytes compared to ApoE1- mice. Rgsl was found to be highly expressed in macrophages from ApoE1- mice compared to B-Iymphocytes, where it has a non-redundant role, and other cells involved in plaque formation. Furthermore, Rgsl is up-regulated with monocyte- macrophage activation by innate stimuli. For the first time, RGS 1 'was shown to affect chemokine receptor signalling in macrophages in vitro. RgsrlApoE1- macrophages showed significantly enhanced chemotaxis to CCL2, CCL3 and CCLS and impaired homologous desensitisation to the chemokine CCLS in comparison to ApoE1- cells. To determine the role of RGS-l in leukocyte trafficking and atherosclerosis, a detailed atherosclerosis study was carried out. RgsrlApoE1- mice had significantly less lesion formation in the aortic roots at 9-weeks and in the aorta at 16-weeks on a chow diet in comparison to ApoE1- mice. This was accompanied with decreased macrophage content in the aortic root at 9-weeks. To further investigate aortic leukocyte recruitment, an Angiotensin IT-induced model of acute vascular inflammation was used. At 9 weeks of age, Rgsrl-ApoE1- mice had significantly less aortic CD4S+ leukocytes and cons' myeloid cells recruited to the aorta in comparison to ApoE1- mice. Collectively, these findings identify a new role for RGS-l in macrophage function and support a role for RGS-l in leukocyte recruitment and retention in the initial stages of atherosclerotic plaque formation. These results identify RGS 1 as a novel target for the treatment of acute vascular inflammation and early atherosclerosis.

Η τεστοστερόνη έχει πολυεπίπεδη αναβολική και ανδρογόνο δράση. Τα τελευταία χρόνια η άποψη ότι συμβάλει στην αύξηση της αθηρωμάτωσης, η οποία οδηγεί σε καρδιαγγειακά συμβάματα στο ανδρικό φύλο, άρχισε να κλονίζεται. Διάφορες μελέτες καταδεικνύουν ότι βασικές μεταβολικές παράμετροι που επηρεάζουν την εξέλιξη της αθηρωμάτωσης, όπως είναι το λιπιδαιμικό προφίλ και το βάρος μεταβάλλονται δυσμενώς με την πτώση των επιπέδων της τεστοστερόνης και αποκαθίστανται με την επάνοδο των επιπέδων της στο φυσιολογικό. Τα αποτελέσματα αυτών των ερευνών είναι όμως πολλές φορές αντιφατικά μεταξύ τους. Σημαντικό στοιχείο του συστήματος των λιπιδίων αποτελούν οι λιποπρωτεΐνες LDL και HDL καθώς και η απολιποπρωτεΐνη Ε και οι νυποδοχείς της LDL οι οποίοι είναι απαραίτητοι στην κάθαρση των LDL σωματιδίων στο ήπαρ. Στόχος της εργασίας αυτής ήταν η περαιτέρω διευκρίνιση του ρόλου της τεστοστερόνης σε βασικούς μεταβολικούς παράγοντες που εξελίσσουν την αθηρωματική διαδικασία. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν τρεις ομάδες μυών: μία με εξάλειψη του γονιδίου της ApoE (ApoE-/- ), μία με εξάλειψη του γονιδίου του υποδοχέα της LDL (LDLr-/- ) και μία αγρίου τύπου C57BL6. Οι μισοί μύες υπέστησαν ορχεκτομή και οι άλλοι μισοί ψευδοχειρουργείο και τέθηκαν σε δίαιτα δυτικού τύπου για 12 εβδομάδες. Οι LDLr-/- ορχεκτομηθέντες μύες είχαν σημαντικά μικρότερο ξηρό βάρος και λίπος από την ομάδα ελέγχου (9.1±0.9gr. και 19.0±1.4gr ξηρού βάρους καθώς και 8.8±0.9gr και 3.4±0.4gr λίπους αντίστοιχα ). Επιπλέον στους LDLr-/- μύες η δοκιμασία ανοχής γλυκόζης έδειξε χειρότερο γλυχαιμικό έλεγχο στην ομάδα ελέγχου αντίθετα με ότι συνέβαινε με την ομάδα των C57BL6. Παρεμφερής εικόνα υπήρξε και από τα τριγλυκερίδια του πλάσματος τα οποία ήταν αυξημένα στην ομάδα ελέγχου των LDLr-/- αντίθετα με τις ομάδες των ApoE-/- και C57BL6 στις οποίες δεν παρατηρήθηκε διαφορά. Τα ευρήματα αυτά καταδεικνύουν τον καθοριστικό ρόλο της τεστοστερόνης στην αύξηση του βάρους και την συνακόλουθη υπερτριγλυκεριδαιμία και διαταραχή στη δοκιμασία ανοχής γλυκόζης σε μύες LDLr-/-. Ειδικότερα, μπορεί να γίνει η υπόθεση ότι η παρουσία της τεστοστερόνης εξασφαλίζει ένα εναλλακτικό μοριακό μονοπάτι αναγκαίο για την αύξηση του βάρους σε LDLr-/- μύες. / Testosterone exhibits multiple anabolic and virilizing functions. Recently the classical view that testosterone contributes to the progression of atherosclerosis which leads to cardiovascular events is being doubted. Various studies have shown that a number of basic metabolic parameters affecting the progress of atherosclerosis such as blood lipid levels and body weight are deteriorated with the decrease of testosterone levels and restored after testosterone levels become normal again. Many of these studies provide contradicting results. The LDL and HDL lipoproteins constitute an important component to the lipid system as well as the Apolipoprotein E and the LDL receptors which are indispensable for the process of the LDL particle removal from circulation through the liver. The aim of this study was to further delineate the role of testosterone in affecting key metabolic parameters which in turn interfere with the rate of atherosclerosis progression. To achieve that, three groups of 10 mice each, were used: wild type C57BL6, ApoE deficient (ApoE-/-) and LDLr deficient (LDLr-/-). Half the mice were orchectomized and the rest were sham operated. After a four week recovery period the mice were fed western type diet. LDLr-/- orchectomized mice had significantly lower dry mass and body fat than the control group (9.1±0.9gr. και 19.0±1.4gr of dry mass and 8.8±0.9gr and 3.4±0.4gr of body fat respectively). Furthermore, glucose tolerance test revealed impaired control in the LDLr-/- control group contrary to what happened with the orchectomized LDLr-/- and C57BL6 mice. Likewise, triglyceride plasma levels were elevated in the LDLr-/- control group in contrast to their ApoE-/- and C57BL6 and, LDLr-/-orchectomized counterparts whose levels did not deviate significantly from their basal state. These findings underline the crucial role testosterone plays in hyperlipedaemia, weight gain and glucose tolerance. Specifically, testosterone seems to provide an alternative molecular route which is crucial for weight gain in LDLr-/- mice.

Atherosclerosis is a disease of cardiovascular system and is usually located within large arteries. It is a major cause of death and mortality and it is related to over 12 million deaths annually affecting nearly all people in the modern world. It is a disease that involves the circulation of low density lipoproteins –LDLs (a main carrier of cholesterol) within the blood stream. These eventually accumulate in the cell wall of large and medium sized arteries to form plaques or atherosclerotic patches gradually narrow the lumen and gradually become the site of bleeding and thrombus formation. It is well known that atherosclerotic lesions in the arterial wall develop at certain sites in the human arterial system such as along the inner walls of curved segments and the outer walls of arterial bifurcations. This phenomenon is called the localization of atherosclerosis. As the early event leading to the genesis of atherosclerosis is the accumulation of atherogenic lipids such as low density lipoproteins (LDLs) within the arterial wall, mass transport between the blood and the artery wall must play an important role in the genesis and development of atherosclerosis. In the present study we investigate the correlation of luminal surface LDL concentration (cw) distribution with the distribution of wall shear stress (WSS) and the effects of both non – Newtonian behavior and pulsation of blood flow on the distributions of luminal surface LDL concentration along the wall of the human aorta. The dependence of viscosity and diffusivity and the local density are incorporated in the single and two phase flow models rendering these quantities position dependent. Then we compared the predictions of a single phase model with those of the two phases one under both steady flow and realistic pulsatile flow conditions using a human aorta model constructed from CT images. Then local hemodynamics studied by using computational fluid-dynamics (CFD) applied to realistic geometric model of the aorta. It is therefore important to solve the problem of accurately reconstructing geometric models from CT image in order to gain accuracy in CFD computations and predictions. The present numerical study revealed an adverse correlation between wall shear stress and the luminal surface LDL concentration in the aorta. The results indicate that the luminal surface LDL concentration depends not only on the local wall shear stress but also on both the global and local flow patterns. Also the results showed that under steady flow conditions, although the shear thinning non – Newtonian nature of blood could elevate wall shear stress (WSS) in most regions of the aorta, especially in areas with low wall shear stress, it had little effect on luminal surface LDL concentration (cw) in most regions of the aorta. Nevertheless, it could significantly enhance cw in areas with high luminal surface LDL concentration through the shear depended diffusivity of LDLs. The pulsation of blood flow could significantly reduce cw in these disturbed places. In conclusion the shear shining non – Newtonian nature of blood has little effect on LDL transport in most regions of the aorta, but in the atherogenic – prone areas where luminal surface LDL concentration is high its effect is apparent. Similar is the effect of pulsatile flow on the transport of LDLs. / Η αθηροσκλήρωση είναι μία νόσος του καρδιαγγειακού συστήματος και βρίσκεται συνήθως μέσα σε μεγάλες αρτηρίες. Πρόκειται για μια σημαντική αιτία θανάτου και η θνησιμότητα της σχετίζεται με πάνω από 12 εκατομμύρια θανάτους ετησίως, η οποία επηρεάζει σχεδόν όλους τους ανθρώπους στο σύγχρονο κόσμο. Είναι μια ασθένεια που περιλαμβάνει την κυκλοφορία των χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών-LDLs (ένας κύριος φορέας της χοληστερόλης) εντός της κυκλοφορίας του αίματος. Η χαμηλής πυκνότητας πρωτεΐνες συσσωρεύονται στο αρτηριακό τοίχωμα των μεγάλων και μεσαίου μεγέθους αρτηριών και σχηματίζουν πλάκες ή αθηρωματικά μπαλώματα, τα οποία σταδιακά προκαλούν στένωση του αυλού και έπειτα δημιουργείται αιμορραγία στη περιοχή, με αποτέλεσμα το σχηματισμό θρόμβων. Είναι γνωστό ότι οι αθηροσκληρωτικές βλάβες στο αρτηριακό τοίχωμα αναπτύσσονται σε συγκεκριμένες περιοχές στο ανθρώπινο αρτηριακό σύστημα, όπως κατά μήκος των εσωτερικών τοιχωμάτων των καμπυλωτών τμημάτων και των εξωτερικών τοιχωμάτων των αρτηριακών διακλαδώσεων. Αυτό το φαινόμενο ονομάζεται localization of atherosclerosis. Καθώς το πρώιμο συμβάν που οδηγεί στη γένεση της αθηροσκλήρωσης είναι η συσσώρευση των αθηρογόνων λιπιδίων όπως είναι οι λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας (LDLs) εντός του αρτηριακού τοιχώματος, η μεταφορά μάζας μεταξύ του αίματος και του τοιχώματος της αρτηρίας μάλλον διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην γένεση και την ανάπτυξη της αθηροσκλήρωσης . Στην παρούσα μελέτη διερευνάται η συσχέτιση της κατανομής της συγκέντρωσης των LDL (cw) στην επιφάνεια του αυλού με την κατανομή των διατμητικών τάσεων (WSS), καθώς και η επίδραση της μη - Νευτώνειας συμπεριφοράς και της παλμικής ροής του αίματος στις κατανομές της συγκέντρωσης των LDL στην επιφάνεια του αυλού κατά μήκος του τοιχώματος της ανθρώπινης αορτής. Η εξάρτηση του ιξώδους, της διάχυσης και της τοπικής πυκνότητας ενσωματώνονται στο μονοφασικό και το διφασικό μοντέλο ροής, καθιστώντας αυτές τις ποσότητες να εξαρτώνται από τη θέση. Στη συνέχεια, συγκρίνουμε τα αποτελέσματα του μονοφασικού μοντέλου με το διφασικό μοντέλο, τόσο υπό σταθερή ροή όσο και υπό ρεαλιστικές συνθήκες παλμικής ροής, χρησιμοποιώντας ένα ανθρώπινο μοντέλο αορτής κατασκευασμένο από CT εικόνες. Τέλος, μελετάτε η τοπική αιμοδυναμική με τη χρήση υπολογιστικής ρευστοδυναμικής (CFD) που εφαρμόζεται στο ρεαλιστικό γεωμετρικό μοντέλο της αορτής. Επομένως, είναι σημαντικό να λύσουμε το πρόβλημα της ακρίβειας στην ανακατασκευή του γεωμετρικού μοντέλου από την εικόνα CT, προκειμένου να έχουμε ακρίβεια στους CFD υπολογισμούς και στα αποτελέσματα. Η παρούσα αριθμητική μελέτη έδειξε ένα αντίστροφο συσχετισμό μεταξύ της διατμητικής τάσης του τοιχώματος και της συγκέντρωσης των LDL στην επιφάνεια του αυλού στην αορτή. Τα αποτελέσματα, επίσης έδειξαν ότι η συγκέντρωση των LDL στην επιφάνεια του αυλού εξαρτάται όχι μόνο από την τοπική διατμητική τάση του τοιχώματος αλλά από τα ολικά και τοπικά πρότυπα ροής. Επίσης, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κάτω από συνθήκες σταθερής ροής, η μη - Νευτώνεια φύση του αίματος αυξάνει τη διατμητική τάση του τοιχώματος (WSS) στις περισσότερες περιοχές της αορτής, ιδιαίτερα στις περιοχές με χαμηλή διατμητική τάση και έχει μικρή επίδραση στη συγκέντρωση των LDL (cw) στην επιφάνεια του αυλού, στις περισσότερες περιοχές της αορτής. Παρ 'όλα αυτά, μπορεί να ενισχύσει σημαντικά το cw στις περιοχές με υψηλή συγκέντρωση των LDL στην επιφάνεια του αυλού μέσω της εξαρτώμενης διατμητικής διάχυσης των LDLs. Η παλμικότητα της ροή του αίματος μπορεί να μειώσει σημαντικά το cw σε αυτές τις διαταραγμένες θέσεις. Εν κατακλείδι, η μη - Νευτώνεια συμπεριφορά του αίματος έχει μικρή επίδραση στη μεταφορά των LDL στις περισσότερες περιοχές της αορτής, αλλά στις αθηρογόνες - επιρρεπείς περιοχές όπου η συγκέντρωση LDL στην επιφάνεια του αυλού είναι υψηλή τα αποτελέσματα είναι εμφανή. Παρόμοια είναι η επίδραση της παλμικής ροής στη μεταφορά των LDLs.

Research suggests that plaque morphology plays a crucial role in determining plaque vulnerability. However the relationship between plaque morphology and rupture is still not clearly understood due to the limited information of plaque morphology. The aim of this study is to improve our understanding of the relationship between plaque morphology and rupture, and to use this to predict the risk of plaque rupture from the morphology at the molecular level. This can enable the identification of culprit lesions in clinical situations for assessing plaque rupture risk. Histological assessments were carried out on 18 carotid plaque specimens. The 3-D collagen, lipid and macrophage distributions along the entire length of the plaque were analysed in both ruptured and non-ruptured symptomatic plaques. In addition, plaque morphology on the rupture sites were examined and compared with the surrounding regions. It was found that ruptured plaques had thinner fibrous caps and larger lipid cores compared to non-ruptured plaques. Also, ruptured plaques had lower collagen content compared to non-ruptured plaques, and higher collagen contents upstream compared to downstream region from the plaque throat. At the rupture site there was lower collagen content, and a larger lipid core thickness behind a thin fibrous cap compared with the mean for the longitudinally adjacent and circumferential regions. Macrophage cells were located nearer to the boundary of the luminal wall in ruptured plaques. For both groups, the area occupied by macrophages is greater at the upstream shoulder of the plaque. There is a positive correlation between macrophage area and lipid core area, a negative correlation between macrophage area and collagen content, and between lipid core size and collagen content for both plaque groups. 3D reconstruction of ex-vivo specimens of carotid plaques were carried out by a combined analysis of US imaging and histology. To reconstruct accurate 3D plaque morphology, the non-linear tissue distortion in histological images caused by specimen preparation was corrected by a finite element (FE) based deformable registration procedure. This study shows that it is possible to generate a 3D patient specific plaque model using this method. In addition, the study also quantitatively assesses the tissue distortion caused by histological procedures. It shows that at least 30% tissue shrinkage is expected for plaque tissues. The histology analysis result was also used to evaluate ultrasound (US) tissue characterization accuracy. An ex-vivo 2D ultrasound scan set-up was used to obtain serial transverse images through an atherosclerotic plaque. The different plaque component region obtained from ultrasound images was compared with the associated histology result and photograph of the sections. Plaque tissue characterisation using ex-vivo US can be performed qualitatively, whereas lipid core assessment from ultrasound scan can be semi-quantitative. This finding combined with the negative correlation between lipid core size and collagen content, suggests the ability of US to indirectly quantify plaque collagen content. This study may serve as a platform for future studies on improving ultrasound tissue characterization, and may also potentially be used in risk assessment of plaque rupture.

La compréhension des mécanismes précis conduisant à la formation d'une plaque d'athérosclérose et à sa déstabilisation provoquant infarctus du myocarde ou accident vasculaire cérébral est fondamentale pour l'amélioration de la prévention, du dépistage et du traitement. Notre travail de thèse a porté sur l'analyse et le développement des modalités d'imagerie de la plaque d'athérosclérose afin d'améliorer notre capacité à suivre in vivo l'évolution de cette maladie. Nous proposons, après une introduction sur l'athérosclérose et la notion de plaque vulnérable, une revue des modèles animaux d'athérosclérose et l'intérêt du suivi en imagerie par résonance magnétique. Différentes modalités permettent le suivi en imagerie de la plaque d'athérosclérose. En pratique clinique, l'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) haute résolution est reconnue comme étant une modalité fiable et reproductible de caractérisation morphologique de la plaque carotidienne. Nous démontrons que l'injection de Gadolinium utilisée classiquement pour visualiser la lumière des vaisseaux permet également de préciser la caractérisation de la plaque carotidienne en donnant des informations sur la néovascularisation, la matrice extracellulaire et son statut inflammatoire. La caractérisation fonctionnelle de la plaque peut également être appréciée par l'injection de particules de fer en IRM ou par l'injection de radio-traceur comme le 18Ffluorodesoxyglucose en Tomographie par Emission de Positron (TEP). Le couplage de l'IRM et de la TEP de développement récent nous a permis de montrer une plus grande sensibilité de signal en TEP qu'en IRM avec particules de fer pour détecter les changements inflammatoires observés dans des plaques d'athérome d'aorte de lapin. Les applications actuelles de l'imagerie de l'athérosclérose sont nombreuses permettant de juger de l'efficacité thérapeutique d'un médicament ou d'identifier les patients à plus haut risque d'évènement cardiovasculaire / A better understanding of mechanisms leading to the formation of an atherosclerotic plaque and its destabilization causing myocardial infarction or stroke is fundamental to improve prevention, detection and treatment. Our work focused on development of imaging modalities of atherosclerotic plaque in order to improve our ability to monitor in vivo the progression of this disease. We propose, after an introduction to the concept of atherosclerosis and vulnerable plaque, a review of existing animal models of atherosclerosis and the interest of monitoring with magnetic resonance imaging. Different methods allow imaging of atherosclerotic plaque. In clinical practice, Magnetic Resonance Imaging (MRI) is recognized as a reliable and reproducible tool for morphological characterization of carotid plaque. We demonstrate that Gadolinium conventionally used to visualize the lumen of the vessels also allows a characterization of carotid plaque with information on neovascularization, extracellular matrix and inflammatory status. The functional characterization of the atherosclerotic plaque can be assessed with iron particles in MRI or with radiotracer such as 18Ffluorodeoxyglucose in positron emission tomography (PET). Combined PET-MR systems allowed us to show a better sensitivity of PET signal than USPIO-MR signal to detect early inflammatory changes in atherosclerotic plaque of rabbit aorta. We also provide some current clinical applications of atherosclerosis imaging (drug efficacy or identification of high risk patients)

L’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique. L’une des caractéristiques des lésions d’athérosclérose est l’accumulation anormale de corps apoptotiques et nécrotiques, due à un défaut d’efferocytose, ceci entraînant la formation du cœur nécrotique. L’évolution de ce cœur nécrotique est également associée à une augmentation de l’inflammation et de la taille des plaques d’athérosclérose, mais aussi dans la survenue de complications telle que la rupture de plaque. Clec9a est un récepteur transmembranaire de type lectine C, majoritairement exprimé par une sous population de cellules dendritiques les DC-CD8α+. Il est capable de reconnaître un ligand spécifiquement exprimé par les corps nécrotiques, l’actine F. L’objectif de notre travail a été de savoir si Clec9a, qui est capable de reconnaître les corps nécrotiques, pouvait être impliqué dans la modulation de l’inflammation observée au cours du développement de l’athérosclérose. Au cours de cette étude, nous avons montré, in vivo partir de deux modèles murins (ApoE-/- et LDLr-/-), que la délétion de Clec9a entraîne une diminution significative de la taille des lésions dans un contexte d’hypercholestérolémie modérée. Cette athéro-protection observée en l’absence de Clec9a, est associée à une augmentation de l’expression de l’IL-10, qui est une interleukine anti-athérogène et anti-inflammatoire. Cet effet athéroprotecteur de l’absence de Clec9a n’est plus observé lorsque l’IL-10 est totalement invalidée. De plus, nous avons montré que l’invalidation de Clec9a spécifiquement dans les DC-CD8α+ entraîne, in vivo, une diminution de l’infiltration des macrophages et des lymphocytes T dans les lésions, ainsi qu’une augmentation de l’expression de l’IL-10, favorisant une diminution de la taille des lésions. La compréhension des mécanismes inflammatoires dans l’athérosclérose constitue un enjeu majeur pour prévenir les risques de complications comme la rupture de plaque ou la thrombose. Ainsi, ce travail met en évidence un nouveau rôle de Clec9a dans la régulation de l’inflammation dans l’athérosclérose et pourrait donc représenter une cible thérapeutique potentielle. / Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease. One of the characteristics of atherosclerotic lesions is the abnormal accumulation of apoptotic and necrotic cells, due to a deficiency of efferocytosis, which leads to the formation of the necrotic heart. The evolution of this necrotic core is also associated with an increase in inflammation and lesions of atherosclerosis, but also in the occurrence of complications such as plaque rupture. Clec9a is a C type lectin receptor, mainly expressed by a subpopulation of dendritic cells, which are the CD8α+ dendritic cells. This receptor is able to recognize a ligand expressed by necrotic cells, the actin F. The aim of our work was to find out if Clec9a, which can sense necrotic cells, could be involved in modulating the inflammation observed during the development of atherosclerosis. In this study, we have shown, in vivo with two mouse models (ApoE - / - and LDLr - / -), that the deletion of Clec9a leads to a significant decrease in the incidence of moderate hypercholesterolemia. This athero-protection observed in the absence of Clec9a, is associated with an increase in the expression of IL-10, which is an anti-atherogenic and anti-inflammatory cytokine. This athero-protective effect of the absence of Clec9a is abolished after total invalidation of IL-10. Furthermore, we report that specific knockdown of Clec9a in CD8α+-DC, in vivo, leads to a decrease in macrophage and lymphocyte infiltration in lesions, as well as an increase in IL-1 expression. 10, which promotes a decrease in lesions size. Understanding of inflammatory mechanisms in atherosclerosis is a major challenge to prevent the risk of complications such as plaque rupture or thrombosis. Thus, this work highlights a new role of Clec9a in the regulation of inflammation in atherosclerosis and could be therefore a potential therapeutic target.

Les cellules myéloïdes jouent un rôle majeur dans le développement et les complications de l’athérosclérose. TREM (Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells)-1 est un récepteur, exprimé par les cellules myéloïdes, impliqué dans l’amplification de la réponse inflammatoire en réponse à une stimulation de la voie des TLRs. Notre objectif était d’étudier les conséquences de l’inhibition de TREM-1 sur le développement de l’athérosclérose expérimentale.Matériel et résultats : Dans un modèle de souris chimères Ldlr-/- retransplantées avec une moelle de souris Trem-1+/+ ou Trem-1-/-, nous avons montré que la déficience hématopoïétique en Trem-1 induisait une réduction de 42% de la taille des plaques d’athérosclérose au niveau du sinus aortique après 6 semaines de régime gras et une réduction de 60% après 14 semaines. De plus, la déficience hématopoïétique en Trem-1 induisait un phénotype lésionnel plus stable avec une moindre accumulation macrophagique, un centre nécrotique moins volumineux. Ces résultats ont été confirmés dans un modèle de souris ApoE-/-/Trem1-/-. Parallèlement, l’inhibition pharmacologique de TREM-1 par des injections répétées de peptide LR12 induisait une réduction significative de la taille des plaques au niveau du sinus et de l’aorte thoracique chez la souris ApoE-/- sous un régime riche en matières grasses. En utilisant différentes approches in vitro et in vivo, nous avons montré que l’invalidation génique de Trem-1 ou son inhibition pharmacologique induisait une déviation de la réponse immune vers un profil moins inflammatoire, réduisait le recrutement des monocytes non classiques dans la plaque d’athérosclérose et enfin limitait l’endocytose des lipides oxydés en régulant l’expression du CD36. Ces données de modulation de la réponse immune et de l’endocytose des lipides ont été confirmées sur des macrophages humains. Nous avons enfin montré que TREM-1 est exprimé dans des plaques d’athérosclérose humaines essentiellement par les macrophages spumeux. L’expression de TREM-1 est significativement plus importante dans les plaques athéromateuses par rapport aux plaques fibreuses. Conclusion : Nous avons montré que TREM-1 est impliqué dans le développement de l’athérosclérose à différents stades de la maladie, en modulant la réponse immune systémique et l’endocytose des lipides oxydés. L’inhibition de TREM-1 pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique des maladies cardiovasculaires. / Innate immune responses activated through myeloid cells contribute to the initiation, progression and complications of atherosclerosis in experimental models. However, the critical upstream pathways that link innate immune activation to foam cell formation are still poorly identified.Objectives: We hypothesized that activation of TREM (Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells)-1 plays a determinant role in macrophage atherogenic responses. Methods and Results: Ldlr-/- mice reconstituted with bone marrow deficient for Trem-1 (Trem-1-/-) showed a strong reduction of atherosclerotic plaque size in both the aortic sinus and the thoraco-abdominal aorta, and were less inflammatory compared to plaques of Trem-1+/+ chimeric mice. Genetic invalidation of Trem-1 led to alteration of monocyte recruitment into atherosclerotic lesions and inhibited Tlr4-initiated pro-inflammatory macrophage responses. Furthermore, we identified a critical role for Trem-1 in the upregulation of Cd36, thereby promoting the formation of inflammatory foam cells. Genetic invalidation of Trem-1 in Apoe-/-/Trem-1-/- mice or pharmacological blockade of Trem-1 in Apoe-/- mice using LR-12 peptide also significantly reduced the development of atherosclerosis throughout the vascular tree, and lessened plaque inflammation. TREM-1 was expressed in human atherosclerotic lesions mainly in lipid-rich areas, with significantly higher levels of expression in atheromatous compared to fibrous plaques. Conclusion: We identify TREM-1 as a major upstream pro-atherogenic receptor. We propose that TREM-1 activation orchestrates monocyte/macrophage pro-inflammatory responses and foam cell formation through coordinated and combined activation of CD36 and TLR4. Blockade of TREM-1 signaling may constitute an attractive novel and double-hit approach for the treatment of atherosclerosis.

L'inflammation chronique en réponse à l'accumulation de lipoprotéines dans la paroi artérielle est centrale dans le développement de l'athérosclérose. L’immunité innée et adaptée sont impliquées dans ce processus. Les cellules Natural Killer (NK), un des éléments clés de l'immunité innée, ont été identifiées dans les lésions athérosclérotiques humaines et murines. Bien que plusieurs études aient cherché à évaluer le rôle des cellules NK dans des modèles animaux expérimentaux d'athérosclérose, les résultats restent contradictoires, certaines rapportant des effets pro-athérogéniques, d’autres anti-athérogéniques. L'une des principales limites de ces études est le manque de spécificité dans le ciblage de la perte ou du gain de fonction des cellules NK. Nous avons utilisé deux approches génétiques sélectives pour étudier le rôle des cellules NK dans l'athérosclérose: 1) des souris Ncr1iCre/+R26lslDTA/+ dans lesquelles les cellules NK ont été déplétées 2) des souris Noé, dont les cellules NK sont hyper-réactives. Les cellules de la moelle osseuse (BM) de ces souris ont été utilisées pour reconstituer le système hématopoïétique de souris Ldlr -/- irradiées. Après une période de récupération de 4 semaines, les souris ont été mises sous un régime riche en matières grasses (HFD) pendant 8 semaines. L'analyse morphométrique de la taille des lésions ‘athérosclérose dans le sinus aortique et l'aorte thoracique n'a montré aucune différence statistiquement significative entre les 3 groupes. De plus, aucune différence n'a été observée dans la composition de la plaque en termes de teneur en collagène, d'infiltration de macrophages ou de profil immunitaire dans le sang et la rate des souris Ncr1iCreR26lsl-DTA, Noé ou contrôles. Nous avons ensuite étudié la sélectivité de des anticorps anti-asialo-GM1 dans la déplétion des cellules NK, qui avaient été utilisés précédemment pour démontrer le rôle pro-athérogène des cellules NK. Nous avons confirmé les effets non spécifiques de cet anticorps, qui déplète non seulement les cellules NK, mais aussi les lymphocytes NKT et CD8+. Enfin, pour déterminer si l'activation des cellules NK par un stimulus externe pouvait avoir des effets sur l’athérosclérose, nous avons traité les souris chimériques (souris Ldlr -/- irradiées reconstituées soit avec les cellules de moelle contrôle ou déficiente en cellules NK) avec du poly IC (un mimétique viral) pendant 8 semaines de HFD. Nous avons trouvé une réduction significative de la taille des lésions au niveau du sinus aortique et de l'aorte thoracique dans les souris déficientes en cellules NK. Nos résultats, à partir de modèles de souris spécifiques, contredisent les études antérieures et démontrent clairement que chez les souris hypercholestérolémiques, les cellules NK n'ont aucun effet direct sur l'athérosclérose, sauf si elles sont pré-stimulée, comme par exemple dans un contexte d’infection virale ou de présence de tumeurs. / Chronic inflammation is central in the development of atherosclerosis. Both innate and adaptive immunity are involved in this process. Although several studies have evaluated the functions of NK cells in experimental animal models of atherosclerosis, it is not yet clear whether NK cells behave as protective or pro-atherogenic effectors. One of the main caveats of previous studies was the lack of specificity in targeting loss- or gain-of-function of NK cells. Here, we used two selective genetic approaches to investigate the role of NK cells in atherosclerosis: 1) Ncr1iCre/+R26lslDTA/+ mice in which NK cells were depleted, 2) Noé mice in which NK cells are hyperresponsive. No difference in atherosclerotic lesion size was found in Ldlr-/- mice transplanted with bone marrow cells from Ncr1iCreR26Rlsl−DTA, Noé or WT mice. Also, no difference was observed in plaque composition in terms of collagen content, macrophage infiltration or the immune profile in blood and spleen, although Noé chimera had more IFN-y-producing NK cells in comparison with WT mice. Then, we investigated the NK cell selectivity of anti-asialo GM1 anti-serum, which was previously used to conclude to the pro-atherogenicity of NK cells. Anti-asialo GM1 treatment decreased atherosclerosis in both Ldlr-/- mice transplanted with Ncr1iCreR26Rlsl−DTA or WT BM, indicating that its anti-atherogenic effects are unrelated to NK cell depletion. Finally, to determine whether NK cells could contribute to the disease in conditions of pathological NK cell overactivation, we treated irradiated Ldlr-/- mice reconstituted with either WT or Ncr1iCreR26Rlsl−DTA BM with the viral mimic Poly(I:C) and found a significant reduction of plaque size in NK-cell deficient chimeric mice. Our findings, using state-of-the-art mouse models, clearly demonstrate that NK cells have no direct effect on the natural development of hypercholesterolemia-induced atherosclerosis, but may play a role when an additional systemic NK cell overactivation occurs.

Η αθηρωματική νόσος είναι η κύρια αιτία καρδιαγγειακών νοσημάτων (CVD). Σύμφωνα με τον WHO το 2004 οι θάνατοι λόγω CVD ήταν 17.1 εκατομμύρια, το 29% των θανάτων παγκοσμίως. Η παθογένεια της νόσου είναι πολυπαραγοντική και οφείλεται σε περιβαλλοντικά και γενετικά αίτια, ένα από τα οποία είναι οι λιπιδαιμικές διαταραχές. Μελέτες τόσο in vitro όσο και in vivo σε ανθρώπους και πειραματόζωα καταδεικνύουν την απολιποπρωτεΐνη Ε (ApoE) ως κομβικό μόριο στη μεταφορά και το μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών, οι οποίες αποτελούν τα μεταφορικά μέσα των λιπιδίων. Η ΑpoE εκφράζεται σε ποικίλους ιστούς, όπως ο λιπώδης ιστός, τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα μακροφάγα και ο εγκέφαλος, αν και η κύρια θέση παραγωγής της είναι το ήπαρ. Στις δράσεις της ΑpoE περιλαμβάνονται η ηπατική πρόσληψη των λιποπρωτεϊνών, η ενεργοποίηση ενζύμων που συμμετέχουν στον μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών (LCAT, CETP, HL) η μεταφορά χοληστερόλης από περιφερικούς ιστούς στο ήπαρ με στόχο την κάθαρση και τελικώς τη ρύθμιση της ομοιόστασης του ισοζυγίου της χοληστερόλης στο αίμα. Η απομάκρυνση VLDL και υπολειμμάτων χυλομικρών από την κυκλοφορία μέσω της αγρίου τύπου (wt) ΑpoE προϋποθέτει την ύπαρξη λειτουργικών υποδοχέων LDLr. Στους ανθρώπους μεταλλάξεις ή πλήρης έλλειψη έκφρασης του LDLr οδηγεί στη εμφάνιση Οικογενής υπερχοληστερολαιμίας (FH). Στην περίπτωση της ομόζυγης Οικογενής υπερχοληστερολαιμίας (HoFH) οι ήδη υπάρχουσες φαρμακολογικές προσεγγίσεις είναι αναποτελεσματικές, με συνέπεια οι ασθενείς να καταλήγουν πρόωρα. Παρά τις ωφέλιμες δράσεις της wt ApoE στο μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών, η θεραπευτική της αξία είναι περιορισμένη καθώς σε συγκεντρώσεις άνω των φυσιολογικών επιπέδων στο πλάσμα επάγει συνδυαστική υπερλιπιδαιμία. Η διερεύνηση της δομής και των λειτουργικών θέσεων της ΑpoΕ οδήγησε στην κατασκευή μιας τεχνητά μεταλλαγμένης μορφής, της ΑpoE4mut1 , η οποία όχι μόνο δεν προκαλεί διαταραχή λιπιδίων αλλά έχει και βελτιωμένες δράσεις σε σχέση με την wt ΑpoE. Η έρευνα που αναλύεται στην εργασία αυτή ξεκίνησε με σκοπό να μελετηθεί η αναγκαιότητα έκφρασης λειτουργικού υποδοχεά LDLr για την εκδήλωση των βελτιωμένων βιολογικών δράσεων της ΑpoE4mut1. Συγκεκριμένα, σε υπερχοληστερολαιμικά ποντίκια με ταυτόχρονη έλλειψη στην ΑpoE και τον LDLr (ApoE-/- x LDLr-/-) χορήγηση της μεταλλαγμένης μορφής ΑpoE4mut1 μέσω αδενοϊών οδήγησε σε μείωση των επιπέδων χοληστερόλης στο αίμα τους. Το γεγονός αυτό καταδεικνύει μια νέα ιδιότητα της ΑpoE4mut1 πολλά υποσχόμενη όσον αφορά στην ανακάλυψη νέων θεραπευτικών κατευθύνσεων για την ομόζυγη οικογενή υπερχοληστερολαιμία (ΗoFH). / Atherosclerosis is a focal disease that constitutes the main cause of coronary heart disease (CHD) and cardiovascular diseases (CVD). According to WHO an estimated 17.1 million people died from CVDs in 2004, representing 29% of all global deaths. The initial formation and progression of atheromatic lesions involves a complex interplay of both genetic and environmental factors, such as dyslipidemias. In vitro and in vivo studies, both in animal models and humans, have established that apolipoprotein E has a key role in the metabolism of lipoproteins, which are the main transport vehicles of the lipids in the circulation. ApoE is mainly synthesized by the liver and secondary by other tissues, such as fat tissue, macrophages, brain. The protein is involved in the efficient hepatic uptake of lipoprotein particles, the activation of enzymes, such as LCAT, CETP, which participate to metabolic pathways of lipoproteins, and the stimulation of reverse cholesterol transport from peripheral tissues to the liver. Therefore, ApoE is capable of regulating cholesterol homeostasis in plasma. The expression of functional LDLr is required by wild type ApoE, in order to perform the clearance of lipoprotein particles. In humans mutations or total deficiency in LDLr result in a disease called Familial Hypercholesterolemia (FH). Homozygote patients with FH (HoFH) do not benefit from the conventional therapies and die prematurely. Despite the central role of wt ApoE in the metabolism of lipoprotein particles, its therapeutic value is reduced due to the limitation that at concentrations higher than physiological, plasma ApoE induces combined hyperlipidemia. Studies on the structure-function relationship of the protein resulted in the generation of a mutant variant ApoE4mut1, which has improved functions regarding wt ApoE4 and does not induce hypertriglyceridemia. The present study was initiated in order to determine whether the improved functions of ApoE4mut1 require the expression of LDLr. The results demonstrated new possible interventions for the treatment of HoFH. In particular, hypercholesterolemic mice with deficiency both in ApoE and LDLr genes (ApoE-/- x LDLr-/-), which expressed through adenovirusmediated gene transfer the mutant ApoE4mut1, showed a decrease in the cholesterol levels. This finding may lead to important therapeutic applications as a new treatment for HoFH when gene therapy becomes a reality in the future.

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde, en lien notamment avec la présence et la rupture de plaques d’athérome. Afin d’éviter la survenue d’évènements aigus, un traitement par statines peut être proposé. Cependant, leur utilisation engendre un risque d’effets délétères. Afin de réduire ce risque, une réduction des doses utilisées pourrait être envisagée. Ce travail de thèse étudie les effets potentiels d’un traitement à très faible dose d’atorvastatine et à long terme sur un modèle animal : le lapin Watanabe. Des mesures ont été menées sur des individus contrôles et traités de 3 à 12 mois. Le suivi de la lipidémie et des principaux facteurs biochimiques, de l’adhésion et de l’inflammation a été fait au niveau sanguin. Le développement de l’athérosclérose a été évalué en tomographie par cohérence optique (OCT). Des mesures en histologie ont permis de valider un classement proposé avec l’OCT et de quantifier les macrophages intra plaques. L’élasticité artérielle a été testée in vivo par la mesure de la vitesse de l’onde de pouls et in vitro par un test de traction statique. La fonction vasculaire a été appréhendée en vasoréactivité sur différents territoires (aorte, carotide, mésentérique). Le contenu en élastine et collagène de la paroi des vaisseaux a été effectué en microscopie à deux photons et génération de seconde harmonique. Enfin la respiration mitochondriale du myocarde et sa susceptibilité aux ROS a été évaluée sur fibres cardiaques perméabilisées, l’activité de systèmes antioxydants enzymatiques mesuré, ainsi que la peroxydation lipidique. Les résultats montrent des effets bénéfiques de ce traitement à très faible dose d’atorvastatine sur la fonction cardiovasculaire indépendamment d’un effet hypolipidémiant. / Cardiovascular diseases are the first worldwide causes of death, associated to the presence and rupture of atherosclerotic plaques. To limit acute events, statins may be prescribed. However, its use leads to deleterious effects risk. To reduce this risk, a dose reduction could be considered. The work of this thesis is to study potential effects of a very low dose of atorvastatin, taken in the long term, in an animal model: the Watanabe rabbit. Measurements are made on control and treated animals from the age of 3 to 12 months. Circulating lipids, biochemical parameters and parameters of adhesion and inflammation were studied. Atherosclerosis evolution was evaluated by optical coherence tomography (OCT). Histological measurements allowed to validate a ranking proposed with OCT observations and to quantify intra-plaque macrophage content. Arterial stiffness was tested in vivo with pulse wave velocity and in vitro with a static tensile test. Vascular function was approached with vasoreactivity in different territories (aorta, carotid, mesenteric). Elastin and collagen contents of the artery wall were determined with two-photon and second harmonic generation microscopy. Finally, mitochondrial respiration and its susceptibility to ROS were evaluated in permeabilized cardiac fibers, any enzymatic antioxidant systems and lipid peroxidation were measured. Results show beneficial effects of this very low dose atorvastatin treatment in cardiovascular function, independently of a lipid-lowering effect.Keywords: atherosclerosis,