In C. difficile infection (COl), the antibody-mediated immune response to secreted toxins A and B appears to be important in determining the nature of clinical disease. The aim of this study was to evaluate multiple aspects of the humoral immune response to C. difficife toxins A and B in patients with C. difficile-associated disease (COAO), among which included subjects with inflammatory bowel disease. Humoral immune measurements were also quantified for healthy controls and patients with cystic fibrosis (CF) who have been reported to rarely develop COl. Isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were fluorescently labelled with Alexa Fluor® 488 and other B cell markers to identify transiently circulating toxin A-specific antigen-activated B cells during clinical disease by flow cytometry. PBMCs were also polyclonally stimulated in vitro for 6 days to induce proliferation and differentiation of memory B cells (MBCs) to antibody-secreting cells (ASCs). ELiSPOT assays were used to quantify toxin A- and B-specific IgG ASCs. Toxin A- and B-specific antibody levels in sera and supernatant samples of cultured PBMCS were studied by ELISA. A small proportion of toxin A-specific, antigen-activated B cells were detected in the circulation soon after COl. Differential antibody and MBC responses to C. difficile toxins A and B were detected over many months following CDl and in CF patients. The magnitude of these responses did not significantly differ between patients with single and recurrent CDAD. A greater proportion of toxin B-specific MBCs were present in the peripheral circulation in the CDAD and CF groups. No correlation was seen between the frequency of circulating toxin-specific antigen-activated or MBCs and contemporaneous serum anti-toxin IgG levels in either group. These data suggest that serum anti-toxin antibodies can underestimate the breadth of humoral immunity and strongly support the use of toxin-specific B (memory) cell analyses to complement serological studies.

Clostridium difficile, a Gram-positive, anaerobic, spore-former is the major cause of antibiotic associated diarrhoea and is also associated with more severe, sometimes life threatening disease. To date little research has been carried out on iron uptake mechanisms and their regulation in C. difficile. In common with other pathogens, iron is likely to be an essential growth factor necessary for the survival of the organism. Conversely, an over-abundance of iron might be toxic, therefore uptake is likely to be strictly regulated. Analysis of available genome sequences reveals the presence of several potential iron uptake systems and regulators. This study investigated for the first time the role of the ferrous iron uptake systems FeoBl, FeoB2, FeoB3 and the ferric uptake regulator Fur, iron dependent global gene regulator in C. difficile. The ClosTron mutagenesis system has been used to generate knockout mutants in the three annotated feoB homologues and in the single fur homologue in C. difficile 630. The fur mutants exhibited clear growth phenotype and were hypersensitive to hydrogen peroxide. Cytotoxicity assays revealed decreased levels of toxins TcdA and B in the fur mutants. The fur mutants demonstrated different phenotypes in sporulation and in swarming, were more susceptible to metronidazole and showed increased cellular iron content. RNA-Seq analysis investigated the fur regu lation in C. difficile and over 1600 genes were differentially expressed in the fur mutant Comparisons of the growth characteristics and cellular metal content suggest FeoBl but not FeoB2 and FeoB3 is involved in ferrous iron uptake. Levels of toxins TcdA and B were markedly reduced in the feoB1 mutant grown under iron limitation. In contrast, feoBl mutant was virulent in the hamster model of virulence. These findings highlight the role of Fur and FeoB systems in regulating key and diverse aspects of physiology and virulence of C. difficile.

Les principales causes de morbidité et de mortalité en Afrique Sous-Saharienne sont les maladies infectieuses et les déficiences nutritionnelles. Plus concrètement, la carence en fer et le paludisme sont, respectivement, les principales maladies contribuant à la morbidité et la mortalité chez la femme enceinte et le nourrisson au Bénin. Pour ces raisons, une politique de supplémentation en fer et un traitement préventif intermittent (TPI) contre le paludisme ont été mis en place pendant la grossesse au Bénin. Étant donné que le TPI influence le paludisme gestationnel, qui, lui, pourrait avoir un effet sur le paludisme de l'enfant, nous avons investigué l'effet du TPI sur le paludisme de l'enfant. En parallèle, étant donné que différentes études épidémiologiques suggèrent que des niveaux de fer élevés auraient un effet délétère sur le risque de paludisme, nous avons investigué le possible risque accru de paludisme chez une cohorte de 1005 femmes enceintes et 400 enfants au Bénin. Dans des modèles multi-niveaux à intercepte aléatoire au niveau de la mère, des niveaux de fer élevés étaient associés significativement au risque d'avoir une goutte épaisse positive et à une parasitémie par P. falciparum plus élevée. Dans des modèles multi-niveaux à intercepte aléatoire au niveau de l'enfant, les niveaux de fer de élevés étaient associés significativement au risque d'avoir une goutte épaisse positive. L'extension du TPI (le nombre de jours entre les deux doses), était significativement associé à un moindre risque de paludisme.Par conséquence on devrait augmenter les doses et l'observance du TPI, et des études supplémentaires sur l'effet de différentes doses de fer, et études comparatives entre le fer donné en tant que traitement vs supplémentation systématique sont nécessaires. / In Benin malaria and nutritional deficiencies are the main diseases contributing to the disease burden. Therefore, preventive strategies targetting both diseases have been deployed for over 10 years. Pregnancy-associated malaria (PAM) is responsible for maternal anaemia, placental malaria and low birth weight (<2500g). To prevent PAM, the WHO recommends the intermittent preventive treatmentduring pregnancy (IPTp). Considering that IPTp has an effect on PAM, and thereby influences the exposure of the fœtus to the parasite, we wanted to investigate the possible effect of IPTp on malaria in infants. In parallel, iron supplements are recommended during pregnancy to prevent maternal anemia. As there is some epidemiological evidence that iron might enhance malaria episodes and their severity we wanted to analyse the association of iron levels with malaria in pregnancy and infancy. Therefore, we conducted a cohort study of 1005 pregnant women and 400 infants from 2010 to 2012 in Allada (Benin). We showed that IPTp duration (number of days between doses) was inversely correlated with malaria risk and P. falciparum parasitemia, possibly due to the reduction of the exposure of the fœtus to the parasite in utero. We also found that iron levels during pregnancy and infancy were associated to increased malaria risk and P. falciparum parasitemia, with a possible dose effect. In a context of growing resistance to SP, IPTp doses and observance should increase. In addition, complementary interventional data are needed to determine the benefits and risks of differently dosed iron supplements, in order to ascertain their impact on infant health in malaria-endemic regions.

Ce travail avait pour objectif, de caractériser le poids des infections au cours de la grossesse et d’étudier la construction de l’immunité anti-PfEMP1 chez le jeune enfant. La première partie, aborde la conséquence des infections et l’efficacité des traitements chez la mère. Cette étude réalisée sur la cohorte de femmes d’une étude prospective au Bénin, a démontré l’impact des infections à bas bruit sur le taux d’hémoglobine maternel et le faible poids de l’enfant. Le TPI-SP, a montré les limites quant à sa capacité à débarrasser les femmes enceintes infectées au moment du traitement de leur parasite. Nos résultats soutiennent davantage la nécessité de trouver des moyens alternatifs de prévention qui offrent une meilleure couverture de la grossesse. La deuxième partie aborde la construction de l’immunité anti-PfEMP1 dans la première année de vie chez l’enfant. Un résultat majeur de cette étude est la démonstration que l’acquisition des anticorps contre les PfEMP1 associés aux complications du paludisme est dépendante des infections patentes de l’enfant. La troisième partie aborde les phénotypes des parasites responsables de diverses formes cliniques du paludisme chez l’enfant Africain âgé de 0 à 5 ans. Cette étude a permis de mettre en évidence un marqueur de mauvais pronostic du paludisme cérébral. Sur un deuxième volet, nous avions montré que les isolats adhérant faiblement à ICAM-1, transcrivent fortement les gènes codant pour les PfEMP1 contenant des motifs DC8. Ces résultats soulèvent la question du rôle de EPCR dans la physiopathologie du neuropaludisme. Le travail développé dans cette thèse a permis de décrire pour la première fois la construction de l’immunité anti-PfEMP1 dans la première année de vie, de mettre à jour les connaissances sur la physiopathologie du paludisme cérébral chez le jeune enfant et de dégager des pistes à explorer prioritairement dans la perspective du développement d'un vaccin contre les formes graves du paludisme. / This work aimed to characterize the burden of P. falciparum infections during pregnancy and to study the construction of the anti-PfEMP1 immunity in the early life. The first part discusses the consequence of infection and the effectiveness of treatments in the mother. This study on the cohort of women from a prospective study in Benin, demonstrated the impact of infections with low parasitemia on the maternal hemoglobin and low weight of the child. IPT-SP, has shown the limits of its ability to rid infected pregnant women in the processing of their parasite. Our results further support the need to find alternative means of prevention that provide better coverage of pregnancy. The second part treated the construction of the anti-PfEMP1 immunity in the first year of life in children. A major finding of this study is the demonstration that the acquisition of antibodies against the PfEMP1 associated with complications of malaria depends on patentes infections in children. The third part studies parasites phenotypes responsible of various clinical forms of malaria in African children aged 0-5 years. This study allowed finding a marker of poor prognosis of cerebral malaria. On a second component, we showed that isolates bind to ICAM-1, highly transcribe the genes encoding PfEMP1 containing DC8. These results raise the question of the role of EPCR in the pathophysiology of cerebral malaria. The work developed in this thesis has allowed describing for the first time the construction of the anti-PfEMP1 immunity in the first year of life, to update knowledge on the pathophysiology of cerebral malaria in young children and identify Options to be primarily from the perspective of developing a vaccine against severe forms of malaria.

La forte prévalence des hémoglobinopathies, notamment l'HbAS, l'HbC et l'α-thalassémie dans des zones d'endémie palustre est considérée comme la conséquence de la protection qu'elles procurent contre les formes létales du paludisme. De nombreux mécanismes ont été évoqués pour expliquer cette protection, ne sont pas cohérentes avec toutes les observations épidémio-cliniques disponibles. La première partie de ces travaux de thèse a abordé la réduction de la cytoadhérence des globules rouges (GR) parasités comme mécanisme potentiel commun aux trois hémoglobinopathies. Pour explorer plus en profondeur ce mécanisme, nous avons mené une étude comparative des phénotypes de cytoadhérence des isolats primaires de P. falciparum obtenus chez des patients HbAS et HbAC et HbAA. Cela avait pour but de déterminer si l'HbAS et l'HbAC jouaient un rôle dans la sélection et le maintien des souches virulentes de P. falciparum dans la nature. La deuxième partie de la thèse a concerné l'influence du trait drépanocytaire (HbAS) sur la déformabilité des GR non parasités d'une part et sur la rétention splénique des GR non parasités et parasités par les formes jeunes de P. falciparum d'autre part. Nous avons observé que l'adhésion des GR parasités aux cellules endothéliales micro-vasculaires humaines ainsi qu'aux monocytes était réduite avec les GR α-thalassémiques par rapport aux GR HbAA. Aucune différence statistiquement significative n’a en revanche été observée entre les profils de cytoadhérence des isolats primaires de P. falciparum issus de sujets HbAA, HbAS ou HbAC. L’étude de la déformabilité des GR a montré que les GR HbAS sont légèrement mais significativement moins déformables que les GR HbAA. En revanche, les GR HbAS parasités par les jeunes parasites de P. falciparum (anneaux) n’étaient pas plus retenus que leurs homologues HbAA dans la rate humaine isolé perfusée ex vivo, ou en microsphiltration, quelles que soient les conditions d’oxygénation. Nous n’avons observé aucune différence au niveau du taux de falciformation entre les GR parasités et non parasités que ce soit avec les GR HbAS ou avec les GR HbSS. En conclusion, nous proposons que la réduction de la cythoadhérence et la rétention splénique des GR contenant les formes matures de P. falciparum constituent un mécanisme commun à la protection des sujets HbAS, HbC et α-thalassémiques contre le paludisme. Ces deux phénomènes interconnectés peuvent rendre compte de l’ensemble des observations épidemio-cliniques disponibles sur la protection conférée par ces hémoglobinopathies. / The high prevalence of several inherited hemoglobin disorders, namely sickle cell trait (HbAS), HbAC and α-thalassemia, in malaria endemic areas is thought to be the consequence of their protective effects against malaria life-threatening manifestations. Numerous potential mechanisms have been proposed to explain this protective effect although many of them are not fully consistent with all available epidemiologic and clinical data. The first part of this thesis work explored the reduction of cytoadherence of infected RBC as a potential common mechanism for α-thalassemia-, HbAS- and HbAC-induced protection against malaria. To further explore this mechanism, and determine whether HbAS and HbAC select and maintain virulent P. falciparum parasite in nature, we compared the cytoadherence phenotype of P. falciparum isolates obtained from HbAS/HbAC and controls HbAA patients. The second part of the thesis work addressed the influence of HbAS on the deformability of uninfected RBC as well as the splenic retention of both uninfected RBCs and ring-infected RBCs. We observed a reduced adherence of α-thalassemic infected RBCs to human micro-vascular endothelial cells and monocytes compared to controls HbAA infected RBCs. The reduction was correlated to the number of non functional α- gene. Expression of PfEMP-1 on the surface of α- thalassemic infected RBCs was lower than on the surface of HbAA infected RBCs. There was no statistically significant difference between the cytoadherence of P. falciparum isolates obtained either from HbAS/HbAC or control HbAA malaria patients. The deformability of uninfected HbAS RBCs was slightly but significant lower than that of control uninfected HbAA RBCs. Retention rates of ring-infected HbAS and HbAA RBCs were similar either in human isolated spleen perfusion ex vivo and in microsphilters in vitro regardless of the oxygenation level. We did not observe any enhanced sickling of ring-infected RBCs compared to non infected RBCs, both in HbAS and HbSS samples. Based on these results along with available epidemiologic and previous experimental data, we propose a common malaria-protective mechanism of HbAS, HbAC and α-thalassemia whereby these hemoglobin disorders reduce the cytoadherence of mature P. falciparum-infected RBCs that stay in circulation where they are exposed to an enhanced splenic retention. These 2 mechanisms would act in conjunction to slower the rise of parasites loads in infected patients and protect them from sequestration-related complications of malaria.

Les sporozoïtes de Plasmodium sont injectés par un moustique Anophèle et infectent le foie où le parasite se développe avant l’initiation d'une phase symptomatique érythrocytaire. Le sporozoïte pénètre activement les hépatocytes en formant une vacuole parasitophore où il se multiplie. Des facteurs parasitaires et de l’hôte sont impliqués dans l’invasion des hépatocytes mais les mécanismes restent méconnus. Pour faciliter l’étude de l’infection, nous avons généré des parasites fluorescents grâce à une nouvelle stratégie GOMO. L’utilisation des parasites P. yoelii fluorescents et d’un modèle cellulaire de lignées permissives ou non à l’infection, nous a permis de caractériser les mécanismes moléculaires et les cinétiques d’invasion. Nous avons montré que l’invasion productive est précédée d’une phase de traversée cellulaire où le parasite forme des vacuoles transitoires, distinctes des vacuoles parasitophores. Le parasite se sert d’une perforine PLP1 pour sortir de cette vacuole transitoire et échapper à la dégradation par les lysosomes de la cellule. Nous avons étudié le rôle de différents facteurs de l’hôte lors de l’invasion productive, selon les espèces plasmodiales. Si CD81 est nécessaire pour l’infection par P. falciparum et P. yoelii, les parasites P. berghei et P. vivax peuvent infecter des cellules n’exprimant pas cette protéine. Nous avons identifié deux protéines de la superfamille CD36, SR-BI et CD36, qui jouent un rôle lors de l’invasion CD81-indépendante. Ces résultats contribuent à l’élucidation des mécanismes d’entrée du parasite dans le foie et orientent vers la découverte des ligands parasitaires impliqués qui pourront être des cibles vaccinales. / Plasmodium sporozoites are transmitted by Anopheles mosquitoes and first infect the liver where the parasite replicates as a pre-requisite to the development of the pathogenic blood stage infection. Sporozoites infect hepatocytes by forming a parasitophorous vacuole differentiating into liver stages. Invasion involves parasite and host proteins but the underlying mechanisms remain unknown. To facilitate monitoring of sporozoite invasion, we generated novel transgenic fluorescent parasites, using a new selection strategy termed GOMO (Gene Out Marker Out). Using fluorescent P. yoelii strains and a robust cellular system we further characterized the temporal and molecular mechanisms of sporozoite invasion. We document that sporozoite productive invasion is preceded by a phase of cell traversal, and show that during cell traversal sporozoites enter transient vacuoles, which are distinct from parasitophorous vacuoles. We also uncovered that the perforin-like protein mediates sporozoite egress from transient vacuoles and escape from degradation by the host cell lysosomes. We studied the role of host factors implicated during the productive invasion of rodent and human Plasmodium species. We knew that P. falciparum and P. yoelii sporozoites require CD81 for infection and that P. berghei and P. vivax can infect cells lacking CD81. We identified two members of CD36 superfamily, SR-BI and CD36, as host entry factors defining a CD81-independent entry route. These results pave the way toward the elucidation of the mechanisms of sporozoite invasion and the identification of parasite ligands that mediate host cell entry, which would constitute potential targets for a malaria vaccine.

Cette thèse de doctorat analyse les inégalités écologiques dans les villes africaines, à travers l’exemple de Cotonou au Bénin, à l’aune du choléra. En tant que pathologie liée à l’exposition à un environnement insalubre, le choléra constitue un marqueur pertinent des inégalités écologiques, qu’il s’agisse d’inégalités d’exposition aux nuisances environnementales, d’accès aux aménités urbaines, de pouvoir d’interpellation de la puissance publique face aux nuisances environnementales ou de participation aux projets environnementaux. A travers l’approche par « effet de lieu », nous avons montré que l’incidence différentielle du choléra entre les arrondissements et les quartiers de Cotonou est liée non seulement à l’effet combiné du milieu et des profils socio-économiques, aux pratiques sociales, mais aussi aux politiques publiques, inspirées parfois des recommandations internationales dans le domaine de l’environnement, et qui occultent le contexte socio-politique local. / This doctoral thesis analyses the ecological inequalities in the african cities, by focusing on the example of Cotonou in Benin, with regard to cholera. As a pathology related to the exposure to an unhealthy environment, cholera forms a relevant marker of the ecological inequalities under all their forms: whether they are inequalities of exposure to the environmental nuisances, access to urban amenities, capacity to question the public power as far as environmental nuisances are concerned or participation in environmental projects. Through the approach by “effect of place”, we showed that the differential incidence of the cholera between the districts of Cotonou is related not only to the combined effect of the environment and the socio-economic profiles, social practices, but also with the public policies, inspired sometimes of the international recommendations in the field of the environment, and that overlook the socio-political local context.