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Caractérisation d’un variant d’épissage alternatif du gène FANCE et son impact sur la voie de réparation de l'ADN FANC-BRCABouffard, Frédérick 23 April 2018 (has links)
Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016 / Divers évènements d’épissage alternatif ont été identifiés pour certains gènes de la famille FANC, notamment pour FANCE. La voie de réparation de l’ADN FANC-BRCA nécessite l’intégrité de l’ensemble des protéines Fanconi afin d’assurer l’efficacité de la réparation des pontages inter-brins. Nous avons alors étudié l’impact de l’expression du variant d’épissage alternatif FANCE∆4 au niveau de la voie FANC-BRCA. Son expression exclusive dans des cellules déficientes en FANCE (EUFA130) n’est pas suffisante pour restaurer l’activation de la voie de réparation. À la suite d’un traitement avec un agent pontant (mitomycine C), les cellules EUFA130 complémentées avec FANCE∆4 demeurent bloquées en phase G2/M du cycle cellulaire, la viabilité n’est pas augmentée et la monoubiquitination de FANCD2 et FANCI est absente, contrairement aux cellules EUFA130 complémentées avec FANCE. Ce projet a particulièrement permis de déterminer que FANCE∆4 n’est pas en mesure de se substituer lors de la perte de FANCE. / Several alternative splicing events were identified for some genes of the FANC family, such as FANCE. The integrity of the proteins of the FANC-BRCA DNA repair pathway is necessary to maintain efficient ICL repair. We studied the impact of the expression of an alternative splicing isoform, FANCE∆4. Its exclusive expression in FANCE-deficient cells (EUFA130) is not sufficient to restore the activation of the pathway. Following treatment with crosslink agent (mitomycin C), EUFA130 cells complemented with FANCE∆4 are blocked in G2/M phase of the cell cycle, the viability is not increased and the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI is absent, in contrast to EUFA130 cells complemented with FANCE. This project highlights FANCE∆4 that cannot replace FANCE in regard to DNA repair.
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Regulation of DNA double-strand break resection in human cellsRonato, Daryl A. 25 March 2024 (has links)
Titre de l'écran-titre (visionné le 5 septembre 2023) / L'instabilité génomique est considérée comme l'une des « caractéristiques du cancer ». Au cours des dernières décennies, divers processus de réparation de l'information génétique ont été découverts, nous permettant de mieux comprendre comment la dérégulation de ces processus peuvent conduire au développement du cancer. Notre groupe de recherche s'intéresse particulièrement au processus de réparation des cassures double-brin (DSBs) de l'ADN, la forme la plus nocive de dommages à l'ADN. La jonction d'extrémités non homologues canonique (c-NHEJ) et la recombinaison homologue (HR) sont les principales voies de réparation des DSBs. Afin d'enclencher la réparation des DSBs, les cellules régulent soigneusement le choix entre ces deux processus de réparation. Le processus de résection de l'ADN facilite le choix entre ces voies de réparation. La résection de l'ADN est caractérisée par la dégradation de l'ADN pour créer un long substrat d'ADNsb favorisant la réparation par HR. En revanche, l'inhibition de la résection de l'ADN favorise la réparation des DSB par la voie c-NHEJ. Les mutations de perte de fonction des protéines impliquées dans la facilitation de la résection de l'ADN conduisent souvent à des troubles génétiques et au développement de cancers. Le développement du cancer a souvent été associé à des mutations de BRCA1, une protéine impliquée dans la résection de l'ADN et le processus de réparation des RH. La létalité synthétique est devenue un concept important dans la réparation de l'ADN et la recherche sur le cancer. Il décrit le phénomène par lequel l'inactivation simultanée de deux événements conduit à la létalité cellulaire, même si chaque événement individuellement est toléré. Le traitement contre le cancer basé sur la létalité synthétique le plus efficace qui ait été développé jusqu'à présent utilise les inhibiteurs de PARP (PARPi). PARP-1 dans une protéine impliquée dans divers processus cellulaires, dont la régulation de la réparation de l'ADN. Il a été constaté que l'inhibition de PARP-1 est synthétiquement létale avec un déficit en HR. Les tumeurs déficientes en HR, sont sensibles aux PARPi alors que leurs homologues cellulaires normaux HR-compétents tolèrent le traitement. Cependant, bien qu'il s'agisse d'une option de traitement prometteuse, de nombreux patients développent encore une résistance aux PARPi. Une façon par laquelle les tumeurs déficientes en BRCA1 développent une résistance à PARPi est la réactivation de la résection de l'ADN. En l'absence de BRCA1 fonctionnel, les inhibiteurs de la résection de l'ADN empêchent l'utilisation de HR pour la réparation des DSBs. Des mutations de perte de fonction dans ces inhibiteurs de la résection de l'ADN entraînent la réactivation de la résection de l'ADN et de la HR. Par conséquent, il est important de comprendre la relation entre les protéines qui facilitent la résection de l'ADN et celles qui l'inhibent. Avec cette compréhension, de meilleures approches pour atténuer le développement de la résistance peuvent être développées. Dans cette thèse, nous approfondissons la relation entre l'inhibition de la résection de l'ADN et le développement de la résistance aux PARPi. Nous discutons du processus de résection de l'ADN et de la façon dont divers inhibiteurs de la résection de l'ADN fonctionnent pour inhiber la réparation par RH. Nous décrivons une méthode pour développer de nouveaux inhibiteurs chimiques qui peuvent être utilisés pour cibler MRE11, une composante importante de la machinerie de résection de l'ADN. De plus, nous avons identifié un nouvel inhibiteur de la résection de l'ADN, DYNLL1, et caractérisons son rôle dans l'inhibition de la résection de l'ADN. Enfin, nous contribuons davantage à la compréhension du mécanisme d'action d'un inhibiteur connu de la résection de l'ADN, RIF1. En outre, nous identifions une nouvelle interaction synthétique létale entre RIF1 et MRE11 qui pourrait être avantageuse dans le développement d'un nouveau traitement contre le cancer avec un défaut dans l'une ou l'autre des protéines. En résumé, nous décrivons de nouveaux mécanismes d'action pour la régulation négative de la résection de l'ADN impliquant DYNLL1 et RIF1. De plus, ces résultats placent MRE11 au cœur de la régulation de la résection de l'ADN, soulignant l'importance du développement de nouveaux inhibiteurs chimiques qui le ciblent. / Genomic instability is considered to be one of the "Hallmarks of Cancer". In recent decades, research on the topic has uncovered various DNA repair processes that cells use to maintain genome stability. This has also given us a better understanding of how errors from and dysregulation of these processes can lead to cancer development. Our research group is particularly interested in the repair process for DNA double-strand breaks (DSBs), the most harmful form of DNA damage. Canonical Non-Homologous End-Joining (c-NHEJ) and Homologous (HR) Recombination are the major DSB repair pathways. In order to facilitate proper DSB repair, cells carefully regulate the choice between these two repair processes. One manner in which cells facilitate the choice between these two pathways is through the process of DNA resection. DNA resection is the degradation of DNA following DSB induction to create a long ssDNA substrate that favours HR repair. In contrast, inhibition of DNA resection favours DSB repair through the c-NHEJ pathway. Loss-of-function mutations of proteins involved in facilitating DNA resection often lead to genetic disorders and cancer development. Cancer development has often been associated with mutations in BRCA1, a protein involved in the DNA resection and HR repair process. Synthetic lethality has become an important concept in DNA repair and cancer research. It describes the phenomenon wherein the simultaneous occurrence of two events leads to unviability or lethality, in this case of the cell, even though each event individually is tolerated. In cancer research, this has been taken advantage of when developing novel treatments particularly in cancer types with a frequently occurring mutation. The most successful synthetic lethality-based cancer treatment that has been developed thus far has been PARP inhibitors (PARPi). PARP-1 in a protein involved in various cellular processes, including the regulation of DNA repair. It was found that PARP-1 inhibition is synthetically lethal with a deficiency in HR. It was found that HR-deficient tumours, especially those with a loss-of-function mutations in BRCA1, are sensitive to PARPi treatment whereas their HR-proficient normal cell counterparts tolerated the treatment. In the clinic, this meant that patients with cancers that are BRCA1-deficient can be effectively treated with PARPi. However, although a promising treatment option, many of the patients still develop PARPi resistance requiring the need for other treatment options. It has been found that one manner in which BRCA1-deficient tumours develop PARPi-resistance is through the reactivation of DNA resection. In the absence of functional BRCA1, DNA resection inhibitors prevent the use of HR for the repair of DSBs. One of the ways these tumours develop PARPi-resistance is by developing loss-of-function mutations in these DNA resection inhibitors. These mutations lead to the reactivation of DNA resection and HR. Therefore, it is important to understand the relationship between proteins that facilitate DNA resection and those that inhibit it. With this understanding, better approaches for mitigating development of resistance can be developed. To further understand the relationship between DNA resection inhibition and PARPi-resistance development, we discuss what is known in the literature about the DNA resection process and how various DNA resection inhibitors work in order to inhibit HR repair. We describe a method for developing novel chemical inhibitors that can be used to target DNA repair proteins using MRE11--an important component of the DNA resection machinery--as an example. Furthermore, we identify a novel DNA resection inhibitor, DYNLL1, and characterize its role in DNA resection inhibition. Lastly, we contribute further to the understanding of the mechanism of action of a known DNA resection inhibitor, RIF1. Furthermore, we identify a novel synthetic lethal interaction between RIF1 and MRE11 that could be advantageous in the development of novel cancer treatment with defect in either protein. In summary, we describe novel mechanisms of action for the negative regulation of DNA resection involving DYNLL1 and RIF1. Furthermore, these results put MRE11 at the heart of DNA resection regulation highlighting the importance of development of novel chemical candidates that target it.
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La recombinaison homologue : mécanismes et criblage de molécules chimiquesPeterlini, Thibaut 21 August 2024 (has links)
Le matériel génétique des cellules de notre organisme est continuellement exposé à différents types d'agressions. En effet, on estime qu'une cellule subit des dizaines de milliers de lésions dans l'ADN par jour. Ces dernières peuvent provoquer une instabilité génomique, une caractéristique du cancer, si elles ne sont pas réparées adéquatement. La recombinaison homologue (RH) est un des mécanismes de réparation des cassures double-brin de l'ADN. À la suite de l'action de nucléases sur les cassures double-brin, des extrémités simple-brin 3'-protubérants sont générées et protégées par la protéine RPA. Celle-ci doit ensuite être enlevée par l'activité médiatrice des protéines PALB2 et BRCA2 afin de permettre à la recombinase RAD51 de polymériser sur l'ADN et catalyser l'invasion du brin endommagé au niveau de la chromatide sœur. PALB2, est au cœur de ce processus, coordonnant les fonctions des protéines BRCA1/BRCA2 et interagissant avec l'ADN brisé pour faciliter la RH. Dans un premier temps, nous avons identifié un site majeur de liaison à l'ADN de PALB2 dans lequel des mutations réduisent de 50% la formation des foyers RAD51 et l'efficacité globale de la HDR (Homology-directed repair) dans les cellules. Le domaine de liaison à l'ADN situé en N-terminal de PALB2 (N-DBD) stimule la fonction recombinase de RAD51. Étonnamment, il possède une activité d'échange de brins sans RAD51. De plus, N-DBD stimule l'échange de brins inverse et peut utiliser des substrats d'ADN et d'ARN. Ces résultats révèlent une propriété d'interaction polyvalente de PALB2 et démontrent un rôle essentiel de la liaison à l'ADN par PALB2 pour la réparation des chromosomes dans les cellules. Ensuite, nous avons utilisé la microscopie électronique à transmission combinée à la biochimie pour caractériser la participation séquentielle de RPA, RAD52 et BRCA2 dans l'assemblage, l'architecture et l'activité du filament RAD51. Nous avons observé que RAD52 peut se lier étroitement à l'ADN simple-brin revêtu de RPA, inhiber le rôle médiateur de BRCA2 et former des filaments mixtes contenant RAD52 et RAD51 plus courts. Ces derniers sont plus efficaces dans la recherche d'homologie ultérieure, dans la formation de complexes synaptiques et de D-loops et entraine des multi-invasions plus fréquentes Une déficience dans la RH peut mener à une instabilité génomique et aux cancers. Dans la plupart des cas, ces défauts de réparation des cassures double-brin par RH surviennent à la suite d'altérations génétiques dans les gènes impliqués dans ce mécanisme tels que BRCA1, PALB2 et BRCA2. Ces tumeurs déficientes en RH peuvent être traitées par des inhibiteurs de PARP grâce au concept de létalité synthétique. En effet, il a été observé que l'inhibition de PARP-1, une protéine impliquée dans la réparation de l'ADN, entraine une létalité synthétique dans ces tumeurs déficientes sans pour autant affecter les tissus sains. Cependant, de nombreux patients vont développer une résistance à ces inhibiteurs de PARP, seulement quelques mois après le début du traitement, entrainant ainsi une récidive du cancer. C'est pourquoi il apparait essentiel de trouver de nouvelles options thérapeutiques. Nous avons utilisé plusieurs molécules commerciales dérivées du DIDS (4,4′-Diisothiocyano-2,2′-stilbenedisulfonic acid), un inhibiteur de RAD51, pour caractériser les déterminants structuraux impliqués dans la modulation de l'activité de RAD51. En combinant des approches biochimiques et biophysiques, nous avons montré que le DIDS et deux analogues étaient capables d'inhiber la liaison de RAD51 à l'ADN simple-brin et d'empêcher la formation de structure D-loop par RAD51. Les deux substituants isothiocyanate du DIDS semblent être essentiels dans l'inhibition de RAD51. Ces résultats ouvrent la voie à la synthèse de nouvelles molécules dérivées du DIDS qui devraient être de plus grands modulateurs de RAD51 et plus efficaces pour l'inhibition de la RH. Finalement, nous avons identifié de nouvelles molécules qui inhibent la RH. Pour cela, nous avons mis au point une technique de criblage *in cellulo* permettant de tester l'effet direct de composés chimiques sur la formation des foyers RAD51. À l'aide de cette technique, nous avons identifié que, parmi 1381 molécules chimiques, l'enzyme nicotinamide phosphoribosyltransférase (NAMPT) pouvait être une cible thérapeutique intéressante pour le traitement de certaines tumeurs notamment celles présentant une surexpression de RAD51 et celles ayant développé une résistance aux inhibiteurs de PARP. En effet, l'inhibition de NAMPT entraine une diminution drastique des foyers RAD51 ainsi que des niveaux protéiques de RAD51 et BRCA2 conduisant à la mort des cellules par apoptose. / The cellular genetic material is continuously exposed to different sources of damages. Indeed, it is estimated that a cell undergoes tens of thousands of DNA lesions per day. These will cause genomic instability, a characteristic of cancer, if they are not correctly repaired. Homologous recombination (HR) is one of the repair mechanisms for DNA double-strand breaks. As a result of the action of nucleases on double-strand breaks, single-stranded 3'-overhang ends are generated and protected by the RPA protein. PALB2 and BRCA2 proteins will then remove RPA to allow the RAD51 recombinase to polymerize on the DNA and catalyze the invasion of the damaged strand to the sister chromatid. PALB2, is central to this process, coordinating the functions of the BRCA1/BRCA2 proteins and interacting with broken DNA to facilitate HR. First, we identified a major DNA-binding site of PALB2, mutations in which reduce RAD51 foci formation and the overall HDR (Homology-directed repair) efficiency in cells by 50%. PALB2 N-terminal DNA-binding domain (N-DBD) stimulates the function of RAD51 recombinase. Surprisingly, it possesses the strand exchange activity without RAD51. Moreover, N-DBD stimulates the inverse strand exchange and can use DNA and RNA substrates. Our data reveal a versatile DNA interaction property of PALB2 and demonstrate a critical role of PALB2 DNA binding for chromosome repair in cells. Then, we have used Transmission Electron Microscopy combined with biochemistry to characterize the sequential participation of RPA, RAD52 and BRCA2 in the assembly of the RAD51 filament, its architecture and its activity. Despite our results confirm that RAD52 lacks a mediator activity, we observed that RAD52 can tightly bind to RPA-coated ssDNA, inhibit the mediator role of BRCA2 and form shorter RAD52- and RAD51-containing mixed filaments that are more efficient in subsequent homology search and formation of synaptic complexes and D-loops, resulting in more frequent multi-invasions as well. A deficiency in HR can lead to genomic instability and cancers, notably breast and ovarian cancers. Most commonly, these defects in the repair of double-strand breaks by RH arise as a result of genetic alterations in the genes involved in this mechanism such as BRCA1, PALB2 and BRCA2. HR-deficient tumors can be treated with PARP inhibitors leading to synthetic lethality. Indeed, it has been observed that the inhibition of PARP-1, a protein involved in DNA repair, leads to synthetic lethality in these deficient tumors without affecting healthy tissues. However, many patients will develop resistance to these PARP inhibitors only a few months after starting treatment, leading to cancer recurrence. Therefore, it seems essential to find new therapeutic options. We used several commercial molecules derived from DIDS (4,4′-Diisothiocyano-2,2′-stilbenedisulfonic acid) to characterize the structural determinants involved in modulating the activity of RAD51. By combining biochemical and biophysical approaches, we have shown that DIDS and two analogs were able to inhibit the binding of RAD51 to ssDNA and prevent the formation of D-loop by RAD51. Both isothiocyanate substituents of DIDS appear to be essential in the inhibition of RAD51. These results open the way to the synthesis of new molecules derived from DIDS that should be greater modulators of RAD51 and more efficient for HR inhibition. Finally, we identified new molecules that inhibit HR. We have developed an *in cellulo* screening technique to test the direct effect of chemical compounds on the RAD51 foci formation. Using this technique, we have identified that, among 1381 chemical molecules, the enzyme nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) could be an interesting therapeutic target for the treatment of certain tumors, in particular those presenting an overexpression of RAD51 and those having developed a resistance to PARP inhibitors. Indeed, inhibition of NAMPT leads to a drastic decrease in RAD51 foci as well as protein levels of RAD51 and BRCA2 leading to cell death by apoptosis.
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Domaines protéiques du complexe histone acétyltransférase NuA4 impliqués dans la transcription et le maintien de l'intégrité du génomeFortin, Israël 11 April 2018 (has links)
Le complexe Histone Acétyltransféranse (HAT) NuA4 s'inscrit comme un élément clef dans le contrôle de plusieurs fonctions cellulaires essentielles chez les eucaryotes. L'implication maintenant connu de NuA4 dans la transcription et dans la réponse aux dommages à l'ADN nous ont poussé à approfondir la caractérisation fonctionnelle des diverses sous-unités de NuA4, notamment au niveau des rôles que peuvent occuper les différents domaines protéiques retrouvés au sein de ce complexe. Une première série d'analyses a démontré l'importance de plusieurs résidus du chromodomaine de Esa1, la sous-unité catalytique de NuA4. La mutation de ces résidus engendre des défauts majeurs d'acétylation de la chromatine, suggérant ainsi un rôle du chromodomaine dans l'activité catalytique de Esa1. Parallèlement, d'autres études ont permis d'approfondir la fonction du domaine SANT de la protéine Eaf2, du PHD finger de Yng2 et du domaine PI-3 kinase de Tra1. Ce dernier domaine intéragit avec le complexe MRX, un complexe de levure recruté directement au site de cassure de l'ADN. Des recherches menées autour de l'étude de l'activité kinase de cette protéine ont permis de suggérer l'implication de NuA4 dans les événements précoces survenant suite à un bris double brin, précisant ainsi le rôle de ce complexe dans la réparation de l'ADN.
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Le suppresseur de tumeurs PALB2 : étude fonctionnelle du domaine N-terminal de liaison à l'ADN et établissement de modèles de létalité synthétiqueBrahiti, Nadine 21 December 2024 (has links)
Les mécanismes de réparation de l’ADN sont cruciaux pour la survie cellulaire. Cependant, ces mécanismes sont souvent altérés dans les processus cancéreux permettant l’accumulation de mutations et d’instabilité génétique. Plusieurs voies de réparation sont utilisées par les cellules pour réparer différents types de dommages à l’ADN. La réparation des cassures double-brin (CDB) par la Recombinaison Homologue (RH) permet de réparer fidèlement ces lésions. PALB2 est au coeur d’un réseau d’interactions protéiques comprenant BRCA1 et BRCA2. Tout comme ces dernières, PALB2 est un gène de prédisposition au cancer du sein. Ainsi, par ses fonctions dans la stabilité du génome et le cancer, l’étude fonctionnelle de PALB2 et la compréhension du rôle de ses domaines sont essentiels. En effet, PALB2 se lie à l’ADN, mais les mécanismes induisant sa liaison et la fonction de cette liaison sont toujours mal compris. En ce sens, nos collaborateurs ont identifié quatre principaux acides aminés dans ce domaine, comme étant importants car leurs mutations en alanine compromettent la liaison de PALB2 à l’ADN. De ce fait, mon premier objectif porte sur l’étude fonctionnelle de ce domaine de liaison à l’ADN dans la recombinaison homologue. En accord avec les essais biochimiques conduits par nos collaborateurs, notre étude in vivo a pu démontrer que la mutation de ces résidus en alanine réduit de 50% la formation de foyers RAD51 aux dommages, réduisant ainsi l’efficacité de la RH dans ces cellules. Mon deuxième objectif, vise l’établissement de modèles de létalité synthétique pour tuer les cellules déficientes en réparation de l’ADN. Le but est d’identifier de nouveaux interacteurs de PALB2 par la technique BioID et qui seraient synthétiquement létaux en combinaison avec d’autres mutations génétiques. Enfin, il a été démontré que les inhibiteurs de PARP amènent à une létalité synthétique dans les cellules déficientes en PALB2. Cependant, ces études ne prennent pas en compte l’aspect tridimensionnel de la tumeur cancéreuse. C’est pourquoi, dans mon projet j’ai initié le développement de modèles 3D qui pourraient possiblement aider à l’évaluation des stratégies de létalité synthétique, se rapprochant ainsi du contexte physiologique de la tumeur.
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Rôle de la poly (ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1)dans la réparation de l'ADN par excision de nucléotidesRobu, Mihaela 16 April 2018 (has links)
Les dommages directs induits à l'ADN par les radiations ultraviolettes (UV) sont éliminés grâce à la réparation par excision de nucleotides (NER). La poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) est une enzyme impliquée dans différentes voies de réparation de l'ADN. Notre laboratoire a montré que la PARP-1 était activée par les dommages directs dus aux UV et que son absence retarde significativement la réparation de ces dommages dans un gène rapporteur viral. Le but de ce projet était de déterminer si la PARP-1 affectait le NER de l'ADN génomique des cellules eucaryotes. Nous avons observé un délai dans la réparation des dommages directs à l'ADN causés par les UV dans les cellules eucaryotes n'exprimant pas la PARP-1. De plus, la PARP-1 immunoprécipite in vivo avec des protéines impliquées dans la phase de reconnaissance de ces dommages. Nos résultats montrent donc que la PARP-1 joue aussi un rôle dans le NER.
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Rôles du suppresseur de tumeurs PALB2 dans la réparation des cassures double-brin de l'ADNBuisson, Rémi 23 April 2018 (has links)
Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / Une personne sur trois au Canada sera affectée par une forme de cancer durant son existence. Aujourd’hui, il a été clairement démontré que les mutations dans l'information génétique sont l'événement initiateur du cancer. Les cassures double-brin de l'ADN font partie des lésions les plus dangereuses retrouvées dans les cellules puisqu'elles peuvent induire des mutations menant au cancer. La cellule possède plusieurs mécanismes pour réparer les cassures double-brin de l’ADN. La réparation par recombinaison homologue est le seul de ces mécanismes permettant aux cellules de réparer les cassures double-brin de l’ADN de manière fidèle sans créer d’autres mutations. Ce mécanisme dépend en majeure partie de la protéine RAD51 qui en catalyse les étapes essentielles. RAD51 a besoin d’autres cofacteurs appelés médiateurs, comme la protéine BRCA2, pour son fonctionnement. Récemment, PALB2 a été identifiée comme un régulateur clé de RAD51 et BRCA2, et donc de la réparation par recombinaison homologue. Les individus, avec des mutations de PALB2, possèdent une prédisposition au cancer du sein et à l’anémie de Fanconi. Le projet de mon doctorat consiste en la caractérisation biochimique de la protéine PALB2 afin de comprendre son rôle dans le contrôle et le fonctionnement de la réparation par recombinaison homologue. Nous avons montré que la protéine PALB2, comme BRCA2, est un médiateur de la recombinaison homologue. Dans les cellules, l’activité de PALB2 est contrôlée par sa dimérisation. En présence de dommages à l’ADN, la monomérisation de PALB2 provoque son activation et la stimulation de la formation du filament de RAD51. Finalement, nous avons découvert un nouveau partenaire des médiateurs PALB2 et BRCA2 : la polymérase r
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Analyse fonctionnelle d'un variant d'épissage de FANCL contenant une exlusion de l'exon 4 sur la réparation de l' ADN dans la voie FANC-BRCASt-Laurent Pedneault, Christopher 19 April 2018 (has links)
L’anémie de Fanconi (FA) est une maladie congénitale rare résultant d’une mutation sur chaque allèle parental d’un gène FANC. Nous avons récemment identifié un variant d'épissage de FANCL contenant une exclusion de l'exon 4. Une analyse par minigène nous a permis de démontrer que le polymorphisme de séquence (SNP) rs7958831 augmente substantiellement le saut de l'exon 4 de FANCL, et que les porteurs de ce SNP ont une quantité significativement plus élevée de transcrits FANCL∆4. L'étude de fractions ribosomales nous a permis de confirmer que le transcrit alternatif est bel et bien traduit en protéine. Toutefois, une protéine de fusion FANCL∆4-GFP ne migre pas au noyau comme le fait FANCLwt-GFP. L'isoforme FANCL∆4 n'est pas en mesure d'accomplir la fonction principale de FANCL, soit de monoubiquitiner FANCD2. De plus, des cellules EUFA868 déficientes en FANCL complémentées avec FANCL∆4 ne retrouvent pas leur phénotype normal en test de survie et ont une proportion plus importante bloquée en phase G2/M. Ces résultats nous permettent de penser que le SNP rs7958831 pourrait moduler le risque de cancer du sein puisque l'isoforme FANCL∆4 ne semble pas fonctionnelle.
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Rôles des paralogues de RAD51 humains dans la recombinaison homologue et le maintien de la stabilité du génome en mitoseRodrigue, Amélie 17 April 2018 (has links)
Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / De toutes les lésions qui menacent l'intégrité du génome, les cassures double-brin (CDBs) de l'ADN sont l'une des plus délétères, puisque toute cassure mal réparée suffit à induire des mutations et des translocations chromosomiques pouvant mener au cancer. La recombinaison homologue (RH) est un processus permettant aux cellules de réparer les CDBs de façon fidèle sans créer de mutations. Chez les eucaryotes supérieurs, ce mode de réparation repose en grande partie sur les fonctions catalytiques de la recombinase RAD51 et des évidences génétiques démontrent que ses paralogues, RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2 et XRCC3, sont également des acteurs clés dans ce processus. Jusqu'à présent, les paralogues de RAD51 n'ont été que très peu caractérisés sur le plan cellulaire et moléculaire si bien que leurs fonctions précises demeurent mal définies. Dans cette étude, nous apportons des évidences implicant les paralogues de RAD51 humains dans les étapes précoces de la RH. Plus précisément, nous démontrons que le paralogue RAD51C interagit avec la recombinase RAD51 et qu'il est requis pour l'assemblage de cette dernière en foyers de réparation. De plus, nous établissons par des immunoprécipitations de chromatine que les paralogues sont recrutés à proximité d'une CDB unique en phase S-G2 du cycle cellulaire et nous montrons par immunofluorescence que RAD51C s'y accumule en foyers, une signature des enzymes de réparation. Par ailleurs, nous avons découvert que les paralogues de RAD51 jouent un rôle crucial dans la progression du cycle cellulaire. Tandis que l'inhibition par ARN interférence de RAD51B ou RAD51C provoque un arrêt prolongé en G2-M, celle de XRCC3 favorise l'entrée en mitose par le phénomène d'adaptation. La microscopie en temps réel a démontré que la perte de XRCC3 engendre un délai mitotique qui s'accompagne d'une fréquence élevée d'anomalies de centrosomes et de défauts de ségrégation chromosomique (micronoyaux et ponts anaphases). Des phénotypes mitotiques comparables sont obtenus suivant la depletion de la résolvase GEN1. Conséquemment, nous proposons qu'une fonction tardive de XRCC3 et de GEN1 dans la RH, soit au niveau de la résolution des jonctions de Holliday, puisse être à l'origine de ces aberrations mitotiques. L'ensemble de ces données permet d'éclaircir les fonctions distinctes et communes des paralogues de RAD51 lors de la RH ainsi que leur rôle dans le maintien de la stabilité du génome en mitose.
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La réparation de l'ADN par la recombinaison homologue et le développement de molécules anticancéreusesPauty, Joris 23 April 2018 (has links)
Le cancer est une cause majeure de décès dans le monde. Il est à présent établi que les mutations de l'information génétique des cellules initient et participent à son développement, et que certaines mutations transmises au sein des familles prédisposent à son apparition. C'est le cas notamment des mutations des gènes BRCA1 et BRCA2 qui prédisposent aux cancers du sein et de l'ovaire. Les protéines produites par ces gènes sont directement impliquées dans la protection de l'information génétique puisqu'elles participent à la réparation des cassures se produisant dans le support de cette information : l'ADN. L'ADN peut être endommagé par diverses lésions mais les plus déstabilisatrices de l'information génétique sont les cassures double-brin. Afin de protéger son génome, la cellule possède de nombreux mécanismes de réparation dont la recombinaison homologue qui permet une réparation fidèle, c'est-à-dire sans perte ou modification de l'information génétique, permettant ainsi de prévenir l'apparition du cancer. La recombinaison homologue repose principalement sur l'activité de la protéine RAD51 qui nécessite l'utilisation des médiateurs BRCA2 et PALB2. Tout comme les gènes BRCA1 et BRCA2, PALB2 est un gène suppresseur de tumeur et ses mutations ont été associées avec une susceptibilité aux cancers du sein, de l'ovaire et du pancréas. En plus de la chirurgie, le traitement de ces cancers implique la radiothérapie et la chimiothérapie. Celles-ci font l'objet d'intenses recherches afin de proposer de nouveaux traitements plus efficaces avec moins d'effets secondaires. De nouvelles stratégies chimiothérapeutiques ont notamment émergé et on s'oriente à présent vers le développement de traitements personnalisés qui sont basés sur une meilleure connaissance des spécificités moléculaires des tumeurs. Les travaux présentés dans cette thèse apportent de nouvelles informations concernant le rôle de PALB2 dans la protection du génome lors du stress réplicatif et sur la régulation de ses fonctions par le contrôle de sa localisation cellulaire. Plus précisément, nous montrons que PALB2 et BRCA2 permettent de maintenir la Polymérase η au niveau des fourches de réplication bloquées et stimulent son activité de synthèse de l'ADN pour réinitier la réplication. Grâce à l'analyse de mutations germinales identifiées dans des cancers du sein et de l'ovaire, nous révélons la présence d'une séquence d'export nucléaire qui provoque l'exclusion de PALB2 du noyau vers le cytoplasme. Enfin, nous rapportons le développement d'une nouvelle molécule chimiothérapeutique, SFOM-0046, qui provoque des cassures double-brin de l'ADN en induisant un stress réplicatif et qui potentialise les effets de l'UCN-01, une molécule qui a été étudiée en clinique. Nous proposons l'utilisation de cette nouvelle molécule comme agent d'amélioration de thérapies ciblées existantes ou pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses personnalisées.
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