L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est caractérisée par l’obstruction des artères pulmonaires, principalement due au phénotype pro-prolifératif/anti-apoptotique des cellules musculaires lisses de la paroi des artères pulmonaires (CMLAP). L’augmentation progressive des résistances vasculaires pulmonaires aboutit à une élévation de la pression pulmonaire qui va induire rapidement une insuffisance cardiaque droite et conduire au décès des patients à moyen terme. Plusieurs études ont démontré l’implication du facteur de transcription NFAT (nuclear factor of activated T cell) dans le maintien du phénotype pro-prolifératif/anti-apoptotique des CMLAP-HTAP. Cependant les voies de signalisation responsables de l’activation constitutive d’NFAT restent peu connues. Durant mon doctorat, j’ai étudié les mécanismes responsables de l’activation d’NFAT dans l’HTAP. Nous nous sommes intéressés au rôle des microARN et notamment à miR-204. Ainsi, les facteurs circulants augmentés dans HTAP, diminue l’expression de miR-204 via l’activation du facteur de transcription STAT3. Par un mécanisme de rétro-action positive, la diminution de miR-204 induit une suractivation de STAT3 aboutissant au phénotype pathologique. Ainsi, l’augmentation exogène de miR-204 permettrait de soigner l’HTAP in vitro et in vivo. Nous avons montré que miR-204 va également moduler l’expression de Runx2, facteur de transcription connu pour être impliqué dans la calcification. Dans les CMLAP-HTAP, la diminution de miR-204 est associée à une augmentation de l’expression de Runx2, connu comme un régulateur positif de l’activation du facteur de transcription HIF-1 impliqué dans l’HTAP. Ainsi la modulation de miR-204 affecte la prolifération et l’apoptose des CMLAP-HTAP par plusieurs axes de signalisation. Enfin, nous avons démontré l’implication du facteur de transcription Krüppel Like Factor 5 (KLF5) dans l’HTAP. La surexpression de KLF5 dans l’HTAP est secondaire à l’activation de STAT3, tandis que son inhibition diminue la prolifération et favorise l’apoptose des CMLAP-HTAP. In vivo, l’administration de siKLF5 renverse l’HTAP en diminuant les pressions pulmonaires, l’hypertrophie ventriculaire droite, la prolifération et augmentant l’apoptose des CMLAP des artères pulmonaires distales. Finalement, j’ai étudié différents aspects du développement de l’HTAP et notamment de l’activation de l’axe STAT3/NFAT. Nous avons pu mettre en évidence que cibler cette voie de signalisation par différents moyens (mimic miR-204, siRunx2, siSTAT3, siKLF5) semble une bonne stratégie pour traiter l’HTAP. Mots clés : l’hypertension artérielle pulmonaire, thérapeutique, prolifération, apoptose, microARN, facteur de transcription, réparation à l’ADN. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is characterized by the obstruction of the pulmonary arteries, mainly due to the pro-proliferative and anti-apoptotic phenotype of the pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC). The progressive increase of pulmonary vascular resistance first leads to an increase of pulmonary pressure and then leads to a right heart failure, which generates patient’s death within few years. Many studies demonstrated the implication of the transcription factor NFAT (nuclear factor of activated T cell), which maintains the pro-proliferative and anti-apoptotic phenotype in PAH-PASMC. However, pathways that lead to the constitutive NFAT activation remain unclear. During my doctorate, I studied mechanisms responsible for the activiation of NFAT in HTAP. We study the role of the microRNA and more exactly to miR-204. Thus, the circulating factors, which are increased in PAH and which decreased miR-204 expression in PAH, via the transcription factor STAT3 activation. Through a positive regulation loop mechanism, the decrease of miR-204 induces an overactivation sustain of STAT3 leading to the pathologique phenotype. Thus, the exogenous increase of miR-204 could treat PAH in vitro as well as in vivo. We demonstrated that miR-204 is able to modulate the expression of the transcription factor Runx2 known to be implicated in calcification. In PAH-PASMC, the decrease of miR-204 is associated to an increase of Runx2 expression, known as positive regulator of the HIF-1 activation implicated in PAH. Thus miR-204 modulations affected the proliferation and apoptosis of PAH-PASMC through many molecular axes. Finaly we reveal the implication of the transcription factor Kruppel Like Factor 5 (KLF5) in PAH. The KLF5 overexpressed in PAH is associated to the STAT3 activation, wherease its inhibition decreased the proliferation and promoted apoptosis in PAH-PASMC. In vivo, si KLF5 reversed PAH by decreasing pulmonary pressures, right ventricular hypertrophy, proliferation and increasing apoptosis in PASMC from distal PA. Finally, I studied many aspects implicated in PAH development and especially the STAT3/NFAT axis activation. We showed that targeting this pathway using many technics (mimic miR-204, siRunx2, siSTAT3, siKLF5) seem to be an interesting strategy to treat PAH. Key words: Pulmonary arterial hypertension, therapeutic, proliferation, apoptosis, microRNA, and transcription factor.

Les cancers du sein et des ovaires sont parmi les cancers gynécologiques les plus fréquents et meurtriers. Parmi les nombreux facteurs de risque de développer un cancer, on retrouve notamment l'instabilité génétique et les mutations. Par exemple, des mutations dans les gènes de réparation de l'ADN tels que BRCA1 ou BRCA2, tous les deux impliqués dans la réparation des cassures double-brin de l'ADN par recombinaison homologue (RH), augmentent la prévalence des cancers du sein et des ovaires puisque 70% des cancers du sein et 40% des cancers des ovaires en possèdent. En effet, une mutation dans la RH va mener à une instabilité génomique, créant des cassures simple-brin de l'ADN qui une fois répliquée deviendront des cassures double-brin de l'ADN, ce qui est très toxique pour les cellules. Depuis plusieurs dizaines d'années, les chercheurs se basent sur le concept de létalité synthétique afin de trouver des pistes thérapeutiques pour les patientes. En effet, lorsque dans la cellule, une voie de réparation est indisponible, une seconde voie pourra agir permettant la survie de celle-ci. Cependant, si cette seconde voie est inhibée, la cellule ne pourra pas réparer le dommage, et entrera en mort cellulaire. C'est sur ce principe que les inhibiteurs de PARP (PARPi) ont été développés et sont maintenant utilisés en clinique depuis 2014 pour traiter les patients atteints de cancer des ovaires, des seins, du péritoine, des trompes de Fallope, de la prostate ou du pancréas, dans un contexte de déficience pour les gènes BRCA1 ou BRCA2 ou lorsqu'un phénotype BRCAness est constaté. Si l'utilisation de ces drogues en clinique a été une révolution, 40% des patients ont par la suite développé une résistance, entrainant une non-réponse au traitement, une réponse partielle ou une récidive du cancer. Il est donc nécessaire de mieux comprendre comment fonctionnent ces drogues pour être en mesure de mieux étudier ces résistances afin d'offrir de meilleurs traitements, plus adaptés, aux patients. Dans ce contexte de résistance aux PARPi, de nombreuses équipes de recherche ont réalisé des criblages génétiques afin d'identifier des gènes de sensibilité ou de résistance à différents PARPi, dans un contexte BRCA1-déficient, BRCA2-déficient ou dans un contexte neutre. DYNLL1, une protéine composante de la chaine légère des dynéines, a été identifiée comme impliquée dans la résistance aux PARPi dans plusieurs criblages réalisés en 2018. En effet, il a été montré que DYNLL1 interagit avec des protéines de la réparation de l'ADN pour médier le choix de la voix de réparation, mais également pour inhiber l'étape cruciale de résection de l'ADN lors de la RH. L'absence de cette protéine dans un contexte BRCA1-déficient entraine une résistance des cellules à l'Olaparib, premier PARPi approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) en 2014. Dans cette étude, nous avons identifié le mécanisme biochimique par lequel DYNLL1 prévient la résection de l'ADN ainsi que le mécanisme de résistance aux PARPi dans les cellules de cancer du sein triple négatif dans un contexte déficient pour les gènes BRCA1 et DYNLL1 grâce à l'utilisation d'un modèle bidimensionnel puis tri-dimensionnel plus complexifié. Grâce à l'analyse de données publiques de l'expression de DYNLL1 dans des échantillons de cancers du sein et des ovaires, nous avons comparé la survie générale des patientes selon leur profil d'expression des protéines BRCA1 et DYNLL1. Nous avons également pris en compte DYNLL2, un paralogue de DYNLL1 homologue à plus de 93% et cependant jamais identifié dans les criblages de résistance, dans notre étude. Nous avons ainsi montré que si DYNLL2 ne semble pas avoir de rôle direct dans la résistance aux PARPi, son rôle dans la réparation de l'ADN mérite néanmoins d'être étudié. En résumé, cette étude apporte de nombreuses précisions sur le rôle de DYNLL1 dans la biologie des cancers du sein et des ovaires déficients pour BRCA1 qui pourront potentiellement permettre de l'utiliser comme biomarqueur pour orienter le choix thérapeutique des patientes dans le futur et ainsi grandement améliorer leur prise en charge. / Breast and ovarian cancers are amongst the most frequent and deadly gynecological cancers. Amid the different risk factors for tumorigenesis, we can find genetic instabilities and mutations. For example, mutations in the DNA repair pathways genes such as BRCA1 and BRCA2, both involved in double strand break repair and more specifically homologous recombination increase the prevalence for breast and ovarian cancer since 70% of breast cancer and 40% of ovarian cancer have some. Indeed, a mutation in homologous recombination leads to genomic instability which can create a single strand DNA break, which, once replicated, will become a double strand break, the most toxic DNA lesion for the cell. For the last decades, researchers have been using the concept of synthetic lethality to find new therapeutic approaches to treat the patients. Indeed, when in the cell, one DNA repair pathway isn't available, another pathway can be used for it to survive. However, if this second pathway is inhibited, the cell will not be able to repair the defect and will die. Based on this concept, PARP inhibitors have been used to treat patients with ovarian, breast, peritoneal, fallopian, pancreas and prostate cancers in a BRCA1/2-deficient or BRCAness context since 2014. The use of those drugs has been a revolution for patients' care, but sadly, 40% of them develop resistance to PARP inhibitors, leading to either no response to the treatment, a partial response, or a recurrence of the cancer. Therefore, it is necessary to better understand how those drugs work to study their resistance and offer better, or personalized treatments to the patients. In this context, many teams performed genetic screenings to identify genes involved in the sensitivity and resistance to PARP inhibitors, in a BRCA1 and/or BRCA2-deficient or in a neutral context. DYNLL1, a component of the dynein light chain, has been identified as involved in the resistance to PARP inhibitors in multiple screens performed in 2018. Indeed, it has been shown that DYNLL1 interacts with DNA repair proteins to mediate the repair pathway choice, but also to inhibit the important step of DNA resection in homologous recombination. The lack of this protein in a BRCA1-deficient context leads to a resistance of the cells to Olaparib, the first PARP inhibitor approved by the FDA in 2014. In this study, we identified the biochemical mechanism by which DYNLL1 prevents DNA resection as well as the PARP inhibitor resistance mechanism in triple negative breast cancer in a BRCA1 and DYNLL1 deficient context, using a two and three-dimensional cell model. Through an analysis of public data , we were able to compare the overall survival of the patients depending on the expression of BRCA1 and DYNLL1 in breast and ovarian cancers. In our study, we also considered DYNLL2, a paralog of DYNLL1, with 93% of homology that has however never been identified in the resistance screens. Thus, we showed that DYNLL2 doesn't seem to have a direct role in the resistance to PARP inhibitor, but that its role in DNA repair should be investigated. In brief, this study brings a lot of precisions on the role of DYNLL1 in the biology of BRCA1-deficient breast and ovarian cancers, which could potentially allow the use of this protein as a biomarker to facilitate the therapeutic choice for patients in the future, and largely improve their care.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2004-2005 / Les cancers cutanés sont associés à la formation des dimères cyclobutyliques de pyrimidine (DCP) générés par les ultraviolets (UV) du soleil. Nos résultats indiquent que les transversions T-->G retrouvées suite aux UVA sont dues aux DCP formés majoritairement sur les TT. Nous avons également démontré que, contrairement au dogme établi, les protéines réparant les mésappariements n'influencent pas la réparation des DCP. p53 a indéniablement une influence sur la réparation des DCP. Cependant, la lignée SW480, contenant un gène p53 double-muté, est fonctionnelle en réparation par excision de nucléotides des DCP. Normalement, un stress est nécessaire à l'activation des effecteurs de p53. Cependant, la protéine p53 double-mutée des SW480 active constitutivement p21, un effecteur de p53. L'activation des protéines réparant les DCP par p53 se fait probablement de la même façon que p21. L'éclaircissement de ces mécanismes a amené une meilleure compréhension de l'induction des cancers.

Adult Stem Cells (SCs) have been found in almost every organ. They are responsible for<p>homeostasis and tissue repair after injury. SCs reside and self-renew in the adult body<p>throughout the life of the organism. In rapid self-renewing organs, such as the skin, the<p>intestine and the blood, SCs divide many times during the life of the animal in order to sustain<p>the homeostatic needs of the tissue.<p>All cells of the body, including SCs, are constantly subjected to DNA assaults arising from<p>endogenous sources, such as reactive oxygen species (ROS) generated by cellular<p>metabolism, or exogenous assaults arising from the environment. The DNA damage response<p>(DDR) and DNA repair mechanisms protect cells from accumulating DNA damage by<p>inducing transient cell cycle arrest allowing DNA repair, triggering senescence or apoptosis.<p>DNA damages trigger the activation of the effectors of the DDR inducing a transient cell<p>cycle arrest, allowing DNA repair, or triggering a permanent arrest of the cell cycle or<p>apoptosis if damages are too extensive.<p>As skin is the outermost barrier of the body, epidermal cells, including SCs, are<p>continuously subjected to genotoxic stress, such as UV rays, ionizing radiation (IR) and<p>chemicals. The skin epidermis is composed of hair follicles (HFs), its associated sebaceous<p>gland (SG) and the surrounding inter-follicular epidermis (IFE). Different types of SCs<p>maintain the homeostasis of the skin; multipotent adult bulge SCs ensure the cyclic<p>regeneration of the HF and the repair of the epidermis after injury, while individual unipotent<p>SCs ensure homeostasis of the SG and the IFE.<p>In tissues with high cellular turnover, such as the epidermis, the numerous divisions that a<p>SC undergoes could result in the accumulation of replication-associated DNA damage. It has<p>been suggested that adult SCs may undergo asymmetric divisions in which the daughter SC<p>retains the older (thus “immortal”) DNA strand, while the daughter cell committed to<p>differentiation inherits the newly synthesized strand that may have incorporated replicationderived<p>mutations. The in vivo relevance of this mechanism is still a matter of intense debate.<p>We used multiple in vivo experimental approaches to investigate precisely how bulge SCssegregate their chromosomes during HF morphogenesis, SC activation and skin homeostasis.<p>Using pulse-chase experiments with two different uridine analogs together with DNAindependent<p>chromatin labelling, we showed that multipotent HF SCs segregate their<p>chromosomes randomly, and that the label-retention observed in the skin epidermis derives<p>solely from relative quiescence of skin SCs 1.<p>We investigated the in vivo response of multipotent adult HF bulge SCs to DNA damage<p>induced by IR. We showed that bulge SCs are profoundly resistant to DNA damage-induced<p>cell death compared to their more mature counterparts. Interestingly, we demonstrated that<p>resistance of bulge SCs to IR-induced apoptosis does not rely on their relative quiescence.<p>Moreover, we showed that DDR in SCs does not lead to premature senescence. We found that<p>two intrinsic cellular mechanisms participate in the resistance of bulge SCs to DNA damageinduced<p>cell death. Bulge SCs express higher level of the anti-apoptotic Bcl-2 and present<p>more transient activation of p53 due to a faster DNA repair activity mediated by a nonhomologous<p>end joining (NHEJ) mechanism. Since NHEJ is not error free, this property<p>might be a double-edged sword, supporting short-term survival of bulge SCs but impairing<p>long-term genomic integrity 2.<p>While we unveiled the relevance of DSBs repair by NHEJ in the skin epidermis, little is<p>known about the role of homologous recombination (HR) during the morphogenesis of the<p>skin epidermis. Brca1 is an essential protein for HR. Conditional deletion of Brca1 in the<p>developing epidermis leads to congenital alopecia accompanied by a decreased density of hair<p>placodes. The remaining HFs never produce mature hair and progressively degenerate due to<p>high levels of apoptosis. Multipotent adult HF bulge SCs cannot be detected in adult HF in<p>the Brca1 cKO epidermis. Brca1 deletion in the epidermis triggers p53 activation throughout<p>the epidermis, which activates apoptosis. Interestingly, IFE and the isthmus region of the HF<p>do not present any pathological phenotype by constitutive deletion of Brca1. Our results<p>demonstrated the critical role of Brca1 during HF morphogenesis. Future studies will be<p>required to understand the molecular mechanisms controlling this phenotype / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La fumée de tabac contient plusieurs substances carcinogènes qui mènent à la formation constante de petites quantités de dommages à l'ADN dans les poumons des fumeurs ainsi que des non-fumeurs exposés à la fumée environnementale de tabac. La 4-(méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) est l'une de ces substances et elle semble plus particulièrement associée avec le développement des adénocarcinomes, la forme de cancer pulmonaire dont l'incidence progresse le plus rapidement ces dernières années. Dans les cellules pulmonaires, la NNK est bioactivée via des cytochromes P450 en intermédiaires réactifs capables de méthyler ou de pyridyloxobutyler l'ADN. Les dommages résultant de ces deux modes d'activation de la NNK peuvent être investigués séparément en utilisant des analogues qui génèrent sélectivement l'un ou l'autre type d'intermédiaires réactifs. Le test des comètes est une technique simple, très sensible et couramment utilisée pour étudier au niveau cellulaire les dommages à l'ADN qui sont peu fréquents. Les travaux présentés dans cette thèse montrent que certains des dommages résultant de l'activation de la NNK peuvent être investigués de manière spécifique à l'aide de cette technique, et ce à des fréquences de dommages qui se rapprochent de celles correspondant à une exposition réelle à la fumée de tabac. Parmi ces dommages, un type d'adduits encore inconnu associé à la pyridyloxobutylation de l'ADN a pu être mis indirectement en évidence. Il s'agit vraisemblablement de la forme formamidopyrimidine (fapy) d'une lésion primaire formée dans les cellules. La vitesse de réparation d'un type de dommage influe sur le risque qu'il a d'être impliqué dans la transformation maligne des cellules. La disparition des dommages dans le temps a pu être suivie avec le test des comètes afin d'investiguer la réparation dans des cellules capables ou pas de bioactiver la NNK. Le suivi post-traitement des dérivés fapy associés à la pyridyloxobutylation de l'ADN, a montré un phénotype ne dépendant pas du type cellulaire mais plutôt du statut de p53 dans les cellules. En effet, au lieu de diminuer après la fin du traitement, la fréquence des adduits fapy dans les fibroblastes augmente dans un premier temps et ce, seulement dans les cellules ayant une protéine p53 fonctionnelle. La nature de ce phénotype particulier n'est pas clairement identifiée, mais elle est vraisemblablement liée à la réparation des dommages à l'ADN. / Tobacco smoke contains several carcinogens that lead to the frequent formation of rare DNA damage in lungs of smokers. 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) is one of these substances that seems more particularly associated with the development of adenocarcinoma. During the last 30 years, the frequency of this lung cancer type has increased significantly. In lung cells, cytochromes P450 can bioactivate NNK into reactive species capable of either methylating or pyridyloxobutylating DNA. The use of analogs capable of generating only one type of NNK-associated reactive species allows to investigate methylation and pyridyloxobutylation separately. The comet assay is a simple and sensitive technique that is commonly used to investigate low frequency DNA damage at the cellular level. The work presented here show how some of the NNK-related DNA damage can be investigated specifically with this technique at damage frequencies that are relevant to a real exposure to cigarette smoke. One of the adduct type resulting of DNA pyridyloxobutylation that we studied here had never been demonstrated before. It corresponds likely to the formamidopyrimidine (fapy) form of a lesion primarily formed in cells. The repair rate of a damage type influences the probability that it has to be implicated in mutagenesis. The time course of different damage types was documented with the comet assay in order to investigate the repair of NNK-related damage in different cell types that can either bioactivate NNK or not. When the fapy adducts associated with pyridyloxobutylation were investigated post-treatment, their time course did not depend on the cell type but showed a p53-dependant phenotype. In fact, instead of decreasing because of repair, the frequency of these fapy adducts in fibroblasts first increased post-treatment and this increase seemed associated with p53 proficiency. The cause of this phenotype is not clearly elucidated but it should be related to DNA damage repair.