Na Fibrose Cística (FC) a infecção pulmonar crônica leva a lesão estrutural e disfunção pulmonar progressiva que precedem a insuficiência respiratória, maior causa de morbidade e mortalidade pela doença. As infecções bacterianas estão associadas a microrganismos específicos. Em geral, Staphylococcus aureus e Haemophilus influenzae estão associados a infecções respiratórias em pacientes mais jovens. Posteriormente a infecção por Pseudomonas aeruginosa marca a aceleração no declínio da função pulmonar e progressão das lesões estruturais pulmonares. A avaliação do comprometimento respiratório inclui culturas de secreção respiratória, provas de função respiratória e imagens de tórax. A tomografia computadorizada de tórax de alta resolução (TCAR) é capaz de avaliar precocemente o comprometimento estrutural de vias aéreas e parênquima pulmonar e tais alterações podem ser sistematicamente mensuradas através de diferentes escores de pontuação. O estudo tem como objetivo comparar a pontuação do escore de Bhalla modificado e as alterações pulmonares detectadas através da tomografia computadorizada de tórax de alta resolução em dois grupos de pacientes com FC vinculados ao Centro de Referência para FC do Instituto Fernandes Figueira, apresentando características microbiológicas distintas: colonizados cronicamente por Staphylococcus aeruginosa (n=26) e por Staphylococcus aureus (n=15). As imagens de tomografia computadorizada de tórax de alta resolução foram individualmente analisadas e pontuadas através do escore de Bhalla modificado, por dois radiologistas em dois momentos distintos. Houve boa concordância global tanto intraobservador (coeficiente de correlação intraclasse > 0.8) quanto interobservador (coeficiente de correlação intraclasse > 0.8) e essa avaliação demonstrou que as medidas são confiáveis e reprodutíveis. As pontuações obtidas através do escore adotado, bem como as alterações de imagem e a freqüência das mesmas, foram avaliadas e comparadas em cada grupo de pacientes. As médias dos escores totais do grupo cronicamente colonizado por Pseudomonas aeruginosa evidenciaram maior gravidade das lesões (observador 1: escore 13.5 e observador 2: escore 11.96) do que o grupo colonizado por Staphylococcus aureus (observador 1: escore 5.0 e observador 2: escore 5.07). A detecção precoce de lesões estruturais relacionadas à infecção e sua análise através de sistema de pontuação podem contribuir efetivamente para o ajuste de estratégias terapêuticas que venham alterar o prognóstico de pacientes portadores de FC. / In Cystic Fibrosis (CF) chronic lung infection leads to irreversible structural abnormalities, progressive lung disease and respiratory failure, most common cause of death in CF. Bacterial infection in CF is usually related to specific agents: Staphylococcus aureus e Haemophilus influenzae usually infect younger patients. After this, Pseudomonas aeruginosa infection is associated with lung function deterioration and progression of structural lung disease. Assessment of CF lung disease includes monitoring of respiratory secretions microbiology, lung function and thoracic imaging. High resolution computed tomography of the lung (HRCT) is involved on early detection of structural airway and parenchymal abnormalities. These structural abnormalities can be assigned systematically through different scoring systems. The aim of this study was to compare the results of the modified Bhalla score for High resolution computed tomography of the lung from two groups of CF patients attending the CF Reference Center at Instituto Fernandes Figueira, Rio de Janeiro, Brazil. These two groups had different microbiological features: chronically infected by Pseudomonas aeruginosa (n = 26) and infected by Staphylococcus aureus (n = 15). High resolution computed tomography of the lung images were randomly and blindly scored using a modified Bhalla scoring system by two independent radiologists in two different moments. There was good intraobserver and interobserver variability and this observation indicates that the measurements are reliable and reproducible. Score results and abnormalities found in each group were compared. Final scores of Pseudomonas aeruginosa group showed more severe disease (radiologist 1: 13.5 and radiologist 2: 11.96) then the Staphylococcus aureus group (radiologist 1: 5.0 and radiologist 2: 5.07). Early detection of structural abnormalities associated to infection and its assessment through scoring systems may contribute to therapeutical approaches that can improve prognosis for CF patients.

A Fibrose Cística (FC) é uma doença letal, de caráter autossômico recessivo, que acomete populações de diferentes etnias. A doença caracteriza-se pelo comprometimento sistêmico das glândulas exócrinas e, na maioria dos pacientes, a doença pulmonar acaba tornando-se a patologia predominante. A infecção por P. aeruginosa é a principal causa de mortalidade dos pacientes com FC. O Sistema de Secreção Tipo III da bactéria é expresso na fase aguda da doença e é responsável por injetar proteínas citotóxicas no interior da célula eucariótica. Há um grande interesse em se investigar a resposta de anticorpos anti P. aeruginosa em pacientes com FC a fim de diagnosticar a colonização e ou infecção pulmonar antes da cultura, permitindo a antibioticoterapia preventiva, a fim de se evitar a infecção pulmonar crônica. Nesta tese, investigamos a resposta de anticorpos (IgG+IgM+IgA) contra as proteínas do SSTT de P. aeruginosa, através do Western-Blot. Participaram do estudo 51 pacientes com FC, de 1.1 a 16.8 anos acompanhados no Departamento de Pneumologia do Instituto Fernandes Figueira - FioCruz, durante um período aproximado de 2 anos. De cada paciente foram coletadas de 1 a 4 amostras de sangue, com intervalo médio de 6 meses entre as coletas. O grupo controle negativo consistiu de 28 indivíduos não fibrocísticos, de 2 a 17 anos, atendidos no Hospital Universitário Pedro Ernesto - HUPE UERJ. As proteínas do SSTT foram extraídas das cepas PAO1 e PAOΔExsA (regulador da expressão do SSTT) de P. aeruginosa. Controles positivos e negativos foram utilizados em todas as reações. Para a identificação das proteínas do SSTT na reação utilizou-se antisoro de camundongos imunizados com a proteína recombinante PcrV. Doze (75%) dos 16 pacientes fibrocísticos considerados não infectados por P. aeruginosa tiveram a primeira sorologia positiva para PopB e 15 (93,75%) para ExoS/ExoT, indicando a colonização ou infecção por P. aeruginosa. Aproximadamente 25% e 35,7% dos soros do grupo controle mostraram reatividade fraca com PopB ou ExoS/ExoT, respectivamente. O tempo decorrido entre a primeira sorologia positiva e o primeiro isolamento de P. aeruginosa nestes pacientes variou de 18 a 30 meses. Concluindo, é possível fazer o diagnóstico sorológico da infecção pulmonar por P. aeruginosa antes do isolamento da bactéria pela cultura. / Cystic Fibrosis (CF) is a lethal disease of autosomal recessive character, which affects people of different ethnicities. The disease is characterized by the involvement of systemic exocrine glands and in most patients, the lung disease becomes the predominant pathology. The infection with P. aeruginosa is the leading cause of mortality in patients with CF. The Type III Secretion System (TTSS) of bacteria is expressed during acute disease and injects cytotoxic proteins inside the host cell. There is a great interesting in investigate the antibody response to P. aeruginosa in CF patients in order to diagnose a pulmonary infection or colonization before the culture. Then, preventive antibiotic treatment can be initiated before the installation of chronic lung infection. We investigated the antibody response (IgG + IgA + IgM) against TTSS proteins of P. aeruginosa by Western-blot. The study included 51 patients with CF, from 1.1 to 16.8 years attending the Pediatric Pulmonology Unit of Fernandes Figueira Institute (IFF) FIOCRUZ, Rio de Janeiro, for a period of approximately 2 years. Most patients had or 4 blood samples collected for antibody analyses. Samples were obtained with a mean interval of 6 months. The negative control group consisted of 28 non-CF individuals, from 2 to 17 years, attended at Pedro Ernesto University Hospital - HUPE - UERJ. The TTSS proteins were extracted from strains PAO1 and PAOΔExsA (regulator of TTSS proteins expression) of P. aeruginosa. Positive and negative controls were used in all reactions. For the identification of TTSS proteins in the reaction we used antisera from mice immunized with the recombinant protein PcrV. Twelve (75%) of 16 CF patients considered not infected by P. aeruginosa had their first serology positive for "PopB" and 15 (93.75%) for "ExoS/ExoT. These results indicated that these patients were colonized or infected by P. aeruginosa. About 25% e 35,7% of negative control sera showed a weak reactivity with PopB or ExoS, respectively. The time between the first positive serology and the first isolation of P. aeruginosa in these patients ranged from 18 to 30 months. In conclusion, it is possible to make a serological diagnosis of pulmonary infection by P. aeruginosa before the isolation of the bacterium by culture.

Les proliférations de cyanobactéries présentent en général d'importantes variations spatiales et temporelles de leur abondance cellulaire et de leur potentiel toxique, ce qui rend très difficile la surveillance de ces microorganismes et l'estimation des risques sanitaires associés à ces événements. Dans ce cadre général, le premier objectif de ma thèse a été de tester différentes stratégies d'échantillonnage pour suivre au mieux l'évolution des abondances cellulaires lors des proliférations de cyanobactéries. Par un échantillonnage à haute fréquence (six points tous les deux jours) réalisé sur un étang piscicole du Forez, nous avons montré que les deux espèces qui proliféraient dans cet écosystème (Microcystis aeruginosa et Aphanizomenon flos-aquae) présentaient des dynamiques spatiales et temporelles de leur abondance cellulaire très contrastées, ne permettant pas de définir une stratégie d'échantillonnage optimale commune aux deux espèces. Si pour ces deux espèces, trois points d'échantillonnage sont au minimum nécessaires pour bien prendre en compte l'hétérogénéité dans la distribution spatiale des cellules, les fréquences d'échantillonnage optimales sont en revanche très variables, allant d'un échantillonnage mensuel ou bimensuel pour Microcystis à un échantillonnage au minimum hebdomadaire pour Aphanizomenon. Le second objectif de ma thèse a été de m'appuyer sur cette stratégie d'échantillonnage à haute fréquence, pour mieux comprendre le développement de la prolifération de M. aeruginosa. Pour ce faire, nous avons estimé les changements spatiaux et temporels intervenant dans la composition génotypique de la population de cyanobactéries (par utilisation de la SSCP sur l'ITS 16S-23S) et dans sa toxicité potentielle (par le dosage des microcystines et l'évaluation de la proportion de cellules possédant le gène mcyB, un des gènes de synthèse de la microcystine). La répartition spatiale de la composition génotypique s'est révélée homogène à l'échelle de l'étang. Il est également apparu qu'au cours de la phase de croissance de la population, cette composition génotypique subissait de nombreux changements à courte échelle temporelle puis restait stable pendant plusieurs semaines lorsque le maximum d'abondance était atteint. Au niveau du potentiel toxique, la proportion de cellules possédant le gène mcyB est resté proche de 60 % durant toute la prolifération avec toutefois, des variations plus importantes pendant le développement du bloom. Aucune relation n'a pu être établie entre les variations observées dans la composition génotypique de la population et celles dans les proportions de cellules toxiques. De même, aucun lien n'a pu être établi entre les variations de diverses variables environnementales (nutriments, température, pluie) et celles de l'abondance cellulaire, de la toxicité potentielle et de la composition génotypique de la population de Microcystis. L'ensemble de ces résultats suggère que d'autres facteurs et processus interviennent probablement dans ces variations et qu'il existe sans doute des interactions très complexes entre toutes ces variables. Enfin, le troisième objectif de ma thèse a été de comparer la composition génotypique et le potentiel toxique de plusieurs populations de Microcystis plus ou moins connectées entre elles. Cette comparaison a permis de montrer l'importance fondamentale des facteurs et processus environnementaux locaux, dans la mise en place et le développement de ces évènements. / Generally, cyanobacteria proliferations show great spatial and temporal variations in their cell abundances and potential toxicity, which makes it difficult to control the development of these microorganisms and to predict the health risks associated with these events. Within this scope, the first goal of my PhD thesis was to test different sampling strategies to guarantee the best monitoring of the cell abundances during cyanobacteria proliferations. We made a high frequency sampling (six points every other day) in a shallow lake located in Forez and we evidenced that the two blooming-species (Microcystis aeruginosa and Aphanizomenon flos-aquae) showed strongly contrasted spatial and temporal patterns of their cell abundances precluding having a common optimal sampling strategy for both species. Even if three sampling points were enough to take into account the spatial heterogeneity of Microcystis and Aphanizomenon cells, a monthly or two-monthly sampling was sufficient for Microcystis whereas a weekly sampling was necessary for Aphanizomenon. The second goal was to gain a better understanding of Microcystis proliferation development. To achieve this aim, we estimated spatial and temporal changes in the genotypic composition (using the SSCP method in the 16S-23S ITS) and in the potential toxicity (by measuring the microcystin concentration and proportion of mcyB+ cells). We obtained a homogeneous spatial repartition of the genotypic composition. Moreover, during the growth phase, there were many rapid changes in the genotypic composition whereas this composition remained stable for several weeks where the maximum cell abundance was reached. As for potential toxicity, the proportion of mcyB+ cells remains at around 60 % during the proliferation but we observed higher variations during the growth phase. No relation was found between the variations of the genotypic composition and proportion of toxic cells on the one hand and the variations of several environmental factors (nutrients, temperature, rain) on the other hand, suggesting that other factors may be involved in these variations and that many complex interactions occur between these factors. Finally, the third goal of my PhD thesis was to compare the genotypic composition and the potential toxicity of different Microcystis populations, which were more or less interconnected. This comparison evidenced the great importance of local environmental factors and processes in the beginning and development of these events.

Pseudomonas aeruginosa est un bacille gram négatif, ubiquiste de l'environnement. Ce pathogène opportuniste humain provoque sous sa forme planctonique des infections aiguës dont le facteur de virulence clé est le SST3. P. aeruginosa peut aussi se développer sous forme de biofilm où elle exprime entre autre le SST6-1 et induire des infections chroniques. L'expression ciblée des différents facteurs de virulence est liée à l'intégration de nombreux stimuli environnementaux transduits au moyen de systèmes à deux composants ou encore de messagers secondaires, comme le di-GMPc et l'AMPc, et conduisant à une régulation très fine, conférant une grande capacité d'adaptation à la bactérie. La nature, de même que les mécanismes impliqués dans la transduction du signal, n'ont pas encore été tous identifiés à ce jour. Le but de cette thèse était de décrypter ces mécanismes moléculaires de détection et de transduction du signal gouvernant la réponse adaptative de ce pathogène à son environnement au moyen de différentes approches : chémogénomique, mutagénèse aléatoire et d'étude d'isolat clinique. Lors de cette thèse, nous avons criblé deux chimiothèques commerciales à la recherche de molécules activatrices du SST3 et du SST6-1 et nous avons pu établir un test de criblage à haut débit robuste pour les criblages de plus larges banques de composés. En utilisant une souche avec deux rapporteurs, nous avons réalisé une banque de mutants par transposons et nous avons trouvé des mutants affectés dans leur expression du SST3, candidats intéressants pour identifier de nouveaux régulateurs du système. Enfin, grâce à l'analyse de l'isolat clinique CHA (issu d'un patient atteint de mucoviscidose), nous avons découvert qu'une délétion dans le gène codant pour le régulateur majeur GacS définissait le phénotype agressif de cette souche. / Pseudomonas aeruginosa is a gram negative bacillum present in several places. This opportunistic pathogen has the capacity to infect a wide range of hosts: plants, animals, humans. This bacterium, that shows an impressive adaptability relying on a multifactorial virulence, possesses two lifestyles. These lifestyles are associated with specific virulence patterns of expression. Under its planktonic form, P. aeruginosa can provoke acute infections thanks to the activation of T2 and T3SS or induces chronic infections in cystic fibrosis patients' lungs where it establishes a biofilm (communautary life). The expression of virulence factors is linked to the integration of several environmental cues that are transduced through two-component systems and secondary messengers like c-di-GMP and that lead to a fine tuned regulation. The nature and the mechanisms involved in this signal transduction remain largely unknown. The goal of this thesis was to decipher molecular mechanisms of signal detection and transduction that govern the adaptive pathogen response to host environment using the combination of a chemogenomics, random mutagenesis and study of clinical isolate. During this work, we screened two commercial libraries and set up a robust high throughput screening test to analyse huge molecules libraries. By setting up a double reporter-gene strain, we realized a transposon mutagenesis bank and identified interesting candidates with a down-regulated T3SS. Finally, the study of the particular clinical isolate CHA (from a cystic fibrosis patient), leads to the discovery that a deletion in the gene encoding for the important regulator GacS shapes the aggressive phenotype of this strain.

Pseudomonas aeruginosa, une bactérie à Gram négatif responsable d'infections nosocomiales, possède de nombreux facteurs de virulence lui permettant d'infecter ses hôtes. En particulier, le Système de Sécrétion de Type III (SST3) lui permet d'injecter des effecteurs directement dans le cytoplasme de la cellule cible eucaryote. Durant cette thèse, deux protéines du SST3 de P. aeruginosa ont été étudiées : l'ATPase PscN et la protéine ExsB. Plusieurs approches ont été utilisées afin d'étudier l'ATPase PscN, indispensable à l'activité du SST3. Des mutations ponctuelles réalisées dans PscN conduisent à des souches de P. aeruginosa non cytotoxiques, et cet effet est dominant négatif. Une autre approche a permis l'obtention de fractions partiellement purifiées de l'ATPase PscN active, sous forme de grands complexes visualisés en microscopie électronique. Ces fractions contiennent également d'autres protéines du SST3, qui pourraient être des partenaires de PscN. La protéine ExsB a été caractérisée pour la première fois. Après avoir vérifié son expression chez P. aeruginosa, son association à la membrane externe de la bactérie a été démontrée. Son rôle a ensuite été étudié par une analyse du phénotype d'une souche de P. aeruginosa dépourvue du gène exsB. Nous n'avons pas identifié d'activité de ExsB dans la régulation du SST3. Après avoir constaté l'implication de ExsB dans la virulence de la bactérie dans des modèles d'infections aiguës chez les animaux, son rôle dans l'activité du SST3 a été établi. Nous avons enfin pu montrer que ExsB a une activité de pilotine, car elle participe à l'assemblage de la sécrétine, le composant de la membrane externe du SST3. / Pseudomonas aeruginosa, a Gram negative bacterium responsible for nosocomial infections, exhibits numerous virulence factors to infect its hosts. In particular, the Type III Secretion System (T3SS) allows the injection of effectors directly into the host cell cytoplasm. This work focuses on the study of two proteins from the T3SS of P. aeruginosa: the ATPase PscN and the ExsB protein. Several approaches were used to study the ATPase PscN, an enzyme essential for T3SS activity. Site-directed mutations, made on PscN, lead to non cytotoxic strains, and this effect is dominant negative. Another approach allowed the partial purification of active PscN, visualized as large complexes by electron microscopy. These partially purified samples also contain other T3SS proteins, which could interact with PscN. The ExsB protein was characterized for the first time. After checking its expression in P. aeruginosa, its association with the outer membrane was shown. The phenotypic analysis of a strain lacking exsB gene gave insights into the role of this protein. We did not identified any function of ExsB in the T3SS regulation. After showing the involvement of ExsB in the bacterial virulence during acute animal infections, ExsB role in T3SS activity was established. Finally, we showed that ExsB has a pilotin activity as it participates in the assembly of the secretin, the outer membrane component of T3SS.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4672.pdf: 1519614 bytes, checksum: a835ffbdf3a94ccbfaa789a3611d3aa6 (MD5) Previous issue date: 2012-09-28 / Universidade Federal de Sao Carlos / Biosurfactants are a surface-active chemical compounds synthesized by microorganisms. These compounds have many advantages when compared to their chemically synthesized counterparts as specific action, low toxicity, higher biodegradability, effectiveness at extreme temperatures, pH and strength ionic. They appear as promising candidates to replace chemical surfactants produced from petrochemicals. The use of renewable and low cost substrates such as agro based industrial wastes is one of the attractive strategies for economical large scale biosurfactants production. In this work, it was evaluated glycerol, a co-product of biodiesel production, as carbon source for biosurfactant production. Two microorganisms, Pseudomonas aeruginosa MSCIC02 and Bacillus subtilis LAMI009, both isolated from environmental sources, were used thorough this work. In the first part of the work experiments were carried out in shake flasks using P. aeruginosa. The results showed that the increase in nitrogen source (sodium nitrate) and the decrease in the carbon source (glycerin) favored rhamnolipids production. In the range studied, the maximum biosurfactant concentration obtained was 2.3 g⋅L-1 (C/N ratio 12). The effect of nitrogen concentration on the biosynthesis of rhamnolipids and pH behavior as a function of the nitrate concentration in the cultures indicated that this strain probably carried a denitrification route favoring the production of rhamnolipids. Experimental runs carried out in bioreactor indicated that the integrated process of production and separation/concentration by fractionation in bubble column equipment caused many operation problems, such as the drag cell, and reducing the concentration of rhamnolipids to 0.4 g⋅L-1in the reaction medium. The kinetics of product formation was evaluated by two models. The Luedeking-Piret model was not able to represent the process. The model proposed by MERCIER et. al. (1992) could adequately describe the rhamnolipids production from P. aeruginosa strain. Emulsifying capacity of the cell-free culture medium was assessed by the emulsification index (EI24). The biosurfactant produced was able to emulsify vegetable oils as well as mineral oils. EI24 greater than 55% was reached. In the second part of the work experimental data from Bacillus subtilis LAMI009 cultivated in shake flasks showed that the growth of this strain was dependent on iv the medium supplementation with yeast extract. A change in culture medium was implemented in order to reduce the length of the lag phase. The use of inorganic nitrogen sources showed that both ammonium nitrate and ammonium sulphate reached similar values of surfactin concentration and volumetric productivity. It was obtained 35 mg⋅L-1 and 6.1 mg⋅L-1⋅h-1, respectively. Surface tension of the cell-free culture medium was similar for both nitrogen sources. The minimal value obtained was 29.7 mN⋅m-1. Sodium nitrate was found to be an adequate nitrogen source for cell growth. However, in these assays low productivity and low surface tension reduction were obtained when compared to the other nitrogen sources evaluated. The supplementation of the culture medium with yeast extract improves the surfactin concentration (60.0 mg⋅L-1) and volumetric productivity (5.2 mg⋅L-1⋅h-1). In this assay the surface tension reached 28.1 mN⋅m-1. The inoculum size had a great influence on cell growth and production of surfactin. When 2% (v/v) of inoculum was used the surfactin concentration and volumetric productivity obtained were 148.2 mg⋅L-1 e 14.22 mg⋅L-1⋅h-1, respectively. The search for genes responsible for production of lipopeptides surfactin and iturine indicated the presence of the genes lpa14 and ituD in B. subtilis LAMI009 genome. Analysis of the chromatography profile of methanol extracts of the lipopeptides from culture medium with ammonium nitrate and sodium nitrate as nitrogen source showed characteristic peaks of the surfactin and iturine. Thereby, it is believed that this strain is a co-producer of both surfactin and iturine. Emulsifying capacity of the cell-free culture medium showed higher stability with the media that employed ammonium nitrate and sodium nitrate as nitrogen source. It was obtained EI24 of 65% with n-hexadecane and 45% with kerosene. The acid precipitation of biosurfactant from the cell-free culture medium showed that this prepurification step promoted an increase in the emulsifying capacity of the mixture of lipopeptides synthesized by B. subtilis LAMI009. The aqueous solution of crude biosurfactant was able to emulsify naphthenic oils, vegetable oils, and an aromatic hydrocarbon. Values of EI24 greater than 65% were obtained. Emulsions formed with naphthenic oils were more stable according to droplet-size distribution. The smaller the size of droplets, the more stable was the emulsion. / Biossurfactantes são compostos químicos tensoativos sintetizados por microrganismos. Estes compostos possuem muitas vantagens quando comparados com seus equivalentes sintetizados quimicamente como ação específica, baixa toxicidade, alta biodegradabilidade, efetividade em condições extremas de temperatura, pH e força iônica. Apresentam-se como substitutos promissores aos surfactantes químicos derivados da indústria do petróleo. A utilização de substratos renováveis e de baixo custo, como os resíduos agroindustriais, consiste em um dos fatores mais importantes para a viabilização econômica da produção destes compostos em escala industrial. Neste trabalho avaliou-se o uso da glicerina, um coproduto da produção de biodiesel, como fonte de carbono para produção de biossurfactante. Dois microrganismos, Pseudomonas aeruginosa MSIC02 e Bacillus subtilis LAMI009, ambos isolados a partir de amostras ambientais, foram empregados neste trabalho. Na primeira parte do trabalho experimentos realizados em frascos agitados com a P. aeruginosa mostraram que o aumento da produtividade de ramnolipídeos foi favorecido pelo aumento da concentração da fonte de nitrogênio (nitrato de sódio) e pela redução da concentração da fonte de carbono (glicerina). Na faixa estudada a concentração máxima de biossurfactante obtida foi de 2,3 g⋅L-1 (razão C/N de 12). O efeito da concentração de nitrogênio sobre a biossíntese de ramnolipídeos e o comportamento do pH em função da concentração de nitrato durante os cultivos indicou que esta cepa possivelmente realizou uma rota denitrificante favorecendo a produção de ramnolipídeos. Os cultivos realizados em biorreator indicaram que o processo de produção integrado a extração/concentração por fracionamento em coluna de bolhas acarretou diversos problemas operacionais, como o arraste de células, e a redução da concentração de ramnolipídeos no meio reacional para 0,4 g⋅L-1. Foram avaliados dois modelos cinéticos de formação de produto para os ensaios realizados. O modelo de Luedeking-Piret não apresentou boa representatividade do processo. O modelo proposto por MERCIER et al. (1992) mostrou-se mais adequado para representar a produção de ramnolipídeos pela cepa estudada. A avaliação da capacidade emulsificante do meio de cultivo livre de células mostrou que o biossurfactante produzido pela P. aeruginosa teve um desempenho eficiente, sendo capaz de emulsificar óleos de origem vegetal e mineral e atingir índice de emulsificação (IE24) maior que 55 %. Na segunda parte do trabalho, cultivos realizados em frascos agitados para avaliação da produção de biossurfactantes lipopeptídeos por B. subtilis LAMI009 indicaram que o crescimento desta cepa foi dependente da suplementação do meio com extrato de levedura. Uma adaptação ao meio de fermentação foi necessária para eliminar a extensa fase lag durante o processo fermentativo. A utilização de fontes de nitrogênio inorgânicas mostrou que tanto o nitrato de amônio quanto o sulfato de amônio apresentaram valores de concentração de surfactina e produtividade volumétrica da ordem de 35 mg⋅L-1 e 6,1 mg⋅L-1⋅h-1, respectivamente. A tensão superficial do meio de cultivo livre de células também foi semelhante para ambas fontes de nitrogênio, cujo valor mínimo foi 29,7 mN⋅m-1. O nitrato de sódio foi fonte de nitrogênio adequada para o crescimento celular, entretanto apresentou baixa produtividade quando comparado com as demais fontes de nitrogênio avaliadas. Com a suplementação do meio de cultivo com extrato de levedura ii obteve-se maior concentração de surfactina (60,0 mg⋅L-1) e produtividade volumétrica (5,2 mg⋅L-1⋅h-1) e menor tensão superficial (28,1 mN⋅m-1) relativamente ao meio de cultivo contendo fonte de nitrogênio inorgânica. O tamanho do inóculo exerceu grande influência sobre a concentração de surfactina e a produtividade volumétrica. Quando se utilizou 2% (v/v) de inóculo a concentração de surfactina e a produtividade volumétrica alcançaram valores de 148,2 mg⋅L-1 e 14,22 mg⋅L-1⋅h-1, respectivamente. A pesquisa de genes responsáveis pela produção dos lipopeptídeos surfactina e iturina indicou a presença dos genes lpa14 e ituD no genoma da linhagem B. subtilis LAMI009. A avaliação do perfil cromatográfico dos extratos metanólicos de lipopeptídeos obtidos a partir dos cultivos com as fontes de nitrogênio nitrato de amônio e nitrato de sódio apresentou picos característicos de outro lipopeptídeo além da surfactina, a iturina,. Portanto, acredita-se que esta linhagem é uma co-produtora de surfactina e iturina. A capacidade emulsificante do meio de cultivo livre de células apresentou maior estabilidade com os cultivos com nitrato de amônio e nitrato de sódio, obtendo-se IE24 de 65 % com n-hexadecano e 45 % com querosene. A separação do biossurfactante por precipitação ácida a partir do meio de cultivo livre de células mostrou que esta etapa de pré-purificação promoveu um aumento da capacidade emulsificante da mistura de lipopeptídeos sintetizada por B. subtilis LAMI009. A solução aquosa do biossurfactante bruto foi capaz de emulsificar óleos naftênicos, óleos vegetais e um hidrocarboneto aromático, apresentando IE24 maiores que 65 % com os óleos avaliados. As emulsões formadas com óleos naftênicos, utilizados como base para lubrificantes, foram mais estáveis. Quanto menor o tamanho das gotas mais estável foi a emulsão formada.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 511649 bytes, checksum: bafb6e1f723d31526306e1605d68727b (MD5) Previous issue date: 2008-07-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The production of biossurfactants on an industrial scale is usually limited by the high cost of the media components for the microorganisms cultivation. The use of agroindustrial substrates as the basic culture mean for the production of these compounds has been suggested as an alternative to making the process. The objective was to study the production and the tensoatives properties of biossurfactants in culture medias based on manipueira and molasses by bacterial isolates previously identified as biossurfactants producer. The low values of surface tension and the high values of Critical Micellar Dilution (CMD) showed that three isolates, Pseudomonas aeruginosa LBBMA 88A, Bacillus subtilis LBBMA 155 and B. subtilis subsp. spizizenii LBBMA 283, stood out as the best among the ten selected for the study. The culture medias for each of the selected bacterial isolates and mixed cultures containing these same isolates was optimized using the Response Surface Methodology (RSM) through the Central Composite Rotational Design (CCRD). P. aeruginosa LBBMA 88A and the mixed culture composed by the three selected isolates were potentially the greater interest to the production of biossurfactant, since they were the only which the biossurfactants production was influenced only by the concentration of molasses and the only who reached values of DMC at least 10 times. The surfactant produced by P .aeruginosa LBBMA 88A formed emulsions considered stable with kerosene. Temperatures over 70°C and pH values of 4.0 reduced the viscosity of culture media destabilizing the emulsions formed between aqueous solutions of biossurfactants and kerosene. NaCl concentrations above 10 g L-1 altered the tensoative activity because of estabilization of the present.surfactant micelles. The media based on molasses and manipueira achieved satisfactory results for the production of surfactant by the tested isolates with desirable characteristics for environmental applications, particularly the stability in wide ranges of salinity, temperature and pH. / A produção de biossurfactantes em escala industrial é usualmente limitada pelo alto custo dos componentes do meio para o cultivo dos microrganismos. A utilização de substratos agroindustriais como meio de cultura básico para a produção desses compostos tem sido sugerida como alternativa para viabilizar o processo. O objetivo deste trabalho foi o de estudar a produção e as propriedades tensoativas de biossurfactantes em meios de cultura à base de manipueira e melaço por isolados de bactérias previamente identificadas como produtoras de biossurfactantes. Os baixos valores de tensão superficial e os altos valores de Diluição Micelar Crítica (DMC) demonstraram que três isolados, Pseudomonas aeruginosa LBBMA 88A, Bacillus subtilis LBBMA 155 e B. subtilis subsp. spizizenii LBBMA 283, destacaram-se como os melhores entre os dez selecionados para o estudo. Os meios de cultura para cada um dos isolados bacterianos selecionados e para culturas mistas contendo esses mesmos isolados foi otimizado usando-se a Metodologia de Superfície de Resposta (MSR) por meio do Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR). P. aeruginosa LBBMA 88A e a cultura mista composta pelos três isolados selecionados foram potencialmente os de maior interesse para a produção de biossurfactante, uma vez que foram os únicos cuja produção de biossurfactantes foi influenciada apenas pela concentração de melaço e que alcançaram valores de DMC de pelo menos 10 vezes. O surfactante produzido por P.aeruginosa LBBMA 88A formou emulsões consideradas estáveis com querosene. Temperaturas acima de 70°C e valores de pH 4,0 reduziram a viscosidade do meio de cultura desestabilizando as emulsões formadas entre soluções aquosas dos biossurfactantes e o querosene. Concentrações de NaCl acima de 10 g L-1 alteraram a atividade tensoativa em razão da desestabilização das micelas presentes. O meio a base de melaço e manipueira alcançou resultados satisfatórios para a produção de surfactante pelos isolados testados com características desejáveis a aplicações ambientais, em especial a estabilidade em amplas faixas de salinidade, temperatura e pH.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnaCSMO_TESE.pdf: 4366304 bytes, checksum: 034491089a42b2a0e2af84a9b17e3da3 (MD5) Previous issue date: 2010-12-29 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Biosurfactants are molecules produced by microorganisms mainly bacteria as Pseudomonas and Bacillus. Among the biosurfactants, rhamnolipids play an important role due to their tensoactive as well as emulsifying properties. Besides can be produced in a well consolidated way the production costs of biosurfactants are quite expansive mainly if downstream processing is goning to be considered. Actually, attention has been given to identification of biosurfactants as well as optimization of its fermentative processes including downstream ones. This work deals with the development of strategies to recovery and purification of rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa P029-GVIIA using sugar-cane molasses as substrate. Broth free of cells was used in order to investigate the best strategies to recovery and purification produced by this system. Between the studied acids (HCl and H2SO4) for the acid precipitation step, HCl was the best one as has been showed by the experimental design 24. Extraction has been carried out using petroleum ether and quantification has been done using the thioglycolic acid method. Adsorption studies were carried out with activated carbon in a batch mode using a 24 experimental design as well as combined with an hydrophobic resin Streamline Phenyl aiming to separate the produced biosurfactant. Biosurfactant partial identification was carried out using High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Experiments in batch mode showed that adsorption has been controlled mainly by pH and temperature. It was observed a reduction of 41.4% for the liquid phase and the solid phase it was possible to adsorb up to 15 mg of rhamnolipd/g of activated carbon. The kinetics of adsorption has been well fitted to a pseudo-first order reaction with velocity constant (k1) of 1.93 x 10-2 min-1. Experiments in packed bed ranging concentration on eluent (acetone) has been shown the highest recovery factor of 98% when pure acetone has been used. The combined effect if using activated carbon with an hydrophobic resin Streamline Phenyl has been shown successful for the rhamnolipids purification. It has been possible to purify a fraction of the crude broth with 98% of purity when the eluted of activated carbon packed bed was used with pure acetone / Os biossurfactantes s?o produzidos por microrganismos, principalmente, bact?rias do tipo Pseudomonas e Bacillus. Entre os biossurfactantes, o rhamnolip?deo ? o mais estudado devido as suas propriedades tensoativas e emulsificantes. Apesar do processo biotecnol?gico de produ??o de biossurfactante, j? tenha sido estabelecido h? alguns anos, o alto custo de produ??o e o caro processo de downstream t?m impedido sua ampla utiliza??o. Deste modo, os ?ltimos estudos est?o concentrados na identifica??o de potenciais surfactantes, na avalia??o de suas propriedades e na otimiza??o dos processos fermentativos para sua produ??o, bem como das etapas de purifica??o. Assim, o presente estudo tem como objetivo desenvolver estrat?gias para a recupera??o e purifica??o de ramnolip?deos produzidos por Pseudomonas aeruginosa P029-GVIIA utilizando mela?o de cana como substrato. Com o caldo fermentado livre de c?lulas estudou-se as melhores t?cnicas de recupera??o e purifica??o do biossurfactante produzido para este sistema. Dentre os ?cidos estudados (HCl e H2SO4) para a etapa de precipita??o ?cida o HCl foi o que obteve melhor resultado atrav?s de um planejamento experimental 24. A extra??o foi realizada com o ?ter de petr?leo e a quantifica??o atrav?s do m?todo do ?cido tioglic?lico. Estudos de adsor??o foram realizados com carv?o ativado tanto em batelada atrav?s de um planejamento experimental 24 como em leito fixo com carv?o ativado e o seu efeito combinado com uma resina de intera??o hidrof?bica Streamline Phenyl, com a finalidade de separar o biossurfactante produzido. Para a identifica??o parcial foi utilizada a cromatografia l?quida de alta efici?ncia (CLAE). Os ensaios em batelada mostraram que a adsor??o ? governada pelo pH e pela temperatura. A redu??o da concentra??o de ramnolip?deo para a fase liquida foi de 41,4% e para a fase s?lida, foi poss?vel adsorver os biossurfactantes na propor??o de 15 mg de ramnolip?deo/ g de carv?o. A cin?tica em batelada foi ajustada ao modelo cin?tico de pseudo-primeira ordem obtendo o valor da constante de velocidade k1= 1,93 x 10-2 min.-1. Os ensaios em leito fixo variando a concentra??o da acetona (eluente), obteve fator de recupera??o de ramnolip?deo de 98% de recupera??o foi para a acetona pura. O efeito combinado em leito fixo do carv?o ativado com a resina de intera??o hidrof?bica mostrou-se eficiente na purifica??o de ramnolip?deos. Foi poss?vel purificar uma fra??o do caldo bruto, cuja pureza atingiu 98% ao se utilizar o eluido do carv?o ativado com acetona pura

Na Fibrose Cística (FC) a infecção pulmonar crônica leva a lesão estrutural e disfunção pulmonar progressiva que precedem a insuficiência respiratória, maior causa de morbidade e mortalidade pela doença. As infecções bacterianas estão associadas a microrganismos específicos. Em geral, Staphylococcus aureus e Haemophilus influenzae estão associados a infecções respiratórias em pacientes mais jovens. Posteriormente a infecção por Pseudomonas aeruginosa marca a aceleração no declínio da função pulmonar e progressão das lesões estruturais pulmonares. A avaliação do comprometimento respiratório inclui culturas de secreção respiratória, provas de função respiratória e imagens de tórax. A tomografia computadorizada de tórax de alta resolução (TCAR) é capaz de avaliar precocemente o comprometimento estrutural de vias aéreas e parênquima pulmonar e tais alterações podem ser sistematicamente mensuradas através de diferentes escores de pontuação. O estudo tem como objetivo comparar a pontuação do escore de Bhalla modificado e as alterações pulmonares detectadas através da tomografia computadorizada de tórax de alta resolução em dois grupos de pacientes com FC vinculados ao Centro de Referência para FC do Instituto Fernandes Figueira, apresentando características microbiológicas distintas: colonizados cronicamente por Staphylococcus aeruginosa (n=26) e por Staphylococcus aureus (n=15). As imagens de tomografia computadorizada de tórax de alta resolução foram individualmente analisadas e pontuadas através do escore de Bhalla modificado, por dois radiologistas em dois momentos distintos. Houve boa concordância global tanto intraobservador (coeficiente de correlação intraclasse > 0.8) quanto interobservador (coeficiente de correlação intraclasse > 0.8) e essa avaliação demonstrou que as medidas são confiáveis e reprodutíveis. As pontuações obtidas através do escore adotado, bem como as alterações de imagem e a freqüência das mesmas, foram avaliadas e comparadas em cada grupo de pacientes. As médias dos escores totais do grupo cronicamente colonizado por Pseudomonas aeruginosa evidenciaram maior gravidade das lesões (observador 1: escore 13.5 e observador 2: escore 11.96) do que o grupo colonizado por Staphylococcus aureus (observador 1: escore 5.0 e observador 2: escore 5.07). A detecção precoce de lesões estruturais relacionadas à infecção e sua análise através de sistema de pontuação podem contribuir efetivamente para o ajuste de estratégias terapêuticas que venham alterar o prognóstico de pacientes portadores de FC. / In Cystic Fibrosis (CF) chronic lung infection leads to irreversible structural abnormalities, progressive lung disease and respiratory failure, most common cause of death in CF. Bacterial infection in CF is usually related to specific agents: Staphylococcus aureus e Haemophilus influenzae usually infect younger patients. After this, Pseudomonas aeruginosa infection is associated with lung function deterioration and progression of structural lung disease. Assessment of CF lung disease includes monitoring of respiratory secretions microbiology, lung function and thoracic imaging. High resolution computed tomography of the lung (HRCT) is involved on early detection of structural airway and parenchymal abnormalities. These structural abnormalities can be assigned systematically through different scoring systems. The aim of this study was to compare the results of the modified Bhalla score for High resolution computed tomography of the lung from two groups of CF patients attending the CF Reference Center at Instituto Fernandes Figueira, Rio de Janeiro, Brazil. These two groups had different microbiological features: chronically infected by Pseudomonas aeruginosa (n = 26) and infected by Staphylococcus aureus (n = 15). High resolution computed tomography of the lung images were randomly and blindly scored using a modified Bhalla scoring system by two independent radiologists in two different moments. There was good intraobserver and interobserver variability and this observation indicates that the measurements are reliable and reproducible. Score results and abnormalities found in each group were compared. Final scores of Pseudomonas aeruginosa group showed more severe disease (radiologist 1: 13.5 and radiologist 2: 11.96) then the Staphylococcus aureus group (radiologist 1: 5.0 and radiologist 2: 5.07). Early detection of structural abnormalities associated to infection and its assessment through scoring systems may contribute to therapeutical approaches that can improve prognosis for CF patients.

A Fibrose Cística (FC) é uma doença letal, de caráter autossômico recessivo, que acomete populações de diferentes etnias. A doença caracteriza-se pelo comprometimento sistêmico das glândulas exócrinas e, na maioria dos pacientes, a doença pulmonar acaba tornando-se a patologia predominante. A infecção por P. aeruginosa é a principal causa de mortalidade dos pacientes com FC. O Sistema de Secreção Tipo III da bactéria é expresso na fase aguda da doença e é responsável por injetar proteínas citotóxicas no interior da célula eucariótica. Há um grande interesse em se investigar a resposta de anticorpos anti P. aeruginosa em pacientes com FC a fim de diagnosticar a colonização e ou infecção pulmonar antes da cultura, permitindo a antibioticoterapia preventiva, a fim de se evitar a infecção pulmonar crônica. Nesta tese, investigamos a resposta de anticorpos (IgG+IgM+IgA) contra as proteínas do SSTT de P. aeruginosa, através do Western-Blot. Participaram do estudo 51 pacientes com FC, de 1.1 a 16.8 anos acompanhados no Departamento de Pneumologia do Instituto Fernandes Figueira - FioCruz, durante um período aproximado de 2 anos. De cada paciente foram coletadas de 1 a 4 amostras de sangue, com intervalo médio de 6 meses entre as coletas. O grupo controle negativo consistiu de 28 indivíduos não fibrocísticos, de 2 a 17 anos, atendidos no Hospital Universitário Pedro Ernesto - HUPE UERJ. As proteínas do SSTT foram extraídas das cepas PAO1 e PAOΔExsA (regulador da expressão do SSTT) de P. aeruginosa. Controles positivos e negativos foram utilizados em todas as reações. Para a identificação das proteínas do SSTT na reação utilizou-se antisoro de camundongos imunizados com a proteína recombinante PcrV. Doze (75%) dos 16 pacientes fibrocísticos considerados não infectados por P. aeruginosa tiveram a primeira sorologia positiva para PopB e 15 (93,75%) para ExoS/ExoT, indicando a colonização ou infecção por P. aeruginosa. Aproximadamente 25% e 35,7% dos soros do grupo controle mostraram reatividade fraca com PopB ou ExoS/ExoT, respectivamente. O tempo decorrido entre a primeira sorologia positiva e o primeiro isolamento de P. aeruginosa nestes pacientes variou de 18 a 30 meses. Concluindo, é possível fazer o diagnóstico sorológico da infecção pulmonar por P. aeruginosa antes do isolamento da bactéria pela cultura. / Cystic Fibrosis (CF) is a lethal disease of autosomal recessive character, which affects people of different ethnicities. The disease is characterized by the involvement of systemic exocrine glands and in most patients, the lung disease becomes the predominant pathology. The infection with P. aeruginosa is the leading cause of mortality in patients with CF. The Type III Secretion System (TTSS) of bacteria is expressed during acute disease and injects cytotoxic proteins inside the host cell. There is a great interesting in investigate the antibody response to P. aeruginosa in CF patients in order to diagnose a pulmonary infection or colonization before the culture. Then, preventive antibiotic treatment can be initiated before the installation of chronic lung infection. We investigated the antibody response (IgG + IgA + IgM) against TTSS proteins of P. aeruginosa by Western-blot. The study included 51 patients with CF, from 1.1 to 16.8 years attending the Pediatric Pulmonology Unit of Fernandes Figueira Institute (IFF) FIOCRUZ, Rio de Janeiro, for a period of approximately 2 years. Most patients had or 4 blood samples collected for antibody analyses. Samples were obtained with a mean interval of 6 months. The negative control group consisted of 28 non-CF individuals, from 2 to 17 years, attended at Pedro Ernesto University Hospital - HUPE - UERJ. The TTSS proteins were extracted from strains PAO1 and PAOΔExsA (regulator of TTSS proteins expression) of P. aeruginosa. Positive and negative controls were used in all reactions. For the identification of TTSS proteins in the reaction we used antisera from mice immunized with the recombinant protein PcrV. Twelve (75%) of 16 CF patients considered not infected by P. aeruginosa had their first serology positive for "PopB" and 15 (93.75%) for "ExoS/ExoT. These results indicated that these patients were colonized or infected by P. aeruginosa. About 25% e 35,7% of negative control sera showed a weak reactivity with PopB or ExoS, respectively. The time between the first positive serology and the first isolation of P. aeruginosa in these patients ranged from 18 to 30 months. In conclusion, it is possible to make a serological diagnosis of pulmonary infection by P. aeruginosa before the isolation of the bacterium by culture.