Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste extracellulaire. La souche PAO1 de P. aeruginosa possède trois loci codant des Systèmes de Sécrétion de Type VI (T6SS) indépendants, nommés H1 à H3-T6SS. Le premier d'entre eux, H1-T6SS, a été largement décrit dans la littérature scientifique et injecte des toxines à activité antiprocaryote dans d'autres bactéries permettant une défense active contre l'attaque d'un T6SS d'une autre bactérie. Les deux autres T6SS de P. aeruginosa sont probablement des facteurs de virulence de cette bactérie, mais aucun effecteur sécrété, ni cible intracellulaire ou rôle n'ont été proposés jusqu'ici. Dans ce travail de thèse, nous avons mis en évidence que la machinerie H2-T6SS permet l'invasion de cellules non-phagocytaires et participe à la virulence de P. aeruginosa. Cette entrée requière la dynamique du réseau de microtubules, via VgrG2b injectée par la machinerie H2-T6SS dans les cellules épithéliales, et capable de cibler les complexes de gamma-tubulines, centre nucléateur des microtubules. Il s'agit d'un mécanisme d'internalisation tout à fait original et jamais encore décrit. Nous avons également exploré la régulation croisée entre H2 et H3-T6SS. Enfin par une analyse de « RNAseq », nous avons observé entre les souches PAO1 et PA14 de P. aeruginosa une expression différentielle de nombreux gènes, certains codant des facteurs de virulence. Pour près de 30% d'entre eux, l'origine de cette variation reposerait sur une quasi-absence d'expression dans la souche PA14 de qslA, codant un anti-activateur du Quorum-Sensing. Ceci serait une nouvelle explication du phénotype hyper-virulent de la souche PA14 de P. aeruginosa. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic extracellular pathogen. The PAO1 strain of P. aeruginosa harbors three loci encoding independent Type VI Secretion Systems (T6SS), named H1 to H3-T6SS. H1-T6SS has been widely described in the literature and injects toxins with antiprokaryotic activity in target bacteria, allowing an active defense against the attack of a T6SS from another bacterium. The other two T6SS of P. aeruginosa are likely virulence factors, but no secreted effector or intracellular target or role have been proposed so far.In this work, we demonstrated that the H2-T6SS machinery triggered the invasion of non-phagocytic epithelial cells and is involved in the virulence of P. aeruginosa. This uptake is mediated by the microtubule network dynamics, and via VgrG2b, injected by the H2-T6SS machinery in epithelial cells, to target the gamma-tubulin complex, the microtubule nucleating center. This is an original mechanism of internalization never described before. We also studied the cross-regulation between H2 and H3-T6SS. Finally through a « RNAseq » analysis, we observed differential expression of many genes, including some encoding virulence factors, between PAO1 and PA14 strains of P. aeruginosa. For nearly 30% of them, the origin of this variation is an almost lack of expression in the PA14 strain of qslA, encoding an anti-Quorum Sensing activator. This can be a new explanation of hyper-virulent phenotype of the PA14 strain of P. aeruginosa.

Le nombre de génomes bactériens et archées complètement séquencés augmentant sans cesse plus, une telle augmentation rend possible le développement de nouveaux types d’approches large échelle, afin de comprendre l’évolution de la structure des génomes au cours du temps. La prédiction du contenu en gènes et la comparaison des génomes ont évolué de telle sorte qu’il est dorénavant possible d’extraire un certain nombre de nouvelles information permettant de comprendre l’évolution des procaryotes. Des séquences importantes dans la compréhension des opérations de réarrangements au sein des génomes de au cours du temps sont les éléments transposables, qui sont des fragments d’ADN ayant la possibilité de se mouvoir d’un lieu à l’autre, et peuvent se dupliquer au cours de ces transpositions. Les éléments transposables chez les procaryotes sont les séquences d’insertion, qui suivent un processus de couper-coller à l’intérieur des séquences ADN. Cependant, les outils ayant pour but de découvrir de telles séquences d’insertions d’une manière efficace et de développer une manière algorithmique originale pour découvrir les séquences d’insertions dans des génomes bactériens, et de constituer une base de données pour découvrir les séquences d’insertion dans des génomes bactériens, et de constituer une base de données les insérant. A l’aide de ces données, nous devons déduire un modèle d’évolution de ces éléments transposables, qui doit être relié à l’évolution de la séquence hôte (le génome procaryote). En particulier, nous devons déterminer si les séquences d’insertion et les génomes hôtes ont évolué de la même manière, et si ces séquences sont responsables, au moins jusqu’à une certaine mesure, de recombinaisons génomiques telles que les inversions. / The number of completely sequenced bacterial and archaeal genomes are rising steadily, such an increasingmakes it possible to develop novel kind of large scale approaches to understand genomes structureand evolution over time. Gene content prediction and genome comparison have both provided newmajor information and deciphering keys to understand evolution of prokaryotes. Important sequencesin understanding rearrangement operations inside genome sequences during evolution are the so-calledtransposable elements (TEs), which are DNA fragments or segments that have the ability to insert themselvesinto new chromosomal locations, and often make duplicate copies of themselves during transposition process.The transposable elements involved in such a move are the insertion sequences (ISs) in prokaryotes, theyfollow a cut-and-paste process inside the host DNA sequence. But the tools that deal with discovering ISs inan efficient way and that relate them to genome rearrangements are still too few and not totally accurate.The aim of this thesis is to develop an accurate algorithmic way to discover insertion sequences (ISs) inbacterial genomes and to constitute a database with these discoveries. Using these data, we must deduce amodel of evolution of these transposable elements, which must be related to the evolution of the host sequence(the prokaryotic genome). In particular, wemust ask whether insertion sequences and host genomes haveevolved in a similar way, and if ISs are responsible, at least to some extent, for genomic recombinationlike inversions.

Durant ma thèse, nous avons identifier PlpA comme une cytotoxine conservée dans des isolats cliniques d'origines diverses, contrairement à son homologue, le facteur de virulence ExoU de Pseudomonas aeruginosa. Un rôle dans la cytotoxicité envers des cellules phagocytaires de l'immunité innée a été attribué à PlpA, et celui-ci dépend de l'intégrité de la dyade catalytique Ser/Asp, caractéristique des protéines de la famille des patatines. Un interactome réalisé in vivo dans des cellules hôtes nous a permis d'identifier des transporteurs de la mitochondrie comme partenaires de PlpA. L'interaction de PlpA avec ses partenaires mitochondriaux, aurait de manière inattendue un effet anti-apoptotique sur les macrophages, mais conduit cependant, à la mort de ceux-ci vraisemblablement par un phénomène de nécrose induite.PlpD a précédemment été caractérisée par Salacha et ses collaborateurs comme étant l'archétype du Système de Sécrétion de Type Vd (2010). Bien que le mécanisme précis de sécrétion de cette protéine reste à ce jour mal connu, nos travaux ont permis de lui attribuer un rôle dans la compétition bactérienne, conférant ainsi un avantage compétitif aux souches qui la possède. D'ailleurs, l'analyse phylogénétique de PlpD (Salacha et al., 2010 ; Heinz & Lithgow 2014) révèle la conservation de cette protéine au sein de nombreuses espèces vivants dans un environnement hostile, suggérant ainsi la nécessité de cette protéine dans l'implantation et la conservation de niches écologiques, que se soit dans l'environnement ou au cours d'infections polymicrobiennes chez un organisme hôte. / During my PhD, in the PAO1 strain of Pseudomonas aeruginosa, we identified PlpA as a cytotoxin conserved in clinical isolates of various origins, contrary to its virulence factor ExoU homologues. A cytotoxic role of PlpA has been highlighted against phagocytic cells, and showed to depend on the integrity of its Ser/Asp catalytic dyad. An in vivo interactome allowed us to identify mitochondrial transporters as partners of PlpA. Interestingly, PlpA interaction with these partners has an anti-apoptotic effect on macrophages but ultimely allows macrophages death probably by a necroptosis phenomenon. PlpD was previously described by Salacha and collaborators as the SST5d archetype (Salacha et al., 2010). While its exact secretion mechanism remains poorly understood, our work allowed showing that it played a role in bacterial competition. PlpD phylogenetic analysis (Salacha et al., 2010 ; Heinz & Lithgow 2014) revealed its conservation in many species living in hostile environments, suggesting its necessity in the implantation and conservation of ecological niches in the environment or during polymicrobial infections into host organism.

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie à Gram négatif ayant un rôle central dans la morbidité et la mortalité des patients mucoviscidosiques, dont l'environnement pulmonaire particulier favorise les infections chroniques par de nombreux pathogènes opportunistes. Malheureusement, de plus en plus de souches développent des résistances, rendant les antibiothérapies à base de β-lactames de moins en moins efficaces. Parmi les différents mécanismes de défenses développés par P. aeruginosa, l'un des plus important est la détection de l'activité antibiotique, avec en réponse la production de la β-lactamase AmpC, une enzyme qui dégrade les antibiotiques β-lactames. Cette détection met en œuvre la glycosylhydrolase NagZ, qui catalyse la formation de l'inducteur d'AmpC.Récemment au laboratoire, nous avons synthétisé un inhibiteur sélectif de NagZ basé sur une structure azépane. La co-administration à une souche résistante de P. aeruginosa de notre composé et de l'antibiotique β-lactame ceftazidime conduit à une perte de la résistance à l'antibiotique de 50%.Afin d'améliorer la sélectivité et l'activité de notre composé lead, des modifications chimiques du groupement acétamide et du groupement hydroxyle en position C-6 ont été réalisées. L'étude des relations de structure-activité basées sur un cliché cristallographique et sur une étude de docking ont ainsi pu être réalisées. Une autre stratégie explorée a consisté à fonctionnaliser l'atome d'azote endocyclique par un motif sidérophore afin de faciliter la pénétration du composé, ce type de groupement étant en effet connu pour jouer le rôle de cheval de Troie.Les azépanes synthétisés ont été évalués par nos collaborateurs biologistes au Japon et au Canada. / Pseudomonas aeruginosa is a gram negative bacterium playing a major role in morbidity and mortality among CF patients, whose particular pulmonary environment promotes chronic infections by various pathogens1. Unfortunately, more and more bacterial strains are developing resistance, making β-lactam-based antibiotic therapies less effective. Among the different mechanisms of defense developed by P. aeruginosa, one of the most important is the detection of the antibiotic activity by the pathogen, responsively producing the β-lactamase AmpC, an enzyme that degrades the β-lactam antibiotic. This detection implements the glycosylhydrolase NagZ, which catalyzes the formation of the enzyme inducer of AmpC2.We have recently designed a selective inhibitor of NagZ based on an azepane structure. Its co-administration with β-lactam ceftazidime to a β-lactam-resistant strain of P. aeruginosa causes a 50% decrease of the antibiotic resistance3.In order to improve the selectivity and the efficiency of our lead compound, chemical modifications of the acetamide moiety and of the hydroxyl group at C6 have been achieved, allowing to perform a SAR study supported by crystallographic studies and molecular modeling. Another strategy explored has consisted in the functionalization of the endocyclic nitrogen atom of the azepane by a siderophore that will act as a Trojan horse4, in order to improve the penetration of the azepane.The libraries of compounds synthesized were biologically evaluated by our Canadian and Japanese partners.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène d’origine environnementale capable de croître et de persister dans les systèmes de distribution d’eau et la plomberie. A l’hôpital, la fréquence des infections et épidémies associées aux soins dues à P. aeruginosa soulève de nombreuses questions quant à son cycle de transmission à l’homme dans l’environnement hospitalier. La situation épidémiologique du Centre Hospitalier Régional Universitaire de Montpellier a permis d’établir une collection de 730 souches de P. aeruginosa isolées durant une période de 9 ans. Cette collection est représentative des différentes niches environnementales et de deux périodes épidémiologiques marquées. Les souches cliniques impliquées dans des phénomènes épidémiques et des infections graves ont aussi été collectées. L’analyse génétique et phénétique de cette collection a pour objectif de mieux comprendre la structure, la dynamique et la persistance des populations de P. aeruginosa dans divers réservoirs environnementaux hospitaliers ainsi que les relations entre les réservoirs environnementaux et le succès épidémiologique des populations de P. aeruginosa.L’analyse intégrée des données obtenues dans les trois parties de cette étude convergent vers les résultats principaux suivants. Les réservoirs environnementaux médico-technologiques présentent une forte dynamique avec des phénomènes d’émergence clonale en relation avec les traitements réalisés sur les réseaux. A l’échelle d’un hôpital, le réservoir environnemental est directement impliqué dans les phénomènes épidémiques. La rupture du cycle homme/environnement par des barrières physiques conduit à un changement de situation épidémiologique avec une limitation de l’importance et de la fréquence des épidémies clonales. De plus, les souches les plus ubiquitaires et les plus persistantes dans l’environnement correspondent aux génotypes à fort risque épidémique local et mondial ou clones EHR (Epidemic High Risk). La structure de population de P. aeruginosa au sein de l’hôpital est similaire à celle de la population mondiale ou à celle décrite dans d’autres études : une structure épidémique avec la recombinaison qui a un effet prépondérant sur l’émergence des lignées. Le clone EHR majoritaire ST308 est plus résistant aux antibiotiques que les clones prévalants dans l’hôpital mais non impliqués dans des épidémies. Toutefois, la caractérisation de 46 souches du clone EHR majoritaire, ST308, montre une extrême variabilité au sein du génotype avec, en particulier, des comportements divers en termes de résistance aux antibiotiques. La forte capacité de formation de biofilm et la faible motilité décrites dans la littérature comme caractéristique des clones EHR ne sont pas observées dans cette étude. Notre principale hypothèse est que le succès épidémique du clone EHR ST308 dans l’hôpital est lié à sa diversité intraclonale plutôt qu’à un caractère particulier partagé par toutes les souches EHR.Ce travail apporte des arguments forts en faveur de l’implication des réservoirs environnementaux hospitaliers dans les épidémies d’infections associées aux soins dues à P. aeruginosa. Dans le but de mieux contrôler ces épidémies, les résultats de cette étude incitent à la surveillance des clones EHR de P. aeruginosa quel que soit leur profil de résistance aux antibiotiques et à mettre en place des mesures barrières entre l’environnement hydrique et le patient dès qu’un réservoir environnemental d’EHR se constitue.Mots clés : Pseudomonas aeruginosa, infections associées aux soins, épidémie, environnement, réseau d’eau, structure de population, clone à haut risque épidémique, résistance aux antibiotiques, biofilm, motilité, variabilité intraclonale, adaptation / Pseudomonas aeruginosa is an environmental pathogen that growths in water and plumbing systems. In hospital, the rate of healthcare associated infections (HAIs) and outbreaks caused by P. aeruginosa raised questions about the cycle of its transmission to human beings in the hospital environment. P. aeruginosa epidemiology at the Montpellier Academic Hospital allowed to collect 730 strains isolated over a 9-years period. This collection is representative of various environmental niches and two marked epidemiological periods. Clinical strains involved in outbreak events and serious infections were also included in the study. Genetic and phenetic analysis were performed with the aim to understand structure, dynamics and persistence of P. aeruginosa populations in various hospital reservoirs as well as the relationships between environmental reservoirs and epidemic success of P. aeruginosa.The experimental study, organized in 3 parts, produced the following major results. Medical and technological reservoirs of P. aeruginosa are highly dynamic and clonal emergence occurs in these systems, particularly in relation with networks decontamination by biocides. At the hospital scale, environmental reservoirs are directly involved in outbreak events. Physical barriers between water and patients cut the cycle of transmission from environment to human and markedly changed the epidemiology with a decrease of outbreaks in frequency and incidence. Moreover, the most ubiquitary strains that also persists in environment correspond to Epidemic High Risk (EHR) clones that succeed locally and globally. Population structure of P. aeruginosa within the hospital is similar to the worldwide population or to more local populations previously described: an epidemic structure with a background of recombinations involved in lineages emergence. The major EHR clone ST308 is more resistant to antibiotics than other prevalent clones not involved in outbreaks. However, the study of 46 strains in ST308 showed extreme within genotype variability, particularly various behaviours against antimicrobial agents. Increased ability to form biofilm and decreased motility have been described in literature as specific traits of EHR clones but it is not observed in this study. Our main hypothesis is that epidemic success of EHR clone ST308 in the hospital was linked to its diversity and versatility rather than to specific characters shared by all EHR strains.This study provides strong arguments in favour of the involvement of P. aeruginosa environmental reservoirs in HAI outbreaks. For a better control of these outbreaks, a surveillance of EHR clones of P. aeruginosa should be implemented independently to their antibiotic resistance. Moreover, barriers between environment and patient should be established as soon as an environmental reservoir of EHR clone is detected.Key words : Pseudomonas aeruginosa, Healthcare Associated Infections, outbreak, environment, water network, population structure, epidemic high risk clone, resistance to antibiotics, biofilm, motility, intraclonal variation, adaptation

Le microbiote pulmonaire complexe de patients atteints de mucoviscidose (MV) peut être modifié par des facteurs de l'hôte (état clinique), xénobiotiques (antibiothérapie, habitat) ainsi que bactériens (pathogènes, commensaux). Notre étude a porté sur ces facteurs bactériens et plus particulièrement sur l'effet de Pseudomonas aeruginosa sur la structuration des microbiotes MV. Le but de notre travail a été d'étudier la structure et la composition des microbiotes pulmonaires chez des patients MV en fonction de la présence ou non de P. aeruginosa, ainsi que l'effet de ces microbiotes sur ce pathogène. Différentes approches nous ont permis de mettre en évidence ces résultats : i) certains genres bactérien (Stenotrophomonas, Prevotella) contenus dans un microbiote particulier plus pauvre et moins diverse sont associés préférentiellement à la présence de P. aeruginosa, ii) aucune diminution de richesse et de diversité n'est observée en amont d'une primo-colonisation par P. aeruginosa mais celle-ci entraine ultérieurement une diminution de richesse du microbiote, iii) le microbiote MV in vitro s'appauvrit et diminue en diversité plus rapidement lors d'une colonisation par une souche ayant un phénotype de « primo-colonisation », iv) les souches de primo-colonisation sont plus virulentes que les souches issues de colonisation chronique, v) ces souches sécrètent des molécules appartenant à la famille des 4-hydroxy-2-heptylquinoline (HAQs) bactéricides vis-à-vis de S. aureus. Une meilleure compréhension de cette modulation des microbiotes MV par P. aeruginosa offriraient de nouvelles stratégies thérapeutiques afin notamment de contrer l'implantation de ce pathogène au niveau pulmonaire et de limiter le développement d'infections chroniques chez les patients MV / Cystic fibrosis microbiota could be modified by different factors such as host factor (clinical state), xenobiotic factor (antibiotic, environment) or bacterial factors (pathogen, commensal). Our study focused on bacterial factors and more particularly on the impact of Pseudomonas aeruginosa on the CF microbiota structure. The objectives were to study the structure and the composition of CF microbiota whether the presence or not of P. aeruginosa and the impact of the CF microbiota on this pathogen. Different experimentations were used to get results : i) bacterial genus (Stenotrophomonas, Prevotella) were preferentially associated with P. aeruginosa in a poor and no diverse microbiota, ii) no previous decrease of microbiota richness was observed when the initial P. aeruginosa pulmonary colonization took place but this event was associated with a later decrease of microbiota richness, iii) In vitro model of CF microbiota showed a more important richness and diversity decrease with early colonization strains, iv) early colonization strains were more virulent than chronic colonization strains, v) these strains secreted bactericid molecules toward Staaphylococcus aureus belonging to 4-hydroxy-2-heptylquinoline (HAQs). Improve our understanding on how P. aeruginosa could modulate CF microbiota could permit to find new therapeutic strategies to prevent the early colonization and then to limit the chronic infections in CF patients

En réanimation, les facteurs de risque d’infection à bactéries résistantes sont nombreux et il est nécessaire d’instaurer une antibiothérapie rapide et adéquate. Cela conduit donc souvent au choix empirique d’antibiotiques à large spectre. Ce travail de thèse regroupant quatre études porte sur les éléments de ce choix. Dans la première étude, les critères de "pneumopathie associée aux soins" sont discutés. Dans la seconde, il est rapporté que le traitement antibiotique prescrit au début du séjour en réanimation est associé à l’acquisition de Pseudomonas aeruginosa. Dans le diagnostic d’une pneumopathie acquise sous ventilation, la troisième étude décrit une technique rapide d’antibiogramme permettant une désescalade antibiotique plus précoce. La néphrotoxicité des aminoglycosides dans le traitement empirique des patients en sepsis sévère est présentée dans la dernière étude. Ces travaux participent à la bonne gestion des antibiotiques à la phase empirique du traitement des infections sévères en réanimation. / Intensive care units (ICU) are a niche for risk factors of infection due to multidrug resistant bacteria. ICU patients are in a need for a rapid and adequate antibiotic therapy. This leads ICU physicians to use empirical broad spectrum antibiotics. This thesis comprises four studies which focus on the empirical step of the treatment. In the first study, the criteria for "health-care-associated pneumonia" are discussed. The second shows that the antibiotic selection pressure administered early during the ICU stay could lead to Pseudomonas aeruginosa acquisition. In the third study, a rapid direct specimen testing method was assessed for ventilator-associated pneumonia diagnosis in order to hasten antibiotic de-escalation. Finally, a review on aminoglycosides’ nephrotoxicity in the severe sepsis setting represents the fourth study. These studies bring a loop forward into the understanding of the antibiotic stewardship of patients with severe sepsis, with particular focus on the empirical antibiotic treatment.

In this study, we tested the long-term and negative effects of microcystin-producing cyanobacterium Microcystis aeruginosa from Vietnam on Daphnia magna under the laboratory conditions. The test organisms were fed with mixtures of green alga Scenedesmus armatus. and toxic M. aeruginosa at different ratios (10% Microcystis + 90% Scenedesmus, 50% Microcystis + 50% Scenedesmus, 100% Microcystis, and 100% Scenedesmus) for over a period of 21 days. The life history traits of the organisms such as, survival, maturation, fecundity were daily recorded. Besides, the intrinsic population rate of D. magna in each treatment was also calculated based on the survivorship, the reproductive age and the clutch size of the animals. The results showed that survival, maturation and reproduction of the D. magna fed with 10, 50 and 100% M. aeruginosa was impaired. Additionally, the intrinsic population rate of the exposed D. magna was lower than that of the control. This study evidenced the adverse effects of toxic M. aeruginosa on both the individual and intrinsic population levels of D. magna. To our knowledge, this is the first report on the chronically detrimental impacts of toxic M. aeruginosa isolated from Vietnam on D. magna and contributed the scientific information on the severe influences of toxic cyanobacteria world wide. / Trong bài viết này, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng xấu mãn tính của loài vi khuẩn lam Microcystis aeruginosa có khả năng sản sinh độc tố microcysin từ Việt Nam lên Daphnia magna trong điều kiện phòng thí nghiệm. Sinh vật thí nghiệm được cho ăn với hỗn hợp tảo lục Scenedesmus armatus và M. aeruginosa có độc ở các tỷ lệ khác nhau (10% Microcystis + 90% Scenedesmus, 50% Microcystis + 50% Scenedesmus, 100% Microcystis, và 100% Scenedesmus) trong thời gian 21 ngày. Các đặc điểm vòng đời của sinh vật bao gồm sức sống, sự thành thục, sức sinh sản được theo dõi hàng ngày. Bên cạnh đó, tỷ lệ phát triển quần thể của D. magna trong từng lô thí nghiệm cũng được tính toán dựa vào sức sống, tuổi sinh sản và kích cỡ sinh sản của sinh vật. Kết quả cho thấy, sức sống, tuổi thành thục và sự sinh sản của D. magna cho ăn với 10, 50 và 100% M. aeruginosa bị ảnh hưởng xấu. Bên cạnh đó, tỷ lệ phát triển quần thể của D. magna trong lô phơi nhiễm thấp hơn so với đối chứng. Nghiên cứu này chứng minh ảnh hưởng xấu của M. aeruginosa có độc lên cả hai mức độ cá thể và quần thể của D. magna. Theo hiểu biết của chúng tôi, đây là báo cáo đầu tiên về ảnh hưởng xấu mãn tính của M. aeruginosa có độc phân lập từ Việt Nam lên D. magna and đóng góp thêm thông tin khoa học cho những ảnh hưởng nghiêm trọng của vi khuẩn lam có độc trên khắp thế giới.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste majeur de l'Homme capable de mettre en jeu tout un ensemble de mécanismes pour résister aux antibiotiques. Parmi eux, le système d'efflux actif MexXY(OprM) s'oppose, lorsqu'il est surproduit, à l'accumulation intracellulaire de différents composés dont certains, comme les aminosides et les fluoroquinolones, sont largement utilisés dans le traitement des infections à P. aeruginosa. Chez les souches cliniques, la surproduction de la pompe MexXY résulte de mutations soit dans le gène répresseur de l'opéron mexXY, mexZ (mutants agrZ) soit dans des loci génétiques encore inconnus (mutants agrUI). Au cours de ce travail, nous avons carcatérisés deux types de mutants agr W dérivés de la souche de référence PAO 1. Les premiers, agr WI, présentent une augmentation de la résistance aux antibiotiques substrats de la pompe Mex.XY comparable à celle observée chez les mutants agrZ tandis que les seconds, agrW2, sont en plus résistants aux carbapénèmes et aux peptides cationiques ( colistine ). Par une approche de séquençage à haut débit des génomes, nous avons identifié chez les mutants agrWI une mutation dans deux des quatre allèles codant pour la sous-unité ribosomale 23S et chez les mutants agrW2 une mutation dans le régulateur de réponse d'un système à deux composants dénommé ParR. A l'aide d'expériences de RT-qPCR, d'inactivation et de complémentation génique deux voies distinctes d'activation de MexXY/OprM ont été identifiées. Parallèlement, la comparaison des transcriptomes globaux des mutants agrWI, agrW2 avec celui de la souche PAOl nous a permis de mieux comprendre dans quel processus cellulaire s'intègre la pompe Mex.XY /OprM. / Pseudomonas aeruginosa is a nosocomial pathogen naturally resistant to many antibiotics thanks to numerous resistant mechanisms. Among them, overproduction of the MexXY/OprM efflux system leads to decrease significantly the susceptibility of P. aeruginosa to aminoglycosides and fluoroquinolones. In clinical strains, upregulation of this pump often results from mutations occurrinJ in mexZ ( agrZ mutants), the local repressor gene of the mexXY operon. Analysis of MexXY­overproducing mutants selected in vitro from the reference strain PAO 1 led to identification of two new classes of mutants (agrWmutants) harboring an intact mexZ gene. The first, named agrWI mutants, shows an increase resistance to Mex.XY substrates similar to that observed in agrZ mutants while the second, dubbed agrW2, are more resistant to carbapenems and cationic peptides (colistin) in addition to aminoglycosides and fluoroquinolones. Whole-genome sequencing experiments revealed in agrWI mutants a mutation in two of the four alleles encoding the 23S ribosomal subunit and in agr W2 mutants, a mutation in the response regulator of a two-component system called ParR. By using RT-qPCR, inactivation and complementation experiments, two distinct activation pathway of the MexXY /OprM efflux system have been identified. Meanwhile, transcriptomic profiles of agrWJ and agrW2 mutants compared with the PAOl reference strain has allowed us to better understand the physiologie function of the MexXY/OprM efflux pump

Les efflorescences de cyanobactéries sont susceptibles d’avoir des effets néfastes sur les organismes des écosystèmes aquatiques, ainsi que sur les populations environnantes, notamment à travers la production de nombreuses molécules potentiellement toxiques (appelées cyanotoxines). Jusqu'à présent, une des cyanotoxines les plus étudiées est la microcystine (MC). Cette thèse a pour objectif d’évaluer la toxicité potentielle sur la reproduction de la MC-LR et de l'extrait d'une souche de Microcystis productrice de MCs en étudiant leurs effets toxiques sur le foie et les gonades de poissons medaka adultes exposés de manière aiguë ou chronique.Une étude complète du foie des poissons médaka deux sexes a été menés par ailleurs, attestant d'un fort dimorphisme sexuel aussi bien au niveau cellulaire que moléculaire et souligne les importantes spécificités métaboliques du foie entre les deux sexes, notamment pour le maintien de la compétence de reproduction chez les poissons medaka adultes femelles.Dans l'étude des effets induits par une exposition aiguë, les poissons medaka adultes ont été exposés par gavage à 10 μg.g-1 bw de MC-LR pure pendant 1 heure. L'examen histologique et l'immunolocalisation des MCs du foie de poisson traité par la MC-LR ont révélé des lésions hépatiques sévères ainsi qu'une distribution intense de la MC-LR dans le foie, localisée particulièrement dans le cytoplasme et dans le noyau des hépatocytes. Dans la gonade des poissons traités, la MC-LR a été détectée dans les tissus conjonctifs de l'ovaire et des testicules. De plus, l’observation par microscopie électronique couplé à la technique d’immunogold a révélé, pour la première fois, que la MC-LR était également détectable dans le chorion, le cytoplasme et le vitellus des ovocytes matures.Au cours des études des effets induits par l’exposition chronique, les poissons medaka adultes ont été exposés durant 28 jours par balnéation à 1 et 5 μg.L-1 de MC-LR et à un extrait de la souche de Microcystis aeruginosa (PCC 7820) productrice de microcystines (5 μg.L-1 équivalent MC-LR). Ces résultats ont révélé que la MC-LR et l'extrait de Microcystis induisent des effets délétères sur différents paramètres de reproduction, tels la fécondité et le taux d’éclosion des embryons. La cause principale de ces perturbations de la reproduction semblent principalement résulté d’un dysfonction hépatique globale induite par les traitements aux MCs (hépatotoxiques, notoires), plutôt qu’à des effets directs sur les gonades. Dans l'ensemble, les résultats de cette thèse démontrent que même si les microcystines pourraient avoir un impact direct, mais modéré, sur la fonction gonadique en induisant une cytotoxicité dans les cellules somatiques gonadiques et les cellules reproductrices, elle semble avoir principalement avoir un impact indirect sur la fonction reproductrice en perturbant la fonction hépatique générale. Ces données améliorent notre compréhension des processus liés à la toxicité potentielle des cyanotoxines pour la reproduction chez un poisson modèle, et fait d’une manière générale progresser questionnement quant à la protection des populations exposées à ces cyanotoxines. / Cyanobacterial blooms threaten human health as well as other living organisms of the aquatic environment, particularly due to the production of natural toxic components (called cyanotoxins). So far, one of the most studied cyanotoxins is the microcystin (MC). This thesis evaluated the potential reproductive toxicity of MC-LR and the extract of one Microcystis strain (MC-producing) by investigating their toxic effects on the liver and gonad of adult medaka fish with one acute and one chronic study.An investigation of the metabolic specificities of the liver in two genders of medaka fish was performed prior to the MC-containing exposure, which attests to a strong sexual dimorphism of medaka liver, and highlights the importance of metabolic adjustments of the liver for maintaining the reproductive competency in adult medaka fish.In the acute study, adult medaka fish were administered with 10 μg.g-1 bw of pure MC-LR for 1 hour by gavage. The histological examination and immunolocalization of the MC-treated fish liver revealed a severe liver lesion along with an intense distribution of MC-LR in the liver, being particularly localized in the cytoplasm and nucleus of hepatocytes. In the gonad of MC-treated fish, MC-LR was shown to be present in the connective tissue of ovary and testis. Additionally, immunogold electron microscopy, for the first time, revealed that MC-LR was also localized in the chorion, cytoplasm and yolk vesicles of oocytes.Overall, the results of this thesis demonstrates that MC might directly impact gonadal function by inducing cytotoxicity in gonadal somatic cells and reproductive cells, and it could also impact the reproductive function indirectly by disturbing the general liver function. This improves our understanding of the potential reproductive toxicity of cyanotoxins in model fish, and advances our current knowledge on the protection of aquatic organism populations as well as human health from cyanotoxin issues.