AgÃncia Nacional do PetrÃleo / Este trabalho teve como objetivo avaliar a produÃÃo de biossurfactante por cepas de Pseudomona aeruginosa e Bacillus subtilis, utilizando suco de caju, integral e clarificado, como matÃria-prima nÃo convencional. Nos ensaios com P. aeruginosa ATCC 10145 em mesa agitadora, avaliou-se a suplementaÃÃo do suco de caju integral (CAJN) com Ãleo de soja, como fonte de carbono, e com diferentes fontes de nitrogÃnio: peptona, NaNO3 e (NH4)2SO4, sendo estes resultados comparados com os obtidos utilizando caldo nutritivo e com meio CAJN. A maior reduÃÃo na tensÃo superficial (41 %) foi obtida no suco de caju suplementado com peptona (CAJP) apÃs 24 h de cultivo. Neste ensaio, observou-se uma reduÃÃo da tensÃo superficial do meio de 50 para 29,5 dina cm-1. Jà em meio suplementado com NaNO3 e (NH4)2SO4, obteve-se, respectivamente, uma reduÃÃo na TS de 37,14 e 15,85% apÃs 72 horas de cultivo. Estudou-se a suplementaÃÃo do meio CAJP com glicerol e Ãleo de soja. Nestes ensaios, observou-se um alto crescimento celular, obtendo uma densidade Ãptica (a 600nm) de 5,0 com 48 h de cultivo, contudo uma pequena reduÃÃo da tensÃo superficial (16,51 %) ao utilizar glicerol. Com base nos resultados conduzidos em mesa agitadora, os meios CAJP e CAJNaNO3 foram selecionados para estudos em fermentador de bancada. Realizaram-se ensaios utilizando biorreator a 30ÂC, 200 rpm e sem aeraÃÃo, porÃm nÃo se observou o mesmo perfil de produÃÃo de ramnolipÃdeos ocorrido em mesa agitadora. Tal fato pode ter ocorrido devido à falta de oxigÃnio no meio de cultivo. Acompanhou-se a estabilidade tÃrmica, efeito da variaÃÃo de pH e da concentraÃÃo de NaCl, na atividade emulsificante do biossurfactante produzido em CAJP e sua composiÃÃo quÃmica. O biossurfactante produzido por P. aeruginosa demonstrou-se estÃvel a variaÃÃes de temperatura, pH e concentraÃÃes de NaCl, e emulsionou todos os hidrocarbonetos estudados e Ãleo de soja. Em paralelo, diferentes ensaios foram realizados visando otimizar o meio de cultivo para a produÃÃo de surfactina por B. subtilis usando CAJN e suco de caju clarificado (CAJC). Os melhores resultados foram obtidos quando se utilizou meio mineral suplementado com extrato de levedura e formulado com CAJC, de maneira que a concentraÃÃo de glicose fosse de 10 g.L-1. Nestes ensaios, obteve-se uma reduÃÃo de 21,37 % na tensÃo superficial e observou-se a presenÃa de surfactina atravÃs das anÃlises conduzidos em HPLC. No entanto, a mÃnima tensÃo superficial alcanÃada foi superior a 39 dina.cm-1. Portanto, avaliaram-se outras cepas de B. subtilis, doze ao total, quanto à capacidade de produzir surfactina utilizando CAJC. ApÃs 48 horas de cultivo com as cepas BE 08, a tensÃo superficial do meio de cultivo livre de cÃlulas atingiu 28,0  1,0 dina.cm-1, que tambÃm apresentou atividade emulsificante. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que o suco de caju à uma matÃria-prima adequada para a produÃÃo de biossurfactantes. / The aim of this work was to investigate the use of natural and clarified cashew apple juice as an alternative raw material for biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa and Bacillus subtilis. In the assays with P. aeruginosa ATCC 10145 on rotary shaker, the influence of medium (CAJN) supplementation with soybean oil, as source carbon, and with different sources of nitrogen: peptone, NaNO3 and (NH4)2SO4, were investigated. Results were compared with the obtained when Nutritive Broth (NB) and CAJN were used as culture medium. Maximum reduction in the Surface Tension (41%)was obtained when P. aeruginosa was grown on CAJP, after 24 h of cultive. In these assays, the surface tension was reduced from 50 to 29.5 dina.cm-1. When P. aeruginosa was grown on CAJN supplemented with NaNO3 or (NH4)2SO4, the reduction in the Surface Tension was of 37.14 and 15.85 %, respectively, after 72 h of cultive. Evaluated CAJP supplemented with glycerol and soybean oil. In these assays, high growth was observed, an optical density of 5,0 at 600 nm with 48h of culture was observed, however small reduction in surface tension (16,51 %) was achieved using glycerol as carbon source. Based on the results in flasks, the mediums CAJP and CAJNaNO3 were selected for further studies in a biorreator. The assays were conduced in biorreator at 30ÂC, 200 rpm and without aeration. Nevertheless, the expected profile of rhamnolipids production was not observed. Such fact may have happened due to the lack of oxygen in the cultivation medium, since the process was conducted without aeration. The stability of biosurfactant produced by P. aeruginosa in CAJP against NaCl, pH and temperature and its chemical structure were evaluated. The biosurfactante produced by P. aeruginosa was stable to temperature and variations, as well as against different NaCl concentrations. Furthermore, it emulsified all the studied hydrocarbons and soybean oil. No protein was detected in the extracted biosurfactant; it however contained carbohydrate. The highest biosurfactant production occurred with 48h,when CAJP was used as culture medium (3.86 g of biosurfactant for 1000 mL de medium) and the poorest in NB. In parallel, different assays were performed to optimize the culture media for surfactin production by Bacillus subtilis using CAJN and clarified cashew apple juice (CAJC). Best results were obtained when mineral medium supplemented with yeast extract (5 g.L-1) was used and formulated with CAJC (glucose concentration - 10 g.L-1). In these assays, a reduction of 21.37 % in the surface tension was obtained and production of surfactin was observed by HPLC. However, best results of surface tension were higher than 39 dina.cm-1. Therefore, twelve strains of Bacillus sp. were evaluated regarding the ability of producing surfactin when grown on CAJC. After 48 hours of cultivation, with strain BE 08, the surface tension of the fermented broth, free of cells, reached 28.0  1.0 dina.cm-1,and it also presented emulsifying activity. The results obtained in this work indicate that the cashew apple juice is an appropriate raw material for biosurfactants production.

Pseudomonas aeruginosa é uma gamaproteobactéria ubíqua capaz de infectar indivíduos imunocomprometidos e causar infecções hospitalares. Entre duas repetições diretas situadas na ilha de patogenicidade PAPI-1 da linhagem PA14, encontram-se dois grupos de genes transcritos em direções opostas. O primeiro, composto de pvrS, pvrR, rcsC e rcsB, codifica proteínas de sistemas de dois componentes e está relacionado com virulência, enquanto o segundo compreende cinco genes (cupD1-D5) e codifica uma fímbria do tipo chaperoneusher, com alta similaridade com o grupo cupA, envolvido na formação de biofilme em outras linhagens de P. aeruginosa. Fímbrias da mesma família são importantes na patogenicidade de outras bactérias. Com o objetivo de estudar a relação entre esses dois grupos de genes, procurou-se caracterizar sua organização por ensaios de RT-PCR, que possibilitaram observar a disposição dos genes dos sistemas de dois componentes em dois operons distintos (pvrRS e rcsCB) e, pelo menos, cupD1-cupD2 como uma unidade transcricional, com indícios apontando para a organização de cupD1-D5 em um único operon. Os inícios de transcrição e as regiões promotoras de cada operon foram caracterizados por experimentos de RACE 5 e extensão de oligonucleotídeo marcado em busca de seqüências relevantes para a ativação da expressão desses genes. Visando investigar a regulação da expressão da fímbria CupD pelos sistemas de dois componentes codificados pelos genes adjacentes, foram realizados ensaios de qRT-PCR, os quais mostraram uma menor expressão de cupD na linhagem mutante para rcsB. RcsB apresenta um domínio de ligação a DNA e, apesar da falta de sucesso em ensaios de ligação dessa proteína à região promotora de cupD, os dados obtidos por qRT-PCR 1 indicam fortemente que essa proteína funciona como um ativador de transcrição dos genes da fímbria. Corroborando esses achados, somente quando se utilizou RNA extraído de P. aeruginosa PA14 superexpressando RcsB foi possível visualizar no gel a banda referente ao início de transcrição de cupD1-D2 no ensaio de extensão de oligonucleotídeo. Ao contrário do efeito positivo de RcsB observado na transcrição de cupD1, cupD2 e cupD5, a histidina quinase RcsC atua negativamente na expressão dos genes da fímbria, sugerindo que, nesse caso, sua atividade predominante sobre RcsB seja a de fosfatase. PvrS e PvrR parecem atuar de forma indireta e positiva sobre cupD. Como um segundo objetivo do trabalho, ensaios de virulência de P. aeruginosa no hospedeiro-modelo Dictyostelium discoideum foram otimizados, com o estabelecimento de uma técnica para se testar alguns genes estudados no laboratório que podem ser relevantes para a virulência dessa bactéria. Resultados desses ensaios confirmaram a atenuação de mutantes para uma suposta metiltransferase, já observada em modelos de planta, camundongo e drosófila. Em conjunto, os resultados desse trabalho tornam-se informações valiosas para serem usadas na pesquisa de controle de infecções por P. aeruginosa, que depende de fímbrias para colonizar com sucesso superfícies abióticas que servem de veículo de disseminação desse agente infeccioso e para que as bactérias possam persistir no organismo do hospedeiro. / Pseudomonas aeruginosa is a ubiquitous gammaproteobacteria able to infect immunocompromised individuals and to cause nosocomial infections. Between two direct repeats in the PAPI-1 pathogenicity island present in strain PA14, there are two gene clusters transcribed in opposite directions. The first, composed of pvrS, pvrR, rcsC and rcsB, encodes two-component systems proteins and is implicated in virulence, whereas the second comprises five genes (cupD1-D5) encoding a chaperone-usher fimbria with high similarity to cupA, a gene cluster involved in biofilm formation in other strains of P. aeruginosa. Fimbriae belonging to the same family of Cup are related to pathogenicity of other bacteria. In order to study the relationship between these two clusters, the organization of the genes in operons was characterized using RT-PCR, which results lead to the conclusion that the twocomponent systems genes are arranged into two different operons (pvrSR and rcsCB) and that cupD1-D2 share the same promoter, with some evidences that the operons extends from cupD1 to cupD5. The transcription start sites and the promoter regions of each operon were characterized with RACE 5 and primer extension assays to look for sequences that could be relevant to the activation of expression of these genes. Quantitative RT-PCR assays were carried out to investigate whether the expression of CupD fimbriae is regulated by the twocomponent systems encoded by the adjacent genes and the results showed a lower expression of cupD in the rcsB mutant strain than in the wild-type. RcsB bears a DNA-binding domain and, although our assays of DNA-protein interactions have failed, data obtained by qRT-PCR 1 strongly indicate that this protein functions as a transcription activator of fimbrial genes. These findings were corroborated by the primer extension assay, in which the band corresponding to the transcriptional start of cupD1-D2 was visible only when the reaction was performed with the RNA extracted of P. aeruginosa overexpressing RcsB. Unlike the effect observed for RcsB in cupD1, cupD2 and cupD5 transcription, the histidine quinase RcsC acts negatively in the fimbrial genes expression, suggesting that it might function predominantly as a RcsB phosphatase. PvrS and PvrR seem to regulate cupD positively and indirectly. As a second aim of this work, virulence assays of P. aeruginosa in the model host Dictyostelium discoideum were optimized, and a technique for testing genes studied in the laboratory that could be important for Pseudomonas virulence was established. These assays confirmed the attenuation-in-virulence of strains mutant in a putative methyltransferase gene, as observed before in plant, mouse and drosophila models. The results obtained in this work may contribute to P. aeruginosa infection control research, since this bacterium depends on fimbriae to successfully colonize abiotic surfaces that act as a dissemination vehicle, and to allow the bacteria to persist into the host organism.

A contínua entrada de metais pesados nos ambientes aquáticos constitui uma potencial ameaça aos ecossistemas naturais devido à ação tóxica direta em organismos aquáticos. Nos ambientes aquáticos, os organismos estão expostos a metais tanto dissolvidos na água como aqueles presentes na cadeia trófica. Um maior conhecimento sobre o papel do alimento como rota adicional de exposição a metais ou como um possível retentor de sua toxicidade para invertebrados aquáticos é necessário. Considerando-se a importância dos metais na contaminação ambiental, bem como a necessidade de melhor entendimento das interações desses elementos nos sistemas aquáticos, o presente estudo visou a avaliar a sensibilidade de espécies fitoplanctônicas (Selenastrum capricornutum e Microcystis aeruginosa) e de espécies zooplanctônicas (Daphnia similis e Ceriodaphnia dubia) aos metais cádmio e cromo e os efeitos tóxicos desses elementos em tais organismos. O crescimento celular, a concentração de clorofila, o biovolume e o peso seco das algas foram analisados quando as espécies algais foram expostas aos metais por meio de testes de toxicidade aguda. Testes de toxicidade aguda e crônica com o zooplâncton aos metais também foram realizados e o efeito de diferentes densidades algais (alta, média e baixa) sobre a toxicidade dos metais aos cladóceros foi avaliado. Além disso, algas foram expostas aos metais, oferecidas como alimento a C. dubia e os efeitos tóxicos crônicos foram investigados. Os resultados demonstraram que S. capricornutum foi mais sensível ao cádmio e M. aeruginosa foi mais sensível ao cromo, sendo essa diferença relacionada à capacidade das algas para reter os metais. Com o aumento de ambos os metais, houve uma diminuição na densidade celular, na taxa de crescimento, na clorofila e no peso seco das algas. A presença de diferentes densidades de S. capricornutum não alterou significativamente o valor da CE(I)50; 48h aos metais para D. similis, mas a elevada densidade de M. aeruginosa reduziu a toxicidade do cádmio para o dafinídeo. A alta densidade de alimento (106 céls/mL) influenciou negativamente a reprodução e a sobrevivência de C. dubia quando exposta a concentrações subletais dos metais em solução. Alimento exposto à metais, quando fornecido em alta e em média densidade, também afetou a sobrevivência e a reprodução dos organismos-teste. Apesar de a água ser uma importante rota de exposição aos metais para os organismos aquáticos, o alimento deve ser considerado uma via de contaminação adicional. / The continuous input of heavy metals into aquatic systems constitutes a potential threat to natural ecosystems because of the direct toxic action on aquatic organisms. In aquatic ecosystems, the organisms are exposed to dissolved metals in the water as to metals presents in the food chain. A larger knowledge about paper of food as an additional route of exposure to metals or as possible retainer of its toxicity for aquatic organisms is necessary. Considering the importance of metals in contamination of aquatic ecosystems and the need of better understanding of the interactions of those elements in the aquatic ecosystems as well, the aim of this study was to evaluate the sensibility of phytoplankton species (Selenastrum capricornutum and Microcystis aeruginosa) and zooplankton species (Daphnia similis and Ceriodaphnia dubia) to cadmium and chromium metals and the toxic effects of those elements in such organisms. Analysed of cellular growth, chlorophyll concentration, biovolume and dry weight of the algae were carried out when algal species were exposed to metals. Acute and chronic toxicity tests with the zooplankton were also accomplished and the effect of different algal densities (high, middle and low) on toxicity of metals to cladoceran was evaluated. Alga S. capricornutum was exposed to metals, supplied as food to C. dubia and chronic toxicity effects were investigated. The results demonstrated that S. capricornutum was more sensitive to cadmium and M. aeruginosa was more sensitive to chromium, this difference was related the capacity of the algae to retain metals. Cell density, growth rate, chlorophyll and dry weight of the algae were reduced with increase of both metals. The presence of different density of S. capricornutum does not alter the value of EC50 to metals for D. similis, but high density of M. aeruginosa reduced the toxicity of cadmium for daphnid. High food density (106 cells/mL) influenced negatively on reproduction and survival of C. dubia when this organism was exposed to sublethal concentrations of metals in solution. Food exposed to metals, when it was supplied at high and middle density, also affected survival and reproduction of the test organisms. Although the water to be considered a important route of exposure of metals for aquatic organisms, the food should be considered an additional source of toxicity.

Pseudomonas aeruginosa é uma gamaproteobactéria ubíqua capaz de infectar indivíduos imunocomprometidos e causar infecções hospitalares. Entre duas repetições diretas situadas na ilha de patogenicidade PAPI-1 da linhagem PA14, encontram-se dois grupos de genes transcritos em direções opostas. O primeiro, composto de pvrS, pvrR, rcsC e rcsB, codifica proteínas de sistemas de dois componentes e está relacionado com virulência, enquanto o segundo compreende cinco genes (cupD1-D5) e codifica uma fímbria do tipo chaperoneusher, com alta similaridade com o grupo cupA, envolvido na formação de biofilme em outras linhagens de P. aeruginosa. Fímbrias da mesma família são importantes na patogenicidade de outras bactérias. Com o objetivo de estudar a relação entre esses dois grupos de genes, procurou-se caracterizar sua organização por ensaios de RT-PCR, que possibilitaram observar a disposição dos genes dos sistemas de dois componentes em dois operons distintos (pvrRS e rcsCB) e, pelo menos, cupD1-cupD2 como uma unidade transcricional, com indícios apontando para a organização de cupD1-D5 em um único operon. Os inícios de transcrição e as regiões promotoras de cada operon foram caracterizados por experimentos de RACE 5 e extensão de oligonucleotídeo marcado em busca de seqüências relevantes para a ativação da expressão desses genes. Visando investigar a regulação da expressão da fímbria CupD pelos sistemas de dois componentes codificados pelos genes adjacentes, foram realizados ensaios de qRT-PCR, os quais mostraram uma menor expressão de cupD na linhagem mutante para rcsB. RcsB apresenta um domínio de ligação a DNA e, apesar da falta de sucesso em ensaios de ligação dessa proteína à região promotora de cupD, os dados obtidos por qRT-PCR 1 indicam fortemente que essa proteína funciona como um ativador de transcrição dos genes da fímbria. Corroborando esses achados, somente quando se utilizou RNA extraído de P. aeruginosa PA14 superexpressando RcsB foi possível visualizar no gel a banda referente ao início de transcrição de cupD1-D2 no ensaio de extensão de oligonucleotídeo. Ao contrário do efeito positivo de RcsB observado na transcrição de cupD1, cupD2 e cupD5, a histidina quinase RcsC atua negativamente na expressão dos genes da fímbria, sugerindo que, nesse caso, sua atividade predominante sobre RcsB seja a de fosfatase. PvrS e PvrR parecem atuar de forma indireta e positiva sobre cupD. Como um segundo objetivo do trabalho, ensaios de virulência de P. aeruginosa no hospedeiro-modelo Dictyostelium discoideum foram otimizados, com o estabelecimento de uma técnica para se testar alguns genes estudados no laboratório que podem ser relevantes para a virulência dessa bactéria. Resultados desses ensaios confirmaram a atenuação de mutantes para uma suposta metiltransferase, já observada em modelos de planta, camundongo e drosófila. Em conjunto, os resultados desse trabalho tornam-se informações valiosas para serem usadas na pesquisa de controle de infecções por P. aeruginosa, que depende de fímbrias para colonizar com sucesso superfícies abióticas que servem de veículo de disseminação desse agente infeccioso e para que as bactérias possam persistir no organismo do hospedeiro. / Pseudomonas aeruginosa is a ubiquitous gammaproteobacteria able to infect immunocompromised individuals and to cause nosocomial infections. Between two direct repeats in the PAPI-1 pathogenicity island present in strain PA14, there are two gene clusters transcribed in opposite directions. The first, composed of pvrS, pvrR, rcsC and rcsB, encodes two-component systems proteins and is implicated in virulence, whereas the second comprises five genes (cupD1-D5) encoding a chaperone-usher fimbria with high similarity to cupA, a gene cluster involved in biofilm formation in other strains of P. aeruginosa. Fimbriae belonging to the same family of Cup are related to pathogenicity of other bacteria. In order to study the relationship between these two clusters, the organization of the genes in operons was characterized using RT-PCR, which results lead to the conclusion that the twocomponent systems genes are arranged into two different operons (pvrSR and rcsCB) and that cupD1-D2 share the same promoter, with some evidences that the operons extends from cupD1 to cupD5. The transcription start sites and the promoter regions of each operon were characterized with RACE 5 and primer extension assays to look for sequences that could be relevant to the activation of expression of these genes. Quantitative RT-PCR assays were carried out to investigate whether the expression of CupD fimbriae is regulated by the twocomponent systems encoded by the adjacent genes and the results showed a lower expression of cupD in the rcsB mutant strain than in the wild-type. RcsB bears a DNA-binding domain and, although our assays of DNA-protein interactions have failed, data obtained by qRT-PCR 1 strongly indicate that this protein functions as a transcription activator of fimbrial genes. These findings were corroborated by the primer extension assay, in which the band corresponding to the transcriptional start of cupD1-D2 was visible only when the reaction was performed with the RNA extracted of P. aeruginosa overexpressing RcsB. Unlike the effect observed for RcsB in cupD1, cupD2 and cupD5 transcription, the histidine quinase RcsC acts negatively in the fimbrial genes expression, suggesting that it might function predominantly as a RcsB phosphatase. PvrS and PvrR seem to regulate cupD positively and indirectly. As a second aim of this work, virulence assays of P. aeruginosa in the model host Dictyostelium discoideum were optimized, and a technique for testing genes studied in the laboratory that could be important for Pseudomonas virulence was established. These assays confirmed the attenuation-in-virulence of strains mutant in a putative methyltransferase gene, as observed before in plant, mouse and drosophila models. The results obtained in this work may contribute to P. aeruginosa infection control research, since this bacterium depends on fimbriae to successfully colonize abiotic surfaces that act as a dissemination vehicle, and to allow the bacteria to persist into the host organism.

La littérature fait suspecter mais n’indique pas clairement un lien entre la contamination du réseau d’eau et les infections nosocomiales à Pseudomonas aeruginosa. Les recommandations de prélèvements d’eau sont différentes selon les pays. Notre travail s’appuie sur les données des résultats des prélèvements d’eau et des prélèvements positifs à P. aeruginosa chez les patients (colonisation ou infections nosocomiales), réalisés au CHU de Dijon entre 2005 et 2013. Les contaminations des points d’eau étaient fréquentes (17%, IC95% 15,5-18,2). Des modèles mixtes n’ont pas montré de diminution d’incidence des cas de P. aeruginosa dans le nouveau bâtiment, moins souvent contaminé, pour les unités qui ont déménagé d’un bâtiment à un autre. La méthode de Kulldorff a permis de détecter peu d’agrégats temporels de cas. Des modèles GEE (Generalized Estimated Equations) ont montré une association positive entre la proportion de prélèvements d’eau positifs dans le trimestre dans le bâtiment et l’incidence des cas nosocomiaux. Cette association était retrouvée dans les analyses en sous-groupe des données de réanimation mais ne l’était plus lorsque les unités de réanimation et d’hématologie étaient exclues.Peu d’arguments en faveur d’un rôle du réseau d’eau dans la survenue de cas de P. aeruginosa sont apportés, en dehors des services de réanimation ou d’hématologie. En raison du coût associé aux prélèvements et aux mesures correctrices, il pourrait être proposé de limiter les prélèvements à ces unités à risque. Des études prospectives génotypiques devraient être conduites afin de mieux explorer l’association entre qualité microbiologique de l’eau à l’hôpital et infections nosocomiales. / Scientific literature allows suspecting but does not clearly indicate a link between water network contamination and Pseudomonas aeruginosa healthcare-associated infections. Guidelines for water samples vary across countries.Our work is based on water samples and P. aeruginosa patients’ samples (healthcare-associated colonizations or infections) in Dijon University hospital between 2005 and 2013.Water outlets contaminations were frequent (17%, CI95% 15.5-18.2). Mixed models on units that moved from a building to another did not show a lower incidence of P. aeruginosa cases in the new building than in the others, although it was less contaminated. Kulldorff’s method allowed detecting few temporal clusters of cases. GEE (Generalized Estimated Equations) models showed a positive association between the proportions of positive water samples in the building in the quarter and the incidence of healthcare-associated cases. This association was still observed in subgroup analyses of intensive care units but was no more observed in the database excluding hematology and intensive care units. Few arguments for an association between water network contamination and P. aeruginosa healthcare-associated colonizations or infections are provided, except in hematology and intensive care units. Given the costs associated with the samples and correctives measures, it could be proposed to limit the samples to these units at risk. Prospective studies with molecular typing methods should be conducted in order to better understand the association between hospital water network microbiologic quality and healthcare-associated infections.

No description available.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Univ., 2007. / Härtill 4 uppsatser.

La bactérie à Gram-négatif Pseudomonas aeruginosa est un pathogène humain opportuniste qui peut causer des infections chroniques pouvant conduire à la mort des patients, et plus particulièrement ceux atteints de la mucoviscidose. Il a été montré qu‘un de ses trois systèmes de sécrétion de type VI (SST6) est actif durant les infections chroniques, le SST6-H1. P. aeruginosa est capable d'injecter des toxines de type bactériolytique directement dans le périplasme des autres bactéries à Gram-négatif grâce au SST6-H1, ce qui laisse penser que cette nanomachine pourrait être capitale dans la compétitivité de P. aeruginosa dans les niches polymicrobiennes, comme par exemple un poumon infecté. Cette nanomachine insérée dans l'enveloppe bactérienne est régulée au niveau post-traductionnel par une voie de phosphorylation ressemblant à celles des eucaryotes. Cette voie est constituée par une kinase, PpkA, et une phosphatase, PppA, qui modulent ensemble le niveau de phosphorylation de la protéine Fha1. Nous avons démontré que quatre protéines spécifiques de Pseudomonas appelées TagT, TagS, TagR et TagQ, agissent en amont du couple PpkA/PppA, et sont indispensables pour l'activation du SST6-H1. De plus, elles sont aussi nécessaires lors de compétitions entre P. aeruginosa et d'autres bactéries. Nous avons montré que TagR, connue comme étant une protéine périplasmique, est en fait associée à la membrane externe et cette localisation dépend de TagQ, une lipoprotéine ancrée dans le feuillet interne de la membrane externe. TagT et TagS forment un transporteur de type ABC qui a une activité d'ATPase. L'association de TagR à la membrane externe a été mise en évidence par des études de protéomique à haut débit qui avaient pour but la caractérisation des membranes externe et interne de P. aeruginosa. Grâce à l'analyse des résultats, unmodèle de l'assemblage du SST6-H1 au sein de l'enveloppe a pu être proposé. Ce travail a permis l'identification de plus de 1700 protéines, parmi elles un complexe multi-protéique incluant MagD, une protéine homologue à la macroglobuline humaine. Les résultats obtenus lors de la caractérisation de ce complexe sont aussi présentés dans ce manuscrit. / Pseudomonas aeruginosa is a human opportunistic pathogen that can cause severe infections and death in chronically infected cystic fibrosis (CF) patients. It has been shown that one of its three Type VI Secretion Systems (T6SS), the H1-T6SS, is active during chronic infections in CF patients. P. aeruginosa injects bacteriolytic toxins directly into other Gram-negative bacteria by means of its H1-T6SS, which could be of high importance in its outcome in complex niches such as an infected lung. This trans-envelope nanomachine is posttranslationally regulated by a eukaryotic-like phosphorylation pathway, which includes a kinase-phosphatase pair, PpkA and PppA, respectively. In this work, TagT, TagS, TagR and TagQ, Pseudomonas specific T6SS proteins that are encoded in the same operon as Ppka, PppA and Fha1, were analysed functionally and biochemically. We found that these four proteins are indispensable for the activation of H1-T6SS, by acting upstream of the phosphorylation checkpoint. Moreover, they were also needed for intra- and inter-species fitness mediated by H1-T6SS. We discovered that TagR, a periplasmic protein, associates with the outer membrane (OM) of P. aeruginosa in a TagQ-dependent manner. TagQ is an OM lipoprotein that faces the periplasm. TagT and TagS form a membrane-bound complex, an ABC transporter, with ATPase activity. TagR association with the OM was discovered by shotgun mass spectrometry analyses of the OM and the inner membrane (IM) of P. aeruginosa. In this work, the IM and OM sub-proteomes of P. aeruginosa are also presented, with highlights on T6SS global assembly. Moreover, these two sub-proteomes allowed the identification of a novel envelope-associated complex with macroglobulin-like protein, MagD. The studies concerning this protein and its partners in P. aeruginosa are also presented in this manuscript.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-05-04. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:26Z : No. of bitstreams: 1 Publico-304.pdf: 908273 bytes, checksum: fde22ebc553f8fa63d900f7873b29d41 (MD5) / Introdução: Acinetobacter spp. e Pseudomonas aeruginosa constituem importantes patógenos causadores de infecções relacionadas à assistência à saúde em hospitais brasileiros e tem se tornado, cada vez mais, resistentes a praticamente todos os antimicrobianos disponíveis. Dessa forma, a indicação clínica do uso parenteral das polimixinas tem sido restabelecida nos últimos anos. Consequentemente, os laboratórios de microbiologia devem estar aptos a realizar testes de sensibilidade que forneçam resultados confiáveis. Objetivo: Avaliar a influência dos métodos de sensibilidade aos antimicrobianos no uso clínico das polimixinas. Material e métodos: Foram testadas nove amostras de P. aeruginosa e 10 de Acinetobacter spp., quanto à sensibilidade à polimixina B e colistina. Foram comparados os resultados obtidos por diluição em ágar, microdiluição em caldo e Etest, realizados conforme recomendações do CLSI. Para cada metodologia foi avaliada a influência do meio de cultura, concentração de cálcio, concentração do inóculo e tempo de incubação, na determinação da CIM. Resultados: Houve uma boa correlação entre as distintas técnicas de sensibilidade às polimixinas para Acinetobacter spp., diferente de P. aeruginosa. Foi observado 100% de concordância entre os resultados obtidos com meio Iso-Sensitest e o meio Mueller-Hinton, por diluição em agar e Etest, para Acinetobacter spp. Já pela metodologia de microdiluição em caldo, essa correlação foi menor: 90% e 60% para polimixina B e colistina, respectivamente. Para P. aeruginosa, a metodologia de Etest foi a que mais sofreu variação nas CIMs, quando utilizados diferentes meios de cultura para realização dos testes de sensibilidade. Em geral, com o meio BHI foram obtidas CIMs mais baixas do que com o meio Müeller-Hinton. O aumento da concentração de cálcio no meio de cultura promoveu a elevação em ±1Log2 nas CIMs de ambas espécies, sendo a metodologia de Etest a que mais sofreu influência dessa variável, sendo que, 55,6% e 88,9% de erros leve foram observados para polimixina B e colistina, respectivamente. Além disso, 11,1% de erro grave foi observado em testes com polimixina B. A metodologia de diluição em ágar sofreu maior influencia do tamanho do inóculo do que microdiluição em caldo, apresentando taxas de erro leve de erros leve de 10% (polimixina B) e 30% (colistina), para Acinetobacter spp.; e 33,3% (polimixina B) e 66,6% (colistina), para P. aeruginosa. Quando realizada leitura com diferentes tempos de incubação, só foi observada diferenças nas CIMs entre os isolados de P. aeruginosa, sendo a metodologia de Etest a que sofreu maior influência dessa variável, onde foram observadas taxas de erro leve de 33,3% (polimixina B) e 44,4% (colistina). Pela metodologia de diluição em ágar ocorreu 11,1% de erro leve. A metodologia de microdiluição em caldo não sofreu influência dessa variável. / Introduction: Acinetobacter spp. e Pseudomonas aeruginosa are important pathogens that cause infections in Brazilian hospitals and have become resistant to almost every available antimicrobial. Thereby, the clinical indication of parenteral use of polymyxin has been reestablished in recent years. Therefore, the clinical laboratory of microbiology need be able to perform reliable susceptibility antimicrobial tests. Objective: Analyze the influence of susceptibility antimicrobial tests in the clinical use of polymyxins. Material and Methods: Nine P. aeruginosa and 10 Acinetobacter spp. strains were tested to polymyxin susceptibility. The results of agar dilution, broth microdilution and Etest were compared, according CSLI. The influence of culture medium, calcium concentration, inoculum concentration and incubation time in the susceptibility antimicrobial test was evaluated. Results: There was good agreement between different polymyxin antimicrobial susceptibility methods for Acinetobacter spp isolates, but not for P. aeruginosa. It was observed 100% of agreement between Iso-sensitest and Müeller-Hinton medium through agar dilution and Etest for Acinetobacter spp. isolates. Through broth microdilution occurred 90% of agreement for polymyxin B and 60% for colistin. Between P. aeruginosa isolates, Etest had greater MIC variation when using different culture mediuns. In general, BHI medium had low MICs comparing with Müller- Hinton. The calcium concentration increase in the culture medium promoted MICs elevation in ±1Log2 of dilution, for both microrganisms. Etest had 55,6% (polymyxin B) and 88,9% (colistin) of minor error, and 11,1% of major error in polymyxin B. Inoculum size had greater influence in agar dilution, with minor error rates of 10% (polymyxin B) and 30% (colistin) for Acinetobacter spp. isolates, and 33,3% (polymyxin B) and 66,6% (colistin) for P. aeruginosa isolates. Different time incubations caused MICs variation only between P. aeruginosa isolates. Etest method had 33,3% (polymyxin B) and 44,4%(colistin) of minor error. Through agar dilution, the minor error rate was 11,1% with incubation time variation. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Biofilmes são comunidades bacterianas complexas encapsuladas em matrizes poliméricas autoproduzidas e podem se desenvolver em superfícies inertes ou tecidos vivos. A formação do biofilme é um importante fator de virulência, pois permite à bactéria resistir às respostas do hospedeiro e à terapia antimicrobiana. Devido a essa elevada resistência aos antimicrobianos, é difícil estabelecer uma estratégia eficaz para o tratamento de infecções com formação de biofilmes, levando a falhas na erradicação das mesmas. Nesse contexto, o objetivo do presente estudo é desenvolver um modelo farmacocinético/farmacodinâmico (PK/PD) para descrever o efeito do ciprofloxacino (CIP) na presença de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), visto que a modelagem PK/PD de antimicrobianos é uma ferramenta útil na escolha de regimes posológicos que atinjam o efeito bactericida máximo, minimizando o desenvolvimento de resistência. Para atingir esse objetivo, inicialmente um método analítico por CLAE/fluorescência foi desenvolvido para quantificar o CIP em amostras de plasma e microdialisado. O método desenvolvido foi simples, rápido e com sensibilidade adequada para corretamente caracterizar a farmacocinética plasmática e pulmonar do CIP. Posteriormente, um modelo animal de infecção pulmonar crônica foi adaptado da literatura e padronizado, permitindo a investigação da distribuição pulmonar do CIP em ratos Wistar sadios e infectados. Para tal, bactérias foram imobilizadas em beads de alginato a fim de manter a infecção por até 14 dias com cargas bacterianas superiores à 108 UFC/pulmão. Estudo de microdiálise foi então conduzido para avaliar as concentrações livres de CIP após administração intravenosa de 20 mg/kg. A análise não-compartimental (NCA) e a modelagem farmacocinética populacional (PopPK) dos dados foram realizadas nos softwares Phoenix® e NONMEM®, respectivamente. Diferenças significativas foram observadas no clearance plasmático (1,59 ± 0,41 L/h/kg e 0,89 ± 0,44 L/h/kg) e na constante de eliminação (0,23 ± 0,04 h-1 e 0,14 ± 0,08 h-1) para ratos sadios e infectados, resultando em uma exposição plasmática maior nos animais infectados (ASC0-∞ = 27,3 ± 12,1 μg·h/mL) quando comparados com os animais sadios (ASC0-∞ = 13,3 ± 3,5 μg·h/mL) ( = 0,05). Apesar da maior exposição plasmática, quando comparados com os animais saudáveis (fT = 1,69), animais infectados apresentaram uma penetração pulmonar quatro vezes menor (fT = 0,44). Diferenças na constante de eliminação pulmonar não foram observadas. Dados plasmáticos e pulmonares foram simultaneamente descritos por modelo PopPK constituído de compartimentos venoso e arterial, dois compartimentos representativos de duas regiões pulmonares distintas e dois compartimentos periféricos, representando outros tecidos que não os pulmões. Um clearance pulmonar foi adicionado ao modelo apenas para os dados de microdiálise dos animais infectados (CLlung = 0,643 L/h/kg) afim de explicar a exposição tecidual diminuída. O modelo desenvolvido descreveu, com sucesso, os dados plasmáticos e teciduais de animais sadios e infectados, permitindo a correta caracterização das alterações observadas na disposição plasmática e pulmonar do CIP decorrentes da infecção com biofilme. Para os estudos de farmacodinâmica, o efeito bactericida do CIP frente a biofilmes e células planctônicas de P. aeruginosa foi simultaneamente avaliado através do uso de curvas de morte bacteriana. Para a construção destas curvas, biofilmes de P. aeruginosa foram formados na superfície de blocos de acrílico e sua formação foi confirmada pelo ensaio cristal violeta e por microscopia eletrônica de varredura. Os blocos foram expostos a concentrações constantes de CIP (de 0,0625 a 10 μg/mL) e, em tempos pré-determinados, células planctônicas e de biofilmes eram amostradas para quantificação. Um modelo semi-mecanístico que incorpora um modelo Emax sigmoidal foi utilizado para descrever o efeito do CIP frente a ambos estilos de vida bacteriano. Uma subpopulação pré-existente com menor suscetibilidade ao CIP foi incluída no modelo e o efeito do CIP nesta subpopulação também foi descrito pelo modelo Emax sigmoidal. A comparação dos parâmetros estimados pelo modelo demonstrou que o efeito in vitro do CIP é maior para as células planctônicas (EC50 = 0,259 mg/L e 0,123 mg/L e Emax = 2,25 h-1 e 5,59 h-1 para biofilmes e planctônicas, respectivamente). A potência estimada do CIP para a subpopulação resistente foi muito menor para ambos estilos de vida bacteriano (EC50 = 2,71 mg/L e 1,15 mg/L para biofilmes e planctônicas, respectivamente). Os modelos desenvolvidos podem ser utilizados para a simulação de cenários não testados e servir como uma ferramenta para guiar a escolha dos regimes posológicos adequados, contribuindo para o sucesso terapêutico no tratamento de infecções associadas à biofilmes. / Biofilms are complex bacterial communities enclosed in self-produced polymeric matrices that can develop in inert surfaces or living tissues. Biofilm formation is an important virulence factor that allows bacteria to resist host responses and antibacterial agents. Due to this high resistance to antibiotics, it is difficult to establish an efficacious strategy for treatment of infections with biofilm formation leading to failure in infection eradication. In this context, the goal of this study was to develop a pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) model to describe the antimicrobial effect of ciprofloxacin (CIP) in the presence of biofilms of Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), since PK/PD modeling for antibacterial agents can be a useful tool to choose dosing regimens and to achieve the maximum bactericidal effect, minimizing the development of resistance. To reach this goal, firstly an analytical method based on HPLC/fluorescence was developed in order to quantify CIP in plasma and lung microdialysate. The developed method was simple, fast and with enough sensibility to proper characterize CIP plasma and lung pharmacokinetics. Secondly, an animal model of chronic lung infection was adapted from literature and standardized, allowing the analysis of CIP lung distribution in infected and healthy Wistar rats. Bacteria were immobilized in alginate beads prior to inoculation to Wistar rats in order to sustain the pneumonia for 14 days, maintaining a bacterial load superior to 108 CFU/lung. A microdialysis study was then conducted to evaluate free CIP concentrations after an intravenous administration of 20 mg/kg. Non-compartimental analysis (NCA) and populational PK modeling (PopPK) of the data were performed in Phoenix® and NONMEM®, respectively. Statistical differences were observed in the plasma clearance (1.59 ± 0.41 L/h/kg and 0.89 ± 0.44 L/h/kg) and elimination rate constant (0.23 ± 0.04 h-1and 0.14 ± 0.08 h-1) for healthy and infected rats, respectively, resulting in a significantly higher CIP plasma exposure in infected rats (AUC0-∞ = 27.3 ± 12.1 μg·h/mL) compare to healthy animals (AUC0-∞ = 13.3 ± 3.5 μg·h/mL) ( = 0.05). Besides the plasma exposure, a four times lower pulmonary penetration was observed in infected rat’s lungs (fT = 0.44) in comparison to healthy animals (fT = 1.69), with no significant differences in the lung elimination rate constant. Plasma and lung data were simultaneously fitted using a PopPK model consisting of an arterial and a venous compartment, two compartments representing different regions of the lungs and two peripheral distribution compartments, representing tissues other than lungs. A lung clearance was added to the model for infected animals (CLlung = 0.643 L/h/kg) to explain the lower tissue exposure. The model successfully described the plasma and microdialysis data from both, healthy and infected rats and allowed to correctly describe the changes in CIP plasma and lung disposition in biofilm infections. For the pharmacodynamic studies, CIP bactericidal effect against Pseudomonas aeruginosa biofilms and planktonic shedding cells were simultaneously evaluated using the time-kill curves approach. For the time-kill curves construction, P. aeruginosa biofilms were formed in acrylic blocks, which was confirmed by the crystal violet assay and scanning electron microscopy. The blocks were placed in flasks containing Mueller-Hinton growth medium and exposed to constant CIP concentrations (ranging from 0.0625 to 10 μg/mL). At pre-determined time points, biofilm and planktonic cells were sampled for bacterial counting. A mechanism-based model which incorporates a sigmoidal Emax model was used to describe the CIP effect against P.aeruginosa in both llifestyles, biofilm and planktonic. The presence of a pre-existing resistant subpopulation was included in the model and also modeled with a sigmoidal Emax model to describe CIP effect in this subpopulation. Comparison of the parameter estimates showed that the in vitro effect of CIP is higher for planktonic cells (EC50 = 0.259 mg/L and 0.123 mg/L and Emax = 2.25 h-1 and 5.59 h-1 for biofilm and planktonic cells, respectively). CIP potency was much lower for the resistant subpopulation, for both bacteria lifestyles (EC50 = 2.71 mg/L and 1.15 mg/L for biofilm and planktonic, respectively). The developed models can be used to simulate untested scenarios and serve as a tool to guide dosing regimen selection, contributing for the therapeutic success of treatments of biofilm-associated infections.