Se purificó la enzima L-aminoácido oxidasa (LAO) del veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox “Jergón” y se determinaron sus propiedades cinéticas. La LAO fue purificada mediante dos pasos cromatográficos, una columna de filtración molecular empleando Sephadex G-75 y otra de intercambio catiónico con CM-Sephadex C-50. La enzima tuvo un peso molecular de 54.6 kDa calculado por PAGE-SDS. Entre los sustratos ensayados a pH 8.5, la LAO presentó mayor actividad específica sobre L-fenilalanina, y luego sobre L-leucina, L-metionina y L-arginina, estando su actividad máxima en un rango de pH de 6.9 a 9.6. Para cada sustrato se determinaron los valores de pH óptimo obteniéndose 8.1 con L-metionina, 8.9 con L-arginina, y 8.2 con L-fenilalanina. Para estos aminoácidos, se determinaron los parámetros cinéticos de Km, Vmax, Kcat y Kcat/Km a pH 7.5 y 8.5. De acuerdo a la eficiencia catalítica, la L-leucina fue el mejor sustrato a pH 8.5 (Kcat/km igual a 71.213 x 104 s-1 M-1) y a 7.5 (Kcat/km igual a 40.903 x 104 s-1 M-1). Asimismo se evaluó la inhibición enzimática a pH 8.5 utilizando ácido antranílico, ácido benzoico, ácido salicílico y ácido sulfanílico, determinándose el modelo de inhibición y los valores de Ki. Se encontró que el ácido antranílico tuvo el menor valor de Ki (0.0082 mM), ajustándose al modelo de inhibición no competitiva, el ácido benzoico fue considerado un inhibidor competitivo y los ácidos salicílico y sulfanílico fueron inhibidores de tipo mixto. / An L-amino acid oxidase from Bothrops atrox venom was purified and its kinetic properties determinated. Purification procedure was carried out through two chromatography steps: a size exclusion chromatography on Sephadex G-75, followed by an ion exchange chromatography on CM-Sephadex C-50. This enzyme had a molecular weight of 54.6 kDa calculated by SDS-PAGE. Between substrates assayed to pH 8.5, LAO had higher specific activity on L-phenilalanine followed by L-leucine, L-metionine and L-arginine. These were in a range of pH 6.9 to 9.6 being optimum values of 8.1 for L-metionine, 8.9 for L-arginine, and 8.2 for L-fenilalanine. Kinetics parameters (Km, Vmax, Kcat and Kcat/Km) for these L-amino acids were determinated at pH 7.5 and 8.5. According to catalytic efficiency, we found that L-leucine was the best substrate at pH 7.5 (Kcat/km same to 40.903 x 104 s-1 M-1) and 8.5 (Kcat/km same to 71.213 x 104 s-1 M-1). By the way, we evaluated enzyme inhibition at pH 8.5 using anthranilic, benzoic, salicylic and sulphanylic acid, determinating the best model of enzyme inhibition as well as Ki values. The minimal Ki value was for anthranilic acid Ki (0.0082 mM), fitting it to a non-competitive model. Benzoic acid was considered a competitive inhibitor, while salicylic and sulphanylic acid showed mixed-type inhibition. / Tesis

Se purificó la enzima L-aminoácido oxidasa (LAO) del veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox “Jergón” y se determinaron sus propiedades cinéticas. La LAO fue purificada mediante dos pasos cromatográficos, una columna de filtración molecular empleando Sephadex G-75 y otra de intercambio catiónico con CM-Sephadex C-50. La enzima tuvo un peso molecular de 54.6 kDa calculado por PAGE-SDS. Entre los sustratos ensayados a pH 8.5, la LAO presentó mayor actividad específica sobre L-fenilalanina, y luego sobre L-leucina, L-metionina y L-arginina, estando su actividad máxima en un rango de pH de 6.9 a 9.6. Para cada sustrato se determinaron los valores de pH óptimo obteniéndose 8.1 con L-metionina, 8.9 con L-arginina, y 8.2 con L-fenilalanina. Para estos aminoácidos, se determinaron los parámetros cinéticos de Km, Vmax, Kcat y Kcat/Km a pH 7.5 y 8.5. De acuerdo a la eficiencia catalítica, la L-leucina fue el mejor sustrato a pH 8.5 (Kcat/km igual a 71.213 x 104 s-1 M-1) y a 7.5 (Kcat/km igual a 40.903 x 104 s-1 M-1). Asimismo se evaluó la inhibición enzimática a pH 8.5 utilizando ácido antranílico, ácido benzoico, ácido salicílico y ácido sulfanílico, determinándose el modelo de inhibición y los valores de Ki. Se encontró que el ácido antranílico tuvo el menor valor de Ki (0.0082 mM), ajustándose al modelo de inhibición no competitiva, el ácido benzoico fue considerado un inhibidor competitivo y los ácidos salicílico y sulfanílico fueron inhibidores de tipo mixto. / An L-amino acid oxidase from Bothrops atrox venom was purified and its kinetic properties determinated. Purification procedure was carried out through two chromatography steps: a size exclusion chromatography on Sephadex G-75, followed by an ion exchange chromatography on CM-Sephadex C-50. This enzyme had a molecular weight of 54.6 kDa calculated by SDS-PAGE. Between substrates assayed to pH 8.5, LAO had higher specific activity on L-phenilalanine followed by L-leucine, L-metionine and L-arginine. These were in a range of pH 6.9 to 9.6 being optimum values of 8.1 for L-metionine, 8.9 for L-arginine, and 8.2 for L-fenilalanine. Kinetics parameters (Km, Vmax, Kcat and Kcat/Km) for these L-amino acids were determinated at pH 7.5 and 8.5. According to catalytic efficiency, we found that L-leucine was the best substrate at pH 7.5 (Kcat/km same to 40.903 x 104 s-1 M-1) and 8.5 (Kcat/km same to 71.213 x 104 s-1 M-1). By the way, we evaluated enzyme inhibition at pH 8.5 using anthranilic, benzoic, salicylic and sulphanylic acid, determinating the best model of enzyme inhibition as well as Ki values. The minimal Ki value was for anthranilic acid Ki (0.0082 mM), fitting it to a non-competitive model. Benzoic acid was considered a competitive inhibitor, while salicylic and sulphanylic acid showed mixed-type inhibition.

En esta Tesis estudiamos soluciones diluidas de aminoácidos desde un punto de vista teórico y con simulación mediante Dinámica Molecular utilizando el paquete de programas GROMOS96. La estructura del trabajo es la siguiente. En el primer capítulo hacemos una breve presentación de nuestros objetos principales de estudio, los aminoácidos y el agua. Repasamos el papel de los aminoácidos en relación a las proteínas y discutimos brevemente algunos aspectos del efecto hidrofóbico, referidos tanto a la hidratación hidrofóbica como a la interacción hidrofóbica. En el capítulo 2 consideramos las principales herramientas que usaremos a lo largo de la Tesis: Dinámica Molecular mediante GROMOS96 y ecuaciones integrales para las correlaciones residuo–agua y residuo–residuo. En el capítulo siguiente utilizamos estas herramientas para estudiar la hidratación hidrofóbica que experimenta un aminoácido apolar en un medio acuoso. Obtenemos las correlaciones entre los átomos del residuo y el agua a partir de las simulaciones y de la solución de las ecuaciones integrales correspondientes. Además establecemos una nueva escala de hidrofobicidad mediante simulación con Dinámica Molecular, calculando la variación de energía libre que se obtiene al transferir un residuo de aminoácido apolar desde un solvente orgánico a agua. El capítulo 4 está dedicado al estudio de la interacción hidrofóbica. El sistema ahora está formado por dos residuos apolares disueltos en agua. En esencia, usamos una teoría mecánico–estadística para calcular las funciones de distribución residuo–residuo y a partir de ellas los potenciales de fuerza media. En el capítulo 5 extendemos la teoría desarrollada en los dos capítulos anteriores para incluir a los residuos de aminoácidos polares y cargados. Luego, comparamos los valores al contacto de nuestros potenciales de fuerza media con los obtenidos por otros métodos que usualmente son utilizados en cálculos de reconocimiento de estructuras u otras aplicaciones. Finalizamos este trabajo discutiendo los resultados obtenidos en relación a su potenciales aplicaciones y las futuras líneas de investigación que procuraremos desarrollar a partir de aquí.

Submitted by VINICIUS DUARTE DE OLIVEIRA null (vinicius.d.oliveira@ufv.br) on 2018-04-02T11:53:08Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Vinicius_Duarte_de_Oliveira.pdf: 1500978 bytes, checksum: d345611e89d00cf9a7f4424e7e8e15ec (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-04-02T12:34:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 oliveira_vd_me_jabo.pdf: 1500978 bytes, checksum: d345611e89d00cf9a7f4424e7e8e15ec (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-02T12:34:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 oliveira_vd_me_jabo.pdf: 1500978 bytes, checksum: d345611e89d00cf9a7f4424e7e8e15ec (MD5) Previous issue date: 2018-03-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A Determinação das ingestões ótimas de isoleucina (Ile), valina (val), triptofano (Trp) das galinhas poedeiras comercias pode permitir novas reduções no fornecimento da proteína bruta dietética. Para cumprir este objetivo as ingestões ótimas biológicas e econômicas de Ile, Val e Trp para poedeiras comercias foram avaliadas em três ensaios, sendo utilizadas 70 aves da linhagem Hisex White com 29 semanas de idade para cada ensaio. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com seis tratamentos e dez repetições de uma ave cada. As dietas experimentais foram formuladas pela técnica da diluição, obtendo-se assim níveis crescentes de Ile (2,80; 3,64; 5,11; 6,34; 6,95; 7,80 g/kg), Val (3,56; 4,58; 6,35; 7,83; 8,58; 9,60 g/kg) e Trp (0,81; 1,06; 1,50; 1,86; 2,05; 2,30 g/kg). Além disso, uma sétima dieta foi formulada em cada ensaio para verificar a limitância do aminoácido teste. Cada ensaio teve a duração de 10 semanas, sendo as seis primeiras de adaptação e as quatro últimas de coleta de dados. As variáveis de ingestão de aminoácidos, massa de ovo e conversão alimentar foram submetidas as análises de variância e regressão com nível de significância de α=5. Em seguida foram ajustados dois modelos matemáticos: linear platô (LP) e polinomial quadrático (PQ). Também foi estimada a ingestão ótima obtida pela 1º intersecção da PQ com o platô do LP. Para obtenção dos coeficientes para o “Reading Model”, os dados foram analisados pelo programa EFG (2006). Os níveis de Ile, Val e Trp influenciaram significativamente todas a variáveis estudadas (p <0,01). Os níveis ótimos de Ile, Val e Trp estimados pelo LP foram 376, 679 e 150 mg/ave/dia, respectivamente. Considerando as ingestões estimadas pelo PQ foram obtidos 633 mg/ave/dia para Ile, 931 mg/ave/dia para Val e 218 mg/ave/dia para Trp. Com base na combinação dos dois modelos (LP+PQ), as ingestões de Ile, Val e Trp foram 531, 771 e 184 mg/ave/dia, respectivamente. Os coeficientes de produção (a) estimados foram 7,23; 9,83 e 2,28 mg/g de ovo para Ile, Val e Trp, respectivamente. A eficiência de utilização foi de 82% para Ile, 75% para Val e 85% para Trp. Os coeficientes de mantença (b) para Ile, Val e Trp foram 13,20; 0,03 e 7,48 mg/kg de peso corporal. Considerando o cenário econômico atual as ingestões ótimas econômicos de Val e Trp recomendados pelo “Reading Model” foram de 852 e 195 mg/ave/dia, para poedeiras comercias de 29 a 39 semanas. / Determination of optimal intakes of isoleucine (Ile), valine (val), tryptophan (Trp) of commercial laying hens may allow further reductions in the supply of dietary crude protein. To achieve this goal, the optimal economic intakes of isoleucine (Ile), valine (Val) and tryptophan (Trp) for commercial laying hens were evaluated in three trials, using 70 hens of Hisex White strain at 29 weeks of age for each assay. The experimental design was completely randomized, with six treatments and ten replications of one bird each. The experimental diets were formulated using the dilution technique, resulting in increasing dietary levels of Ile (2.80; 3.64; 5.11; 6.34; 6.95; 7.80 g.Kg-1), Val (3.56; 4.58; 6.35; 7.83; 8.58; 9.60 g.kg-1) and Trp (0.81; 1.06; 1.50; 1.86; 2.05; 2.30 g.kg-1). In addition, a seventh diet was formulated for each trial, in order to confirm if the amino acid test was the first-limiting. After a six-weeks adaptation period, the data collection were carried out for four weeks, thus each trial lasted ten weeks. The variables of amino acid intake, egg mass and feed conversion were submitted to analysis of variance and regression with significance level of α = 5. Then, two mathematical models were fitted: linear plateau (LP) and quadratic polynomial (PQ). It was also estimated the optimal intake obtained by the 1st intersection of the PQ with the LP plateau. To obtain the coefficients for the Reading Model, the data were analyzed by the EFG program (2006). Levels of Ile, Val and Trp significantly influenced all variables studied (p <0.01). The optimal levels of Ile, Val and Trp estimated by LP were 376, 679 and 150 mg / bird / day, respectively. Considering the intakes estimated by the PQ, 633 mg / bird / day were obtained for Ile, 931 mg / bird / day for Val and 218 mg / bird / day for Trp. Based on the combination of the two models (LP + PQ), Ile, Val and Trp intakes were 531, 771 and 184 mg / bird / day, respectively. The estimated coefficients of production (a) were 7.23; 9.83 and 2.28 mg / g egg for Ile, Val and Trp, respectively. The efficiency of use was 82% for Ile, 75% for Val and 85% for Trp. The maintenance coefficients (b) for Ile, Val and Trp were 13.20; 0.03 and 7.48 mg / kg body weight. Considering the current economic scenario, the optimal economic intakes of Val and Trp recommended by the Reading Model were 852 and 195 mg / bird / day, for commercial laying hens from 29 to 39 weeks / FAPESP: 2016/14754-5

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-23T08:29:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Em Saccharomyces cerevisiae, a permease codificada pelo gene AGT1 é responsável pelo transporte ativo de uma série de a-glicosídeos usados em diversas aplicações industriais de leveduras, como panificação, cervejaria, produção de bebidas destiladas e álcool combustível. O transporte destes açúcares para dentro da célula, através de proteínas transportadoras, é o passo inicial para seu metabolismo, e também constitui um fator limitante na fermentação do açúcar. Com o intuito de compreender detalhes moleculares do mecanismo de transporte e contribuir para a otimização do processo fermentativo, no presente trabalho foi analisado os resíduos de aminoácidos da permease Agt1p que poderiam estar envolvidos na ligação do próton e/ou especificidade do substrato. Analisando a estrutura prevista para o transportador Agt1p, identificamos 4 resíduos de aminoácidos carregados em seus segmentos transmembrana (Glu-120, Asp-123, Glu-167 e Arg-504), resíduos que estão significativamente conservados nas mesmas posições em outros genes de transportadores de a-glicosídeos em Saccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces e Candida. Permeases Agt1p mutantes nos resíduos Glu-120, Asp-123 e Arg-504 foram geradas por mutagênese sítio-dirigida, expressadas em uma cepa agt1?, e a funcionalidade das permeases foi testada através do crescimento em maltotriose. A substituição do resíduo Arg-504 pela alanina aboliu completamente a utilização de maltotriose pelas células, enquanto que as permeases mutantes geradas pela substituição do Asp-123 pela glicina ou do Glu-120 pela alanina ocasionaram menores taxas de consumo de maltotriose e menor rendimento de etanol quando comparado ao transportador Agt1p normal, porém não impediram o crescimento em maltotriose. A atividade de transporte da permease Agt1p normal ou dos mutantes derivados também foi avaliada pelo transporte de pNPaG (substrato específico para o transportador Agt1p) e pelo transporte ativo de outros a-glicosídeos (maltose, maltotriose, trealose, sacarose e a-metil glicosídeo). Nesses ensaios, a mutação R504A ocasionou a maior perda na atividade de transporte da permease, tendo em vista que apresentou taxas similares às células sem a permease Agt1p. Em contrapartida, os mutantes E120A e D123G apresentaram atividades de transporte de pNPaG e de co-transporte açúcar-H+ inferiores à observada para o transportador Agt1p normal, condizendo com o perfil de utilização de maltotriose. Apesar das diferentes atividades de transporte encontradas para as permeases construídas, todas essas permeases (normal ou mutantes) quando fusionadas à GFP em sua extremidade C-terminal apresentaram-se normalmente localizadas na membrana plasmática. Portanto, os resultados demonstram o envolvimento dos resíduos mutados no transporte ativo de açúcares realizado pela permease Agt1p, sugerindo a participação dos resíduos Glu-120 e Asp-123 na translocação do próton, e de Arg-504 na ligação do substrato. Porém, estudos ainda são necessários para melhor esclarecer o mecanismo de transporte ativo realizado pela permease Agt1p, o que certamente é de grande relevância para o desenvolvimento de estratégias que permitam a otimização dos processos fermentativos industriais.

A Doença do Xarope do Bordo (DXB) é uma desordem hereditária causada pela deficiência do complexo enzimático desidrogenase dos cetoácidos de cadeia ramificada, e como conseqüência ocorre o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (AACR) leucina (Leu), isoleucina (Ile) e valina (Val), e seus respectivos cetoácidos α- cetoisocapróico (CIC), α-ceto-β-metilvalérico (CMV) e α-cetoisovalérico (CIV), que caracteriza a doença. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos graves, tais como convulsões, coma, retardo psicomotor e retardo mental. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos da doença ainda não estão esclarecidos. Em estudos anteriores, realizados em nosso laboratório, observamos que os α-cetoácidos de cadeia ramificada modificaram a fosforilação dos filamentos intermediários em córtex cerebral de ratos wistar em diferentes idades, alteraram a morfologia de células gliais e provocaram estresse oxidativo em células de glioma C6. Neste estudo, nós investigamos o efeito in vitro dos aminoácidos de cadeia ramificada, nas concentrações encontradas nos pacientes afetados por DXB, sobre a fosforilação dos filamentos intermediários de córtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. Fatias de córtex cerebral de ratos wistar de 9, 12,17 e 21 dias foram incubadas com os aminoácidos Leu, Ile e Val na presença de 32P-ortofosfato, a fração citoesquelética foi extraída e a radioatividade incorporada pelas subunidades dos filamentos intermediários foi medida. Os resultados obtidos não demonstraram alterações significativas no parâmetro estudado. Também foram realizados estudos morfológicos em cultura de células C6 através de microscopia de contraste de fase e técnicas de imunocitoquímica. As células foram incubadas por 3, 12 ou 24 horas na presença ou na ausência dos AACR. Os resultados demonstraram que os AACR alteraram a morfologia das células de redondas para fusiformes com a presença de vários processos de um modo dependente do tempo e do tipo de AACR. A imunocitoquímica com anticorpos anti-actina e anti-proteína glial fibrilar ácida (GFAP) demonstrou que estes metabólitos induziram uma reorganização do citoesqueleto. Além disso, observamos morte celular intensa na presença dos AACR. Por outro lado, verificamos que não houve alteração de fosforilação da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) nas células C6, mas observamos que houve diminuição da glutationa e aumento da produção de óxido nítrico quando as células C6 foram incubadas por 3h com os AACR. Quando as células C6 foram tratadas com glutationa ou L-NAME e com os AACR estes antioxidantes foram capazes de prevenir as alterações metabólicas causadas por estes metabólitos, sugerindo o envolvimento do estresse oxidativo nas alterações causadas pelos AACR. Considerando que as células astrogliais são de fundamental importância para o desenvolvimento e o funcionamento do cérebro é provável que as alterações provocadas pelos AACR possam ter importantes conseqüências para a neurodegeneração característica dos pacientes portadores de DXB. / Maple syrup urine disease (MSUD) is a inherited disorder caused by a deficiency of the enzyme complex branched-chain α-keto acid dehydrogenase (BCKD), and consequently occurs the accumulation of branched-chain amino acids (BCAAs) leucine (Leu), isoleucina (Ile) and valine (Val), and theirs corresponding branched-chain α-keto acids (BCKAs) α-keto-isocaproic acid (KIC), α-keto-β-methyvaleric acid (CMV) and α- keto-isovaleric (KIV), that characterize the disease. Affected patients present severe neurological symptoms such as coma, psychomotor delay and mental retardation. However, the physiopathologic mechanisms are unknown. In previous studies carried through in our laboratory we observed that the BCKAs had modified the phosphorylation of the intermediate filaments (IF) in cerebral cortex of rats wistar in different ages. We also verified that these metabolites altered the morphology of glial cells and provoked oxidative stress in C6 cells. In this study, we investigate the in vitro effect of BCAAs, in the concentrations found in the patients affected with MSUD, on the phosphorylation of the IF from cerebral cortex of rats during development. Slices from cerebral cortex of wistar rats of 9, 12, 17 and 21 days were incubated with the amino acids Leu, Ile and Val in the presence of 32P-ortophosphate, the cytoskeleton fraction was extracted and the radioactivity incorporated into the subunits of the IF was measured. The results obtained do not demonstrate significant alterations in this studied parameter. We also performed morphologic studies in C6 cells through analyses of imunocitochemistry and phase contrast microscopy. The cells had been incubated for 3, 12 or 24 hours in the presence or the absence of the BCAAs. The results demonstrate that the BCAAs alter the morphology of the cells from rounded to fusiformes with the presence of some processes in a dependent way of the time and the type of BCAAs. The imunocitochemistry with anti-actin and antiglial fibrilary acid protein (GFAP) antibodies demonstrates that these metabolites induce a reorganization of cytoskeleton. Moreover, we observe intense cellular death in the presence of the BCAAs. On the other hand, we verify that it does not involve an alteration of the phosphorylation of GFAP in C6 cells. We also observe a reduction of glutathione and a increase of nitric oxide production when the cells were incubated for 3 hours with the BCAAs. When the C6 cells were treated with glutathione or L-NAME in the presence of the BCAAs these antioxidants were capable to prevent the metabolic alterations caused by these metabolites, suggesting the involvement of oxidative stress in the alterations caused by the BCAAs. Considering that the astroglials cells are have fundamental importance on the development and functioning of the brain it is feasible that the alterations provoked by the BCAAs have important consequences for the neurodegeneration characteristic of MSUD patients.

A tuberculose (TB) é uma séria doença infecciosa causada por Mycobacterium tuberculosis, e constitui um importante problema de saúde pública em todo o mundo. Novas drogas e vacinas de segunda geração são urgentemente necessárias para o controle da TB, mas a complexa biologia de M. tuberculosis tem dificultado o desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras. A manipulação genética de M. tuberculosis também é complicada, mas, atualmente, técnicas novas e mais eficientes de troca alélica permitem o estudo detalhado de diversos genes micobacterianos. No presente trabalho, os genes da corismato mutase (CM) e fosforilase de nucleosídeos purínicos (PNP) de M. tuberculosis e Mycobacterium smegmatis foram estudados. A CM catalisa a conversão de corismato em prefenato na rota de biossíntese dos aminoácidos aromáticos fenilalanina e tirosina em bactérias, fungos e plantas. Dois genes de CMs monofuncionais (aroQ e *aroQ) foram identificados, clonados, expressos e bioquimicamente caracterizados em ambas as espécies de micobactérias. Esses genes também foram investigados usando uma metodologia de recombinação homóloga e ensaios de atividade promotora. Os resultados indicam que os genes aroQ são provavelmente essenciais ao crescimento in vitro de M. tuberculosis e M. smegmatis, enquanto uma linhagem mutante para o gene *aroQ de M. smegmatis pôde ser obtida. A PNP catalisa a interconversão e reciclagem de bases, nucleosídeos e nucleotídeos purínicos na via de salvamento das purinas. A construção de mutantes para o gene deoD (que codifica a PNP) de M. tuberculosis e M. smegmatis, usando um método eficiente de troca alélica em duas etapas, não foi possível. Assim, sugere-se que, nas condições testadas, o gene deoD seja essencial ao crescimento in vitro dessas micobactérias. A identificação de genes essenciais é de fundamental importância, pois indica tanto a relevância biológica dos mesmos como, no caso de M. tuberculosis, que seus produtos constituem alvos moleculares interessantes para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. / Tuberculosis (TB), a serious infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis, still remains a public health problem in the world. New drugs and second generation vaccines are urgently required to control TB, but the complex biology of M. tuberculosis has hindered the development of novel therapeutic tools. Genetic manipulation of M. tuberculosis is also difficult, but currently new, more efficient gene replacement techniques have allowed detailed studies of many mycobacterial genes. In the present work, the chorismate mutase (CM) and purine nucleoside phosphorylase (PNP) genes from M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis were studied. CM catalyzes the rearrangement of chorismate to prephenate in the biosynthetic pathway that forms phenylalanine and tyrosine in bacteria, fungi, and plants. Two monofunctional CM genes (aroQ and *aroQ) were identified, cloned, expressed, and biochemically characterized in both mycobacteria. Those genes were also investigated by homologous recombination methods and promoter activity assays. AroQ genes seem to be essential for the growth of M. tuberculosis and M. smegmatis, while an *aroQ mutant strain could be generated in M. smegmatis. PNP promotes the interconversion and recycling of purine bases, nucleosides, and nucleotides in the purine salvage pathway. Construction of deoD (which codes for PNP) deletion mutants of M. tuberculosis and M. smegmatis using an efficient two-step gene replacement technique was not possible. Thus, it is suggested that deoD is also essential for mycobacterial growth under the conditions tested. The identification of essential genes is of great importance, both because it indicates their biological significance, and because, with pathogens like M. tuberculosis, these may also indicate attractive molecular targets for the development of new antimycobacterial drugs.

Um possível mecanismo de dano ao tecido induzido por hiperglicemia persistente na diabetes mellitus é a formação de produtos avançados de glicação (AGEs). Endogenamente, açúcares reduzidos reagem não enzimaticamente com grupos amino de proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos através de uma série de reações que formam bases de Shiff seguida da formação de produtos de Amadori para a produção de AGEs. O glioxal e o metilglioxal são espécies reativas de carbonilas com ação de glicação, formados pela degradação de proteínas glicadas, intermediários glicolíticos e peroxidação lipídica e reagem com proteínas para formar os AGEs. No presente estudo nós avaliamos os efeitos dos glioxais in vitro sobre o metabolismo dos aminoácidos glicina, leucina e alanina, bem como sobre o metabolismo da glicose, lactato, acetato e glutamina em córtex cerebral de ratos Wistar de 10 dias de idade pós-natal e aos 3 meses de idade pós natal. Para verificar estes efeitos na incorporação à proteínas, síntese lipídica e produção de CO2 utilizamos os seguintes substratos: 0,2 mM de alanina, 0,2 mM glicina, 0,2 mM leucina, 2,0 mM glutamina, 5mM de glicose, ou 10mM de lactato ou 1mM de acetato As fatias de córtex cerebral foram incubadas com os substratos descritos a 37ºC em ambiente fechado. O CO2 captado foi determinado em contador de cintilação líquida. O homogeneizado foi lavado com TCA 10% para a extração dos lipídios com Clorofórmio:Metanol (2:1), e acrescentado o líquido de cintilação, a radioatividade incorporada foi determinada em contador de cintilação líquida. O precipitado resultante foi dissolvido em ácido fórmico para medida de incorporação a proteínas. Concluímos que os efeitos do glioxal foram superiores aos efeitos do metilglioxal sobre o metabolismo dos aminoácidos estudados; Os glioxais (glioxal e metilglioxal) não tiveram efeitos sobre os parâmetros estudados no metabolismo da glicose, lactato e acetato; Os glioxais não alteraram o metabolismo da glicina e da glutamina em córtex cerebral de ratos adultos; A utilização de antioxidantes (N-acetilcisteína e trolox) no meio de incubação não modificou os efeitos dos glioxais sobre o metabolismo dos aminoácidos; A N-acetilcisteína e a penicilamina exerceram um acentuado efeito sobre o metabolismo dos aminoácidos. O estudo não estabeleceu um mecanismo para os efeitos do glioxal. Especulamos que a quantidade do antioxidante trolox usada não foi suficiente. A N-acetilcisteína e a penicilamina tiveram um efeito próprio que impossibilitou uma conclusão. / A possible way of tissue damage induced by persistent hyperglycemia in diabetes mellitus is the production of advanced glycation end products (AGEs). Endogenously, reduced sugar, like glucose, react not enzimatically with amino groups of proteins, lipids and nucleic acids trough a plenty of reactions which form Shiff bases follow the formation of Amadori products to the next production of AGEs. The glyoxal and mthylglyoxal are reactive carbonyl species with a potential glycation action. They are formed by the degradation of glycated proteins, glycolitic intermediates and lipid peroxidation and react with protein to form AGEs. In the present study we evaluate the effects of the glyoxals in vitro on the metabolism of the amino acids glycine, leucine and alanine and on the metabolism of glucose, lactate, acetate and glutamine in cerebral cortex of Wistar mouse with 10 day old and with 3 months old. To verify this effect on the protein incorporation, lipid synthesis and production of CO2, we used the follow substrates: 2 mM of alanine, or glycine, or leucine, or glutamine, or 5mM of glucose, or 10 mM of lactate or 1mM of acetate. The slices of cerebral cortex were incubated with those substrates at 37ºC. The CO2 captured was determined in a liquid-scintillation counter. The homogenized was washed with TCA 10% for the extraction of lipids with Clorform:Methanol (2:1), and it was add scintillation liquid, the radioactivity incorporated was determined in a liquid-scintillation counter The result precipitate was dissolved in formic acid to the measure of the incorporation to protein. We could conclude that the effects of glyoxal were higher to the effects of methylglioxal on the metabolism of the amino acids studied; Glyoxal and Methylglyoxal didn't show effects on the metabolism of glucose, lactate and acetate; Glyoxals didn't change the metabolism of glycine and glutamine in cerebral cortex of adults Wistar mouse; The utilization of anti-oxidants (N-acetylcysteine and trolox) didn't change the effects of the glyoxals on the metabolism of the amino acids; N-acetylcysteine and penicillamine showed an accentuate effect on the metabolism of the amino acids. This data didn't establish a mechanism for the effects of glyoxal. We speculate that the amount of the antioxidant trolox used in the research wasn't sufficient. The N-acetilcysteine and penicilaminne showed an own effect the reason why we could not find a conclusion.

BELO, Ezequiel de Andrade. Espectroscopia vibracional em cristais de d-alanina e dl-alanina sob condições extremas. 2013. 196 f. Tese (Doutorado em Física) - Programa de Pós-Graduação em Física, Departamento de Física, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Edvander Pires (edvanderpires@gmail.com) on 2015-10-29T18:52:54Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_eabelo.pdf: 8141519 bytes, checksum: 23e619611e4ac088bc0e3dd45a7acd9d (MD5) / Approved for entry into archive by Edvander Pires(edvanderpires@gmail.com) on 2015-11-03T19:46:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_eabelo.pdf: 8141519 bytes, checksum: 23e619611e4ac088bc0e3dd45a7acd9d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-03T19:46:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_eabelo.pdf: 8141519 bytes, checksum: 23e619611e4ac088bc0e3dd45a7acd9d (MD5) Previous issue date: 2013 / Neste trabalho foi estudado o comportamento vibracional de monocristais de D-alanina (DALA) DL-alanina (DLA) sob condições de extremas de temperatura e pressão, para tal utilizamos espectroscopia infravermelho e Raman. Os espectros infravermelho para o cristal de DALA foram medidos entre 400 cm-1 a 3200 cm-1 desde a temperatura ambiente 290 K até 100 K e o resultados obtidos são similares aqueles reportados na literatura para a L-alanina (LALA) e a DLA com pequenas diferenças discutidas no texto. Os espectros Raman para o cristal de DALA foram medidos entre 30 cm-1 a 3200 cm-1 com temperatura variando de 295 K até 20 K em seis polarizações diferentes usando a geometria de retroespalhamento. Os resultados obtidos ilustram a complexidade do espectro de fônons próximo ao ponto q = 0 e indicam a existência de duas transições de fase nas regiões 230±20 K e 150±20 K. Espectros Raman para o cristal de DALA também foram medidos submetendo a amostra a pressões de até 14 GPa foram analisadas varias regiões espectrais e os resultados apontam, mais uma vez, para duas possíveis transições de fase nas faixas de pressão 1.5 a 1.8 GPa e 3.6 e 4.4 GPa. Os espectros Raman para o cristal de DLA foram medidos entre 50 cm-1 a 3100 cm-1 desde a pressão atmosférica até 18 GPa. As alterações observadas nesses espectros conduzem a conjecturar três transições sofridas pelo cristal de DLA. A essas transições estruturais estão associadas mudanças conformacionais que ocorrem a pressões ligeiramente inferiores aquelas relativas às mudanças estruturais sendo que a primeira ocorre entre 1.7 GPa e 2.3 GPa. Logo acima em 4 GPa e 4.6 GPa nota-se mudanças que precede a segunda transição estrutural que ocorre entre 6 GPa e 7GPa . Finalmente, mudanças nos modos da rede entre 11.6 GPa e 13.2 GPa foram designados com uma terceira de transição de fase. É importante ressaltar que ao retornar as condições ambientes em ambos os experimentos de pressão e temperatura recupera-se os espectros obtidos anteriormente nas mesmas condições o que indica a reversibilidade das transições estudadas nesta tese.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-07-03T18:27:33Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 296558 bytes, checksum: ced5035a2df1275e22a4e30cff8ee50b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-03T18:27:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 296558 bytes, checksum: ced5035a2df1275e22a4e30cff8ee50b (MD5) Previous issue date: 2001-03-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Dois experimentos foram conduzidos no Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa. O primeiro com o objetivo de determinar a composição química e energética de oito alimentos: milho grão, milho pré-cozido I e II, farelo de canola, plasma sangüíneo, farinha de vísceras, glicose e amido de milho, e o segundo com o objetivo de determinar o coeficiente de digestibilidade verdadeiro dos aminoácidos do milho grão, milho pré-cozido I e II, farelo de canola e farinha de vísceras. Para determinar os valores de energia metabolizável aparente (EMA) e energia metabolizável aparente corrigida pelo balanço de nitrogênio (EMAn), foram utilizados o método tradicional de coleta total de excretas, com pintos de corte, machos e fêmeas, de 21 a 30 dias de idade. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com dez tratamentos, cinco repetições e oito aves por unidade experimental. Os milhos grão e pré-cozido I e II, substituíram em 40%, e o amido e a glicose em 20% uma ração referência com 26% PB; e o farelo de canola substituiu em 40%, e o plasma sangüíneo e a farinha de vísceras em 20% uma ração referência com 18% PB. Os valores de matéria seca MS (%), proteína bruta PB (%), EMA (Kcal/Kg) e EMAn (Kcal/Kg) foram, respectivamente, para o milho: 87,72, 7,33, 3.246 e 3.235; milho pré-cozido I: 87,75, 7,14, 3.385 e 3.379; milho pré-cozido II: 87,88, 7,34, 3.187 e 3.179; farelo de canola: 87,53, 37,89, 1.793 e 1.778; plasma sangüíneo: 90,67, 74,24, 3.503 e 3.474 e farinha de vísceras: 90,35, 64,98, 4.293 e 4.268. Foram determinados os valores de MS (%), EMA (Kcal/Kg) e EMAn (Kcal/Kg) para a glicose 99,12, 3.170 e 3.168 e para o amido de milho 85,52, 3.203 e 3201, respectivamente. No segundo experimento, para determinar os aminoácidos digestíveis foi utilizado o método de “alimentação forçada” com galos cecectomizados. O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado, com seis tratamentos, seis repetições e um galo por unidade experimental. Os valores dos aminoácidos digestíveis como a lisina, metionina, metionina+cistina, treonina e arginina, expressos em porcentagem na matéria natural, foram respectivamente, para o milho grão: 0,21, 0,18, 0,28, 0,13 e 0,19; milho pré- cozido I: 0,16, 0,14, 0,24 0,16 e 0,18; milho pré-cozido II: 0,24, 0,17, 0,34 0,22 e 0,25; farelo de canola: 3,43, 0,97, 1,41, 1,30 e 2,33; plasma sangüíneo: 7,12, 2,22, 3,41, 3,21 e 3,13; e farinha de vísceras: 4,32, 1,05, 1,75, 2,39 e 4,70. / Two experiments were conducted in the Animal Science Department of Federal University of Viçosa. The first one with the objective of determining the chemical and energetic composition of eight feedstuffs: corn grain, corn pre- cooked I and II, canola meal, spray-dried plasma, poultry by-product meal, glucose and corn starch, and the second with the objective of determining the true digestibility coefficient of the amino acids the corn grain, pre-cooked I and II, canola meal, spray-dried plasma and poultry by-product meal. To determine the values of apparent metabolizable energy (AME) and nitrogen corrected apparent metabolizable energy (AMEn) the traditional method of total excreta collection were used, with broiler chicks, male and female, 21 to 30 days old. A complete randomized design was utilized, with ten treatments, five replications and eight birds per experimental unit. The corn grain and pre-cooked I and II, replaced 40%, and the starch and glucose 20% of the reference diet with 26% CP; the canola meal replaced 40%, and spray-dried plasma and poultry by-products meal 20% of the reference diet with 18% CP. The dry matter –DM (%), crude protein –CP (%), AME (Kcal/Kg) e AMEn (Kcal/Kg) values were, respectively, for corn grain: 87,72, 7,33, 3.246 and 3.235; for pre-cooked I: 87,75, 7,14, 3.385 and 3.379; for pre-cooked II: 87,88, 7,34, 3.187 and 3.179; for canola meal: 87,53, 37,89, 1.793 and 1.778; for spray-dried plasma: 90,67, 74,24, 3.503 and 3.474; and for poultry by-product meal: 90,35, 64,98, 4.293 and 4.268. The DM (%), AME (Kcal/Kg) and AMEn (Kcal/Kg) values were determined for glucose 99,12, 3.170 and 3.168; and corn starch 85,52, 3.203 and 3201, respectively. The second experiment, to determine the digestible amino acids the “method of forced feed” was used with cecectomized roosters. A complete randomized design was used, with six treatments, six replications and one bird per experimental unit. The values of digestible amino acids as lysine, methionine, methionine+cystine, threonine and arginine, expressed in percentage of the natural matter, were respectively, for grain corn: 0,21, 0,18, 0,28, 0,13 and 0,19; corn pre-cooked I: 0,16, 0,14, 0,24 0,16 and 0,18; pre-cooked corn II: 0,24, 0,17, 0,34 0,22 and 0,25; canola meal: 3,43, 0,97, 1,41, 1,30 and 2,33; spray-dried plasma: 7,12, 2,22, 3,41, 3,21 and 3,13; and poultry by-products meal: 4,32, 1,05, 1,75, 2,39 and 4,70. / Dissertação importada do Alexandria