Made available in DSpace on 2014-10-09T12:33:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:03:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:35:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:04:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:23:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:06:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 01011.pdf: 1513856 bytes, checksum: 5aef640dc2adb97f1d5a80607ef8ffc3 (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IEA/D / Instituto de Biociencias, Universidade de Sao Paulo - IB/USP

Orientador : Lilian Maria de Castilho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T19:52:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 BaleottiJunior_Wilson_D.pdf: 8406610 bytes, checksum: 54b8f3febe199a21fce361b234c634e8 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O sistema de grupo sangüíneo Dombrock é constituído por um par de antígenos antitéticos, Doa e Dob, e três antígenos de alta freqüência populacional, Gregory (Gya), Holley (Hy) e Joseph (Joa). O gene DO, que codifica os antígenos do sistema Dombrock, foi recentemente clonado e suas bases moleculares foram elucidadas. Os antígenos Doa e Dob. são controlados pelos alelos DOA e DOB que estão associados à troca de três nucíeotídeos no exon 2 do gene DO: 378C/T, 624T/C e 793A/G, respectivamente. O fenótipo Jo(a-) está associado com a substituição 350C/T que caracteriza o alelo JO. O fenótipo Hy-negativo está associado à presença de um dos alelos: HY1 ou HY2. O alelo HY2 é caracterizado pela substituição 323G/T. Uma substituição adicional 898C/G, no exon 3, caracteriza o gene HY/1. Recentemente dois novos alelos foram descritos: DOB- SH (378C, 624C, 793G) e DOA-HA (378T, 624T, 793A). Considerando que: as bases moleculares dos antígenos Dombrock foram elucidadas; que novos alelos têm sido descritos; a miscigenação da população brasileira e que até o momento nenhum estudo foi realizado sobre a freqüência dos genes Dombrock na nossa população, estudamos 450 amostras de DNA, através das técnicas de PCR-RFLP e Microarrays® - HEA Beadchip para determinar a freqüência dos aletos DO {DOA, DOB, HY1, HY2, JO). Dois novos alelos foram identificados baseados em novas combinações de SNPs: alelo DOB- WL (793G, 898G, 323C) e alelo DOA-SH (378C, 624C, 793A). Nossos dados demonstram uma grande complexidade e heterogeneidade dos alelos Dombrock na população brasileira e confirmam a necessidade do estudo molecular em diferentes populações / Abstract: Background: The molecular basis of the Doa and Dob polymorphism, are associated with three single-nucleotide polymorphisms (SNPs) on exon 2 of DO gene: 378C>T, 624T>C and 793A>G, DOA and DOB alleles, respectively. The SNPs 350OT (JO allele) and 323G>T (HY allele) are associated with: Jo(a-) and Hy-negative phenotype. Recently, two new DO alleles were identified using the microarray technology, DOB-SH (378C, 624C, 793G) and DOA-HA (378T, 624T, 793A). Although the molecular background of Dombrock system is well defined, no studies were carried out in the Brazilian population. Methods: We employed PCR-RFLP based assays and a microarray assay to determine the frequency of the DO alleles {DOA, DOB, HY1, HY2 and JO) in Brazilians. We tested DNA of 288 Brazilians people by PCR-RFLP to determine the 793A>G (DOA/DOB), 323G>T {HY), 350OT (JO) and 8980G {HY1IHY2) SNPs. We also tested DNA from 162 blood donors by the HEA Beadchip¿ (BioArray Solutions, USA) to determine the 3780T, 624T>C, 793A>G (DOAIDOB), 350OT (JO allele) and 323G>T (HY) SNPs. Results: Two novel alleles combinations were found in our samples: the 793G SNP (DOB allele) associated with 898G and 323G (DOB-WL) and the SNPs 378C, 624C, 793A and 323G (DOA-SH). We also found the DOB-SH and DOA-HA alleles recently reported. Conclusion: Our data demonstrate high heterogeneity of DO alleles in the Brazilian population and highlight the importance of testing a cohort of different populations to determine the DO allele combinations and establish reliable genotyping to predict the Doa/Dob antigen status / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Orientadores : Maria Helena Andrade Santana, Ricardo de Lima Zollner / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-29T06:07:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zanin_MariaHelenaAmbrosio_D.pdf: 3129739 bytes, checksum: 3bf129235472299864d6a448f93f8cab (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A importância farmacológica dos gangliosídios tem crescido nos últimos anos devido à identificação desses compostos como antígenos, produzindo anticorpos antigangliosídios que podem estar envolvidos em algumas doenças autoimunes ou neuropatias. Os estudos na literatura dos gangliosídios abrangem desde suas propriedades e funções nas membranas neuronais assim como a sua farmacologia no sistema nervoso central, quando injetados na forma pura em animais e humanos. Entretanto, o estudo de seus efeitos no sistema imunológico, quando associados aos lipossomas, ainda é escasso, o que motivou o desenvolvimento dessa pesquisa. Este trabalho compreendeu a preparação e caracterização de lipossomas multilamelares compostos de dipalmitoilfosfatidilcolina, colesterol, dihexadecilfosfato e gangliosídios, monossialogangliosídio (GM1) e Mist (mistura de GM1 21%, dissialogangliosídio (GD1a) 40%, dissialogangliosídio (GD1b) 16%, trissialogangliosídio (GT1b) 19%) e avaliação do efeito imunológico destes lipossomas quando injetados em camundongos. Os animais testados foram camundongos do tipo Balb/c, os quais receberam seis doses de lipossomas a cada duas semanas, perfazendo um total de doze semanas. Após este período os animais foram sacrificados e seus soros submetidos a testes ELlSA para avaliação da produção de anticorpos antigangliosídios, classes IgM e IgG. Em termos de significância estatística os lipossomas livres de gangliosídios e os associados à Mist não apresentaram imunogenicidade e alguns soros de animais tratados com lipossomas associados ao GM1 apresentaram algumas classes de imunoglobulinas. Porém, em termos de avaliação para diagnóstico de anticorpos, todas as formulações foram consideradas não imunogênicas quando considerada as unidades arbitrárias / Abstract: The pharmacological importance of gangliosides has increased in the last few years due to the identification of these compounds as antigens, producing antiganglioside antibodies, which may be involved in autoimmune diseases or neuropathy. Studies in ganglioside literature encompass their properties and functions in the neuronal membranes as well as their pharmacology in the central nervous system upon injection in pure ganglioside form in animais and humans. However, as associated to the liposomes, the studies of their effects on the immunological system are still scarce, which motivated the development of this research. This work includes the preparation and characterization of multilamellar liposomes consisting of dipalmitoyl phosphatidyl choline, cholesterol, dihexadecylphosphate and gangliosides, monosialoganglioside (GM1) and Mist (mixture of GM1 21%, disialoganglioside (GD1a) 40%, disialoganglioside (GD1b) 16%, trisialoganglioside (GT1b) 19%) and evaluation of immunologic effect of hese liposomes as administered in mice. The animais tested were Balb/c mice, which were treated with six liposome doses at 2 week-intervals during twelve weeks. After this period the animais were sacrificed and their sera were assayed by ELlSA tests in order to evaluate the production of antiganglioside antibodies of IgM and IgG classes. With respect to the statistical significance, the liposomes without gangliosides and the ones associated to the Mist were non immunogenic and some of animal sera, which were treated with liposomes associated to the GM1, showed some Immunoglobulin classes. H oweve r, in terms of evaluation of the antibody diagnostic, ali of liposome formulations were considered non immunogenic in regard to the arbitrary units / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:23:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:56:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 00203.pdf: 1432783 bytes, checksum: d2a399f27f88b4a93cdad210e33ea6a6 (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IEA/D / Instituto de Biociencias, Universidade de Sao Paulo - IB/USP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:23:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:57:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 01103.pdf: 1172103 bytes, checksum: 91bab2b13d660ec6ae7ebd98dbcc08fa (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IEA/D / Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia, Universidade de Sao Paulo - FMVZ/USP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:35:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:04:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Staphylococcus aureus é um dos principais microorganismos causadores de infecção em humanos, podendo causar inclusive bacteremia e endocardite nos indivíduos infectados. Diversas cepas desta bactéria apresentam resistência a diferentes tipos de antibióticos, dentre eles os antibióticos meticilina e amoxicilina, como no caso da bactéria Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). A Proteína ligadora de Penicilina 2a (PBP2a) é a enzima responsável por conferir resistência para a MRSA aos antibióticos β-lactâmicos, sendo uma molécula promissora para terapia com AcM. No entanto, além das terapias os métodos de diagnóstico também são ineficientes, pois atualmente o diagnóstico leva vários dias para produzir um resultado confiável. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um radiofármaco utilizando o AcM anti-PBP2a, desenvolvido em Bio-Manguinhos/FioCruz, marcado com 99mTc, para identificação in situ do foco infeccioso causado por MRSA. Neste trabalho, incialmente o AcM anti-PBP2a foi reduzido com o agente redutor 2-mercaptoetanol (2-ME), para gerar grupos sulfidrilas (- SH). Logo após foram utilizados dois diferentes métodos da Marcação Direta: o Método 1, utilizando o reagente tartarato e o ácido gentísico, que atuam como agente transquelante e estabilizador, respectivamente; e o Método 2, utilizando um kit comercial de MDP, no qual o MDP atua como agente transquelante. Após a marcação do anticorpo, o radiofármaco foi submetido a ensaios de avaliação funcional, utilizando os métodos de eletroforese em gel SDS-PAGE não redutor; Immunoblotting; ELISA e o Ensaio de Neutralização in vitro. Como resultado foi visto que a quantidade média de grupos sulfidrilas produzida por AcM foi considerada satisfatória, cerca de 5 grupos SH por IgG, utilizando para isto a relação molar de 6.500:1 de 2-ME:AcM. O Método 2 foi o método que obteve melhor rendimento de marcação, com 73,5%, apresentando boa estabilidade depois de 2 horas (73,2%). A melhor formulação utilizada foi a seguinte: 0,5 mg de AcM anti-PBP2a; 10 μL do kit do MDP, depois de ser resuspendido com 5 mL de solução salina; e 75,48 MBq (2,04 mCi) de 99mTc, a reação ocorrendo em 15 minutos. Os Ensaios de Avaliação Funcional demonstraram que o AcM manteve a especificidade e afinidade de ligação à PBP2a. / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:23:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:06:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 01011.pdf: 1513856 bytes, checksum: 5aef640dc2adb97f1d5a80607ef8ffc3 (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IEA/D / Instituto de Biociencias, Universidade de Sao Paulo - IB/USP

Glicoconjugados são abundantes na superfície de Trypanosoma cruzi e têm sido bastante estudados por diferentes grupos. A degradação dessas moléculas, no entanto, tem sido alvo de pouco interesse. O objetivo deste trabalho foi determinar a atividade de alfa-L-fucosidase em T.cruzi uma vez que trabalhos anteriores haviam concluído que várias hidrolases, entre elas a alfa-L-fucosidase estavam ausentes em epimastigota (AVILA, et al., 1979). Empregando-se p-nitrofenilfucopiranosídeo como substrato e extrato de formas epimastigotas, verificou-se que a enzima apresenta praticamente a mesma atividade em um intervalo de pH entre 6,0 e 7,5, caindo drasticamente em pHs mais ácidos. A incubação prévia da enzima a 28°C em pH 7,0 leva à perda de aproximadamente 30% de sua atividade após 1h 30mim e à perda de 100% após 4 horas de incubação. O efeito de íons na atividade da enzima foi estudado,verificando-se que Zn +2 inibe 90% sua atividade, enquanto que outros, como o Ca +2 praticamente não tem efeito. A enzima é parcialmente encontrada na fração particulada, podendo ser solubilizada parcialmente com 1% de Triton X-100 ou com NaCl 1 M. As tentativas feitas de purificar a enzima foram infrutíferas, uma vez que não se encontraram condições para manter a proteína ativa por longos períodos de tempo. A alfa-L-fucosidase está presente não só em pimastigotas, mas também em tripomastigotas, embora parentemente com diferentes atividades específicas, sendo maior em epimastigotas. Mesmo nos epimastigotas, grandes variações de atividade específica foram detectadas ao longo deste trabalho (de 0,03 a 0,23 unidades). Anticorpos preparados contra alfa-L-fucosidase comercial de epidídimo bovino imunoprecipitaram de extratos de epimastigotas previamente marcados com 35 S-metionina, um polipeptídeo em torno de 50 kDa após eletroforese em gel desnaturante e uma banda de 130-150 kDa em gel não desnaturante, sugerindo que a enzima em T.cruzi pode ser dimérica, a exemplo de outras alfa-L-fucosidases descritas na literatura. A imunoprecipitação de extrato de epimastigotas marcados com 35 S-metionina na presença de tunicamicina, com o anticorpo anti-alfa-L-fucosidase revelou um polipeptídeo de 45 kDa, mostrando que a enzima é glicosilada. A glicosilação daenzima também foi observada pelo emprego de corantes comerciais. Além disso, os anticorpos anti-alfa-L-fucosidase imunoprecipitam moléculas com atividade de alfa-L-fucosidase,embora não se tenha observado aumento da atividade, possivelmente devido à perda de atividade da enzima nas condições empregadas durante a imunoprecipitação. Os anticorpos anti-alfa-L-fucosidase reconhecem, por imunofluorescência indireta, tanto as formas epimastigotas como tripomastigotas de cultura de tecido. A análise por microscopia de transmissão mostra a reatividade intensa do anticorpo com uma região membranar localizada na região posterior do epimastigota. No caso do tripomastigota, a reatividade é menos pronunciada mostrando uma leve marcação no interior do parasita. / Alpha-L-fucose is a component of glycoproteins, inc1uding glycoproteins isolated from Tcruzi. a-L fucosidases have been isolated from different sources, but earlier studies were unable to detect this enzyme in T. cruzi epimastigotes (AVILA et al., 1979). In this work immunocytochemical and biochemical techniques have been used to localize and characterize a membrane-associated, neutral-pH-optimum alpha-L fucosidase from Trypanosoma cruzi epimastigotes. Light and electron microscopy specifically localized the alpha-L fucosidase on membranes in the posterior region of the epimastigotes and on the parasite surface. Immunoreactivity for alpha-L-fucosidase, a1though less intense, was also detected on the surface of trypomastigotes. Fractionation of epimastigotes homogenates indicated that over 50% of the a-Lfucosidase activity was associated with the 80 000 g pellet. This pellet-associated activity could be solubilized with 1 M NaCl or with 1% Triton X-I 00, suggesting that alpha-L-fucosidase is peripherally associated with membranes. Analysis of alpha-L-fucosidase on epimastigote extracts indicated that the enzyme had a pH-activity curve (with an optimum near 7) which was comparable to other alpha-L-fucosidases reported in the literature. A higher specific activity (in units/mg) was found in epimastigotes as compared to the other differentiation stages of the parasite: 0.028 for epimastigotes, 0.002 for metacyc1ic trypomastigotes and 0.015 for tissue - cultured trypomastigotes. SDS/PAGE and Westem blotting analysis indicated that epimastigotes have a protein band of 50 kDa which was immunoreactive with anti-alpha-L-fucosidase antibodies.