Orientador: Ronaldo Aloise Pilli / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-19T09:48:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Correia_ValquirioGraia_M.pdf: 5120551 bytes, checksum: 59d3f74f13394c176e7a8ee336417804 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Neste trabalho sintetizamos alguns análogos à febrifugina (1), alcaloide inicialmente isolado a partir de extratos da erva Chang shan (Dichroa febrífuga) e detentor de potente atividade antimalárica. Foram sintetizados análogos na forma racêmica em que se variou o tamanho do anel heterocíclico saturado, a ausência de substituinte e presença de um átomo de bromo na posição C3¿, visando estudar a influência desses elementos na atividade contra P. falciparum e na citotoxicidade. A síntese dos análogos envolveu reações de a-amidoalquilação entre íons N-acilimínio e éteres enólicos de silício ou acetatos enólicos na etapa chave. Os análogos 11, 80 e 81 foram preparados em oito etapas, em bons rendimentos globais. Enquanto os análogos 82-84 foram preparados em seis etapas, utilizando-se metodologias diastereosseletivas, em rendimentos globais razoáveis / Abstract: In this work we synthesized some febrifugine analogs (1), alkaloid initially isolated from the extracts of the herb Chang Shan (dichroa febrifuga) wich displayed potent antimalarial activity. Analogs have been synthesized in racemic form, varying the size of the saturated heterocyclic ring, the absence of substituent and the presence of a bromine atom at C3¿ position aiming to study the influence of these elements in the activity against P. falciparum and the cell toxicity. To synthesize the analogues we have used a-amidoalkylation reaction between N-acyliminium ions and silylenolethers or enolacetates in the key step. Analogs 11, 80 and 81 were prepared in eight steps in good overall yields, while the analogs 82-84 were prepared in six steps, using a diastereoselective á-amidoalkylation reaction, in reasonable overall yields / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

Orientador: Fabio Trindade Maranhão Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T06:24:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes_StefanieCostaPinto_D.pdf: 63660430 bytes, checksum: 46ba12508eba9cd5aeed590ca748d9cd (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Este trabalho de tese está dividido em dois capítulos. Abaixo descreveremos brevemente os achados de cada um deles. O primeiro capítulo entitulado Desenvolvimento de Drogas Experimentais trata da atividade antimalárica de um composto natural, a violaceína e suas formulações geradas com o auxílio da nanotecnologia. Neste sentido, a violaceína foi eficiente em eliminar in vitro formas sanguíneas de P. falciparum 3D7 e P. falciparum S20, sendo este último isolado resistente à cloroquina. Quando testada in vitro em isolados frescos de P. vivax, a violaceína não foi capaz de inibir o desenvolvimento parasitário. No entanto, acreditamos que novos ensaios são necessários para confirmar este dado, uma vez que o IC50 (concentração inibitória 50%) observado para cloroquina apresentou-se estranhamente elevado. Os experimentos in vivo utilizando camundongos infectados com Plasmodium chabaudi chabaudi AS revelaram uma potente atividade desta droga, inclusive quando o tratamento foi iniciado após o estabelecimento de infecção patente nos animais. Quando administrada em animais infectados com uma cepa murina letal (Plasmodium chabaudi chabaudi AJ), a violaceína protegeu 80% dos animais. Como a violaceína é um composto insolúvel em água, novas formulações com essa molécula foram feitas visando sua solubilidade e também potencializar sua atividade antimalárica. Neste sentido, tanto a violaceína encapsulada com co-polímero de ácido láctico e ácido glicólico quanto as formulações de violaceína com três diferentes nanotubos de carbono também foram capazes de inibir o crescimento parasitário in vitro contra P. falciparum, no entanto esta atividade não foi potencializada. Em síntese, este capítulo nos mostra que a violaceína apresenta capacidade de inibir o crescimento parasitário de Plasmodium sp., no entanto as suas formulações não foram capazes de potencializar a atividade antimalárica. O segundo capítulo entitulado Imunopatogênese na malária vivax trata da capacidade adesiva de eritrócitos infectados por P. vivax (Pv-EI) a diferentes receptores endoteliais e da capacidade deste parasita em formar rosetas. Uma vez que há uma baixa proporção de formas maduras principalmente esquizontes na circulação periférica de pacientes infectados por P. vivax, estabelecemos uma técnica de cultivo in vitro para obtenção destas formas maduras e investigamos a capacidade adesiva destas formas do parasita. Neste sentido, observamos que Pv- EI pós-amadurecimento apresentam maior capacidade adesiva em HLEC (células endoteliais de pulmão humano) que parasitas do mesmo isolado antes do amadurecimento. Quando avaliado os receptores envolvidos antes e após o amadurecimento, ensaios com células transfectadas ou uso de inibidores específicos, revelou a participação de ICAM-1 (molécula de adesão intercelular 1) e CD36 (cluster de diferenciação 36) na citoadesão deste parasita enquanto a participação de CSA (Condroitin Sulfato A) permanece a ser elucidada. Ao passo que ICAM-1 parece estar envolvida na citoadesão de todos os estágios do parasitas, o CD36 parece ser estritamente envolvido na citoadesão de formas maduras, essencialmente esquizontes. Além disso, a citoadesão de Pv-EI em HLEC foi potencializada na presença de soro do próprio paciente, sugerindo a existência no soro dos infectados de mediadores adesivos. Quando investigada a formação de rosetas por Pv-EI verificamos que a porcentagem de rosetas foi maior nas formas amadurecidas e também foi potencializada na presença de soro autólogo. Os dados aqui apresentados abrem perspectivas para novos estudos visando compreender o fenômeno patológico envolvido na malária vivax grave, incluindo a participação de mediadores plasmáticos e a identificação dos receptores celulares e dos ligantes parasitários envolvidos / Abstract: This thesis was divided into two chapters, and below we briefly describe the findings of each one. The first chapter entitled Experimental Drug Development investigates the antimalarial activity of a natural compound, violacein, and its formulations developed by nanotechnology. Violacein effectly killed in vitro blood stages of P. falciparum 3D7 and P. falciparum S20, a chloroquine resistant strain. When tested in vitro against P. vivax fresh isolates, violacein did not inhibit parasite development. However, further experiments are needed to confirm this finding, as chloroquine IC50 (inhibition concentratios 50%) was strangely high. The in vivo experiments using mice infected with Plasmodium chabaudi chabaudi AS revealed a potent activity of this drug, even when treatment was initiated after the establishment of patent infection in animals. When administered to lethal strain (Plasmodium chabaudi chabaudi AJ) infected mice, violacein protected 80% of animals. As violacein is insoluble in water, new formulations were developed to enhance its solubility and also its antimalarial activity. However, violacein encapsulated with PLGA (poly(lactic-co-glycolic acid)) and violacein formulations with three different carbon nanotubes did not enhanced violacein activity in vitro against P. falciparum. In summary, this chapter shows that violacein has the capacity to inhibit Plasmodium sp. growth; still their formulations were not able to potentiate violacein antimalarial activity. The second chapter entitled Immunopathogenesis of vivax malaria investigates the adhesive capacity of P. vivax infected erythrocytes (Pv-IE) in different endothelial cell receptors and the ability of this parasite to form rosettes. Since there are a low proportion of mature forms, especially schizonts, in peripheral circulation of malaria vivax patients, we established an in vitro technique to obtain these mature forms and investigate their adhesive capacity in endothelial cells. Here we showed that post-maturation Pv-IE presented more adhesive capacity in HLEC (human lung endothelial cells) than the same isolate before maturation. The search for receptors involved in cytoadhesion before and after maturation, using transfected cells or specific inhibitors, showed that ICAM-1 (intracellular adhesion molecule 1) and CD36 (cluster of differentiation 36) were involved in Pv-IE cytoadhesion whereas CSA (chondroitin sulfate A) involvement remains to be elucidated. While ICAM-1 seems to be involved in all stages of Pv-IE cytoadhesion, CD36 seems to be strictly involved in mature forms cytoadhesion, essentially schizonts. Furthermore, Pv-IE cytoadhesion in HLEC was enhanced in patient's serum presence, suggesting the existence of adhesive mediators in Pv-IE infected serum. Rosette formation by Pv- IE was also higher in mature forms and rosette formation was enhanced in autologous serum presence. These data collectively open new perspectives to study the pathological phenomenon involved in severe vivax malaria, including the involvement of plasma mediators and identification of cell receptors and parasite ligands involved in Pv-IE cytoadhesion / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Fabio Trindade Maranhão Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T14:00:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kayano_AnaCarolinaAndradeVitor_M.pdf: 4619978 bytes, checksum: 3bf657caae96f9c4faf7fcdf7e519956 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Para superar o problema do aumento de resistência às drogas, os medicamentos tradicionais são fontes importantes na investigação de potenciais novos antimaláricos. Caesalpinia pluviosa, mais conhecida como 'sibipiruna', é originária do Brasil e estudos mostraram que este gênero apresenta várias propriedades farmacológicas, incluindo a atividade antimalárica. O extrato bruto obtido da casca foi submetido ao fracionamento com diferentes solventes resultando em sete frações. Para avaliar a citotoxicidade do extrato e frações em células MCF-7 foi realizado o ensaio de MTT. Essas amostras foram testadas in vitro contra P. falciparum cloroquino sensível (3D7) e resistente (S20) e in vivo em camundongos infectados por P. chabaudi. A interação da fração etanólica 100% de C. pluviosa com o artesunato foi avaliado e análises de espectrometria de massas foram realizados. As frações etanólica 100% e metanólica 50% apresentaram atividade antimalárica significativa em concentrações não tóxicas, e o ensaio de interação medicamentosa do artesunato com a fração etanólica 100% foi sinérgico. Essa fração foi capaz de inibir significativamente a parasitemia dos animais de forma dose dependente após 4 dias de tratamento (0-3 dia pós infecção). Além disso, análise de espectrometria de massas revelou a presença do íon m/z 303.0450, sugerindo a presença de quercetina. No entanto, em uma segunda análise com o padrão de quercetina mostrou íons diferentes como m/z 137 e 153. Nossos resultados mostram que a fração etanólica 100% de C. pluviosa apresentou atividade antimalárica in vitro em concentrações não tóxicas e esse efeito foi potencializado com a presença de artesunato. Além disso, essa atividade antimalárica foi também sustentada após o tratamento in vivo de camundongos infectados. Finalmente, as análises de espectrometria de massas sugerem que um novo composto, provavelmente um isômero da quercetina, possa estar relacionado à atividade antimalárica da fração etanólica 100% / Abstract: To overcome the problem of increasing drug resistance traditional medicines are an important source for investigation of potential new antimalarials. Caesalpinia pluviosa, commonly named 'sibipiruna', is originated from Brazil and studies showed that this genus present multiple therapeutic properties, including antimalarial activity. Crude extract obtained from stem bark was purified with different solvents, resulting in seven fractions. MTT assay was performed to evaluate cytotoxicity in MCF-7 cells. The crude extract and its fractions were tested in vitro against chloroquine-sensitive (3D7) and -resistant (S20) strains of Plasmodium falciparum and in vivo in P. chabaudi-infected mice. In vitro interaction with artesunate and C. pluviosa fraction was assessed and mass spectrometry analyses were conducted. At non-toxic concentrations the 100% ethanolic and 50% methanolic fractions presented significant antimalarial activity against both 3D7 and S20 strains, and drug interaction assays with artesunate showed a synergistic effect with 100% ethanolic fraction. This fraction was able to inhibit mice parasitemia significantly and in a dose dependent manner after 4 days treatment (0-3 post-infection). Moreover, mass spectrometry analyses revealed the presence of an ion corresponding to m/z 303.0450, suggesting the presence of quercetin. However, a second set of analyses, with the standard quercetin, showed distinct ions of m/z 137 and 153. Our findings show that the 100% ethanolic fraction of C. pluviosa exhibited antimalarial activity in vitro at non-toxic concentrations and this effect was potentiated with the presence of artesunate. Moreover, this antimalarial activity was also sustained in vivo after treatment of infected mice. Finally, mass spectrometry analyses suggest a new compound, most likely an isomer of quercetin, related with antimalarial activity of the 100% ethanolic fraction / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

O estudo da biossíntese de isoprenóides em P. falciparum por meio da via 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato (MEP) é apontado como possível alvo terapêutico, visto a via ser ausente em humanos. Foi descrito que nos estágios intraeritrocitários de P. falciparum a via essencial de biossíntese de isoprenóides é a via MEP. As vias do Chiquimato e MEP são precursoras da biossíntese de vitamina E e ambas já foram descritas em P. falciparum. É sugerido que a biossíntese de vitamina E possa ocorrer no parasita, representando um possível alvo para o desenvolvimento de novas drogas antimaláricas. Empregando marcações metabólicas com precursores radioativos, três diferentes métodos de RP-HPLC e análises por espectrometria de massas confirmamos a biossíntese de vitamina E nos três estágios intraeritrocíticos do parasita. O tratamento com ácido úsnico, mostrou inibição dessa biossíntese no estágio esquizonte e do crescimento do parasita. Demonstramos por meio de uma sonda fluorescente, ácido Parinárico, que a vitamina E atua como antioxidante lipofílico, protegendo a lipoperoxidação. Esses resultados não só contribuem para a compreensão da biologia de P. falciparum, mas também elucidam partes das vias MEP e do Chiquimato que podem servir como alvos terapêuticos. / The study of isoprenoid biosynthesis in Plasmodium falciparum by 2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway (MEP) it is presented as a therapeutic target once that it is absent in humans. It was found in intraerythrocytic stages of P. falciparum the biosynthesis of isoprenoids by the MEP pathway. The shikimate and MEP pathways are the precursors of biosynthesis of vitamin E and both pathways have already been described in P. falciparum. It is suggested that the biosynthesis of vitamin E might occur in the parasite, representing a possible target for developing new antimalarial drugs. Using metabolic labelling with radiolabelled precursors, three different methods of RP-HPLC and mass spectrometry analyses confirmed the biosynthesis of vitamin E in the three intraerythrocytic stages of parasite. The treatment with usnic acid showed an inhibition of this biosynthesis and of the growth of parasite. We demonstrated by means of a fluorescent probe, the acid Parinaric, that vitamin E acts as a lipophilic antioxidant protecting the membrane of lipoperoxidation. These findings not only contribute to the current understanding of P. falciparum biology but shed light on a pathway that could serve as a chemotherapeutic target.

O aumento da resistência do parasita da malária a maioria da drogas antimaláricas disponíveis, tornandose necessário pesquisar novos compostos com potencial atividade antimalárica. O objetivo desta tese foi inicialmente caracterizar a atividade do risedronato contra as formas intraeritrocitárias do parasita in vivo, além de identificar seu possível mecanismo de ação. A IC50 do risedronato foi de 20 <font face=\"Symbol\">mM em culturas de Plasmodium falciparum. Risedronato reduziu a biossíntese de FOH e GGOH e a isoprenilação de proteínas, inibindo a transferência do grupo FPP para as proteínas farnesiladas, entretanto, a transferência do GGPP para as proteínas geranilgeraniladas não foi inibida, isto também ocorreu quando proteínas ras e rab foram analisadas, sugerindo que a droga está inibindo a enzima FPPS. A enzima FPPS de P. falciparum foi expressa e obtivemos uma proteína recombinante fusionada a GST (rPfFPPS). Os substratos IPP, DMAPP, GPP e FPP foram utilizados para determinação da atividade catalítica da enzima, demonstrando FPP e GGPP como principais produtos. Os valores de Km para os diferentes substratos foi determinado. Demonstramos também que rPfFPPS é inibida por risedronato, podendo ser explorado como potencial alvo antimalárico. / The increased resistance of the malaria parasite most of antimalarial drugs are available, making it necessary to search for new compounds with potential antimalarial activity. The aim of this thesis was initially characterize the activity of risedronate against intraerythrocytic forms of the parasite in vivo, and identify its possible mechanism of action. The IC50 of risedronate was 20 <font face=\"Symbol\">mM in cultures of Plasmodium falciparum. Risedronate reduced biosynthesis and FOH, GGOH and protein isoprenylation, inhibiting the transfer of FPP group for farnesylated proteins, however, the transfer of GGPP to geranygeranylated proteins was not inhibited, this also occurred when ras and rab proteins were analyzed, suggesting that the drug is inhibiting the enzyme FPPS. The FPPS enzyme from P. falciparum was expressed and obtained a recombinant protein fused to GST (rPfFPPS). The substrates IPP, DMAPP, GPP and FPP were used to determine the catalytic activity of the enzyme, demonstrating FPP and GGPP as main products. The Km values for the various substrates were determined. We also demonstrate that rPfFPPS is inhibited by risedronate, which can be exploited as potential antimalarial target.

A malária é responsável por cerca de 207 milhões de casos e 627 mil óbitos em todo o mundo. No Brasil, em 2013, foram registrados mais de 167 mil casos. Um dos grandes desafios para o controle da doença é o desenvolvimento de resistência aos antimaláricos. Dentre as cinco espécies que podem causar malária em seres humanos, Plasmodium falciparum é a que apresenta maior habilidade de desenvolver resistência a quase todas as classes de medicamentos utilizados no tratamento. Estudos com marcadores moleculares têm associado mutações em diversos genes à resistência aos antimaláricos. A mutação K76T no gene pfcrt é relacionada à resistência à cloroquina. Mutações em pfmdr1 e aumento de seu número de cópias foram associados à resistência a diversos antimaláricos, como quinino, mefloquina e derivados de artemisinina. A resistência aos antifolatos é associada a mutações nos genes pfdhfr e pfdhps. Mutações nos genes pfATPase6 e pfAP2-u têm sido relacionadas à diminuição de sensibilidade à artemisinina. O monitoramento dessas mutações e suas associações às respostas in vivo e in vitro aos antimaláricos pode contribuir para a escolha de terapêutica para o controle da doença. O objetivo deste estudo foi analisar o perfil genético relacionado à resistência em P. falciparum ao longo de 27 anos. Foram analisadas amostras de P. falciparum coletadas no período entre 1984 e 2011, de pacientes atendidos em serviços de saúde nos estados do Pará e São Paulo, com infecções provenientes principalmente de países da América do Sul e África. A análise do gene pfcrt mostrou frequência de 100% da mutação K76T nas amostras de países da América do Sul ao longo das décadas analisadas. Este resultado é concordante com o fenótipo de resistência à cloroquina observado em 100% das amostras testadas in vitro para sensibilidade a este antimalárico. Amostras de países africanos apresentaram o genótipo selvagem em infecções únicas ou mistas. Com relação ao gene pfmdr1, a análise do códon 86 mostrou surgimento do mutante 86Y na última década em amostras da América do Sul e ocorrência de alelos selvagens e mutantes em amostras da África. Na análise do códon 1246 foi observada predominância do mutante 1246Y nas amostras sul-americanas e do selvagem D1246 nas africanas. Com relação ao gene pfdhfr, as amostras brasileiras apresentaram frequência de 100% dos mutantes 51I e 108N. O mutante 59R não foi observado no período 1980-1990, mas estava presente em 22,6% das amostras de 2000-2010. A análise do gene pfdhps das amostras brasileiras mostrou frequência de 100% do mutante 437G em todas as décadas e diminuição da frequência de 540E no período 2000-2010 em relação aos anteriores. O sequenciamento do gene pfATPase6 revelou a ocorrência de mutações que já haviam sido relatadas anteriormente, porém seu papel na resistência aos derivados de artemisinina ainda não foi elucidado. Na análise do gene pfAP2-? foram observadas duas novas mutações. Não foram observadas associações entre as mutações estudadas e a resposta in vivo e in vitro à mefloquina, quinino e derivados de artemisinina. Este estudo permitiu a avaliação do perfil genético de P. falciparum, com análise de marcadores moleculares relacionados à resistência a diversos antimaláricos, em amostras coletadas ao longo de 27 anos em que o parasito foi submetido à pressão de diferentes esquemas terapêuticos adotados no Brasil / Malaria is responsible for 207 million cases and 627 thousand deaths worldwide. In Brazil, in 2013, more than 167 thousand cases were reported. The major challenge for malaria control is the emergence and spread of resistance to antimalarials. Among the five species able to cause malaria in humans, Plasmodium falciparum presents ability to develop resistance to almost all classes of drugs for malaria treatment. Studies with molecular markers have associated mutations in several genes to antimalarial resistance. The mutation K76T in pfcrt is related to chloroquine resistance. Polymorphisms in pfmdr1 and increased copy number were associated to several antimalarials resistance, such as quinine, mefloquine and artemisinin derivatives. Resistance to antifolates is associated to mutations in pfdhfr and pfdhps genes. Mutations in pfATPase6 and pfAP2-u were linked to decreased sensibility to artemisinins. The monitoring of these mutations and their association with in vivo and in vitro responses may contribute to the choice of therapeutics for malaria control. The aim of the present study was to analyze the genetic profile related to resistance in P. falciparum over twenty-seven years. Samples collected from 1984 to 2011 from patients enrolled at health facilities in Para and Sao Paulo States were assessed. The origin of infections was mainly from South America and Africa countries. Pfcrt analysis showed that all samples from South America countries harbored the K76T mutation over the four decades, in agreement with the resistant phenotypic response of samples tested in vitro for chloroquine. African samples presented the wild type in mixed or single infections. Regarding to the pfmdr1 gene, the emergence of the mutant 86Y was observed in the last decade in South American samples and occurrence of both, mutant and wild type, in African ones. The analysis of 1246 showed only the mutant 1246Y in South American samples and the wild type D1246 in samples from Africa. Regarding to pfdhfr gene, the frequency of mutants 51I and 108N was 100% in Brazilian samples. The mutant 59R was not observed in the period 1980-1990 and it was present in 22.6% in samples from 2000-2010. The mutant 437G of pfdhps gene was observed in 100% of Brazilian samples in all decades and the frequency of mutant 540E decreased in the period 2000-2010 when compared to 1980-1990. The sequence analysis of pfATPase6 gene showed mutations previous described, but their role in artemisinin resistance is not well defined. Two novel mutations were observed in pfAP2-? gene. No association between the polymorphisms studied and in vivo or in vitro responses to mefloquine, quinine and artemisinin derivatives was observed. This study enabled the knowledge of P. falciparum genetic profile regarding to mutations related to resistance in samples collected over twenty-seven years, when the parasite was exposed to selective pressure of several therapeutic schemes adopted in Brazil

Demonstramos que o P. falciparum dentro do eritrócito é capaz de usar a via de sinalização celular dependente do inositol trifosfato (IP3). Investigamos os estoques de Ca2+ intracelular sensíveis ao IP3 neste parasita e a sensibilidade ao IP3 em diferentes estágios no ciclo intraeritrocítico. Demonstramos que o hormônio melatonina é capaz de aumentar a concentração de IP3 neste parasita. Com o uso de uma coluna de afinidade ao IP3 tentamos encontrar proteínas candidatas ao receptor de IP3 em P. falciparum. Este trabalho também estuda a enzima heme oxigenade de P. falciparum (PfHO). Testamos a capacidade desta enzima em converter biliverdina (BV) em bilirubina (BR), a modulação desta atividade na presença de diversas metaloprotoporfirinas e o potencial destes compostos como antimaláricos. Reportamos que a biliverdina é capaz de modular o ciclo intraeritrocítico de P. falciparum e apresentamos a proteína enolase de P. falciparum como candidato ao sensor de BV neste parasita. / We demonstrate that P. falciparum within the erythrocyte is able to use the cellular signaling pathway dependent on inositol triphosphate (IP3). We investigated the intracellular Ca2+ stores sensitive to IP3 and explore parasite sensitivity to IP3 at different stages in the intraerythrocytic cycle. We demonstrate that melatonin hormone is capable of increasing the IP3 concentration on this parasite. Using an IP3 affinity column, we tried to find candidate proteins for IP3 receptor in P. falciparum. This work also studies the enzyme P. falciparum heme oxygenase (PfHO). We tested the ability of this enzyme to convert biliverdin (BV) in bilirubin (BR), the modulation of this activity in the presence of various metalloprotoporphyrins and the potential of these compounds as antimalarials. We reported that biliverdin is capable of modulating the intraerythrocytic cycle of P. falciparum and present P. falciparum enolase as candidate for BV sensor on this parasite.

A malária apresenta um alto índice de mortalidade com mais de 500 mil mortes registradas em 2013. Para agravar a situação de saúde pública, foi descrito o surgimento de resistência às drogas usadas na terapêutica da doença. Torna-se necessário a identificação e o estudo de novos alvos antimaláricos. A via MEP se mostra como um potencial alvo para o desenvolvimento de drogas contra P. falciparum uma vez que está ausente em humanos. Nossos objetivos foram avaliar a função da vitamina E biossintetizada pelo parasita, caracterizar a biossíntese de vitamina K1 e o metabolismo de fitol. Esse estudo determinou que a vitamina E biossintetizada pelo parasita atua no sistema redox do parasita. Por outro lado, mostramos que a biossíntese de vitamina K1 é ativa no parasita e detectamos sua forma reduzida. Por fim, observamos que existe uma via de reaproveitamento de fitol em P. falciparum assim como em plantas. O estudo abre oportunidades para um desenvolvimento racional de novos antimaláricos e aprofunda o conhecimento na biologia do parasita. / Malaria has the highest mortality rate with more than 500 000 deaths in 2013. The public health situation gets worse because it has been described the emergence of resistance to common drugs used in the treatment of disease. It is necessary to identify and study of new antimalarial targets. The MEP pathway is a potential target for drug development against Plasmodium falciparum once it is absent in humans. Our objectives were to evaluate the function of vitamin E biosynthesized by the parasite and characterize the biosynthesis of vitamin K1 and the phytol metabolism. This study determined that vitamin E biosynthesized by the parasite operates in the redox system of the parasite. We show the biosynthesis of vitamin K1 is active on parasite and we detected its reduced form. Finally, we demonstrate that there is a phytol salvage pathway in P. falciparum as well as plants. The study opens opportunities for the rational development of new antimalarials and deepens knowledge on parasite biology.

A malária é responsável por cerca de 207 milhões de casos e 627 mil óbitos em todo o mundo. No Brasil, em 2013, foram registrados mais de 167 mil casos. Um dos grandes desafios para o controle da doença é o desenvolvimento de resistência aos antimaláricos. Dentre as cinco espécies que podem causar malária em seres humanos, Plasmodium falciparum é a que apresenta maior habilidade de desenvolver resistência a quase todas as classes de medicamentos utilizados no tratamento. Estudos com marcadores moleculares têm associado mutações em diversos genes à resistência aos antimaláricos. A mutação K76T no gene pfcrt é relacionada à resistência à cloroquina. Mutações em pfmdr1 e aumento de seu número de cópias foram associados à resistência a diversos antimaláricos, como quinino, mefloquina e derivados de artemisinina. A resistência aos antifolatos é associada a mutações nos genes pfdhfr e pfdhps. Mutações nos genes pfATPase6 e pfAP2-u têm sido relacionadas à diminuição de sensibilidade à artemisinina. O monitoramento dessas mutações e suas associações às respostas in vivo e in vitro aos antimaláricos pode contribuir para a escolha de terapêutica para o controle da doença. O objetivo deste estudo foi analisar o perfil genético relacionado à resistência em P. falciparum ao longo de 27 anos. Foram analisadas amostras de P. falciparum coletadas no período entre 1984 e 2011, de pacientes atendidos em serviços de saúde nos estados do Pará e São Paulo, com infecções provenientes principalmente de países da América do Sul e África. A análise do gene pfcrt mostrou frequência de 100% da mutação K76T nas amostras de países da América do Sul ao longo das décadas analisadas. Este resultado é concordante com o fenótipo de resistência à cloroquina observado em 100% das amostras testadas in vitro para sensibilidade a este antimalárico. Amostras de países africanos apresentaram o genótipo selvagem em infecções únicas ou mistas. Com relação ao gene pfmdr1, a análise do códon 86 mostrou surgimento do mutante 86Y na última década em amostras da América do Sul e ocorrência de alelos selvagens e mutantes em amostras da África. Na análise do códon 1246 foi observada predominância do mutante 1246Y nas amostras sul-americanas e do selvagem D1246 nas africanas. Com relação ao gene pfdhfr, as amostras brasileiras apresentaram frequência de 100% dos mutantes 51I e 108N. O mutante 59R não foi observado no período 1980-1990, mas estava presente em 22,6% das amostras de 2000-2010. A análise do gene pfdhps das amostras brasileiras mostrou frequência de 100% do mutante 437G em todas as décadas e diminuição da frequência de 540E no período 2000-2010 em relação aos anteriores. O sequenciamento do gene pfATPase6 revelou a ocorrência de mutações que já haviam sido relatadas anteriormente, porém seu papel na resistência aos derivados de artemisinina ainda não foi elucidado. Na análise do gene pfAP2-? foram observadas duas novas mutações. Não foram observadas associações entre as mutações estudadas e a resposta in vivo e in vitro à mefloquina, quinino e derivados de artemisinina. Este estudo permitiu a avaliação do perfil genético de P. falciparum, com análise de marcadores moleculares relacionados à resistência a diversos antimaláricos, em amostras coletadas ao longo de 27 anos em que o parasito foi submetido à pressão de diferentes esquemas terapêuticos adotados no Brasil / Malaria is responsible for 207 million cases and 627 thousand deaths worldwide. In Brazil, in 2013, more than 167 thousand cases were reported. The major challenge for malaria control is the emergence and spread of resistance to antimalarials. Among the five species able to cause malaria in humans, Plasmodium falciparum presents ability to develop resistance to almost all classes of drugs for malaria treatment. Studies with molecular markers have associated mutations in several genes to antimalarial resistance. The mutation K76T in pfcrt is related to chloroquine resistance. Polymorphisms in pfmdr1 and increased copy number were associated to several antimalarials resistance, such as quinine, mefloquine and artemisinin derivatives. Resistance to antifolates is associated to mutations in pfdhfr and pfdhps genes. Mutations in pfATPase6 and pfAP2-u were linked to decreased sensibility to artemisinins. The monitoring of these mutations and their association with in vivo and in vitro responses may contribute to the choice of therapeutics for malaria control. The aim of the present study was to analyze the genetic profile related to resistance in P. falciparum over twenty-seven years. Samples collected from 1984 to 2011 from patients enrolled at health facilities in Para and Sao Paulo States were assessed. The origin of infections was mainly from South America and Africa countries. Pfcrt analysis showed that all samples from South America countries harbored the K76T mutation over the four decades, in agreement with the resistant phenotypic response of samples tested in vitro for chloroquine. African samples presented the wild type in mixed or single infections. Regarding to the pfmdr1 gene, the emergence of the mutant 86Y was observed in the last decade in South American samples and occurrence of both, mutant and wild type, in African ones. The analysis of 1246 showed only the mutant 1246Y in South American samples and the wild type D1246 in samples from Africa. Regarding to pfdhfr gene, the frequency of mutants 51I and 108N was 100% in Brazilian samples. The mutant 59R was not observed in the period 1980-1990 and it was present in 22.6% in samples from 2000-2010. The mutant 437G of pfdhps gene was observed in 100% of Brazilian samples in all decades and the frequency of mutant 540E decreased in the period 2000-2010 when compared to 1980-1990. The sequence analysis of pfATPase6 gene showed mutations previous described, but their role in artemisinin resistance is not well defined. Two novel mutations were observed in pfAP2-? gene. No association between the polymorphisms studied and in vivo or in vitro responses to mefloquine, quinine and artemisinin derivatives was observed. This study enabled the knowledge of P. falciparum genetic profile regarding to mutations related to resistance in samples collected over twenty-seven years, when the parasite was exposed to selective pressure of several therapeutic schemes adopted in Brazil

A caracterização fenotípica de Plasmodium falciparum permite conhecer o padrão de sensibilidade do parasito às drogas antimaláricas utilizadas em países endêmicos. No presente estudo avaliamos fenotipicamente isolados clínicos de P. falciparum provenientes do Continente Africano e do Caribe. A sensibilidade à dihidroartemisinina (DHA: 4 - 1.000 nM), artesunato (AS: 0,1 - 100 nM), lumefantrina (LMF: 3,1 - 200 nM) e mefloquina (MFQ: 0,2 - 1.000 nM) foi investigada por meio de quatro técnicas: (a) ensaio de sensibilidade ex-vivo e in vitro, (b) ensaio de dormência, (c) ensaio de citometria de fluxo e (d) ensaio de sobrevivência do trofozoíto jovem (Ring Stage Survival Assay - RSA). Nos experimentos ex-vivo e in vitro, os IC50 estabelecidos foram 0,4 - 66,6 nM para DHA; 3,8 - 48,8 nM para LMF; 0,3 - 25,9 nM para AS e 2 - 439 nM para MFQ. No ensaio de dormência, esquizontes foram observados na amostra de referência NF54 de P. falciparum e na amostra clínica S-01/15 após pressão com 62,5 nM, 250 nM e 1.000 nM de DHA. O período de recuperação variou de 4 a 40 dias. Para LMF, houve maturação para o estágio de esquizonte no isolado de referência no sétimo e décimo segundo dia após a exposição a 66,6 nM e 200 nM da droga, respectivamente. Esquizontes foram visualizados no isolado clínico FS-08/15 de P. falciparum depois da pressão com 100 nM de AS, com recuperação de 0 a 28 dias, portanto sem apresentar dormência. Na citometria de fluxo, trofozoítos jovens viáveis de P. falciparum marcados com Rodamina 123 e DAPI foram observados nas máximas concentrações de DHA (1.000 nM) e LMF (200 nM). Finalmente no RSA, a taxa de crescimento (TC) e porcentagem de supervivência (PS) do isolado de referência foi 2,92 e 4,19%, respectivamente, frente a 700 nM de DHA. O mesmo isolado pressionado com 3.500 nM de LMF apresentou 3,6 de TC e 2,25% de PS. A avaliação microscópica dos ensaios de sensibilidade ex-vivo e in vitro subestima a resposta de P. falciparum à terapia combinada com artemisinina (ACT). Nossos resultados sugerem que a dormência, principal mecanismo de tolerância às artemisininas (ART), não aconteceria em todos os isolados clínicos de P. falciparum. A citometria de fluxo avaliou com acurácia a viabilidade parasitária. No presente estudo, pela primeira vez foi reportada a dormência de P. falciparum à LMF / The phenotypic characterization of Plasmodium falciparum is useful for the knowledge of parasite sensitivity against antimalarial used in endemic countries. In this study we evaluated the sensitivity of clinical isolates of P. falciparum from the African continent and the Caribbean. The sensitivity to dihydroartemisinin (DHA: 4 - 1,000nM), artesunate (AS: 0.1 - 100 nM), lumefantrine (LMF: 3.1 to 200 nM), and mefloquine (MFQ: 0.2 to 1,000 nM) was investigated through four techniques: (a) ex vivo and in vitro microtests, (b) dormancy assay, (c) flow cytometry assay and (d) survival assay using young trophozoites (Ring Stage Survival Assay - RSA). In the ex vivo and in vitro experiments, the IC50 was calculated and was 0.4 - 66.6 nM for DHA; 3.8 - 48.8 nM for LMF; 0.3 - 25.9 nM for AS and 2 - 439 nM for MFQ. According to dormancy assays, schizonts were observed in the P. falciparum reference isolate NF54 and in the clinical isolate S-01/15 after pressure with 62.5 nM, 250 nM and 1,000 nM DHA. The recovery period ranged from 4 to 40 days. For LMF was observed the growth to the schizont stage in NF54, in the days 7 e 12 after exposure to 66.6 nM and 200 nM of the drug, respectively. Schizonts were seen in the P. falciparum clinical isolate FS-08/15 after pressure with 100 nM of AS, right after incubation period, with no dormancy of trophozoites. In flow cytometry assays, viable young trophozoites of P. falciparum labeled with DAPI and Rhodamine 123 were observed at the maximum concentrations of DHA (1,000 nM) and LMF (200 nM). Finally in RSA, the growth rate (GR) and percentage of survival (PS) of the reference isolate was 2.92 and 4.19%, respectively, after pressure with 700 nM of DHA. The same isolate pressed with 3,500 nM of LMF presented GR of 3.6% and PS of 2.25%. In conclusion, microscopic evaluation of ex vivo and in vitro sensitivity tests underestimates the P. falciparum response to artemisinin-based combination therapy (ACT). Our results suggest that the dormancy, main mechanism of tolerance to artemisinin (ART), is not presented in all clinical isolates of P. falciparum. Flow cytometry was able to confirm the parasite viability accurately. In this study, for the first time the dormancy of P. falciparum after pressure with LMF was reported