L’ARN est sans aucun doute la molécule biologique la plus versatile qui soit. Tout comme l’ADN, il peut contenir et transmettre de l’information génétique. Tout comme les protéines, il peut accomplir une multitude de fonctions biologiques. De plus, son rôle le plus connu demeure celui d’intermédiaire entre l’ADN et les protéines. L’ARN est donc au cœur d’un bon nombre de processus biologiques. Ceci lui confère un immense potentiel thérapeutique qui jusqu’à présent demeure largement inexploité. Pour accomplir ses fonctions, l’ARN doit adopter une structure tridimensionnelle précise qui est dépendante à la fois de sa séquence et de son environnement. Ainsi, en modifiant la structure d’un ARN, il est possible d’en moduler sa fonction. C’est l’objectif global des travaux présentés dans cette thèse. Pour y parvenir, de courts oligonucléotides antisens (OA) ont été utilisés. Cette stratégie revêt plusieurs avantages. Comme les OA s’apparient à leur cible en formant des paires de bases Watson-Crick, ils offrent une grande spécificité et leur design est facile. De plus, en se fiant aux données structurales et aux logiciels de prédictions de structures des ARN, on peut aisément identifier les régions à cibler avec les OA. Enfin, cette technique est versatile puisqu’on peut cibler différents motifs d’ARN. La première cible a été le ribozyme du virus de l’hépatite D. Cet ARN, qui catalyse une réaction d’auto-coupure, a été modifié afin que son activité devienne dépendante à la liaison d’OA. Plusieurs modules ont ainsi été créés et combinés afin d’obtenir des ribozymes qui répondaient à la présence d’un ou plusieurs OA. En insérant ces interrupteurs moléculaires dans les régions non traduites d’un ARNm, nous avons ainsi modulé l’expression de ce gène avec les OA. Cet outil a des applications intéressantes pour la régulation de gènes en biologie synthétique. Un autre motif ciblé a été le G-quadruplex (G4). Cette structure non canonique exerce de nombreuses fonctions biologiques et représente donc une cible thérapeutique intéressante. Lorsque présent dans la région 5’ non traduite d’un ARNm, le G4 mène généralement à une diminution de la traduction. En utilisant des OA qui empêchent la formation du G4, nous avons été en mesure d’augmenter la traduction du gène ciblé. De plus, il a été possible de développer des OA qui favorisent la formation d’un G4 dans le but de diminuer l’expression de la cible. Finalement, dans le dernier chapitre de cette thèse, il est démontré que les G4 présents dans les microARN primaires influencent leur maturation en microARN matures. Des OA ciblant ces G4 ont été utilisés afin de favoriser la maturation de microARN suppresseurs de tumeurs, ce qui présente un potentiel thérapeutique intéressant. En bref, les travaux présentés dans cette thèse démontrent clairement que les OA sont un outil de choix pour cibler et modifier la structure de motifs d’ARN spécifiques. / Abstract : RNA is a versatile biological molecule. Like DNA, it can contain and transmit genetic information. Like proteins, it can accomplish multiple biological functions. Also, its most known role remains that of intermediary between DNA and proteins. RNA is thus a key player in many biological processes. This gives it an immense therapeutic potential which remains largely untapped. To fulfill its functions, RNA must adopt a precise threedimensional structure that is dependent on both its sequence and its environment. Thus, by modifying the structure of an RNA, it is possible to modulate its function. This is the overall objective of the work presented in this thesis. To achieve this, small antisense oligonucleotides (ASO) have been used. This strategy has several advantages. As ASO bind their target with Watson-Crick base pairs, they offer great specificity and their design is easy. Moreover, reliance on structural data and RNA structure prediction softwares makes it easy to identify the regions to be targeted with ASO. Finally, this technique is versatile since it is possible to target different RNA motifs. The first target was the HDV self-cleaving motif. This RNA, which catalyzes a self-cleaving reaction, has been modified so that its activity became dependent on the binding of ASO. Several modules were thus created and combined in order to obtain ribozymes which responded to the presence of one or more ASO. By inserting these molecular switches into an mRNA’s UTR, the expression of this gene was modulated with the ASO. This has interesting applications for the regulation of genes in synthetic biology. Another target motif was the G-quadruplex (G4). This non-canonical structure exerts many biological functions and therefore represents an interesting therapeutic target. When present in the mRNA’s 5’UTR, G4 generally lead to a decrease in translation. Using ASO that prevent G4 formation, we were able to increase the translation of the target gene. In addition, it has been possible to develop ASO which promote the formation of a G4 in order to decrease the expression of the target. Finally, in the last chapter of this thesis, it is demonstrated that the G4 present in the primary microRNAs influence their maturation in mature microRNAs. ASO targeting these G4 have been used in order to promote the maturation of tumor suppressor microRNAs, which has an interesting therapeutic potential. The work presented in this thesis clearly demonstrates that ASO are ideal for targeting and altering the structure of specific RNA motifs.

La maladie de Huntington (MH) est causée par une expansion de répétitions CAG sur l’exon 1 du gène huntingtine (htt), codant pour une protéine mutée. Il a été montré que la diminution d’expression de cette protéine est une piste thérapeutique très prometteuse. Dans ce projet, nous avons étudié et comparé trois approches dites «antisens» : une stratégie allèle non-spécifique, visant à diminuer de manière générale l’expression de htt ; une stratégie allèle spécifique ciblant les répétitions CAG afin d’impacter préférentiellement l’allèle muté ; et enfin une stratégie de saut d’exon permettant d’enlever des sites de clivage à l’origine d’une forme raccourcie et toxique de la protéine htt. Nous avons évalué ces approches grâce à deux outils différents : les tricyclo-DNA (TcDNA), qui sont une nouvelle classe d’oligonucléotides antisens (AON) plus performante que les chimies précédentes, et le système U7snRNA vectorisé, permettant d’induire une expression stable des séquences antisens. Dans un premier temps, ces différentes molécules ont été évaluées in vitro dans des lignées de fibroblastes de patients en quantifiant le niveau d’ARNm et de protéines htt par RTqPCR et Western blot respectivement. Par la suite, les séquences les plus efficaces in vitro ont été sélectionnées et les AON et AAV-U7snRNA correspondants ont été injectés en intracérébroventriculaire (ICV) dans un modèle murin de la MH (souris YAC128). Les résultats les plus encourageants ont été obtenus avec le TcDNA-NS (pour allèle Non Spécifique), permettant une diminution significative de l’expression de htt dans le cortex, l’hippocampe et le striatum 2 et 6 semaines après une injection ICV. Ces résultats prometteurs suggèrent le potentiel des TcDNA comme nouvel outil thérapeutique pour la MH. / Huntington’s disease (HD) is caused by a CAG repeat expansion in the exon 1 of huntingtin gene (htt), encoding for a mutant protein. It has been shown that the silencing/down regulation of huntingtin protein is a promising therapeutic lead. In this project, I have explored and compared three strategies using the antisense approach: a non-allele specific strategy, aiming to silence the global expression of htt; an allele specific strategy targeting CAG repeats to silence preferentially the mutant allele; and an exon-skipping strategy in order to remove cleavage sites which originally cause a shorter and toxic form of the htt protein. These strategies have been evaluated using two different tools: tricyclo-DNA (TcDNA), a new class of antisense oligonucleotides (AON) more efficient than the previous chemistries, and a vectorized approach using U7snRNA system allowing a stable expression of antisense sequences. Firstly, these different molecules have been assessed in vitro in HD fibroblasts quantifying mRNA and htt protein levels with RTqPCR and Western blot respectively. Subsequently, the most efficient sequences have been selected and intracerebroventricular (ICV) injections have been performed with corresponding AON and AAV-U7snRNA in a HD mouse model (YAC128). The most encouraging results have been obtained with the TcDNA-NS (for Non Specific allele), allowing a significant decrease of htt expression in cortex, hippocampus and striatum 2 and 6 weeks after ICV injection. These promising results suggest the potential of TcDNA as a new therapeutic tool for HD.

Selon les estimations de l'OMS, le bilan mondial du paludisme a atteint 212 millions de cas et 429 000 décèsen 2015 (OMS, 2016). Cette gravité est principalement due à Plasmodium falciparum. A l’heure actuelle, P. falciparum présente des résistances à tous les antipaludiques donnés en monothérapie.Par conséquent, pour réduire le risque d’échec thérapeutique, l'OMS a recommandé depuis 2001 l’utilisation de bithérapie, notamment d'Artemisinin Combination Therapy (ACT), comme traitement de première intention.Les ACT sont composés essentiellement d’un dérivé d’artéminisine, à demi-vie courte et un autre antipaludique à demi-vie longue, connu en monothérapie.Le parasite a également montré des signes de résistance aux ACT, principalement en Asie du Sud-est, menaçant les programmes d’éradications contre le paludisme.La découverte de nouveaux composés à activité antipaludique ou de nouvelles procédures de traitement sont urgentes.La valorisation d’anciennes molécules est également au cœur des études afin d’améliorer notamment leur biodisponibilité et réverser les mécanismes de résistance du parasite. Ainsi, des études prouvent l’intérêt de l’utilisation de nanotechnologies pour l’amélioration de l’efficacité d’antipaludiques. L’atovaquone en est un exemple, cette modification a notamment permis d’améliorer sa biodisponibilité. Notre étude a porté sur une de ces formulations, de l’atovaquone encapsulée dans une nanoémulsion cationique (NE) appelée ATQ. Une deuxième génération a ensuite été testée par association d’oligonucléotides antisens anti-ARNm de topoisomérase II(AST) de P. falciparum. En effet, des stratégies antisens thérapeutiques font leur preuve en santé humaine et présentent un intérêt croissant en parasitologie. Les NE/AST ont montré une activité anti-palustre spécifique contre P. falciparum in vitro. Leur spécificité a permis d’aboutir à l’arrêt du cycle cellulaire et une forte diminution du taux d’ARNm de la topoisomérase II. Ce phénomène a montré être dépendant de l’action de la RNase H. Un effet synergique de ces NE/AST a également été montré en association avec la chloroquine, l’atovaquone et la dihydroartémisinine sur une souche sensible de P. falciparum et des souches résistantes aux antipaludiques précédemment cités.L’ATQ a également montré une forte efficacité sur une souche résistante à l’atovaquone d’un facteur 5. En présence d’ATQ, la mitochondrie a rapidement été altérée conduisant à une mort précoce du parasite. Un traitement à l’ATQ a abouti à la guérison de souris Swiss infectée par P. berghei après deux injections en i.v. en 5 jours. Enfin, l’ATQ/AST a montré une efficacité in vitro contre P. falciparum et P. berghei in vivo. Un test de cytoadhérance des hématies parasitées a des cellules endothéliales a révélé un fort pourvoir d’inhibition de la cytoadhérance de l’ATQ/AST.Un résultat prometteur dans le cadre de traitement du neuropaludisme. / According to the estimations of theWHO, in 2015, 212million cases ofmalariahave been reported(WHO,2016). These figuresmakemalariathe most deadlyparasitic diseasein the world, with429.000deaths per year. Some treatments against Plasmodium falciparum exist. However, no really good treatment option can be found in monotherapy due to the resistance emergency. Therefore To reduce the risk of resistance, WHO has recommended since 2001 combination therapies, which is basically an Artemisinin Combined Therapy (ACT), as first-line treatment. The main problem of commercialized bi-therapy is that they are composed of two molecules with individual resistance which leaded to the emergence of resistance to the latest ACTs such as a dihydroartemisinin /piperaquine combinationmainly in South-East Asia.Thus the use of new therapeutic combination strategy that can bypass the parasites' mechanisms of resistance is urgent to effectively treat malaria. As the pathway from drug discovery to drug commercialization is both long and very expensive, it is essential to develop ways to improve existing antimalarial treatments. In the first place it’s necessary to find a new antimalarial formulation based on an already commercialized drug to modify its biodisponibility and its mechanism of action in order to revert the resistance. In the second place its necessary to associate this formulation with a novel none commercialized antimalarial strategy such as the antisens oligonucleotides already usedinhumanhealth. In our lab we have developed nanoemulsions containing atovaquone and antisense oligonucleotides anti topoisomerase II against P. falciparum.Nanoemulsionsvectoringantisens oligonucleotidesandused againstP. falciparum topoisomerase II(NE/AST) showed encouraging anti-parasite killing results.Additionalresultshave showna synergistic in vitro effectwithantimalarial drugs(chloroquine, dihydroartemisinin and atovaquone) in sensitive and resistances strains. Moreover NE/ASTrestricted Topoisomerase II gene expression and blocked the cell cycle in G2/M phase leading to parasite’s death by mitophagy.As Drug delivery systemscan improve the efficacy ofcommon antimalarial drugs by delivering the drug to its target, while protecting it from degradation in biological environment and increasing its biodisponibility, our nanoemulsions containing atovaquone (ATQ) leaded to reversion of atovaquone resistance with 5 fold decrease in its IC50. Observations made with confocal microscopy have shown mitochondrial alteration after ATQ treatment.Our novel and original bi-therapy is focused on the association ofATQ with NE/AST (ATQ/AST).We obtained an IC50 8-fold lower than atovaquone’s IC50with total inhibition of parasites’ capacity to reinfect new red blood cells. A cytoadherence test of parasitized erythrocytes to endothelial cells revealed a strong capacity of cytoadherence inhibition of ATQ / AST, a promising result in the treatment of cerebral malaria.

Die Graft-versus-host-Disease (GvHD) zeichnet sich dadurch aus, dass bei einer Gewebetransplantation (Transplantation des Knochenmarks) die transplantierten Zellen des Donors vom Empfänger abgestoßen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein möglicher gentherapeutischer Ansatz mittels Nutzung von Oligonukleotiden untersucht. Diese beruhen u.a. auf der Inaktivierung reifer T-Zellen des Spenders, welche Gewebe als fremd erkennen und schwere Entzündungen hervorrufen. Die Aktivierung der T-Zellen erfolgt über die Bindung des CD4-Moleküls und des kostimulatorischen Rezeptors CD28 an den MHCII Komplex von antigen-präsentierenden Zellen des Empfängers. Die Inaktivierung der CD4 und CD28 Gene, und somit die Hemmung der T-Zellaktivität des Spenders, erfolgte durch antisense Oligonukleotide (AONs) und durch small interfering RNAs (siRNA). Zur effizienten und sicheren Einschleusung (Transfektion) der Oligonukleotide in die Zielzellen wurden Nanopartikel verwendet. Die Wirkung wurde zunächst in vitro an murinen und humanen Zellen und anschließend in vivo an einem GvHD-Mausmodell (allogen, transgen) untersucht. In den Mausmodellen wurden weiterhin zwei Applikationsschemata gewählt, zum einen die Behandlung der Spenderzellen ex vivo und zum anderen die direkte i.p.Applikation der Oligonukleotide in die Maus. Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen: Eine verminderte Expression der Oberflächenmoleküle CD4 und CD28 erfolgte nach Gabe zweier funktioneller AONs mit muriner Sequenz, in vitro. In murinen Milzzellen ließ sich durch diese beiden funktionellen AONs die Produktion der pro-inflammatorischen Zytokine Interferon γ (IFNγ) und Tumornekrosefaktor α (TNFα) hemmen. Zusätzlich bewirkte der Einsatz eines AON und einer siRNA mit einer funktionellen humanen Sequenz eine Hemmung der CD4 Expression in humanen PBMCs. Insbesondere die kombinierte Behandlung mit a-CD4 und a-CD28 AONs zeigte im murinem allogenen GvHD Modell einen signifikant positiven Effekt auf das Überleben sowie die Krankheitssymptome der Versuchstiere. Der positive Effekt konnte ebenso durch eine Reduktion von pro-inflammatorischen Zytokinen und einer verminderten Expression der Oberflächenmoleküle CD4 und CD28 bestätigt werden. Ähnlich wie das allogene Modell zeigte auch das CD4 transgene Modell positive Effekte hinsichtlich des Überlebens und der Herunterreglierung pro-inflammatorischer Zytokine. Anschließend erfolgten Studien zur Lokalisation (Biodistribution) der Nanopartikel-Nukleinsäure-Komplexe und die Untersuchung der Seren auf allgemeine Leber- und Nieren-toxische Schäden. Sie führten zu folgenden Ergebnissen: Unabhängig von der Applikationsart (i.p. und i.v.) befanden sich nach 24h die Komplexe hauptsächlich in der Lunge. Ebenfalls ließen sich relevante Mengen im Knochenmark und im Dünndarm der transplantierten Tiere nachweisen. Diese beiden Gewebe sind besonders interessant für therapeutische Ansätze zur Behandlung einer aufkommenden GvHD. Unabhängig von der Art der Komplexierung (AON ± PEI) wurde ein Anstieg Anstieg der Aspartat-Aminotransferase (lebertoxischer Parameter) und Glukose beobachtet. Generell scheint die Behandlung der GvHD mittels Oligonukleotide erfolgreich zu sein, neben der geigneten funktionellen Sequenz muss jedoch die chemische Modifikation der Oligonukleotide und die zielgerichtete Biodistribution in vivo evaluiert werden.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................... iii 1 Einleitung ................................................................................................ 1 1.1 Prinzipien der Gentherapie ................................................................. 1 1.1.1 Mechanismen der Gentherapie ....................................................... 2 1.1.2 Methoden des Transfers therapeutischer Nukleinsäuren ................ 8 1.2 Graft-versus-Host-Disease .................................................................. 11 1.2.1 Pathologie ....................................................................................... 11 1.2.2 Klinik und Methoden zur Behandlung der GvHD ............................. 14 1.2.3 GvHD-Modelle ................................................................................. 17 1.3 Zielstellung........................................................................................... 19 2 Material & Methoden ................................................................................ 20 2.1 Design funktioneller Oligonukleotide .................................................... 20 2.2 In vitro Zellkultur .................................................................................. 21 2.2.1 Zelllinien und primäre Immunzellen ................................................. 21 2.2.2 Stimulation und Transfektion ........................................................... 23 2.3 In vivo GvHD Modell ............................................................................ 24 2.3.1 Zeitlicher Ablauf und Durchführung ................................................. 25 2.3.2 Begleitendes klinisches Monitoring & Probenentnahme ................. 29 2.4 Funktionellen Messungen .................................................................... 30 2.4.1 Quantitative mRNA Expression ....................................................... 30 2.4.2 Proliferationstest ............................................................................. 33 2.4.3 Differentialblutbild ............................................................................ 34 2.4.4 Histologie ........................................................................................ 35 2.4.5 Serummessung ............................................................................... 36 2.4.6 Durchflußzytometrie ........................................................................ 37 2.5 Statistik ................................................................................................ 39 3 Ergebnisse ............................................................................................... 40 3.1 Anwendung funktioneller Oligonukleotide in vitro ................................ 40 3.2 Anwendung funktioneller Oligonukleotide in vivo ................................. 49 3.2.1 Indirekte ex vivo Applikation ............................................................ 50 3.2.2 Direkte in vivo Applikation im murinem allogenen Modell ............... 69 3.3 Pharmakologie in vivo applizierter Nukleinsäure-Komplexe ............ 77 3.3.1 Biodistribution .................................................................................. 77 3.3.2 Toxikologie ...................................................................................... 81 4 Diskussion ............................................................................................... 85 4.1 Anwendung funktioneller Oligonukleotide in vitro ................................ 85 ii 4.2 Indirekte ex vivo Applikation zur Prävention der GvHD ....................... 89 4.2.1 allogenes Tiermodell ....................................................................... 89 4.2.2 transgenes Tiermodell ..................................................................... 93 4.3 Therapeutischer anti-GvHD Oligonukleotid-basierter Ansatz (in vivo Applikation) .......................................................................................... 94 4.4 Biodistribution applizierter Oligonukleotide .......................................... 96 4.5 Untersuchung unspezifischer Toxizität nach in vivo Applikation .......... 98 Zusammenfassung der Arbeit ............................................................................. 101 Anhang ................................................................................................................. vii 5 Literaturverzeichnis .................................................................................. xxi 6 Tabellenverzeichnis ................................................................................. xxxiv 7 Abbildungsverzeichnis ............................................................................. xxxiv

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24192号 / 医博第4886号 / 新制||医||1060(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 萩原 正敏, 教授 森信 暁雄, 教授 遊佐 宏介 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24996号 / 医博第5030号 / 新制||医||1069(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 齊藤 博英, 教授 滝田 順子, 教授 小川 誠司 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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