O Abortamento de repetição (AR) é uma condição patológica definida pela ocorrência de duas ou mais perdas gestacionais consecutivas. Estima-se que esta desordem acometa 5% dos casais em idade reprodutiva. Esta condição clínica é classificada em dois subtipos clínicos: AR primário e AR secundário. Apesar dos esforços em investigar as causas desta desordem obstétrica, estima-se que em 50% dos casos a etiologia do AR permanece desconhecida. A reprodução humana implica em um paradoxo imunológico fundamental: no qual o feto representa uma entidade estranha ao sistema imune materno, sendo constituído por metade de material genético paterno, no entanto, de forma fascinante este não é rejeitado. Sendo assim, a aceitação materna do feto é um evento único e demonstra como o sistema imune materno remodela-se e tolera a presença de células invasivas semi-alogênicas no útero. Casos de AR, pré-eclâmpsia (PE), entre outras desordens gestacionais, levam a uma questão retórica; ‘Porque a mãe rejeitou o feto?’. No entanto, considerando as gestações saudáveis e as complexas interações que ocorrem na interface materno-placentária, talvez, a intrigante e fascinante questão correta que ainda permanece é ‘Porque a mãe não rejeitou o feto?’. Existem muitos mecanismos que protegem o feto de um possível ‘ataque’ do sistema imune materno das quais podemos citar: (i) a baixa expressão de moléculas clássicas de classe I do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) na interface materno-placentária, (ii) a expressão diferencial de moléculas não clássicas de classe I do MHC nas células do trofoblasto, como HLA (antígeno leucocitário humano)-E, HLA-F e HLA-G, (iii) a apoptose de células do sistema imunológico ativadas, entre outras. A morte celular programada ou apoptose é essencial ao desenvolvimento e funcionalidade dos organismos multicelulares. Os mecanismos apoptóticos mais reconhecidos pela efetividade em desencadear a morte celular são: o sistema FAS-FAS-L (via extrínseca) e BAX-BCL-2 (via intrínseca). A molécula do HLA-G, descrita por sua versatilidade imunológica, é essencial na gestação e neste cenário é descrito que, além de contribuir essencialmente na imunotolerância materna, também atua nos processos de angiogênese, apoptose e consequente remodelação tecidual da decídua materna. Considerando que os eventos apoptóticos estão presentes nas diversas etapas da gestação, desde a concepção até o nascimento, e que constituem diferentes interações de proteínas apoptóticas e anti-apoptóticas específicas para manter a adequada homeostasia celular e tecidual, o presente estudo visa: (i) a compreensão dos principais genes envolvidos neste processo e (ii) o entendimento da contribuição destes na predisposição à recorrência de abortamentos, em um estudo de carácter caso-controle. No total, 138 mulheres diagnosticadas com AR e 156 mulheres saudáveis com mais de dois filhos, sem histórico de complicações gestacionais foram incluídas neste estudo. Os genes e variantes polimórficas analisados no estudo a menos diferentemente especificado correspondem a variações presente na região promotora, são: FAS (rs1800682, rs763110), FASL-L (rs5030772, rs763110), BAX (rs4645878), BCL-2 (rs2279115) e HLA-G [região 3̍ UTR (região não traduzida) (rs66554220, rs1707, rs1710, rs17179101, rs17179108, rs1063320, rs9380142 e rs1610696)]. Como conclusão, no presente estudo nós não observamos a associação destas variantes ao AR na população estudada. No entanto, algumas ressalvas a respeito deste estudo devem ser mencionadas, são estas: (i) a heterogeneidade genética da população estudada, (ii) o tamanho amostral e (iii) o critério clínico para o diagnóstico do abortamento de repetição como 2 (duas) ou mais perdas gestacionais consecutivas. Portanto, o papel destas variantes genéticas na predisposição ao AR não deve ser descartada e necessitam ser confirmadas em estudos posteriores. Como perspectivas, no intuito de gerar evidências mais satisfatórias sobre o ofício destas variantes genéticas na fisiopatologia do AR, estudos com adequado tamanho amostral capaz de detectar tais efeitos funcionais destas variantes, bem como em diferentes populações são fortemente recomendados. / Recurrent miscarriage (RM) or recurrent pregnancy loss (RPL) is a pathological condition defined by occurrence of two or more consecutive pregnancy losses. It is estimated that about 5% of couples in reproductive age are affected by RM. This clinical condition is classified in two subtypes: primary and secondary RM. In despite of the efforts to investigate the causes of RM, approximately 50% of cases the etiology of RM remains unknown. Human reproduction involves a fundamental immunological paradox: in which the fetus is seem as foreign entity to the maternal immune system, consisting of half maternal and half paternal genetic material origin; however, in a fascinating way the fetus is not rejected. Thus, maternal-fetal acceptance is a unique example and demonstrates how the maternal immune system shapes and tolerates up the presence of invasive semi-allogeneic cells in utero. Obstetric disorders such as RM, preeclampsia (PE) and other pregnancy complications, lead to a rhetorical question: 'Why the mother rejected the fetus?'. However, considering all healthy pregnancies and complex interactions that occur in the maternalplacental interface, perhaps the intriguing question that remains is 'why the mother did not reject the fetus?’ there are many mechanisms that protect the fetus of a possible 'attack' from maternal immune system. Among them we can cite: (i) the low expression of classical class I molecules of the major histocompatibility complex (MHC) in maternalplacental interface, (ii) the differential expression of non-classical class I molecules MHC on the trophoblast cells such as HLA (human leukocyte antigen)-E, HLA-F and HLA-G, (iii) tryptophan catabolism by the enzyme indoleamine (2,3)-dioxigenase, (iv) regulation of the complement system in maternal-placental interface and (v) apoptosis of maternal activated immune system cells. Programmed cell death or apoptosis is essential to development and function of multicellular organisms. Apoptotic mechanisms recognized for the effectiveness in triggering cell death are: FAS-FAS-L system (extrinsic pathway) and BAX-BCL-2 (intrinsic pathway). HLA-G molecule is described by its immunological versatility being essential to establishment of a healthy gestation. The HLA-G contributes primarily to maternal immunotolerance and is related to many process, such as angiogenesis, apoptosis and consequently to tissue remodeling of maternal decidua. Since the apoptotic events are present at different stages of pregnancy, from conception to birth, and considering different interactions of apoptotic and specific anti-apoptotic proteins to maintain a suitable cellular and tissue homeostasis, this study aims to: (i) the understanding of key genes involved in the apoptotic process and (ii) the understanding of these genes in the predisposition to recurrent miscarriages, in a case-control study. A total of 138 women diagnosed with RM and 156 healthy women with more than two children with no history of pregnancy complications were included in this study. All polymorphic variants of candidate genes analyzed in the study unless otherwise specified correspond to variations in the promoter region. The variants assessed in study are: FAS (rs1800682, rs763110), FASL-G (rs5030772, rs763110), BAX (rs4645878), BCL-2 (rs2279115) and HLA-G [region 3̍ UTR (untranslated region) (rs66554220, rs1707, rs1710, rs17179101, rs17179108, rs1063320, rs9380142 and rs1610696)]. In conclusion, we did not observe the association of these variants to the RM risk in the present population. However, some caveats about this study should be mentioned, such as (i) the genetic heterogeneity of the study population, (ii) the sample size and (iii) the clinical criteria for the diagnosis of recurrent miscarriage as two (2) or more consecutive pregnancy losses. Therefore, a definitive conclusion on the role of these genetic variants in the predisposition to RM should not be dismissed and should be further confirmed in future studies. As prospects to generate more satisfactory evidence about the role of these genetic variants in the pathophysiology of RM, further studies with adequate sample size capable of detecting such functional effects of these variants as well as in different populations are strongly recommended.

As heme oxigenases catalisam a degradação do grupo heme produzindo bileverdina, monóxido de carbono (CO) e ferro. A heme oxigenase I (HO-1) é a isoforma indutível e está dentro do grupo das proteínas de choque térmico. A expressão dessa enzima é desencadeada como resultado de diversos estímulos de estresse. Evidências presentes na literatura sugerem um papel fundamental da HO-1 no crescimento e morte celular. Apesar da maioria das evidências confirmarem o efeito citoprotetivo (anti-apoptótico) da HO-1, ainda existem muitas controvérsias a esse respeito. Já foi demonstrado que a HO-1 pode exercer diferentes efeitos na sobrevivência celular incluindo a indução de apoptose, dependente dos níveis de expressão da enzima bem como do tipo celular. A linhagem célular pré-monocítica, U937, e a linhagem celular linfoblástica, Jurkat, foram submetidas a restrição de soro mais hemina 20μM (grupo heme oxidado, indutor de HO-1), durante diferentes tempos, e a quantidades crescentes de hemina durante 24h sem restrição de soro. Após 12h, ambas as linhagens celulares demonstraram, no tratamento envolvendo restrição de soro mais hemina, um aumento significativo (p<0,001) na atividade de caspase 3/7 (U937, 135 pmol/min/mg proteina, e Jurkat, 384 pmol/min/mg proteina) quando comparado aos controles. A adição do inibidor específico de HO-1, zinco II protoporfirina IX (ZnPP), resultou em um diminuição significativa (p<0,001) na atividade de caspase 3/7 (U937, 70 pmol/min/mg proteina, and Jurkat, 150 pmol/min/mg proteína), demonstrando um papel ativo da HO-1 na apoptose induzida pelo tratamento que empregou restrição de soro mais hemina. As linhagens celulares mostraram comportamentos distintos quando tratadas com quantidades crescentes de hemina, de forma que não se atingiu a super-expressão da enzima HO-1. A linhagem celular Jurkat apresentou uma regulação negativa na expressão de HO-1 em quantidades crescentes de hemina, resultado esse sem precedentes na literatura, indicando uma regulação diferenciada dessa enzima nessa linhagem celular. Esses resultados indicam que a atividade de HO-1 é importante para manter os altos níveis de caspase 3/7. Portanto, no sistema de estresse gerado pela restrição de soro mais hemina, a HO-1 estaria agindo como um regulador positivo da apoptose.

O ditelureto difenila (DTDF) é um protótipo para o desenvolvimento de novas moléculas biologicamente ativas. Estudos prévios caracterizaram o efeito citotóxico dessa molécula em fibroblastos de pulmão de hamster chinês (células V79) mas os mecanismos relacionados à redução da viabilidade pelo DTDF são pouco conhecidos. Portanto, neste trabalho foi investigado o tipo de morte celular provocada pelo DTDF, sua influência no ciclo celular e sua possível interação com enzimas topoisomerases empregando células V79 e a levedura Saccharomyces cerevisiae como modelos biológicos de estudo. Conforme esperado, houve redução da viabilidade celular após o tratamento DTDF observada pelo ensaio MTT. A análise morfológica por coloração diferencial mostrou ocorrência de células apoptóticas e necróticas. Um aumento da atividade da enzima caspase 3/7 confirma a indução de apoptose pelo DTDF. Foi observada parada na progressão do ciclo celular na fase S e em sub-G1. A interação com topoisomerases foi verificada pelo teste de micronúcleo (MN) em células V79 onde foi verificado um possível potencial intercalante do DPDT. Linhagens de levedura deficientes em Top1p apresentaram maior tolerância ao DTDF em relação à linhagem selvagem, sugerindo que a interação com a enzima pode estar envolvida na toxicidade do DTDF. A sensibilidade ao DTDF encontrada na linhagem top3Δ indica que Top3p pode participar na reparação das lesões do DNA induzidas por este composto. Os nossos resultados sugerem que a diminuição da viabilidade celular pode ser atribuída à interação do DTDF com enzimas topoisomerases, levando a formação de quebras no DNA com consequente parada no ciclo celular e morte celular por apoptose/necrose. / The diphenyl ditelluride (DPDT) is a prototype for the development of new biologically active molecules. In previous studies, this organotelluride has shown an elevated cytotoxicity in lung fibroblast cell line derived from Chinese hamster (V79 cells), but the mechanisms for reduction of cell viability still remain unknown. Therefore, in this study we investigate the type of cell death induced by DPDT, the influence on cell cycle and its possible interaction with topoisomerase enzymes using V79 cells and the Saccharomyces cerevisiae yeast as biological models of study. As expected, there was a reduction in cell viability after DPDT treatment observed by MTT assay. Morphological analysis showed significant elevation in apoptotic and necrotic cells. An increase of caspase 3/7 activity confirms the apoptosis induction by DPDT. The arrest in the progression of the cell cycle in S phase and in sub-G1 was observed. The interaction with DNA topoisomerases was verified by the micronucleus test (MN) in V79 cells, which showed a possible intercalating potential of DPDT. Yeast strain deficient in Top1p showed higher tolerance to DPDT in relation to the wild type isogenic strain, suggesting that the interaction with this enzyme could be involved in the toxicity of DPDT. The sensitivity to DPDT found in top3Δ strain indicates that Top3p could participate in the repair of DNA lesions induced by this compound. Our results suggest that the decrease in cell viability can be attributed to interaction of DPDT with topoisomerases enzymes, leading to formation of DNA breakage and consequent cell cycle arrest and cell death by apoptosis / necrosis.

Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-04-17T13:32:41Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSertaçao MARIA Rodrigues.pdf: 1663164 bytes, checksum: 66dfcc4e829af7fa8b8c01548a1f3bea (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T13:32:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSertaçao MARIA Rodrigues.pdf: 1663164 bytes, checksum: 66dfcc4e829af7fa8b8c01548a1f3bea (MD5) Previous issue date: 2013 / CNPq FACEPE / Os compostos 4 - tiazolidinonas tem despertado grande interesse pela sua diversidade estrutural e descoberta de um grande número de atividades biológicas. O presente estudo avaliou a atividade citotóxica de novos derivados de 4- tiazolidinonas dos quais seis foram considerados ativos com percentual de inibição de crescimento celular superior a 75% pelo teste do MTT. Os compostos foram testados nas seguintes linhagens de células tumorais humanas: NCI-H 292 (carcinoma mucoepidermóide de pulmão); HT – 29 (carcinoma humano do cólon, HEp – 2 (carcinoma epidermóide de laringe); HL- 60 (leucemia promielocítica aguda) e K562 (leucemia mielocítica crônica). Nos seis compostos considerados ativos foi realizado o estudo da concentração que inibe 50% do crescimento celular (IC50) em sete concentrações seriadas que variaram de 0,39 a 25 μg/mL. O análogo 2-[(2-piridinyl-metileno)hydrazono]-4-thiazolidinonas (composto 2) apresentou melhores resultados com valores de IC50 entre 0,5 e 3,3 μg/mL nas linhagens testadas e por esse motivo foi escolhido para prosseguir com o estudo sobre mecanismo de morte celular frente à linhagem de células tumorais HL-60, na qual apresentou menor valor de CI50 no tempo de 48 h (CI50 = 3,04 μg/mL). A doxorrubicina foi utilizada como controle positivo e apresentou CI50 de 48 horas igual a 0,03 μg/mL. O composto em estudo não apresentou atividade hemolítica frente a eritrócitos de camundongos apresentando concentração efetiva - EC50 > 250 μg/mL, sugerindo uma citotoxicidade por mecanismo de ação mais específico. No teste do Azul de Tripan foi observado que após 48 horas de incubação houve redução do número de células viáveis com percentual de inibição de 72,22% na concentração de 3 μg/mL e de 91,08% para a concentração de 6 μg/mL. A análise morfológica após coloração May- Grunwald- Giemsa indicou alterações celulares típicas de células em processo de apoptose (membrana íntegra, redução do volume celular, núcleo picnótico e cromatólise). A integridade da membrana celular e a fragmentação do DNA foram avaliadas por citometria de fluxo. Foi observado na concentração de 6 μg/mL que um grande percentual de células apresentou fragmentação do DNA e que pequeno número de células apresentou redução da integridade da membrana celular. Estes dados sugerem um mecanismo citotóxico por indução da via apoptótica e apontam o potencial citotóxico do composto 2.

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-07-13T17:15:42Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) tese edleneribeiro.pdf: 1980907 bytes, checksum: 2427c8e8ae36bd96b7ecdb2acc42e917 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-13T17:15:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) tese edleneribeiro.pdf: 1980907 bytes, checksum: 2427c8e8ae36bd96b7ecdb2acc42e917 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / FACEPE / A dietilcarbamazina (DEC) é um fármaco filaricida mais amplamente utilizado no tratamento e controle da filariose, e tem mostrado um potencial para tratamanto de doenças inflamatórias como resultado de sua interferência no metabolismo do ácido araquidônico, assim como inibindo fatores de transcrição e induzindo células inflamatórias à apoptose em doenças pulmonares. As doenças pulmonares principalmente as crônicas afetam milhares de pessoas em todo o mundo, representando um sério problema de saúde pública. Dentre as mais comuns podemos citar a asma, doença obstrutiva crônica, apneia obstrutiva do sono, doenças pulmonares ocupacionais, fibrose pulmonar e hipertensão pulmonar (HP), doenças graves e progressivas, que podem levar à incapacidade e à morte. Estima-se que a incidência anual de hipertensão pulmonar esteja em torno de um a dois casos por milhão de habitante, sendo uma doença grave e incapacitante e com sobrevivência histórica média de três a cinco anos após diagnóstico. Estudos demonstram que a HP apresenta cunho inflamatório, com presença no tecido pulmonar de infiltrados inflamatórios perivascular de macrófagos e linfócitos. O uso de modelo animais para avaliar o progresso da HP é extremamente importante, devido a sua complexidade, uma vez que se torna inviável o uso de material humano para tais análises, visto que, na maioria dos casos a doença é diagnosticada quando se encontra em estado avançado. Outro fato importante é a procura de novos potenciais fármacos, na busca de uma melhor qualidade de vida e quem sabe a cura da HP. Inicialmente investigamos o desenvolvimento da HP via inflamação em camundongos C57BL/6J com uma injeção intraperitoneal de monocrotalina (600 mg/kg) uma vez por semana durante 4 semanas (total de quatro doses) estabelecendo os grupos MCT7, MCT14, MCT21, MCT28 com o objetivo de compreender os padrões de reações teciduais e moleculares. A análise dos resultados mostraram que a monocrotalina promoveu alterações teciduais, aumento de citocinas inflamatórias de fatores de crescimento e do estresse oxidativo desempenhando um papel importante no desenvolvimento da HP em camundongos. Outro aspecto que avaliamos foi a ação da DEC sobre as alterações teciduais, deposição de colágenos e apoptose em modelo experimental de HP, estabelecendo os grupos MCT28 e MCT28/DEC. Observamos que a DEC reduziu as alterações teciduais, deposição de colágeno e aumentou os fatores relacionados a apoptose demonstrando resultados bastante satisfatórios. / The diethylcarbamazine (DEC) is a filaricide drug most widely used in the treatment and control of filariasis, and it has shown potential for treatment inflammatory diseases as a result of their interference with arachidonic acid metabolism, as well as inhibiting transcription factors and inducing inflammatory cells to apoptosis in lung diseases. Pulmonary diseases, especially chronics, affect thousands of people around the world, representing a serious public health problem. Among the most common pulmonary diseases there are asthma, chronic obstructive lung disease, obstructive sleep apnea, occupational lung disease, lung fibrosis and pulmonary hypertension (PH). They are severe and progressive disease, and can lead to disability and death. It is estimated that the annual incidence of pulmonary hypertension is around one to two cases per million inhabitants, and this is a serious disease, debilitating, and the historical median survival is of three to five years after diagnosis. Studies show that PH has inflammatory nature, and inflammatory perivascular infiltrates of lymphocytes and macrophages are present in the lung tissue. These injuries of the HP include medial hypertrophy of the arteries and pulmonary arterioles due to excessive proliferation of smooth muscle cells and fibrosis. The use of animal models to evaluate the PH progress is extremely important due to its complexity, since it is not feasible using human material for such analysis since, in most cases, the disease is diagnosed when it in advanced state. Another important fact is the search for new potential drugs to afford a better quality of life and perhaps the cure of PH. Initially we investigated the PH through developing inflammation in C57BL/6J mice with an intraperitoneal injection of monocrotaline (600 mg/kg) once a week for 4 weeks (total of four doses) setting the MCT7, MCT14, MCT21, MCT28 groups with order to understand the patterns of tissue and molecular reactions. The analysis of the results showed that the monocrotaline promoted tissue changes, increased inflammatory cytokine growth factors and oxidative stress plays, an important role in the development of PH in mice. Another aspect that we evaluated was the action of DEC on the tissue changes, collagen deposition and apoptosis in PH experimental model, establishing the MCT28 group and MCT28/DEC group. We noted that DEC reduced tissue changes, collagen deposition and increased factors related apoptosis demonstrating satisfactory results. Based on these results an aspect that we will also assess the DEC's action in chronic inflammation, noting that cytokines, transcription factors may be involved in the development and resolution of chronic lung disease.

A piplartina ou piperlongumina (PPLGM) é uma amida isolada de plantas do gênero Piper, da qual se obtêm as pimentas. As plantas desse gênero encontram-se distribuídas pelo mundo inteiro e têm sido utilizadas medicinalmente em diferentes culturas há muitos anos. A piplartina é o composto isolado desta espécie que mais se destaca, mostrando diferentes atividades biológicas e promissoras propriedades anticancerígenas. A resistência adquirida ao tratamento convencional é muito comum no câncer colorretal, na maioria dos casos devido à perda de função nas vias de apoptose e proteínas relacionadas ao ciclo celular. Sendo assim, buscou-se avaliar a capacidade da piplartina de induzir a morte celular na linhagem celular de carcinoma colorretal HCT 116. As células de HCT 116 selvagem e deficientes para as proteínas Bax, p21 e p53 foram tratadas com diferentes concentrações de piplartina, bem como a linhagem celular não tumoral Hek-293. Observou-se uma redução importante na viabilidade celular das células HCT 116, independentemente do estado de Bax, p21 e p53. As alterações morfológicas características de apoptose foram evidenciadas por coloração de Giemsa, microscopia eletrônica de varredura e coloração de laranja de acridina e brometo de etídeo. Para confirmar a indução de apoptose, foi realizado o ensaio de Anexina-V/PI, que evidenciou um aumento no percentual de células apoptóticas após o tratamento com piplartina, com o aumento da concentração relacionado ao aumento de células em apoptose tardia e pequeno aumento no número de células necróticas. A análise do ciclo celular mostrou alteração na distribuição tanto na linhagem selvagem quanto nas deficientes após o tratamento com a piplartina. Neste ensaio, o resultado mais expressivo foi o aumento de células na fase Sub-G0/G1, o que está relacionado à diminuição do conteúdo de DNA devido à fragmentação e indução de apoptose. Para avaliar a interação da piplartina com o DNA foram realizados ensaios com DNA plasmidial. Nesses ensaios, não foi observada interação direta da piplartina com o DNA, evidenciando sua ação indireta sobre o mesmo, que pode estar associado ao aumento de espécies reativas de oxigênio. Os dados aqui apresentados sugerem que PPLGM trata-se de uma molécula promissora na terapia de câncer colorretal. / Universidade de Caxias do Sul, UCS / Piplartine or piperlongumine is an amide isolated from plants of the genus Piper, from which the peppers is obtained. Plants of this genus are distributed all over the world, and have been used medicinally in different cultures for many years. From the isolated compounds found in these species, piperlongumine is the most outstanding, showing different biological activities and promising anticancer properties. Acquired resistance to conventional treatment is very common in colorectal cancer, in most cases due to loss of function in apoptotic methabolism and cell cycle protein regulation. Therefore, we sought to evaluate the ability of piperlongumine to induce cell death in HCT 116 colorectal carcinoma cell line. HCT 116 wild-type and lines deficient in Bax, p21 and p53 were treated with different concentrations of piperlongumine, as well as the non-tumor cell line Hek-293. A significant reduction in the cell viability of HCT 116 cells was observed, independent from Bax, p21 and p53 status. The morphological alterations from apoptosis were evidenced by Giemsa staining, scanning electron microscopy and acridine orange and ethidium bromide staining. To confirm apoptosis induction, Annexin-PI assay was performed, which evidentiate an increasing percentage of apoptotic cells after PPLGM treatment, with increasing concentrations related with higher percentage of late apoptosis stage and small increase of necrotic cells number. Cell cycle analysis showed altered distribution in both proficient and deficient cells after PPLGM treatment. In this assay, the most expressive result was the increase of Sub-G0/G1 cells phase, which is related to decrease DNA content due to fragmentation and apoptosis induction. To evaluate direct interaction of PPLGM with DNA, plasmidial DNA assays were performed. In this trials, there were no direct interaction of PPLGM with DNA observed, evidencing the indirect action of PPLGM through the increase of reactive oxygen species. The data presented here suggest that PPLGM should be a promising molecule in colorectal cancer therapy

Orientador: Sara T. O. Saad / Deissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T23:58:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_DeniseSilviade_M.pdf: 5043387 bytes, checksum: 45f6a641dda3292cdb3759ed8468aae3 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Para que a terapia gênica seja aplicada à terapêutica clínica, é necessário o desenvolvimento de um sistema que permita a eficácia biológica e segurança no caso de efeitos tóxicos. O gene da eritropoetina (EPO) pode ser utilizado para o tratamento de anemias crônicas, porém estudos in vivo têm demonstrado que efeitos tóxicos, como trombose e policitemia fatal, são freqüentes devido ao descontrole da expressão da EPO e alta elevação do hematócrito (Hct). O objetivo deste estudo foi buscar um sistema capaz de induzir a apoptose de células transformadas com o gene da EPO, baseado na ativação artificial da caspase9, através de indutores químicos de dimerização (CIO), comparando este sistema ao do Tet-Off. Duas construções foram utilizadas: a primeira contendo o cDNA da EPO murina (pBS-mEpoD) sob o controle do sistema Tet-off (ptetTA) e o segundo contendo o cDNA da caspase9 ligado a duas moléculas de FKBP em tandem (iCasp9). As moléculas de FKBP contêm uma mutação F36V que permite a ligação específica do indutor químico de dimerização (CIO) AP20187, gentilmente cedido pela ARIAD Pharmaceutics (Cambridge, MA). Estudos in vitro mostraram que, em células murinas C2C12 transfectadas estavelmente, o vetor icasp9 apresentou expressão adequada e 90% das células entraram em apoptose após a administração do AP 20187. Os ensaios in vivo foram realizados, inicialmente, com 3 grupos de camundongos (11/grupo), que receberam '5mu¿p pBS-mEpoD , '0,5mu¿g ptet-tTA e diferentes concentrações de iCasp9: grupo 1: zero, grupo 2= '6mu¿g e grupo 3= '10mu¿ g. As injeções intramusculares foram seguidas de eletroporação (8 pulsos, 30mseg , 200V/cm, 1Hz). Após cinco semanas, os animais apresentaram aumento no Hct de 33% (Student T test p=0.0013), 36.8% (p=0.0004) e 12.8% (p=0.0374) nos grupos 1,2 e 3 respectivamente, sugerindo que a administração de '6mu¿g de icasp9 não altera a expressão do vetor pBSmEpoD, enquanto que '10mu¿g de iCasp9 reduz sua eficiência. Novo experimento foi realizado, onde 49 animais participaram do estudo, sendo que treze destes receberam as concentrações administradas ao grupo 1, acima descrito, e 36 receberam as concentrações do grupo 2. Através deste experimento, foi possível verificar a eficiência do sistema na elevação e sustentação do hematócrito, assim como comparar os sistemas iCasp9/AP20187 e Tet-Off, no controle da expressão da eritropoetina. ... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: In order to apply gene therapy to clinical practice, it is necessary to develop a system establishing biological efficiency and safety in case of toxic effects.The erythropoietin gene (EPO) can be used in the treatment of chronic anemia, however in vivo studies have revealed that toxic effects, such as thrombosis and fatal polycythemia, are frequent due to uncontrolled EPO expression and a high increase in the hematocrit (Hct) levels.The aim of this study was to search for a system capable of inducing apoptosis in cells transformed by the EPO gene, based on the artificial activation of caspase-9, using chemical inducers of dimerization (CIO), comparing this system to Tet-Off. Two constructions were used: the first one containing the cONA of murine EPO (pBSmEpoO) under Tet-Off system (ptet-tTA) control and the second containing the cONA of caspase-9 connected to two FKBP molecules in tandem (iCasp9). The FKBP molecules contain a F36V mutation that permits a specific connection to the chemical inducer of dimerization (CIO) AP20187, kindly provided by ARIAO Pharmaceutics (Cambridge, MA). Studies in vitro demonstrated that, in stably transfected murine cells C2C12,the icasp9 vector presented and adequate expression and 90% of the cells entered apoptosis after AP20187 administration. The in vivo assays were performed, initially, with 3 groups of mice (11/group) that received '0,5mu¿g pBS-mEpoO, '0,5mu¿g ptet-tTA and different concentrations of iCasp9: group 1: zero, group 2='6mu¿g, and group 3='10mu¿g.The intramuscular injections were followed by electroporation (8 pulses, 30mseg, 200V/cm, 1Hz). After five weeks, the animais demonstrated a 33% increase in Hct (Student T test p=0.0013), 36.8% (p=0.OO04)and 12.8% (p=0.0374) in groups 1, 2, and 3 respectively, suggesting that the administration of '6mu¿g of icasp9 does not alter the pBS-mEpoO vector expression, although '10mu¿g of iCasp9 reduces its efficiency. A new assay was performed, the study involved 49 animais, thirteen of which received the same concentrations administered in group 1, described above, and 36 received the same concentrations as group 2. ... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Ricardo de Lima Zollner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-08T20:21:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zanin_MariaEduarda_M.pdf: 1416849 bytes, checksum: a8f43b38009831f8aa92831c13bdc49e (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Atualmente, o interesse pelas reações provocadas pelo fungo Lentinus edodes, cogumelo Shiitake, tem aumentado acompanhando sua popularidade nos países do Ocidente, onde ele é cada vez mais empregado na culinária e como ¿elixir de boa saúde¿. Paralelamente, tem crescido o número de relatos de reações alérgicas provocadas pelo consumo e manuseio do cogumelo, principalmente em produtores, que entram em contato com os esporos, facilmente inalados, e desenvolvem reações como tosse, calafrios e febre após o contato. As respostas iniciadas após a exposição fúngica devem-se aos sistemas de modulação da resposta imune, tais como subtipos de célula T recrutados para a resposta (TH1 ou TH2), tipos de citocinas secretadas e apoptose. Nosso estudo foi direcionado para a observação dos mecanismos de resistência e susceptibilidade às reações pulmonares e sistêmicas (células esplênicas) contra o Shiitake, baseados na expressão gênica das citocinas IL-2, IL-4, IL-5, IL-12, TNF-a e IFN-g, e componentes apoptóticos Fas, Fas¿Ligante (Fas-L) e Bcl-w nos camundongos BALB/c submetidos à exposição de esporos de Shiitake e Aspergillus fumigatus, utilizado como parâmetro de comparação, uma vez que as reações por ele provocadas são amplamente descritas na literatura. Dessa forma, os resultados obtidos evidenciam a modulação direcionada para células TH1 provocadas pelos esporos de Shiitake e Aspergillus fumigatus nos animais estudados, com expressão aumentada das citocinas IL-12, TNF-a e IFN-g, tanto local quanto sistemicamente, além do aumento de linfócitos nos pulmões. O estudo dos componentes apoptóticos revelou a expressão da molécula Fas apenas nos pulmões e células esplênicas dos animais expostos aos esporos de Shiitake e Aspergillus fumigatus, com observação de apoptose in situ pelas técnicas de Feulgen e TUNEL realizadas nos pulmões desses animais, sugerindo a modulação desses fungos na ocorrência da apoptose / Abstract: The Lentinus edodes (Shiitake mushroom) is one the most popular edible mushrooms in the world. The indoor cultivation of Shiitake can lead to allergic symptoms in mushroom worker¿s, in contrast to outdoor cultivation where problems occur sporadically. Simultaneously have been growth relates of allergic reaction elicited by the consumption and handily of this mushroom, mainly between workers which inhaled the spores released during manipulation of Shiitake. These spores reaching the terminal area of the lung producing symptoms that suggest a delayed hypersensibility reaction with clinical symptoms of dispnea, cough, chills, and fever. The immune response after fungal exposition is attributed to the modulation of this response by the T cells subsets recruited (TH1 or TH2), cytokines release and apoptosis. The aim of this study was to verify the resistance and susceptibility to the Shiitake by the analyzes of molecular expression of cytokines IL-2, IL-4, Il-5, IL-12, TNF-a and IFN-g and apoptotic components Fas, Fas-L and Bcl-w, in lung and spleen cells of BALB/c submitted to Shiitake and Aspergillus fumigatus spores exposure, as a positive control of response. We found a over expression of cytokines IL-12, TNF-a, and IFN-g, in both compartments, systemic and locally (spleen cells and lung respectively), moreover, the lymphocytes were increased, suggesting the TH1 driving response evoked by exposure to Aspergillus fumigatus and Shiitake spores. The study of apoptotic components demonstrated the expression of Fas only in lungs and spleen cells of exposed animals to spores. The presence of apoptosis in lung was confirmed by the Feulgen and TUNEL techniques, suggesting the fungal modulation of apoptosis / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica

Orientadores : Carmen Verissima Ferreira, Nora Marcela Haun Quiros / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T23:38:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freire_AnaClaudiaGalvao_D.pdf: 5573587 bytes, checksum: 42953ae5b64a43727a0686fe5fb30d9c (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A linhagem celular da leucemia promielocítica humana (HL60) foi estabelecida a partir do sangue periférico de uma paciente com leucemia promielocítica aguda. Essa cultura prolifera continuamente em suspensão, consiste predominantemente de promielócitos e tem sido utilizada como alvo para o estudo do efeito citotóxico de drogas, diferenciação e morte celular. Neste trabalho foi avaliada a citotoxicidade de inibidores de proteínas fosfatases (ácido okadáico e pervanadato) e da desidrocrotonina (t-DCTN) através dos seguintes parâmetros de viabilidade, após 24h de tratamento: redução do MTT (integridade mitocondrial), dosagem do teor de proteínas (indicação do número de células) e atividade fosfatásica (metabolismo celular). Os dois inibidores de proteínas fosfatases apresentaram efeito citotóxico sobre as células HL60. Em relação à função mitocondrial e atividade fosfatásica, as células apresentaram somente 20% de viabilidade em presença do ácido okadáico (100 nM) e pervanadato (200 11M). Para a t-DCTN foram obtidos os seguintes valores de ICso: 500 e 300 11M para o teor de proteína e redução do MTT, respectivamente. Outro aspecto abordado foi a relação entre o estado redox celular com uma possível indução da diferenciação e morte celular. Para este propósito foram determinados: redução do NBT, fragmentação do DNA, perda da assimetria da membrana plasmática e conteúdo total de GSH. A t-DCTN apresentou uma baixa capacidade de indução de diferenciação (20%). No entanto, na presença dos inibidores de proteínas fosfatases este efeito foi observado. A apoptose foi induzida na presença do ácido okadáico (34%) e este efeito foi aumentado em combinação com a t-DCTN (65,28%). De acordo com os resultados obtidos, sugere-se a importância da modulação química das proteínas fosfatases em diversos processos celulares, uma vez que os efeitos citotóxicos apresentados por estes compostos podem ser explicados pela alteração do estado redox celular e/ou efeito direto (formação de adutos) sobre estas enzimas ou outras macromoléculas / Abstract: patient with acute myeloid leukemia. This culture proliferates continuously in suspension and predominantly consists of promyelocytes and has been used as tool for cytotoxic studies of drugs, differentiation and cell death. ln this work was evaluated the cytotoxicity of protein phosphatases inhibitors (okadaic acid and pervanadate) and dehydrocrotonin (tDCTN) through following viability parameters, after 24h of the cells treatment: MTT reduction (mitochondrial integrity), protein determination (cell number indication) and fosfatase activity (cell metabolism). Both inhibitors presented cytotoxic effect on HL60 cells. In relation to mitochondrial function and phosphatase activity, these cells presented only 20% of viability in presence of okadaic acid (100 nM) and pervanadate (200 1lM). For t-DCTN were obtained the following IC50 values: 500 and 300 mM for protein content and MTT reduction, respectively. Other approached aspect was the relation to cellular redox state with a possible differentiation and cell death induction. For this purpose were determined: NBT reduction, DNA fragmentation, the loss of plasma membrane asymmetry and total GSH. t-DCTN presented low capacity of differentiation induction (20%). However, in the presence of protein phosphatase inhibitors this effect was not observed. Apoptosis was induced when the cells were treated with okadaic acid (34%) and plus t-DCTN this effect was increased (65,28%). According to the results obtained, we can suggest the importance of chemical modulation of protein phosphatases in several cellular processes, since cytotoxic effects presented by these compounds could be explained by redox state changing and/or direct effect (adducts formation) on these enzymes or other macromolecules / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Tomomasa Yano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:07:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FalconMarquez_Rosabel_D.pdf: 7259844 bytes, checksum: 0e6b8786d8132690001b0097d422051c (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: A enterotoxina citotóxica de Aeromonas hydrophila (Ent-ctx) possui múltiplas atividades biológicas. Entre elas, está a capacidade de lisar eritrócitos, causar danos irreversíveis nas membranas celulares e induzir acúmulo de fluido no intestino em modelo animal. Neste estudo, as hemácias de rato foram mais sensíveis a ação citolítica da Entctx quando comparadas às outras hemácias. A IgG purificada anti-Ent-ctx foi capaz de neutralizar o efeito citotóxico da Ent-ctx, apresentando títulos maiores que 1: 16384, revelando uma única banda com um peso molecular aproximado de 54 kDa na análise do imunoblotting. A Ent-ctx causou perda de junção intercelular, crescente condensação nuclear, a fragmentação e eliminação de corpos nucleares e citoplasmáticos em linhagens celulares Vero (rim de macaco verde africano) e HT29 (epitélio intestinal humano). As análises ultraestruturais, assim como análise eletroforética em gel de agarose, reação de Feulgen, e a metodologia do TUNEL confirmaram que a Ent-ctx induziu apoptose em HT29. Os danos ocasionados pela Ent-ctx foram irreversíveis, constatando-se que a perda da função mitocondrial nas células HT29 precede a destruição da membrana celular. Estudos in vivo em células epiteliais intestinais de rato revelaram severa desorganização estrutural, levando a destruição de enterócitos, alterações em organelas intracelulares e a perda do arranjo das células do tecido conectivo. A presença de um infiltrado inflamatório difuso constituído por eosinófilos e neutrófilos foi constatada nas análises microscópicas. Através da técnica de PCR não foram detectados os genes responsáveis pela enteropatogenicidade em E. coli (L T-I, STa, STb) na amostra de A. hydrophila produtora da Ent-ctx. Neste estudo, as alterações morfológicas observadas em células intestinais epiteliais in vitro e in vivo, sugerem que a Ent-ctx está relacionada com a enteropatogenicidade de A. hydrophila / Abstract: The cytotoxic enterotoxin secreted by Aeromonas hydrophila (Ent-ctx) produces hemolytic and cytotoxic activities and possesses the ability to evoke a fluid secretory response in a ligated intestinal loop model, amongst other biological activities. In this study, rat erythrocytes were the most sensitive to the hemolytic activity. The cytopathic effects were neutralized using antiserum purified against the cytotoxin of A. hydrophila (titer > 1 :16384). The immunoblotting analysis revealed one only band with molecular weight of 54 kDa. Vero (African green monkey kidney) and HT29 (human epithelial intestinal) cells treated with the Ent-ctx became round and lost their adhesion to each other and to the substrate. Cytoplasmic blebbing, nuclear condensation, fragmentation and formation of apoptotic bodies also occurred. Intemucleosomal DNA fragmentation was detected by TUNEL labeling, Feulgen staining in situ and agarose gel electrophoresis. These results confirmed that the Ent-ctx of A. hydrophila induces apoptosis in HT29. The cytotoxic response of this enterotoxin was irreversible and progressive showed that the lost of mitochondrial function come first that destruction of membrane permeability. In vivo studies revealed a dramatic structural disorganization, leading organelles damage, degeneration of epithelial cells and lost of the connective tissue in rat epithelial intestinal cells. Microscopic observations showed migration of eosinophils and neutrophils through the intestinal epithelium. Using L T-I, STa, and STb of E.coli as probe no homology to the whole cell DNA of A.hydrophila (AH 191) strain was detected on PCR analyses. These alterations induced by the cytotoxic enterotoxin of A. hydrophila, suggest that mechanism of this toxin could be associated to the enteropathogenicity involving A.hydrophila strains / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular