A isquemia cerebral causada pela parada cardíaca leva ao desapareciemnto neuronal. studamos os mecanismos de morte celular envolvidos na isquemia in vitro em linhagem de neuroblastoma.O insulto isquêmicao foi reproduzido cultivando as células sem fatores de crescimento, sem glicose e em embiente hipóxico produzido por um sistema de anaerobiose. Os resultados sugerem que a privação de oxigênio, glicose e fatores de cresciemtno do meio de cultura reproduzem o fenômeno semelhante a isquemia. INvestigamos ainda a participação de processo apoptótico e sua modulação térmica. Observams que a hipotermia produz neuroproteção, enquanto a hipertermia agrava o processo de morte celular por apoptose. / Cardiac arrest causes cerebral ischemia and neuronal disappearance. We investigate celular death mechanisms elucidated by a model of ischemia in neuroblastoma cell line. The ischemic insult was reproduced by deprivation of growth factors and glucose in a hypoxic environment produced by an anaerobiosis system. Our results validate the experimental model and revel the participation of an apoptotic process in the celular loss induced by ischemia. We also demonstrated that hypothermia can be used as a neuroprotector agent whereas hyperthermia aggavates celular damage.

L'antigène tumoral CA125 est surexprimé dans 80% des cas de cancer de l'ovaire et ses fonctions sont encore inconnues. En se basant sur l'analogie avec MUC1, qui confère une résistance à l'apoptose induite par les agents génotoxiques, nous avons émis l'hypothèse que CA125 pourrait moduler la réponse à la chimiothérapie des cellules de cancer de l'ovaire. Le but de ce projet est de déterminer l'implication de CA125 dans la sensibilité aux agents cytotoxiques des cellules de cancer épithélial de l'ovaire. Le modèle utilisé consiste en des clones stables dérivés de la lignée de cancer de l'ovaire NIH:OVCAR-3 exprimant un minianticorps, ou scFv, dirigé contre CA125. Ce scFv possède un signal de rétention au RE, ce qui permet de séquestrer CA125 au RE et d'empêcher sa localisation naturelle à la surface cellulaire (clones CA125-knockdown 1:9 #9 et 1:9 #7). Le clone contrôle exprimant un scFv qui ne lie pas CA125 est nommé scFv contrôle. La sensibilité des cellules aux agents cytotoxiques a été mesurée par une mesure de la viabilité cellulaire par essai XTT et les drogues testées sont de différents types: drogues liant l'ADN (cisplatin, cyclophosphamide, doxorubicine), drogues inhibiteurs de la dynamique des microtubules (taxol, vinorelbine) et drogue inhibant la topoisomérase II(etoposide). Les résultats obtenus montrent que les clones CA125-knockdown (1:9 #9 et 1:9 #7) sont de trois à cinq fois plus sensibles aux drogues qui affectent l'ADN (cisplatin, doxorubicine, cyclophosphamide, etoposide) par rapport aux cellules contrôles (scFv contrôle et lignée parentale OVCAR-3). Par contre, aucune différence de sensibilité n'a été observée pour ce qui est des drogues inhibant la dynamique des microtubules. Des analyses des niveaux endogènes des molécules de la cascade apoptotique et de l'activité basale de la caspase-3 n'ont démontré aucune différence significative chez les clones CA125-knockdown par rapport aux cellules contrôles. Lors du traitement des cellules au cisplatin, une augmentation de l'activation des caspases-3 et -9 de même qu'une augmentation de l'activité de la caspase-3 ont été démontrées, ce qui confirme que les cellules meurent par apoptose. Les cellules CA125-knockdown 1:9 #9 et 1:9 #7 montrent des niveaux endogènes de P-AKT plus élevés et une diminution de la localisation nucléaire du facteur de transcription FOXO3a, ce qui suggèrent une modulation de la réponse au stress et de la réparation de l'ADN. De plus, l'expression forcée des domaines unique, transmembranaire et cytoplasmique de CA125 (MUC16-CTD) dans la lignée SKOV-3 confère une résistance de ces cellules aux drogues génotoxiques. Ces résultats suggèrent que CA125 régule la sensibilité aux agents génotoxiques et que le domaine C-terminal est suffisant pour effectuer cette modulation. L'augmentation de la sensibilité aux agents génotoxiques pourrait être causée par la modification de voies en amont de la caspase-9 chez les cellules CA125-knockdown ou par une diminution de la localisation nucléaire de FOXO3a qui affecterait la réparation de l'ADN. Ces données amènent l'hypothèse que le statut tumoral de CA125 pourrait influencer la réponse à la chimiothérapie des patientes atteintes d'un cancer épithélial de l'ovaire.

1. Zusammenfassung Lösliche humane TRAIL-Varianten (hTRAIL), die nur die “TNF homology domain” (THD) beinhalten, binden sowohl den TRAILR1 aus auch den TRAILR2, stimulieren jedoch nur den TRAILR1. Nach sekundärem Quervernetzen des Liganden wird dann aber auch der TRAILR2 effektiv aktiviert. Entsprechende murine TRAIL-Varianten (mTRAIL) dagegen zeigen nur eine schwache Rezeptorbindung und sind selbst nach sekundärem Quervernetzen nur wenig aktiv. Interessanterweise kann ein Fusionsprotein aus der THD von mTRAIL und der Trimerisierungsdomäne von Tenascin-C (TNC), das wie mTRAIL selbst auch als Trimer vorligt, effizient an TRAIL-Rezeptoren binden und nach sekundärem Quervernetzen den TRAILR2 gut stimulieren. Weiterhin kann eine mTRAIL-Variante, die neben der THD auch die Stammregion des Moleküls enthält, die die THD von der Transmembrandomäne trennt, nach sekundärem Quervernetzen Apoptose induzieren, jedoch nicht so effektiv wie das TNC-mTRAILFusionsprotein. Die spezifische Bioaktivität der humanen TRAIL-Varianten wird gleichfalls, wenn auch weniger stark, durch Fusion mit der Tenascin-C-Trimerisierungsdomäne gesteigert. Die Fixierung des N-Terminus der THD, die hier durch die TNCDomäne sonst jedoch durch die Stamm- oder Transmembrandomäne gewährleistet wird, könnte demnach für mTRAIL für eine gute Rezeptorbindung und effektive Apoptoseinduktion nötig sein. Dies deutet auf eine bisher nicht erkannte Rolle der Stammregion für die Aktivität dieser Liganden hin und bietet die Möglichkeit, rekombinante lösliche Liganden der TNF-Familie mit erhöhter Aktivität zu generieren. Die TRAIL-induzierte Apoptose kann für die Behandlung von Tumorzellen nützlich sein. Es wurde jedoch kürzlich gezeigt, dass TRAIL neben Apoptose auch proinflammatorische, d. h. potentiell tumorfördernde Signalwege, insbesondere in apoptoseresistenten Zellen induzieren kann. Im Folgenden sollte untersucht werden, inwiefern TRAIL solche Signalwege in Myelomzellen stimuliert. Oligomerisiertes TRAIL kann bei allen analysierten Zelllinien Caspasen aktivieren und Apoptose induzieren. Werden die Zelllinien mit dem pan-Caspaseinhibitor ZVAD behandelt, kann die Caspase- Aktivierung bei allen Zellen blockiert werden, die Apoptoseinduktion jedoch nur bei zwei Zelllinien. Im Gegensatz dazu schützt ZVAD drei andere Myelomzelllinien nur partiell vor der TRAIL-induzierten Apoptose. Dies zeigt, dass TRAIL in Myelomzellen auch caspaseunabhängigen Zelltod induzieren kann. TRAIL induziert in den Myelomzellen auch proinflammatorische Signalwege wie den NFкB-, den JNK-, den p38- und den p42/44-Signalweg. Die Stimulation des JNK- und des p38-Signalwegs erwies sich hierbei in zelltypspezifischer Weise caspaseabhängig, die Aktivierung des NFкB- und p42/44-Signalwegs immer als caspaseunabhängig. Zusammenfassend geht aus diesen Ergebnissen hervor, dass zur Behandlung des multiplen Myeloms, TRAIL in Kombination mit anti-inflammatorisch wirkenden Mitteln eingesetzt werden sollte, insbesondere um mögliche proinflammatorische Nebenwirkungen durch TRAIL zu minimieren. / 2. Summary Variants of soluble human TRAIL (hTRAIL), encompassing solely the TNF-homology domain (THD), interact with TRAILR1 and TRAILR2, but they only stimulate TRAILR1 robustly. After crosslinking however, these ligands are also able to activate TRAILR2. Contrarily, the corresponding murine TRAIL variants poorly bind and activate their receptors even after crosslinking. Interestingly, a fusion protein consisting of the THD of mTRAIL and the trimerization domain of Tenascin-C (TNC) shows an effictive receptor binding and TRAILR2 activation after crosslinking. A variant of mTRAIL that not only contains the THD, but also the the stalk region, which seperates the transmembranedomain from the THD, does also induce apoptosis after crosslinking, but not as effective as the TNC-mTRAIL fusionprotein. The activity of soluble human TRAIL variants is also enhanced after fusion with TNC. It seems that especially for mTRAIL the spatial fixation of the THD by TNC is necessary for proper receptor binding and activation. This spatial fixiation is otherwise ensured by the stalk region or the transmembrane-domain. So the stalk region has unanticipated functions for the activity of the TNF ligands. Moreover, there is now an option to generate soluble ligands of the TNF-family with improved activity. TRAIL-induced apoptosis could be applied in the treatment of tumor cells. However, it was shown that TRAIL cannot only induce apoptosis, but also activates proinflammatory potentially tumor promoting pathways, especially in apoptosis resistant cells. Therefore, the ability of TRAIL to activate such pathways in myeloma cells was analyzed. Oligomerized TRAIL induces apoptosis and caspase activation in all analyzed myeloma cells. In experiments with the pan-caspase inhibitor ZVAD caspase acitvation could be blocked in all cell lines, but apoptosis could be blocked only in two cell lines. Three other myeloma cell lines were only marginally rescued from apoptosis. Therefore, TRAIL can also induce caspase independent cell death in myeloma cells. Beside apoptosis TRAIL also stimulates proinflammatory pathways like the NFкB-, the JNK, the p38- and the p42/44- pathway. Thereby, the activation of the NFкB- and p42/44-pathways is always caspase-dependent, but the induction of the p38- and JNKpathways is cell type specifically caspase-dependent. Thus, taken together for myeloma therapy TRAIL should be used in combination with anti-proinflammatory drugs to avoid potential side effects related to the proinflammatory properties of TRAIL.

O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença inflamatória crônica autoimune que se caracteriza pela perturbação da homeostase imunológica. Envolve a indução e produção de autoanticorpos, bem como formação e deposição de complexos imunes, que conduzem a uma intensa resposta inflamatória e dano tecidual. Fatores imunológicos, ambientais, hormonais e genéticos podem estar implicados na patogênese da doença. A expressão alterada de genes e proteínas reguladores da apoptose em células T pode comprometer a tolerância imunológica e induzir autoantígenos responsáveis pelo desenvolvimento e perpetuação de condições autoimunes. Mas, pouco se sabe a respeito de como a expressão destas proteínas afeta o desenvolvimento e a função das células T. As células T regulatórias (Treg), uma subpopulação celular de importância para prevenir a autoimunidade, apresentam número e capacidade supressora alterados nos pacientes lúpicos. Buscando entender como anormalidades observadas nas vias apoptóticas contribuem para a autoimunidade, o presente estudo avaliou a frequência de apoptose inicial e morte celular de linfócitos nestes pacientes, a frequência de subtipos de células T expressando as proteínas envolvidas nas vias extrínseca e intrínseca da apoptose, como Fas, FasL, Bax, Bcl-2 e p53, além da expressão dos genes que as codificam. Analisou-se ainda a frequência de polimorfismos nos genes FAS, FASL, BCL-2 e BAX em pacientes, comparando estes dados com o de controles, buscando possíveis associações com a predisposição à doença e com os dados clínicos. Foram estudados 427 pacientes com LES do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) e 543 indivíduos saudáveis, como controles. Dados de 50 mulheres lúpicas mostraram maior frequência de células Treg, bem como maior densidade de expressão do fator de transcrição Foxp3 nestas células em relação a controles, embora não tenhamos observado diferenças estatísticas em relação à expressão de proteínas pró- e antiapoptóticas nesta subpopulação celular. Uma proporção aumentada de células T CD4+ expressando Fas e p53, e uma frequência reduzida expressando Bcl-2 foi encontrada nas pacientes, em relação aos controles. Esse último dado foi apoiado pela relação observada entre a menor frequência de T CD4+ expressando Bcl-2 e a atividade da doença, e pela expressão diminuída do gene BCL-2 em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de mulheres lúpicas. Células T CD8+ expressando Bax e p53 também foram mais frequentes nas pacientes, ressaltando que células T CD8+p53+ foram mais numerosas nas pacientes com positividade para anticorpos anti-DNA. Maior frequência de morte de linfócitos foi observada em mulheres lúpicas. Com relação ao estudo dos polimorfimos, variantes alélicas dos genes FASL e BAX possivelmente se relacionam com o desenvolvimento e proteção da doença, respectivamente. Em conclusão, nossos achados apontam que a expressão modificada de genes e proteínas em células TCD4+ e TCD8+, relacionada a uma maior taxa de apoptose, podem conduzir à desregulação das vias apoptóticas e levar à perda da tolerância periférica, favoráveis ao desenvolvimento do LES. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is a chronic inflammatory autoimmune disease that is characterized by disruption of the immune homeostasis. It involves the induction and production of autoantibodies, as well as formation and deposition of immune complexes, leading to a severe inflammatory response and tissue damage. Immunological, environmental, hormonal and genetic factors may be implicated in the pathogenesis of the disease. The altered expression of genes and proteins regulating apoptosis on T cells may lead to breakdown of the immune tolerance and induce autoantigen responsible for the development and perpetuation of autoimmune conditions. Little information is known of how these proteins affect the development and function of T cells. Regulatory T cells (Treg), a cell subpopulation of importance to prevent the autoimmunity, exhibit changed number and suppressive capacity in SLE patients. Trying to understand how abnormalities observed in apoptotic pathways contribute to autoimmunity, the present study evaluated the frequency of initial apoptosis and cell death of lymphocytes in these patients, the frequency of T cell subsets expressing the proteins involved in the extrinsic and intrinsic pathways of apoptosis, such as Fas, FasL, Bax, Bcl-2 and p53, besides the expression of genes that encode them. We also examined the polymorphisms frequencies of Fas, FasL, Bcl-2 and Bax genes in patients, comparing these data with controls, looking for possible associations with the predisposition to disease and the clinical data. 427 SLE patients from Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) and 543 healthy subjects, as controls were studied. Results from 50 SLE women showed a higher frequency of Treg cells as well as a higher density of Foxp3 expression in these cells compared to controls, although we have not observed statistical differences in relation to the expression of pro- and antiapoptotic proteins in this cell subpopulation. An increased proportion of CD4+ T cells expressing Fas and p53, and a reduced frequency expressing Bcl-2 were found in patients. The latter finding was supported by the negative relation found between the frequency of CD4+Bcl-2+ cells and the disease activity index and by the decreased expression of BCL-2 gene in PBMCs of lupus women. CD8+ T cells expressing Bax and p53 were also more frequent in patients, noting that CD8+ T cells expressing p53 were more frequent in patients positive for anti-DNA antibodies. A higher frequency of death of lymphocytes was observed in SLE women. Regarding to polymorphisms analysis, allelic variants of FasL and Bax are possibly relate to the development and protection of the disease, respectively. In conclusion, our findings indicate that the modified expression of genes and proteins in CD4+ and CD8+ T cells, related to an increased apoptosis, may lead to dysregulation of the apoptosis pathways and the loss of peripheral tolerance, favorable for SLE development.

Orientador: Maria Cristina Cintra Gomes Marcondes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-11-01T14:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Toledo_MerciaTancredo_D.pdf: 3837085 bytes, checksum: 8ec6cd217ab21fa4523eaf5e631553fd (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: A placenta provê todas as necessidades para o crescimento e desenvolvimento fetal. Na presença de neoplasia é difícil predizer qual será a duração, evolução e termo da gravidez. O crescimento tumoral é prejudicial à mãe e á unidade materno fetal. O substrato energético fundamental usado pelo feto é a glicose proveniente da placenta, já que o fígado fetal é incapaz de processar a gliconeogênese. A placenta armazena glicogênio para sua própria atividade metabólica e provê lactato para o metabolismo fetal. Em estudos prévios, observamos danos à unidade feto-placentária, através de alterações bioquímicas e morfológicas na placenta, associadas ao crescimento do tumor de Walker ou à inoculação do líquido ascítico. Apoptose placentária pode afetar as funções da placenta e pode estar associada ao retardo de crescimento fetal. Por isto, este trabalho teve por objetivos investigar: 1) Reserva de nutrientes placentários através da análise de armazenamento de glicogênio; 2) Precursores de apoptose placentária possivelmente produzidos em função do crescimento do Carcinossarcoma de Walker 256 ou pela inoculação de líquido ascítico; 3) Envolvimento do sistema ubiqu.itina-proteossomo no processo seletivo de proteínas placentárias. Ratas Wistar grávidas adultas foram distribuídas em três grupos: controle (C); tumor de Walker (W); inoculadas com líquido ascítíco (A); sacrificadas no 16°, 19° e 21 ° dia após a cruza. Os tecidos placentários foram homogenizados e analisados através de: I) ensaios bioquímicos para glicogênio, conteúdo protéico, fosfatase alcalina e atividade glutationa-S-transferase; II) ensaios imunohistoquímicos, contando-se células positivas para P ARP, caspase-3 e citocromo c, e IV) quantificação de precursores apoptóticos (PARP, anti-caspase 3 e citocromo c) e do sistema ubiquitina-proteossomo subunidade 205, P42 e ubiquitina E2 por Westem blotting. Os pesos placentário e fetal foram significativamente reduzidos em ratos implantados com tumor e inoculados com líquido ascítico nos três dias de análise da gravidez. O efeito do crescimento tumoral aumentou os índices de reabsorções fetais que foram semelhantes ao dos grupos inoculados com líquido ascítico. O labirinto trofoblasto apresentou-se reduzido no 210 dia em ambos os grupos W e A. Os estoques de glicogênio e a atividade da fosfatase alcalina foram reduzidos no grupo implantado com tumor. Os efeitos produzidos pelo crescimento tumoral foram semelhantes aos observados nos grupos inoculados com líquido ascítico. Diminuição do conteúdo protéico placentário foi observado nos grupos W e A. Placenta, de ratos implantados com tumor e inoculados com líquido ascítico, apresentaram diminuição na atividade de GST no 190 e 210 dia; paralelamente houve aumento significativo de PARP, caspase-3 e citocromo c placentário tanto na análise imunohistoquímica quanto na análise por Westem blotting. O crescimento do tumor de Walker causou prejuízo ao tecido placentário e, especialmente, promoveu modificações nos precursores da apoptose. Considerando-se que o espongio trofoblasto é um dos responsáveis por manter a função placentária normal, a apoptose descontrolada destas células pode resultar em impacto negativo ao desenvolvimento fetal através de fatores produzido pelas células do tumor, ou, indiretamente, pelos efeitos causados pela inoculação do líquido ascítico aumentando a apoptose. Em animais implantados com tumor e inoculados com líquido ascítico os tecidos placentários não apresentaram dif¿!rença significativa de ubiquitina E2, embora as subunidades proteossômicas 208 e P42 fossem significativamente mais expressivas nos grupos W e A, com relação aos respectivos controles. 0 sistema ubiquitina-proteossomo está envolvido na reorganização e seleção de proteínas nucleares e citoplasmáticas; sendo assim, a presença de tumor ou a inoculação do líquido ascítico promoveu alterações neste sistema comprometendo, provavelmente, a viabilidade dos tecidos placentários e, conseqüentemente, a evolução da gravidez. Esses resultados podem ajudar na compreensão de eventos e identificação de métodos que venham garantir o bem-estar fetal e desenvolvimento da placenta. Assim o crescimento do tumor de Walker, juntamente com a inoculação de líquido ascítico, promovem danos irreversíveisá placenta alterando sua homeostasia assim prejudicando o desenvolvimento e a sobrevida fetal no ambiente uterino / Abstract: The placenta provides ali needs for healthy fetus development. The cancer development difficulties to predict the period, evolution and term of pregnancy. The tumour growth can be prejudicial to mother, foetus and, especially to maternal-fetal unit. The fundamental energy substrate used by fetus and placenta is glucose, although fetalliver is incapable to process gluconeogenesis. The placenta cells mobilise glycogen storage for its own energy activity and provides lactate to earlier fetal metabolism. In previous studies, we observed damage in the maternal-foetal unity, showed by biochemical and morphological alterations in placenta associated to tumour growth or ascitic fluid inoculation. Placental apoptosis may affect a range of placental functions and can be associated foetal growth retardation. For this reason the aim of this work was to analyse the effects of Walker 256 carcinosarcoma growth in pregnant rats studing 1) the nutrient reserves as glycogen storage 2) the effects on placental apoptotic precursors and 3) the involvement of the ubiquitin-proteasome system on the selective process of placental proteins. Adult pregnant Wistar rats were distributed into three groups: control, C; tumour bearing, W; injected ascitic fluid, A, and sacrificed on 16th, 19th or 21 st day after breeding. The placental tissue aliquots were analysed after homogenising and measuring I) placental glycogen, and protein content and alkaline phosphatase and glutathione-8-transferase activity; II) histochemically the glycogenceHs presence; III) Immunohistochemically assays counting [positive cells for P ARP I caspase-3 and cytochrome c, and IV) The apoptotic precursors (PARP, anti-caspase-3 and cytochrome c) and ubiquitin-proteasome proteins (ubiquitin E2, P42 and subunit 208) expression. The placenta and fetal weight were significantly reduced in both tumour bearing and ascitic fluid injected rats since 16th, 19th and 21st day of pregnancy. The effects of tumour growth, inducing high fetal reabsorption sites were similar in ascitic fluid injected group. Labyrinth layer was significantly reduced on 21 st day in both tumour bearing and ascitic fluid injected. The placental glycogen cells andalkaline phosphatase activity were reduced in tumour groups. The effect produced by tumour growth were similar that observed in ascitic ftuid injected group. Decrease in placenta I protein content was observe in both W and A Placental P ARP, caspase-3 and cytochrome c positive cells, analysed by immunohistochemistry and cells and Westem blot, were increased in tumour- bearing and ascitic fluid injection groups, showing that tumour growth clearly produced damage in placental tissue, especially inducing changes in apoptotic precursors. Since the trophoblastic cells are the responsible ones for maintaining normal placental function, the uncontrolled death of this cells could result in a negative impact to foetal development, as many factors either directed produced by tumour cells or indirectly effect produced by ascitic fluid substances, increasing the apoptosis rate. In tumour-bearing and ascitic fluid groups the placenta tissues showed no difference in ubiquitin E2 quantity, although the proteasome subunits 208 and P42 contents were significantly higher in the W and A rats. This results suggest that the ubiquitin proteasome system was involved in placental tissues probably being responsible for organizer and selection of citoplasmatic and nuclear proteins. The presence of tumour or ascitic fluid injected probably promoted alterations in the placenta tissues that committed the pregnancy evolution. The knowledge of this events resulted by tumour effects may help to identify the better way to guarantee the welfare of fetal and placenta development. In conclusion the tumour growth and, especially, ascitic fluid injected promoted irreversible damage in a placenta tissue altering the homeostasis and compromising the foetal development / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Die vorliegende Arbeit behandelt TRAIL-induzierte Apoptose und Nekroptose in verschiedenen Zelllinien. Im Speziellen wurden die verschiedenen Funktionen des TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) untersucht. Hierzu wurde ein transienter Knockdown etabliert und dessen Wirkung auf die Suszeptibilität der Zellen gegenüber dem Zytokin TRAIL untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein Knockdown von TRAF2 nicht nur zur Sensitivierung für Apoptose führt, sondern auch in Nekroptose-kompetenten Zellen zu einer Verstärkung der durch Caspaseinhibition mittels zVAD-fmk nach TRAIL-Stimulation induzierten Nekroptose führt. Mittels des Zytokins Fc-TWEAK wurde Fn14-vermittelt TRAF2 aus dem Zytosol in ein Triton X100-unlösliches Kompartiment rekrutiert und dadurch physiologisch depletiert. Dies führte zwar kaum zu gesteigerter TRAIL-abhängiger Apoptose, sensitivierte jedoch analog zum TRAF2-Knockdown RIP3-exprimierende Zellen für Nekroptose. Durch Vergleich RIP3-negativer (HeLa-Leervektor) mit RIP3-exprimierenden Zellen (HeLa RIP3, HT29, HaCaT) konnte die Essentialität von RIP3 für die Nekroptose herausgestellt werden und Einsatz des RIP1-Kinase-Inhibitors Necrostatin-1 sowie des MLKL-Inhibitors Necrosulfonamide belegte die Beteiligung der Nekroptosomkomponenten RIP1 und MLKL. Antagonismus putativen autokrinen TNFs bewies, dass es sich bei dem durch Fc-TWEAK verstärkten Zelltod um einen direkten TRAIL-Effekt handelte und Inhibition kanonischen NFkBs durch IKK2-Inhibitor TPCA-1, dass die TRAF2-Knockdown-vermittelte Sensitivierung gegenüber TRAIL nicht auf verändertes NFkB-Signalling zurückzuführen ist. Einsatz des SMAC-Mimetikums BV6 rekapitulierte zudem stark das im TRAF2-Knockdown Gesehene und unterstrich die Bedeutung der cIAPs. Immunpräzipitation von Caspase 8 unter nekroptotischen Bedingungen zeigte bei TRAF2-Knockdown eine Depletion von TRAF2 und cIAP1/2 sowie RIP1 und RIP3 aus dem Komplex mit Caspase 8. Insgesamt wird deutlich, dass TRAF2 einerseits antiapoptotisch wirkt als K48-Ubiquitinligase, die die Halbwertszeit aktiver Caspase 8-Komplexe determiniert und andererseits eine antinekroptotische Funktion hat, da es durch Rekrutierung von cIAP1/2 an RIP1 die TRAIL-induzierte Nekroptose verhindert, wenn die Caspasen inhibiert sind. / This study focussed on TRAIL-induced apoptosis and necroptosis in a number of different cell lines. In detail, the different functions of TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) were examined. Establishment of a transient TRAF2 knockdown discovered not only sensitization for apoptosis upon treatment with the cytokine TRAIL but also enhanced necroptosis in cells competent for this alternative programmed cell death mode. Physiological recruitment of TRAF2 into a triton x100- insoluble compartment using Fn14 ligand Fc-TWEAK revealed no stronger apoptosis after TRAIL treatment, but featured enhanced necroptosis. Comparing RIP3-negative cells (HeLa) with RIP3-expressing cells (HeLa RIP3, HT29, HaCaT) confirmed necroptosis and the necessity of RIP3 for necroptosis. Using RIP1 kinase inhibitor necrostatin 1 and MLKL inhibitor necrosufonamide fortified the involvement of the necroptosome components RIP1 and MLKL in TRAIL-induced necroptosis. Antagonizing putative autocrine TNF verified the thesis that the enhanced cell death phenotype observed upon Fc-TWEAK pre-treatment was indeed a genuine TRAIL signalling effect. Inhibition of classical NFB via TPCA-1 ruled out possibly altered NFB signalling due to TRAF2 knockdown. SMAC mimetics with BV6 strongly recapitulated the TRAF2 knockdown-induced phenotype in TRAIL-derived apoptosis and necroptosis and emphasizes cIAP1/2 relevance. Under necroptotic conditions, immunoprecipitation of caspase 8 complexes revealed depletion of TRAF2, cIAP1/2, RIP1 and RIP3 upon TRAF2 knockdown. Summarizing, by determining the shelf life of activated caspase 8, TRAF2 directly acts antiapoptotically. Moreover, by recruiting cIAP1/2 to RIP1, TRAF2 inhibits TRAIL-induced necroptosis, under conditions where caspases are inhibited.

Les granulocytes, neutrophiles et éosinophiles, sont des cellules effectrices de l'immunité innée. La régulation de la vie des granulocytes par le mécanisme de mort programmée cellulaire quest lapoptose procure un équilibre judicieux entre leur fonction de cellules effectrices dans la défense de lorganisme et le renouvellement sécurisé de ces cellules potentiellement dangereuses. Lapoptose spontanée constitue un processus nécessaire pour le maintien de lhoméostasie des cellules immunes, telles que les granulocytes. Mon travail de doctorat a permis didentifier de nouveaux mécanismes régulateurs de l'apoptose des granulocytes. La première étude démontre le rôle important des céramides de type C16 et C24 en tant que messagers secondaires dans la transmission du signal de mort dans les neutrophiles vieillissants. En effet, nous montrons que ces céramides, générées par la voie de synthèse de novo, s'accumulent spontanément dans les neutrophiles et précèdent l'apparition des signes de l'apoptose précoce ainsi que l'activation des caspases-8, -9 et -3. L'inhibition ou l'accélération pharmacologiques de cette accumulation ralenti ou accélère l'apoptose des neutrophiles, respectivement. Laccumulation des céramides C16 et C24 est également inhibée par le traitement des neutrophiles avec du GM-CSF, une cytokine proinflammatoire et anti-apoptotique. Par contre, nos résultats montrent que la mort induite par l'activation du récepteur Fas ne dépend pas de la synthèse de céramides par la voie de novo. Au cours de la seconde étude, nous avons identifié un mécanisme spécifique dans la régulation de l'apoptose des éosinophiles. Nous montrons que les éosinophiles expriment spontanément CD40 à leur surface et que lengagement de CD40 s'oppose à la mort des éosinophiles via l'induction de la protéine inhibitrice de l'apoptose cytoplasmique-2 (c-IAP2). En outre, nous apportons les évidences de l'existence d'un mécanisme similaire in vivo, en particulier dans l'inflammation allergique des voies respiratoires.

NF-kB, découvert en 1986 dans des lymphocytes B mature, est un groupe de facteurs de transcription impliqué dans plusieurs processus cellulaires différents tels les réponses immunitaires et inflammatoires, les processus du développement et de la croissance cellulaire ainsi que l'apoptose. L'activité de NF-kB est régulée par IkB ; lors de la phosphorylation de ce dernier, NF-kB est relocalisé vers le noyau. L'apoptose, une mort programmée identifiée en 1972, est caractérisée par une fragmentation de l'ADN et la formation de corps apoptotiques. Les mécanismes contrôlant ce phénomène sont très complexes. Un de ces mécanismes nécessite des protéases à cystéine aspartate-dépendantes que l'on nomme caspases. En utilisant le modèle cellulaire neuronal Neuro 2A, l'objectif de cette étude a été de déterminer si un stress oxydatif (H₂O₂) et un stress thermique (40 à 43°C) pouvaient induire l'apoptose par les mêmes mécanismes et si NF-kB avait un rôle dans la réponse cellulaire à ces deux stress. Une condensation de la chromatine, une caractéristique de l'apoptose, a été observée lors d'un stress oxydatif comme lors d'un stress thermique dans les Neuro 2A. Bien qu'une diminution de la polarité des membranes mitochondriale n'a été observée que pour le choc thermique, l'activation de l'apoptose serait induite au moins par la voie mitochondriale puisqu'il y a eu activation de la caspase 9 dans les deux stress. L'implication de la voie des récepteurs de mort est moins évidente; une activité de la caspase 8 est détectée dans les deux stress mais n'est que peu ou pas augmentée par rapport à l'absence de stress. La présence de H₂O₂ (0 à 25 µM) ne stimule pas l'activité de la caspase 3, mais active significativement l'activité de la caspase 6. Au contraire, durant le choc thermique (42 à 43°C), l'induction de la caspase 3 est très significative, soit environ près de dix fois celle des cellules témoins (37°C), et l'activité de la caspase 6 ne varie pas. La présence de l'inhibiteur Bay 11-7082 (inhibiteur de la phosphorylation de IkB, 4 µM) a peu d'influence sur l'activité des caspases 3 et 6 lors du stress oxydatif mais multiplie l'activité de la caspase 3 d'environ vingt fois lors d'un stress thermique. En conclusion, nos résultats ont permis de montrer l'implication de la voie mitochondriale (caspase 9) dans la mort apoptotique induite par H₂O₂ et le choc thermique et cela, dans la lignée neuronale Neuro 2A. La caspase effectrice 6 serait activée dans le stress oxydatif mais non thermique. Les résultats pour la caspase 6 dans le choc thermique demeurent à être vérifiés en analysant l'activité de cette caspase plus tardivement. En effet, la caspase 6 est située en aval de la caspase 3 dans les mécanismes apoptotiques. L'utilisation de Bay 11-7082 dans le choc thermique montre que NF-kB aurait un effet inhibiteur sur l'activation de la caspase 3. Le Bay 11-7082 en combinaison avec le choc thermique pourrait trouver application dans le traitement de tumeurs neuronales.

L'acroléine est un aldéhyde α,β-insaturé, très électrophile, auquel l'être humain est exposé dans plusieurs situations. Ce composé toxique est un polluant environnemental qui est principalement présent dans les produits de la combustion de la matière organique tels que la fumée de cigarette, les gaz d'échappement et les vapeurs des huiles de cuisson. De façon endogène, l'acroléine est produite lors d'un stress oxydatif et d'une inflammation ce qui suggère qu'elle est impliquée dans plusieurs pathologies telles que les maladies neurodégénératives, respiratoires et l'insuffisance rénale. L'acroléine réagit rapidement avec plusieurs sites nucléophiles de la cellule et forme ainsi des adduits au niveau de l'ADN et des protéines et favorise la peroxydation des lipides. La réaction de l'acroléine avec le glutathion ainsi que les cystéines de plusieurs enzymes résulte en une perturbation de la balance d'oxydoréduction de la cellule ce qui perturbe plusieurs voies de signalisation cellulaire dont la voie apoptotique. L'implication de l'acroléine dans la mort cellulaire a été démontrée dans les études précédentes sans pour autant détailler les mécanismes moléculaires dans les cellules pulmonaires A549. Le but de ce travail est d'étudier l'implication du réticulum endoplasmique (RE) dans la transduction du signal apoptotique induit par l'acroléine (25-200 µM) dans les cellules d'adénocarcinome humain A549. Notre étude montre que l'acroléine (25-200 µM) induit la réponse apoptotique des cellules A549. Plus précisément, l'acroléine cause un stress du RE et induit ainsi la réponse aux protéines à conformations anormales (UPR) qui se traduit par la phosphorylation des kinases PERK et IRE1α ainsi que par le clivage de l'ATF6α. Cependant l'activation de la réponse UPR n'a pas induit l'expression de Bip. De plus, la réponse UPR, induite par un traitement de 2h avec l'acroléine, n'est pas en mesure d'exercer son effet de survie ce qui résulte en l'initiation de la voie pro-apoptogène. Nos résultats indiquent que l'apoptose induite par l'acroléine implique l'induction du facteur de transcription CHOP, l'augmentation du taux de calcium libre intracellulaire qui est responsable de l'activation des calpaïnes qui à leur tour sont impliquées dans l'activation des caspases 12 et 4. Nous avons également montré que le chélateur de calcium BAPTA-AM ainsi que l'inhibiteur des calpaïnes protègent les cellules A549 contre l'apoptose induite par l'acroléine. Toutefois, les inhibiteurs des caspases 12 et 4 n'ont pas montré un effet significatif. Dans le cas de la caspase 4, son inhibition cause une inhibition partielle (non significative) de l'apoptose. Ceci peut suggérer l'implication d'autres voies dans la transduction du signal apoptotique induit par l'acroléine dans les cellules pulmonaires A549. Nos observations suggèrent que le processus apoptotique induit par l'acroléine peut être médié par la voie du RE mais n'implique pas nécessairement l'activation des caspases 12 et 4. Cette étude révèle de nouveaux aspects sur les mécanismes de toxicité de l'acroléine. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Acroléine, Apoptose, Caspase, Réticulum endoplasmique.

Proefschrift--Universiteit Leiden, 2003. / Textes en anglais et en néerlandais. Bibliogr. en fin de chap.