Orientador : Irene Lorand-Metze / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T08:47:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_GislaineBorba_M.pdf: 1136616 bytes, checksum: 39ae5f174c71eaaa0994339452586771 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A leucemia linfóide crônica apresenta grande variabilidade na sua apresentação e evolução clínica, bem como, na sua resposta ao tratamento. Estudando a apoptose destas células in vivo, observou-se que ela se encontra bloqueada, o que não ocorre após a cultura a curto prazo, onde este processo acontece espontaneamente. Neste estudo, avaliamos o grau de apoptose in vitro e suas interações com alguns parâmetros clínicos e laboratoriais. Foram avaliados a idade, o estádio clínico segundo os critérios de Rai e Binet, índice de massa tumoral (TTM) e os seguintes parâmetros laboratoriais: hemoglobina (g/dl), contagem de leucócitos, linfócitos e plaquetas (/l ), a porcentagem de células com cluster de AgNOR, a porcentagem de células positivas para a Anexina V, o índex e o número absoluto de células CD8 positivas. A apoptose foi medida através da técnica da Anexina V e a taxa de proliferação através da técnica das AgNORs. Houve correlação inversa entre a porcentagem de células positivas para a Anexina V e a contagem de linfócitos periféricos (r=-0,49), com o estádio de Rai (r=-0,40), com o estádio de Binet (r=-0,50), com com o TTM (r=-0,51) e com a porcentagem de células com um cluster de AgNOR (r=-0,45). As correlações diretas ocorreram com os valores de hemoglobina (r=0,34) e de plaquetas (r=0,52). O número de células CD8 positivas mostrou correlação com a contagem de linfócitos periféricos (r=0,49). Quando esta variável foi mantida constante, foi possível detectar uma correlação entre a contagem de células CD8 positivas e o estádio clínico (r=-0,47), com o TTM (r=-0,42) e com a contagem de plaquetas (r=0,67). Os linfócitos CD4 positivos apresentaram uma correlação somente com os linfócitos CD8 positivos. Na análise de clusters, foi possível a criação de três grupos de pacientes com diferentes taxas de apoptose, utilizando os valores do TTM e dos clusters de AgNOR. Portanto, nos foi permitido concluir com este trabalho que, com a progressão da doença, ocorre o aumento da massa tumoral e da taxa de proliferação paralelalmente ao aumento da susceptibilidade à apoptose / Abstract: Chronic lymphocytic leukemia (CLL) presents considerable variability in clinical presentation as well as in its evolution. In contrast to the inhibition of apoptosis in vivo, spontaneous apoptosis after short-term culture occurs. We studied the degree of this apoptosis in vitro, and its interactions with several clinical and laboratory parameters. Apoptosis was measured by the annexin V technique. Proliferation rate was evaluated by the AgNOR (nucleolar organizer regions) technique. There were inverse correlations between the percentage of annexin V-positive cells and peripheral lymphocyte count (r=-0,49), Rai stage (r=-0,40), Binet stage (r=-0,50) , TTM (total tumor mass score; r=-0,51), and percentage of cells with one AgNOR cluster (r=-0,45). Direct correlations were found with hemoglobin values (r=0,34) and platelet counts (r=0,52). The number of CD8positive cells showed a correlation with perIpheral lymphocyte count (r=0,49). When this variable was held constant, a correlation was detected between CD8-positive cells and staging (r=-0,47), TTM (r=-0,42), and platelet count (r=0,67). CD4-positive lymphocytes presented a correlation only with CD8-positive lymphocytes. In a cluster analysis, it was possible to create three groups of patients with different apoptosis rate using the TTM and AgNOR values. We conclude that, with the progression of the disease, together with the increase of tumor mass and proliferation rate, there is a decrease in the susceptibility to apoptosis / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica

Les maladies neurodégénératives constituent un enjeu humain, sociétal et économique majeur, dont l'importance croît avec le vieillissement des populations. Cette dénomination regroupe un grand nombre de maladies neurologiques, comme les maladies d'Alzheimer, de Parkinson ou la sclérose latérale amyotrophique (SLA). L'étiologie de ces maladies est complexe et reste encore mal comprise. Néanmoins, elles résultent vraisemblablement d'une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux et se caractérisent toutes par la dégénérescence d'une population neuronale spécifique. Les mitochondries jouent un rôle primordial dans l'apport énergétique, la régulation calcique ou la gestion du stress cellulaire et sont directement impliquées dans le déclenchement de la mort cellulaire programmée (ou apoptose). L'implication centrale de cet organite dans les pathologies neurodégénératives a logiquement suscité un ciblage croissant des fonctions mitochondriales dans les nouvelles approches thérapeutiques envisagées ces dernières années. Des curcuminoïdes ont par exemple été testés pour contrer les effets dus au stress oxydatif, mais les résultats restent encore à être améliorés. L'utilisation de facteurs anti-apoptotiques dérivés de virus représente une piste très prometteuse. En effet, l'apoptose des cellules infectées représente la "première ligne" de défense de l'hôte contre une invasion virale. En réponse à ce mécanisme de défense, de nombreux virus expriment divers facteurs (protéines, ARN ...) dont la fonction est de bloquer le processus apoptotique, en particulier en ciblant la mitochondrie, favorisant ainsi la réplication virale au sein de la cellule. Dans ce contexte, notre équipe a établi que la protéine X du Bornavirus possède de remarquables propriétés neuroprotectrices. Si le potentiel thérapeutique de cette protéine virale est maintenant démontré, les mécanismes moléculaires à l'origine de cet effet neuroprotecteur étaient à ce jour inconnus. Au cours de ma thèse, nous avons contribué à une meilleure compréhension de la biologie de cette protéine au sein de la cellule et en particulier dans les mitochondries. Nous avons déterminé ses séquences d'adressages intracellulaires ainsi que son impact sur la dynamique mitochondriale et sur certains paramètres de la bioénergétique mitochondriale tels que le potentiel de membrane mitochondrial, la respiration cellulaire et la production d'ATP (énergie de nos cellules). L'ensemble de ces connaissances devrait nous permettre d'améliorer sa capacité neuroprotectrice. / Bornavirus, a non-cytolytic RNA virus establishes a long-lasting persistence in the central nervous system of infected animals. Viral persistence is facilitated by the expression of the non-structural X protein, which is addressed both to nucleus and mitochondria, where it interferes both with cellular antiviral responses and the initiation of apoptosis. Our team recently reported that the singled-out expression of the X protein could protect neurons against toxins of the mitochondrial respiratory chain, both in vitro and in a mouse model of Parkinson's disease (PD). During my Ph.D., we further demonstrated that the X protein triggered enhanced filamentation of the mitochondrial network, in physiological as well as in oxidative stress conditions. This effect is particularly interesting when considering the importance of mitochondrial dynamics in the pathophysiology of neurodegenerative diseases. Even if the therapeutic potential of this viral protein is now well established, the underlying molecular and cellular mechanisms are far from being elucidated. It is however clear that neuroprotection conferred by the X protein is strictly dependent on its mitochondrial localization. In this context, the goal of my Ph.D. project was to clarify the molecular mechanisms whereby the X protein is targeted to mitochondria and/or to the nucleus, in link with its protective capabilities. We focused on the amino terminal residues of X, by performing fusion proteins of various forms of these residues with GFP and by analyzing their cellular localization. We demonstrated that this region contains overlapping and interdependent signals for nuclear localization, nuclear export and mitochondrial targeting of the X protein. We also identified a point mutation or deletion leading to an almost exclusively mitochondrial localization of the X protein. As a consequence, these X mutants exhibited a better neuroprotective function. In order to get further insight into X-mediated neuroprotection, we also searched for the cellular partners of X in mitochondria. We revealed a direct and specific interaction of the X protein with the chaperone Hspa9, a protein that was recently shown to be involved in neurodegenerative diseases, notably in PD's patients. We observed that the down-regulation of Hspa9 triggered by mitochondrial toxins was attenuated by the coexpression of X, suggesting a functional link between these two proteins. We also demonstrated that Hspa9 overexpression could protect neurons from mitochondrial dysfunctions, similarly to the X protein. Altogether, these results have contributed to a better understanding of the mechanisms underlying the neuroprotective potential of the X protein, which may favor the development of novel therapeutic strategies.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2015-12-03T14:40:27Z No. of bitstreams: 1 thamirisdornelasdearaujo.pdf: 2561728 bytes, checksum: fff1785edaa93117a2f0ca8fea98bc43 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2015-12-03T14:42:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 thamirisdornelasdearaujo.pdf: 2561728 bytes, checksum: fff1785edaa93117a2f0ca8fea98bc43 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-03T14:42:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 thamirisdornelasdearaujo.pdf: 2561728 bytes, checksum: fff1785edaa93117a2f0ca8fea98bc43 (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / As mudanças climáticas constituem ameaça às espécies e à sustentabilidade financeira dos sistemas de produção. Estudos preliminares mostraram que embriões bovinos submetidos ao choque térmico apresentam níveis diferenciados de heterocromatina, o que pode comprometer o desenvolvimento. Algumas substâncias interferem na estrutura da cromatina ou na metilação do DNA e podem influenciar os eventos epigenéticos do desenvolvimento embrionário. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito de 5-aza-2’-deoxycytidine na produção de embriões bovinos utilizando oócitos submetidos ao choque térmico. Oócitos de vacas de abatedouro foram maturados em TCM-199+10% soro de vaca em cio e distribuídos em: experimento 1(NHS, sem choque térmico) - 5%CO2 e 38,5ºC 24h; experimento 2 (HS, choque térmico) - 6,5-7,0%CO2 e 41,5ºC 12h + 12h em 5%CO2 e 38,5ºC. Foi realizada FIV em FERT-TALP por 20h nas condições convencionais de maturação. Procedeu-se o cultivo em CR2aa+2,5%SFB a 38,5ºC, 5%CO2 e 5%O2 por 8 dias. Em cada experimento os embriões foram divididos nos seguintes tratamentos: sem adição de 5-aza (NHS ou HS - Controles), expostos a 5-aza (10nM) por 24h (NHS24h ou HS24h) ou por 48h (NHS48h ou HS48h). Após exposição à droga os embriões foram cultivados em meio idêntico ao de NHS e HS até completarem o desenvolvimento. O estágio de desenvolvimento e a taxa de embriões foram avaliados nos dias 3 (D3), 7 (D7) e 8 (D8), e blastocistos D8 foram avaliados por TUNEL quanto à taxa apoptótica. Embriões D2 e D3 foram submetidos à imunofluorescência para marcação de HP1β. Não houve diferença na clivagem dos dois experimentos. O percentual de embriões com 8 células em D3 foi menor em todos os grupos tratados com 5-aza. Menores taxas de blastocistos em D7 e D8 foram obtidas no tratamento NHS48h. Menores taxas de blastocistos foram produzidas em D7 e D8 para HS24h e HS48h. O número de células totais e da massa celular interna dos blastocistos não diferiu entre os grupos dos dois experimentos. O índice apoptótico nos grupos do experimento 1 foi similar, e no experimento 2 ocorreu diferença apenas entre os grupos HS24h e HS48h. O índice apoptótico da massa celular interna não diferiu nos dois experimentos. O uso de 5- aza não influencia as taxas de clivagem em D3, mas a longa exposição reduz as taxas de blastocistos. Associado ao choque térmico, 5-aza reduz as taxas de blastocistos independente do tempo de exposição. No entanto, não houve injúrias celulares detectáveis nos embriões que se desenvolveram a blastocisto. A intensidade do sinal para heterocromatina em embriões com 4-7 células foi similar entre os grupos, o percentual de núcleos não marcados foi baixo e NHS24h marcou mais núcleos fortemente. Embriões de 8-16 células apresentaram redução na intensidade do sinal quando expostos a 5-aza, o que não ocorre nos embriões de choque térmico, com intensidades similares a NHS, e 5-aza não tem aparente efeito sobre a presença de HP1β. Mudanças nos padrões de eucromatina e heterocromatina nos embriões de choque térmico podem estar relacionadas a uma ativação do genoma embrionário mais complexa, reduzindo a produção de blastocistos. / Climate changes is a threat to the species and the financial sustainability of the production systems. Preliminary studies showed that bovine embryos submitted to heat shock presented differentiated levels of heterochromatin, which can compromise the development. Some substances interfere in the chromatin structure or DNA methylation can influence the epigenetic events of embryonic development. The objective of this work was to evaluate the effect of 5-aza-2'deoxycytidine in the production of bovine embryos using oocytes submitted to heat shock. Oocytes of slaughterhouse cows were matured in TCM-199 + 10% serum cow in heat and distributed on: experiment 1 (NHS without heat shock) - 5%CO2 and 38.5ºC 24h; experiment 2 (HS with heat shock) - 6.5-7.0%CO2 and 41.5ºC 12h + 12h in 5%CO2 and 38.5ºC. IVF was performed in FERT-TALP for 20h in conventional maturation conditions. The cultivation was performed in CR2aa+2.5%FBS a 38.5ºC, 5%CO2 and 5%O2 for 8 days. In each experiment, the embryos were divided into the following treatments: without addition of 5-aza (NHS or HS - Controls), exposed to 5- aza(10nm) for 24h (or NHS24h or HS24h) or 48h (or NHS48h or HS48h). After exposure to the drug, embryos were cultivated in the same NHS and HS to complete development. The development stage and the rate of embryos were evaluated at day 3 (D3), 7 (D7) and 8 (D8), and blastocysts were evaluated by TUNEL as the apoptotic rate. Embryos D2 and D3 were submitted to immunofluorescence for marking HP1β. There was no difference in the cleavage of the two experiments. The percentage of 8-cell embryos D3 was lower in all the groups treated with 5-aza. Lower blastocyst rates were obtained in treatment NHS48h. Lower blastocysts rates were produced in D7 and D8 to HS24h and HS48h.The number of total cells and the inner cell mass of blastocysts was similar between groups in the two experiments. The apoptotic index in experimental group 1 was similar, and in experiment 2 occurred only difference between HS24h and HS48h groups. The apoptotic index of the inner cell mass did not differ in both experiments. The use of 5-aza do not affect the cleavage rates in D3, but the long exposition reduces blastocyst rates. Associated with heat shock, 5-aza reduces blastocyst rates independent of the exposition time. However, there was no detectable cell injury in embryos that developed to blastocyst. The intensity of the signal for heterochromatin in embryos with 4-7 cells was similar between the groups, the percentage of HP1β negative nucleus was low and more nucleus were exhibiting increased HP1β signal in NHS24h. 8-16 cell embryos present a reduction of signal intensity when exposed to 5-aza, which does not occur in the heat shock embryos with similar intensities to NHS, and 5-aza has apparently no effect on HP1β levels. Changes in euchromatin and heterochromatin patterns in the heat shock embryos may be related to a complex EGA related to those groups, which might be related to lower blastocyst rate.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / La protéine de l'adénovirus humain E4orf4 (Early region 4 open reading frame 4) induit un programme de MC programmée indépendant des caspases chez les cellules transformées et cancéreuses. Des données indiquent qu'E4orf4 pourrait fournir un outil moléculaire pour obtenir des connaissances plus approfondies sur la façon de manipuler les fonctions oncogéniques afin d'induire sélectivement le suicide des cellules cancéreuses. Les travaux du laboratoire indiquent que la cytotoxicité d'E4orf4 repose sur sa capacité à perturber le trafic des endosomes de recyclage (ERs) via l'action concertée des kinases de la famille Src (KFS), de la RhoGTPase Cdc42 et de l'actine. Ces perturbations stimulent le transport des ERs dirigés par Rab11a vers le trans-Golgi et la fragmentation du Golgi, laquelle contribue à la progression de la MC. Les travaux présentés dans ce mémoire visent à déterminer la contribution de cette nouvelle voie de signalisation (contrôlant le trafic des ERs) dans le remodelage des organites en réponse au stress. Pour ce faire, la staurosporine (STS), un inhibiteur de kinases à large spectre induisant plusieurs mécanismes de MC, a été utilisé comme modèle principal. Les résultats indiquent que la STS perturbe le trafic des ERs et stimule leur translocation vers les membranes du trans-Golgi, lesquelles sont subséquemment fragmentées. Ces évènements sont indépendants des caspases et contribuent à la MC. En outre, la mobilisation des ERs induite par la STS est médiée par les KFS, Cdc42 et l'actine, tout comme la fragmentation du Golgi. De plus, j'ai démontré que la fragmentation du Golgi induite par la STS en absence de caspases contrôle partiellement la fission apoptotique des mitochondries, une organelle ayant un rôle central dans la signalisation de plusieurs modes de MC. Finalement, j'ai évalué la contribution de cette voie de transport rétrograde à l'activation des caspases. Les résultats préliminaires suggèrent que les GTPases Rab11a et Cdc42 jouent un rôle en amont de l'activation des caspases effectrices. Nous proposons que les signaux de stress stimulent la mobilisation des ERs, lesquels pourraient délivrer des lipides et des protéines de signalisation contribuant au remodelage des organelles et à la communication inter-organites orchestrant l'activation de multiples mécanismes de MC, tout au moins, dans le contexte de cellules cancéreuses.

Les sepsis sévères et chocs septiques constituent des causes croissantes de morbidité et de mortalité chez les patients hospitalisés. La dysfonction cardio-circulatoire lors d'un choc septique s'avère un élément majeur et initial dans l'induction et l'entretien des défaillances organiques subséquentes. En effet, certaines bactéries et endotoxines déclenchent une séquence d'événements cellulaires qui mènent à une altération des performances cardiaques. Le macrophage migration inhibitory factor (MIF) a récemment été identifié en tant que facteur de dépression cardiaque lors de choc septique. Ainsi, la présente étude révèle que la neutralisation du MIF prévient la dysfonction myocardique induite par l'endotoxine dans un modèle expérimental chez le rat. De façon sous-jacente, le blocage du MIF empêche la hausse d'expression et de production dans le coeur de cytokines inflammatoires paracrines et autocrines (IL-1, IL-6 et TNF-[alpha]) en réponse au LPS. D'un point de vue mécanistique, cette étude démontre que la neutralisation du MIF inhibe l'apoptose des cardiomyocytes provoquée par l'endotoxine. Ainsi, le présent travail met en évidence un mécanisme précis par lequel le MIF influence la dépression cardiaque endotoxinique. Ce mécanisme implique que le blocage du MIF induit une augmentation du ratio protéique cardiaque de Bcl-2/Bax contribuant ainsi à prévenir le relâchement du cytochrome c mitochondrial induit par l'endotoxine. Cette inhibition de la perte de cytochrome c mitochondrial entraîne une réduction de l'activation de la caspase-3. La neutralisation du MIF rétablie la déficience provoquée par le LPS au niveau de la translocation nucléaire de phospho-Akt et par conséquent l'expression du facteur nucléaire de survie cardiaque GATA-4. Cette baisse d'activité caspase-3 et le rétablissement de la translocation/expression des facteurs de survie par le blocage du MIF résultent en une diminution de la fragmentation de l'ADN caractéristique de l'apoptose tardive. Globalement, l'inactivation du MIF lors d'un choc endotoxinique prévient le déséquilibre inflammatoire et apoptotique dans le coeur protégeant ainsi contre la dysfonction myocardique subséquente.

TAF6 est un co-facteur de transcription qui fait partie du complexe multiprotéique, TFIID. TAF6 possède 4 isoformes et deux d'entre eux ont des fonctions opposées. TAF6[alpha] est l'isoforme anti-apoptotique et peut dimériser avec TAF9, tandis que TAF6[delta] est l'isoforme pro-apoptotique et ne peut pas dimériser avec TAF9. TAF6[delta] induit l'apoptose indépendamment de p53. Cette nouvelle voie apoptotique présente un intérêt certain et l'étude de la régulation de l'épissage alternatif de TAF6[delta] est essentielle pour comprendre le mécanisme par lequel TAF6[delta] induit l'apoptose. Nous avons donc développé un minigène de TAF6 qui récapitule le patron d'épissage endogène. Nous avons muté le minigène TAF6 afin d'identifier des éléments sur l'ARN controllants son épissage. Ces éléments ont été retrouvés surtout au niveau de l'exon 2 et de l'intron entre l'exon 2 et l'exon 3. Trois sites activateurs d'épissage ont été déterminés dans l'exon 2. De plus, nous avons démontré la présence d'une structure secondaire importante dans le choix du site 5' d'épissage. Nous avons aussi établi que la distance de 30 nucléotides entre les deux sites 5' d'épissage avait un rôle à jouer dans le choix de ce site d'épissage. Un dernier site activateur a été positionné dans l'intron. D'après ces résultats de mutations et un criblage PCR d'ADNc de cellules transfectées par des siRNAs contre des protéines de liaison à l'ARN, nous avons identifié hnRNP K comme facteur trans potentiel régulant l'épissage de TAF6. Les facteurs trans liants les éléments cis permettent de réguler en partie l'épissage alternatif d'un ARN pré-messager. Des expériences d'immunoprécipitation in vivo nous ont permis d'établir qu'il existe une interaction entre l'ARN de TAF6 et hnRNP K. Le signal extracellulaire qui agit sur les éléments cis et permet de changer l'épissage alternatif de TAF6 est encore inconnu. Nous avons tenté de le déterminer, mais, pour l'instant, nos hypothèses n'ont pas été confirmées par les expériences menées. L'apoptose, si elle est dérégulée, peut mener à des pathologies. L'expression de TAF6 et l'inclusion d'éléments répétitifs Alus dans son ARN messager ont été démontrés comme étant augmentées dans les cellules tumorales du sein. Nous avons aussi commencé l'étude de l'importance de ces éléments répétitifs dans l'augmentation de l'expression de TAF6 dans les cancers. Nous avons identifié une mutation ponctuelle au niveau de la deuxième séquence répétitive Alu qui peut être retrouvée dans TAF6, mais nous ne connaissons pas encore sa fonction dans la surexpression de TAF6 dans les cancers du sein. Bref, ce mémoire présente les différents résultats obtenus dans le cadre d'expériences dont le but était d'identifier les éléments cis, les facteurs trans, le signal déclenchant l'épissage et le rôle des éléments répétitifs Alus présents dans l'ARN de TAF6.

EOC (epithelial ovarian cancer) is a leading cause of death from gynecological cancers. The majority of the patients with EOC are diagnosed at a late stage. The survival of these patients is limited due to recurrence of chemotherapy resistant disease. Therefore, the development of novel therapeutic agents for the treatment of EOC is urgently needed and it is a high priority in the field. TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is a promising novel agent for the treatment of cancer, including EOC, because of its unique ability to trigger apoptosis in cancer cells and spare normal cells. Our laboratory has previously shown that a significant number of EOC cell lines and primary EOC samples are intrinsically resistant to TRAIL-induced apoptosis. The mechanisms leading to intrinsic resistance are largely unknown. TRAIL-resistant cells often display increased activation of the pro-survival PI3K/Akt pathway. Based on our observations that EOC ascites induced activation of the PI3K/Akt pathway in TRAIL-sensitive EOC cells which resulted in inhibition of the TRAIL-mediated apoptosis, we hypothesized that activation of the pro-survival PI3K/Akt pathway in EOC cells plays an important role in the resistance to TRAIL-induced apoptosis. The objectives of my project were to demonstrate that Akt is implicated in the regulation of TRAIL-induced apoptosis in EOC cells and to investigate the mechanisms by which Akt contributes to TRAIL resistance. We report that Akt activation reduces the sensitivity of ovarian cancer cells to TRAIL. TRAIL-resistant cells were sensitized to TRAIL-induced apoptosis by treatment with P13K or Akt inhibitors but inhibition of PI3K/Akt signaling pathway did not interfere with the recruitment and processing of the pro-caspase-8 to the death-inducing signaling complex (DISC). Conversely, overexpression of Akt1 in TRAIL-sensitive cells promoted resistance to TRAIL. Despite the fact that TRAIL-induced caspase-8 activation was observed in both TRAIL-sensitive and -resistant cell lines, Bid cleavage occurred only in TRAIL-sensitive cells. Akt activation in TRAIL-sensitive cells inhibited TRAIL-induced Bid cleavage. Furthermore, Bid expression was downregulated by Akt activation. Depletion of Bid by siRNA in TRAIL-sensitive EOC cells was associated with a decrease in TRAIL-mediated apoptosis and Bid overexpression in TRAIL-resistant cells resulted in increased TRAIL-mediated apoptosis. Altogether, these results suggest that Akt is a critical factor for mediating intrinsic TRAIL resistance among EOC cells and that an important mechanism by which Akt activation contributes to TRAIL resistance is by regulating the expression of pro-apoptotic protein Bid. Given these data, we speculate that Akt activation may be a potential biomarker to predict patient's response to TRAIL therapy and that the inhibition of the PI3K/Akt pathway can become one of the strategies to overcome resistance to TRAIL therapy in ovarian cancer.

Résumé : Les maladies cardiovasculaires représentent, par une large mesure, la première cause de morbidité et de mortalité chez les diabétiques. L’activation de RAGE par les produits de glycation avancée (AGE) générés en conditions hyperglycémiques est associée à une multitude de complications diabétiques vasculaires, notamment par une signalisation favorisant l’inflammation chronique ainsi que la mort des cellules formant les tissus et les organes exposés aux AGE. La surexpression de RAGE dans les cellules musculaires lisses des plaques athérosclérotiques vulnérables suggère que le récepteur pourrait contribuer à la survenue des accidents vasculaires. Nous avons donc émis l’hypothèse que l’activation de RAGE dans les cellules musculaires lisses était impliquée dans leur apoptose. Pour le vérifier, nous avons, dans un premier temps, mis au point une nouvelle méthode de détection sans marqueur basée sur le principe de la résonance des plasmons de surface (SPR) pour mesurer l’apoptose d’une monocouche cellulaire en temps réel et caractériser avec précision les paramètres cinétiques des phases d’initiation et d’exécution. Cet essai a permis de montrer que l’activation de RAGE induit l’apoptose dans plus de 75,6% des cellules musculaires lisses stimulées avec le CML-HSA pendant 20 heures. De surcroît, nous avons remarqué que l’activation de RAGE générait un fort stress du réticulum endoplasmique, indiqué par la formation d’un grand nombre de granules de stress ainsi que par l’augmentation de l’expression du marqueur de stress réticulaire HuR et de la caspase-9, deux importants régulateurs de l’apoptose induite par le stress réticulaire endoplasmique. Afin de vérifier le potentiel d’un antagoniste à bloquer l’activation du récepteur, nous avons ensuite synthétisé le peptide iRAGE dont la séquence est dérivée d’un site de liaison du CML-HSA ayant la particularité de posséder de nombreuses charges négatives à pH physiologique. Le prétraitement avec iRAGE s’est montré efficace pour prévenir l’activation de NF-κB, l’induction de l’apoptose et l’augmentation du stress réticulaire endoplasmique. Nous suggérons un modèle de fonctionnement par lequel iRAGE inhibe la signalisation de RAGE en empêchant la liaison des ligands multimériques et en stabilisant les récepteurs sous forme de monomères. À terme, la synthèse d’un antagoniste de RAGE utilisable en clinique pourrait constituer une avancée majeure dans la prévention des complications vasculaires et l’amélioration de la qualité de vie chez les diabétiques. / Abstract : Cardiovascular diseases represent, to a large extent, the first cause of morbidity and mortality among people with diabetes. RAGE activation by advanced glycation end products (AGE) generated in hyperglycemic conditions is associated to a multitude of vascular diabetic complications, in particular by a signaling promoting chronic inflammation as well as death of cells forming tissues and organs exposed to AGE. Overexpression of RAGE in smooth muscle cells of vulnerable atheromatous plaques suggests the receptor could contribute to heart attacks and strokes. Therefore, we hypothesize that RAGE activation in smooth muscle cells is involved in apoptosis. To verify this hypothesis, we first designed a new label-free assay based of surface plasmon resonance (SPR) to measure apoptosis of a cell monolayer in real-time and to characterize precisely the kinetic parameters of the initiation and execution phases. This assay showed that RAGE activation induces apoptosis of more than 75.6% of smooth muscle cells stimulated with CML-HSA for 20 hours. Moreover, we noticed that RAGE activation generated strong endoplasmic reticular stress, indicated by the formation of a great number of stress granules as well as the increased expression of stress marker HuR and caspase-9, two important regulators of reticular stress-induced apoptosis. In order, to assess the potential of an antagonist to block RAGE activation, we then synthesized the iRAGE peptide whose sequence is derived from a binding site of CML-HSA that has the particularity of owning numerous negative charges at physiological pH. Pretreatment with iRAGE was successful to prevent activation of NF-κB, induction of apoptosis and generation of endoplasmic reticular stress. We suggest a model by which iRAGE inhibits RAGE signaling by hindering the binding of multimeric ligands and by stabilizing the receptors in a monomer state. Ultimately, the synthesis of a RAGE antagonist usable in clinic could constitute a major progress in the prevention of vascular complications and in the quality of life of people with diabetes.

La MAP kinase p38 régule la transduction du signal en réponse à un stress environnemental. Les inhibiteurs spécifiques de p38, qui sont connus pour bloquer la production de cytokines pro-inflammatoires, mais peuvent également intervenir sur le phénomène d'apoptose. C'est dans cette dernière optique que de nouvelles structures d'inhibiteurs, ont été synthétisées. Ces structures, après caractérisation par RMN, ont été ensuite évaluées en termes de mécanisme d'action et de disponibilité biologique. Outre les méthodes classiques cette évaluation a finalement fait appel aux techniques HR-MAS. Les sept molécules ainsi synthétisées ont été regroupées en trois famille (1a, 2a-c, 3a-c). Quoique les propriétés physico-chimique de ces motifs soient très différentes, il en ressort une potentialité d'action commune en tant qu'inhibiteur de la MAP kinase p38.

Il est maintenant admis que l’activité anti-tumorale du TNF implique une destruction de la vascularisation de la tumeur par induction d’apoptose des cellules endothéliales. Si le traitement au TNF en thérapie humaine permet des rémissions complètes, il n’est applicable qu’aux membres isolés de la circulation systémique car les doses requises de TNF sont létales pour le patient. Mettre en évidence les mécanismes qui contrôlent l’apoptose de la cellule endothéliale devrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques favorisant l’effet thérapeutique du TNF tout en évitant le choc septique qu’il engendre. Nous avons abordé cette question en utilisant le modèle de la cellule endothéliale d’aorte bovine (BAEC) stimulée au TNF afin d’étudier les mécanismes qui contrôlent le processus apoptotique et ce au cours des phases précoces de celui-ci. D’une part, nous avons identifié par une approche pharmacologique au moins trois voies de contrôle négatif d’induction de mort cellulaire par le TNF dans les cellules endothéliales : la première faisant intervenir une des protéines kinases C, une seconde la PI3-kinase et une troisième la protéine kinase p38. Cette dernière semble spécifiquement activée par le TNF et pourrait donc constituer une nouvelle cible pharmacologique visant à sensibiliser les cellules endothéliales de la vascularisation de la tumeur à l’action apoptotique du TNF. D’autre part nous avons mis en évidence et identifié par une approche protéomique au moins deux protéines montrant une rapide diminution de phosphorylation lorsque les cellules endothéliales sont stimulées par le TNF en présence de cycloheximide. Ces deux événements semblent en aval de l’activation d’une protéase de la famille des caspases. La première protéine est la sous-unité régulatrice de type II alpha (RIIα) de la protéine kinase A. Cependant, la relation entre cette déphosphorylation et le processus d’apoptose n’a pas pu être mise en évidence, une stimulation de l’activité PKA n’affectant pas l’induction d’apoptose des BAEC. La seconde est la protéine HDGF, connue pour être sur-exprimée dans certains cancers, mais dont la régulation par phosphorylation ainsi que son implication éventuelle lors du processus apoptotique n’avaient encore jamais été envisagées. Enfin, nous avons voulu mettre en évidence le rôle potentiel de la protéine hnRNP K qui subit une modification post-traductionnelle précoce lors de l’apoptose des BAEC. Notre étude, menée après surexpression de la protéine étiquetée, suggère une modification autre qu’une dégradation. Cependant, il ne nous a pas été permis de lui attribuer un rôle puisque la surexpression de cette protéine n’affecte pas l’apparition de différents marqueurs associés à l’apoptose.