Orientador: Michiko Sakate / Banca: Noeme de Sousa Rocha / Banca: Maria do Carmo Fernandez Vailati / Banca: Mário Roberto Hatayde / Banca: Márcia Ferreira da Rosa Sobreira / Resumo: O uso de antiinflamatórios não esteroidais (AINEs) aumentou significativamente na clínica médica de pequenos animais após a descoberta de AINEs seletivos, e isso resultou em uma elevação da incidência de intoxicações por estes medicamentos. O presente estudo teve como objetivo avaliar a histologia e o índice apoptótico hepático, níveis de citocinas séricas e fibrinogênio plasmático nos ratos tratados com diclofenaco, meloxicam e firocoxibe. Utilizaram-se 90 animais que foram divididos em seis grupos de 15 animais cada: G1 - controle: 0,3mL/100g de solução fisiológica; G2 - diclofenaco de sódio: 15mg/kg; G3 - meloxicam: 2mg/kg; G4 - meloxicam: 10mg/kg; G5 - firocoxibe: 5mg/kg; G6 - firocoxibe: 25mg/kg. A medicação foi realizada por meio de gavage, a cada 24 horas, por cinco dias. Após a eutanásia dos ratos, foram colhidos materiais para dosagens de fibrinogênio e citocinas, análise histopatológica e de apoptose hepática. Os ratos tratados com diclofenaco, meloxicam e firocoxibe não apresentaram diferença estatística em relação aos índices apoptóticos hepáticos. A concentração sérica de TNF- foi semelhante em todos os grupos avaliados, e a IL-10 foi maior nos grupos tratados com os AINEs quando comparada ao grupo de solução fisiológica. O fibrinogênio plasmático elevou-se nos ratos tratados com diclofenaco e com meloxicam. As alterações histopatológicas foram mais frequentemente observadas nos animais que receberam diclofenaco e alterações leves, com o uso de meloxicam e firocoxibe. O meloxicam e o firocoxibe foram considerados AINEs seguros, pois não causaram alterações significativas nos ratos tratados com a dose recomendada e discreto grau de toxicidade no grupo tratado com cinco vezes a dosagem / Abstract: The employ of non-steroidal anti-inflammatory drugs increased significantly in medical clinic of small animals after the discovery of NSAID selected and this effected in an increase of times of intoxications by these medicines. The present study aims to evaluate the histology and the hepatic apoptotic index, quantify serum dosage of cytokines and plasmatic fibrinogen in rats deal with diclofenac, meloxicam and firocoxibe. It were used 90 animals which they're divided in six groups with 15 animals each one. G1- control: 0.3mL/100g physiologic solution; G2- diclofenac: 15mg/kg (positive control); G3- meloxicam: 2mg/kg; G4- meloxicam: 10mg/kg; G5- firocoxib: 05mg/kg; G6- firocoxib: 25mg/kg. Medication was administered though gavage every 24 hours by five days. After euthanasia of these rats, were cropped materials to dosing of fibrinogen, cytokines, hipathology and hepatic apoptosis. The rats which were under care with diclofenac, meloxicam and firocoxibe didn't show difference statistics in report to the hepatic apoptotic index. TNF- serum concentration was similar to all groups and IL-10 concentration was higher on the groups which were under care with the AINEs when were compared with the group of physiological solution. The plasma fibrinogen is elevated in rats treated with diclofenac and meloxicam. The most frequency histopathological changes were observed in animals that received diclofenac and mild changes, with the use of meloxicam and firocoxib. Meloxicam and firocoxib cam be considered NSAIDs safe, because they didn't cause significatives alterations in the rats treated with the recommended dose and a slight degree of toxicity in the group treated with five times the dosage / Doutor

Evidências sugerem o envolvimento de mecanismos de resiliência celular, estresse e de alterações epigenéticas na patofisiologia dos transtornos de humor, como o transtorno bipolar (TB) e o transtorno depressivo maior. Os estudos apresentados nesta tese tiveram como objetivo explorar esses mecanismos de forma translacional, partindo da avaliação da morte e sobrevivência celular até a correlação dos achados com a resposta ao tratamento. O primeiro capítulo se propôs a revisar dados da literatura com relação à progressão do TB, os quais apontam para uma série de alterações biológicas envolvendo resiliência celular em pacientes com diferentes estágios do transtorno. O segundo capítulo teve como objetivo avaliar parâmetros de morte celular em pacientes com TB, onde um aumento na frequência de células em apoptose inicial foi detectado em comparação a controles. Em seguida, considerando os efeitos potenciais dos glicocorticóides na indução de apoptose, o terceiro capítulo avaliou a atividade do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) em pacientes com TB, seus irmãos e em controles saudáveis, além de mecanismos moleculares associados ao eixo. Nossos resultados sugerem uma disfunção do eixo HPA em pacientes associada a uma hiporresponsividade do receptor de glicocorticóide, maiores níveis da proteína ligante de FK506 de 51 kDa (FKBP51) e um aumento da metilação do gene FKBP5. Nós ainda observamos que os pacientes com maior número de episódios apresentaram uma disfunção do eixo mais pronunciada do que aqueles em estágio inicial. No quarto e último capítulo nós realizamos um estudo para verificar os mecanismos moleculares pelos quais o estresse pode induzir alterações epigenéticas envolvendo a metilação do DNA, onde descrevemos o efeito oposto das cochaperonas FKBP51 e FKBP52 sobre a fosforilação da enzima DNA metiltransferase 1 (DNMT1). Além disso, a redução da fosforilação da DNMT1 correlacionou-se com uma melhor resposta clínica ao tratamento em pacientes com transtorno depressivo maior. Em suma, os resultados desta tese sugerem que a resiliência celular, a resposta ao estresse e a metilação do DNA desempenham importantes papéis na patofisiologia, progressão e resposta ao tratamento de pacientes com transtornos de humor. Novos tratamentos com alvo em mecanismos epigenéticos, na modulação do receptor de glicocorticóide e no aumento da resiliência celular devem ser priorizados em estudos futuros. / Evidence suggests the involvement of cellular resilience mechanisms, stress, and of epigenetic alterations in the patophysiology of mood disorders, such as bipolar disorder (BD) and major depressive disorder. The studies presented in this thesis aimed at exploring these mechanisms in a translational fashion, going from the assessment of cellular death and survival to the correlation of findings with the response to treatment. The first chapter aimed at reviewing data from the literature regarding the progression of BD, which point to a series of biological alterations involving cellular resilience in patients at different stages of the disorder. The second chapter aimed at assessing cell death parameters in patients with BD, in which a higher frequency of cells in early apoptosis was detected when compared to controls. In addition, considering the potential effects of glucocorticoids in the induction of apoptosis, the third chapter assessed the activity of the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis in patients with BD, their siblings, and in healthy controls, in addition to the molecular mechanisms associated with the axis. Our results suggest a dysfunction of the HPA axis in patients associated with a hyporesponsiveness of the glucocorticoid receptor, increased FK506-binding protein of 51 kDa (FKBP51) levels, and increased methylation levels at the FKBP5 gene. We also noted that patients with a greater number of previous episodes presented a more pronounced dysfunction of the axis when compared to early-stage patients. In the fourth and last chapter we performed a study to verify the molecular mechanisms by which stress can induce epigenetic alterations involving DNA methylation, where we describe opposing effects of the cochaperones FKBP51 and FKBP52 on DNA methyltransferase 1 (DNMT1) phosphorylation. In addition, the reduction of DNMT1 phophorylation was correlated with a better clinical response to treatment in patients with major depressive disorder. In summary, the results of this thesis suggest that cellular resilience, response to stress and DNA methylation play key roles in the pathophysiology, progression and response to treatment in patients with mood disorders. Novel treatments targeting epigenetic mechanisms, the modulation of the glucocorticoid receptor, and enhancing cellular resilience should be prioritized in future studies.

Glioblastoma (GB) é o tumor cerebral maligno mais frequente. O prognóstico para os pacientes é ruim e a sobrevida média após o diagnóstico varia de 6 meses a 1 ano. Isso ocorre devido à ineficácia das estratégias terapêuticas dos tratamentos atuais, pois esses tipos de tumores são altamente invasivos. Deste modo, novas estratégias terapêuticas são necessárias. Neste contexto surge a doxazosina (2 - {4 - [(2,3-dihidro-1,4-benzodioxano-2-il) carbonil] piperazina-1-il} -6,7-dimetoxiquinazolina-4amina, um composto quinazolínico pertencente à classe farmacológica dos antagonistas dos receptores adrenérgicos α1, amplamente utilizada na clínica para o tratamento de pressão arterial elevada, assim como no tratamento de retenção urinária relacionado com a hiperplasia benigna da próstata (BPH). O presente estudo avaliou os efeitos do tratamento com doxazosina em modelos experimentais de gliomas humano (U-138MG) e de rato (C6). Observamos que a doxazosina foi capaz de inibir a viabilidade na linhagem celular de glioma de rato C6. Além disso, o fármaco permaneceu estável no meio de cultura após 48 horas de incubação e foi captado pelas células de glioma C6, não apresentando efeito tóxico sobre as células não tumorais (cultura organotípica e cultura primária de astrócitos) em concentrações inferiores a 250µM. Os resultados mostraram que doxazosina foi capaz de diminuir a densidade celular e induzir a morte celular em ambas as linhagens (U-138MG e C6). Além disso, o fármaco induziu a diminuição da fosforilação das proteínas Akt e GSK-3β em 24 e 48hs de tratamento. São vários os possíveis mecanismos que possam estar associados com a ação da doxasozina, dentre eles apoptose, necrose, senescência e/ou autofagia. / Glioblastoma (GB) is the most frequent and most malignant human brain tumor. The prognosis for the patients with GB remains dismal, as median survival after diagnosis varies from 6 month to 1 year. This is largely due to the inability of current treatment strategies to address the highly invasive nature of this disease. Thus, new therapeutic strategies are needed. Doxazosin (2-{4-[(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-2yl)carbonyl]piperazin-1-yl}-6,7-dimethoxyquinazolin-4-amine, a quinazoline compound, is an selective α1-adrenoceptor antagonists, widely used for treatment of high blood pressure as well as in the treatment of urinary retention related with prostate benign hyperplasia (BPH). Doxazosin α1-adrenoceptor antagonists is a very promissing quinazoline drug, may represent chemical starting points to develop more potent death inducing agents free of α1-adrenoceptor antagonistic action and suitable for cancer treatment with minimal and well-tolerated side effects. Within this context, the present study was designed to evaluate the effects of doxazosin treatment in experimental models of gliomas. Doxazosin was able to viability inhibition of the C6 glioma cell line. Moreover, the drug seems to be stable in the culture medium after 48 hours of incubation and was taken up by C6 glioma cells and showed no toxic effect on non-tumor cells at concentrations below 250µM. The results showed that doxasozin was able to decrease cell density and induce cell death in both lineages. In addition, doxazosin induced the inactivation of Akt and of GSK-3β proteins after 24 and 48 hours. Taken together, our results show that doxazosin was able to significantly induce cells death of both, human and rat glioma lines (U-138MG and C6 respectively). The mechanisms associated with this effect involve apoptosis induction, necrosis, senescence or autophagy.

Die Apoptose der Leberzellen ist abhängig von externen Signalen wie beispielsweise Komponenten der Extrazellulären Matrix sowie anderen Zell-Zell-Kontakten, welche von einer Vielfalt und Vielzahl an Knoten verarbeitet werden. Einige von ihnen wurden im Rahmen dieser Arbeit auf ihre Systemeffekte hin unter- sucht. Trotz verschiedener äußerer Einflüsse und natürlicher Selektion ist das System daraufhin optimiert, eine kleine Anzahl verschiedener und klar voneinander unterscheidbarer Systemzustände anzunehmen. Die verschiedenartigen Einflüsse und Crosstalk-Mechanismen dienen der Optimierung der vorhandenen Systemzustände. Das in dieser Arbeit vorgestellte Modell zeigt zwei apoptotische sowie zwei nicht-apoptotische stabile Systemzustände, wobei der Grad der Aktivierung eines Knotens bis zu dem Moment stark variieren kann, in welchem der absolute Systemzustand selbst verändert wird (Philippi et al., BMC Systems Biology,2009) [1]. Dieses Modell stellt zwar eine Vereinfachung des gesamten zellulären Netzwerkes und seiner verschiedenen Zustände dar, ist aber trotz allem in der Lage, unabhängig von detaillierten kinetischen Daten und Parametern der einzelnen Knoten zu agieren. Gleichwohl erlaubt das Modell mit guter qualitativer Übereinstimmung die Apoptose als Folge einer Stimulation mit FasL zu modellieren. Weiterhin umfasst das Modell sowohl Crosstalk-Möglichkeiten des Collagen-Integrin-Signalwegs, ebenso berücksichtigt es die Auswirkungen der genetischen Deletion von Bid sowie die Konsequenzen einer viralen Infektion. In einem zweiten Teil werden andere Anwendungsmöglichkeiten dargestellt. Hormonale Signale in Pflanzen, Virusinfektionen und intrazelluläre Kommunikation werden semi-quantitativ modelliert. Auch hier zeigte sich eine gute Ubereinstimmung der Modelle mit den experimentellen Daten. / Apoptosis of liver cells is dependent on external signals such as components of the extracellular matrix and cell-cell-contacts, which are processed by a variety of numerous nodes of which several are examined here for their system effects. Despite different input interferences and presumably also due to natural selecti- on, the system nevertheless appears to be optimized to adopt a small number of clear and distinguishable states, and the various inputs and crosstalk mechanisms only optimize the best choice between them. For the model described within this work, two nonapoptotic and two apoptotic states are found, although the degree of activation at a node can differ widely until the absolute system state is altered (Philippi et al., BMC Systems Biology, 2009) [1]. The model is still a simplification of the complete cellular network and its different states, and operates independently of detailed kinetic data and parameters for individual nodes. Nevertheless, it allows modeling the readout of apoptosis after FasL stimulation with qualitative agreement and includes crosstalks from collagen/integrin signa- ling, the effect of genetic deletion of Bid and the consequences of viral infection. The second part of this work deals with other applications using this method. Semi-quantitative models are used for hormonal signaling in plants, viral infec- tions and intra-cellular communication. The simulated results fit to the experi- mental data provided.

La mitogaligine est une protéine codée par galig, un nouveau gène cytotoxique. Les résultats précédemment obtenus indiquent que cette protéine, adressée aux mitochondries, induit la fuite vers le cytoplasme d'un effecteur pro-apoptotique mitochondrial, le cytochromec. Cette nouvelle étude suggère tout d'abord, que l'interaction directe de la mitogaligine avec la cardiolipine, un phospholipide spécifique des mitochondries, puisse être à l'origine de la destabilisation des membranes mitochondriales, et expliquer ainsi la fuite de cytochrome c. Ce faisceau de résultats indique que la cytotoxicité de galig est associée à l'action de la mitogaligine sur les mitochrondries. Dans une seconde partie, la mort cellulaire induite par la mitogaligine a été caractérisée. Bien que les mitochondries soient précocemment altérées, il apparaît que la mitogaligine puisse également être adressée au noyau des cellules, et induire la mort cellulaire à partir de ce compartiment. Ces résultats suggèrent que l'activité cytotoxique de la mitogaligine puisse être régulée par son adressage subcellulaire.

La destruction du compartiment T CD4 induite par le VIH‐1 est essentiellement périphérique. Cependant, l'atteinte des précurseurs lymphocytaires T, pour laquelle existent des arguments, est encore mal connue. L'objectif de ce travail a été d'explorer le rôle de la protéine Nef, hors contexte d'infection virale, dans la différenciation lymphoïde. Nef, produite très tôt après l'infection par le VIH‐1, possède un rôle‐clé dans la pathogénie, comme en témoigne la reproduction, chez la souris transgénique pour Nef, d'une maladie proche de la maladie humaine. Dans les lymphocytes matures infectés, Nef module l'expression du récepteur CD4, des molécules du CMH de classe I et induit un état d'activation T. Nef interagit également avec de nombreux partenaires cellulaires impliqués dans des voies de signalisation cytokinique, de contrôle de l'apoptose et de l'ontogénie T. Au cours de ce travail, nous avons montré que l'expression de Nef en absence d'autres gènes viraux bloquait le potentiel T et NK des précurseurs hématopoïétiques humains par un mécanisme apoptotique indépendant des caspases et lié à une perturbation du potentiel mitochondrial. Grâce à l'utilisation du système de culture OP9‐DL1 permettant l'identification des premiers stades de différenciation des cellules T, nous avons montré que la génération de cellules T à partir de CD34+ est affectée à un stade CD3+CD5+CD1a+ qui a initié le réarrangement D‐J du TCRβ. Les stades suivant du développement T sont aussi affectés, en effet, une réduction quantitative du nombre de CD4 ISP et de DP CD4+CD8+ TCRαβ a été observée. Nef diminue aussi la génération de cellules NK CD56+ alors que la production de cellules B n'est pas affectée. Des analyses par dilution limite montrent une réduction significative de la fréquence des précurseurs T/NK parmi les cellules CD34+ exprimant Nef. Nous avons par ailleurs montré une augmentation de 15 à 25% de cellules apoptotiques dans les cellules exprimant Nef‐WT par rapport aux autres conditions. Cette apoptose n'est pas caspase dépendante et La voie Fas/Fas‐L ne semble pas entrer non plus en jeu. Nous avons par ailleurs pu déterminer que l'atteinte apoptotique des précurseurs passait par une déstabilisation mitochondriale, ceci grâce à un marquage DIOC6. L'ensemble des résultats regroupés dans de ce travail permet d'approfondir les connaissances des mécanismes d'interférence du VIH avec l'hématopoïèse et plus précisément des actions de Nef sur l'hématopoïèse humaine.

La détection de l'apoptose revêt un intérêt considérable en raison de son implication dans de nombreuses pathologies d'incidence élevée, comme le cancer ou la maladie d'Alzheimer pour n'en citer que deux. Des méthodes de mise en évidence de ce phénomène se multiplient et se développent sans cesse visant à détecter in vitro voire même in vivo, cette forme de mort cellulaire programmée. Grâce à son pouvoir de résolution élevé et à des agents de contraste spécifiques, l'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) offre la possibilité de détecter, de manière non invasive, les cellules apoptotiques. Cette approche trouvera son utilité pour la mise au point de traitements anti-tumoraux et pour leur suivi en clinique. Aujourd'hui, il existe des agents de contraste magnétiques capables de reconnaître les cellules apoptotiques, mais leurs molécules vectrices sont constituées de protéines, d'anticorps ou de leurs domaines dont on ne peut ignorer l'important pouvoir immunogène. Des molécules mimétiques ou des oligomères de petite taille comme des peptides seraient plus adaptés et plus simples à synthétiser chimiquement. Notre travail porte sur la sélection, de peptides capables de reconnaître spécifiquement les cellules apoptotiques, en se fixant à la phosphatidylsérine (molécule marqueur des cellules apoptotiques). Ces peptides ont été sélectionnés par la méthode du phage display. Le phage display est une technique de biologie moléculaire permettant de sélectionner, entre autre, des peptides de longueur déterminée, en fonction de leur affinité pour une cible donnée. Plusieurs milliards de séquences peptidiques exposées par les phages constituant la bibliothèque, peuvent être testés simultanément. Les meilleures séquences sont ensuite synthétisées chimiquement et testées indépendamment du phage. Dans la première partie de ce travail, plusieurs protocoles de phage display basés sur différentes méthodes d'immobilisation de la cible, et différents types de bibliothèques de phages ont été testés et comparés. A l'issue de ces sélections, plusieurs phages présentant une affinité élevée pour la phosphatidylsérine ont été sélectionnés. Un des peptides exposés par un de ces phages, nommé E3, a été synthétisé et étudié dans la seconde partie de ce travail. Le peptide E3 a été d'abord greffé à un contrastophore magnétique de type superparamagnétique (Ultra Small Particle Iron Oxide) pour être testé in vitro sur des systèmes biologiques (apoptose induite chez des cellules Hep G2 par la camptothécine). Après avoir été testé avec succès sur culture cellulaire, ce nouvel agent de contraste magnétique a été utilisé, in vivo dans le modèle murin d'apoptose hépatique induite par injection i.v. d'anticorps anti-Fas. Comme tout agent de contraste de type particulaire, le GG-E3-USPIO (peptide E3 greffé aux USPIOs par un pont diglycyle) serait capté de manière non spécifique par le foie. Il doit donc être rendu "furtif" pour permettre l'exploitation de sa spécificité. Afin de contourner le problème de capture non spécifique par le foie, le GG-E3-Gd-DTPA (peptide E3 greffé au Gd-DTPA par un pont diglycyle), un autre agent de contraste, cette fois de type paramagnétique, a été synthétisé. Les agents de contraste GG-E3-USPIO-PEG (peptide E3 greffé aux USPIO recouvertes de polyéthylèneglycol par un pont diglycyle) et GG-E3-Gd-DTPA se sont avérés efficaces, provoquant respectivement une diminution et un rehaussement du signal des foies apoptotiques de souris en IRM.

Introduction: L'apoptose est un mécanisme étroitement contrôlé qui répond à des besoins particuliers de l'organisme et permet une élimination physiologique des cellules excessives ou endommagées. Elle est donc nécessaire au développement et au maintien du bon fonctionnement de tout organisme vivant puisqu'elle joue un rôle important dans l'embryogenèse, dans les changements morphologiques, dans l'homéostasie cellulaire, dans l'atrophie et la réparation des tissus et dans la régression des tumeurs. Cette forme de mort cellulaire fait intervenir une famille de sérines protéases connues sous le nom de caspases. Leur activation survient après stimulation des cellules par différents facteurs comme des signaux physico-chimiques (UV, rayons gamma), la privation en facteurs de croissance ou une grande variété des molécules chimiques comme les polluants environnementaux et les médicaments anti-cancéreux. Parmi ces derniers on cite l'Adriamycine qui est un médicament anti-tumoral efficace, cependant son utilisation entraîne malheureusement de sévères altérations du fonctionnement cardiaque. Ceci limite par conséquent les doses pouvant être données sans danger aux patients cancéreux. D'autre part l'utilisation clinique de ce médicament semble être également limitée par la résistance que développent certaines formes de tumeurs à la chimiothérapie. Pour surmonter ces deux limites les chercheurs ont essayé de développer certaines stratégies thérapeutiques comme l'hyperthermie, visant à sensibiliser la tumeur aux faibles concentrations des médicaments. Objectifs: La présente étude permettra d'étudier le mécanisme de mort cellulaire induite par l'Adriamycine et l'hyperthermie. Les deux principaux piliers de ce projet sont: (1) Déterminer si l'Adriamycine ou l'hyperthermie utilisées séparément peuvent déclencher l'apoptose chez des cellules tumorales du col utérin humain (HeLa) et chez la même lignée exprimant la protéine de résistance aux médicaments MDR (HeLa MRP). (2) Déterminer si l'hyperthermie pourrait sensibiliser les cellules à l'action de l'Adriamycine. Résultats : L'Adriamycine ou l'hyperthermie utilisés séparément ou combiné avait comme effet une activation de la caspase initiatrice (9) et de la caspase effectrice (3) ainsi qu'un clivage de l'inhibiteur du facteur de fragmentation d'ADN activé par les caspases (ICAD). D'un autre coté l'hyperthermie a causé l'accumulation intracellulaire de l'Adriamycine, la diminution du potentiel membranaire mitochondriale due à une translocation du Bax vers la mitochondrie suivi d'un relarguage du cytochrome c vers le cytosol. Conclusion: L'hyperthermie seule pourrait induire l'apoptose et pourrait servir comme une stratégie utile pour augmenter l'effet pro-apoptotique de l'Adriamycine chez des cellules HeLa parentales ou résistantes aux médicaments (HeLa MRP). ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Hyperthermie, Résistance pléiotropique, MRPl, Apoptose, Adriamycine.

Thèse de doctorat : Pharmacologie expérimentale et clinique : Paris 12 : 2004. / Titre provenant de l'écran-titre.

Thèse de doctorat : Physique : Lyon, École normale supérieure (sciences) : 2006. / Bibliogr. en fin de chapitres.