Résumé Par leur capacité de moduler la réponse immune, les rayons ultraviolets (UV) ont trouvé des applications dans le traitement de diverses maladies immunes. Leurs mécanismes d’action sont encore incomplètement définis. L’un d’entre eux comporte l’induction de cytokines immunosuppressives et antiinflammatoires. Ce processus peut être provoqué par la phagocytose de corps apoptotiques, l’apoptose constituant une des lésions cellulaires élémentaires provoquée par les UV. Le but de notre travail a été de préciser les cytokines impliquées dans la réponse aux UV, de définir certains mécanismes de leur production et de la potentialiser par des agents pharmacologiques. Notre étude a comporté deux parties: (1) l’une in vivo chez des malades souffrant de GVH chronique résistante aux traitements conventionnels et traités par photochémothérapie extracorporelle, procédure dans laquelle les leucocytes du malades, prélevés par leucaphérèse puis traités par un psoralène et par UVA lui sont finalement réinjectés; (2) l’autre in vitro où des PBMC de volontaires sains ont été irradiés avec 10J/m2 de rayons UVC qui ne nécessitent pas de photosensibilisation par psoralène. Deux cytokines, l’IL-10 et l’IL-1Ra ont été évaluées par RT-PCR dans un système de coculture autologue entre PBMC et PBL rendus apoptotiques par irradiation. L’évolution du processus apoptotique déclenché par les UV a été mesurée par cytomètrie de flux. Celui-ci concernait essentiellement les lymphocytes, les monocytes/macrophages révélant une résistance relative à l’apoptose, il était progressif, culminant entre la 24ème et la 48ème heures. Lors des cocultures entre PBMC et PBL irradiés, un accroissement très significatif du nombre de copies d’ARNm, concernant les deux cytokines étudiées, l’IL-10 et l’IL-1Ra était observé. L’induction d’IL-1Ra était dépendante de l’IL-10. Une préactivation par du LPS était nécessaire pour la révélation du phénomène. Ensuite, nous avons évalué l’implication sur la synthèse de cytokines du processus de phagocytose de lymphocytes rendus apoptotiques par irradiation UV et divers moyens pharmacologiques pour la potentialiser. La préincubation du matériel irradié pendant une nuit (16h) à 37° dans le but d’accroître la proportion de cellules en voie d’apoptose avant mise en contact avec les PBMC a permis d’obtenir un accroissement très marqué sans nécessiter de LPS, portant essentiellement sur la production d’IL-1Ra tant sur l’ARNm que la protéine secrétée; l’induction d’IL-10 était cette fois négligeable. L’implication de la phagocytose dans le processus a été démontrée par deux agents bloquants (a) l’anticorps monoclonal anti-CD36 (corécepteur avec l’intégrine V3 de la thrombospondine) activant la production d’IL-1Ra et mimant par ce fait le processus phagocytaire et (b) la cytochalasine E la bloquant. Nous avons testé diverses substances pharmacologiques dont l’action activatrice de l’IL-1Ra est connue, en l’occurrence les immunoglobulines G à usage IV (IgIV) et le GM-CSF. L’adjonction d’IgIV (1mg/ml) ou GM-CSF (10 ng/ml) une heure après le début de la coculture exerce sur la sécrétion d’IL-1Ra un effet additif avec les UV. Selon la concentration utilisée, les IgIV peuvent agir par deux mécanismes. Outre l’effet d’activation macrophagique lié au récepteur Fc, nous avons démontré à haute concentration un mécanisme nouveau, du à la présence dans les IgIV d’anticorps naturels antiFas induisant l’apoptose des lymphocytes. Une incubation de 16h des lymphocytes avec 25 mg/ml d’IgIV avant mise en culture provoque outre une apoptose importante une augmentation significative de l’IL-1Ra. Dans ce cas, le processus est indépendant du fragment Fc, la fraction F(ab’)2 gardant la capacité d’induire l’apoptose et de provoquer la production d’IL-1Ra. En conclusion, nous avons mis en évidence un mécanisme nouveau d’induction d’IL-1Ra, non décrit auparavant et défini diverses modalités qui pourraient accroître sa production: - L’incubation de 16h du matériel irradié permet d’orienter le système en accroissant la production de l’IL-1Ra sans que la production de l’IL-10 soit modifiée et sans nécessiter de LPS. Nous attribuons cet effet à l’accroissement du processus apoptotique qui en résulte. - Nous avons potentialisé la production d’IL-1Ra par deux agents pharmacologiques, le GM-CSF et les IgIV. Les mécanismes d’action des IgIV dépendent de la concentration utilisée. 1. Aux concentrations de l’ordre de 1mg/ml, les IgIV exercent, avec les UV un effet additif sur l’induction d’IL-1Ra par une action dépendant du fragment Fc. 2. Aux concentrations élevées de 25mg/ml, un effet apoptotique attribuable à l’action d’anticorps anti-Fas agonistes est observé. Une préincubation de 16h de lymphocytes avec cette concentration d’ IgIV avant mise en culture avec les PBMC autologues provoque outre l’apoptose importante des lymphocytes un accroissement significatif de la production d’IL-1Ra. Le processus est indépendant du fragment Fc, la fraction F(ab’)2 gardant la capacité d’induire l’apoptose et la production d’IL-1Ra.

Les facteurs de transcription E2F sont impliqués dans différents processus physiologiques comme l'apoptose, la sénescence et la progression dans le cycle cellulaire par exemple. Des travaux antérieurs dans le laboratoire ont démontré que la localisation de E2F4 est dépendante du cycle cellulaire. Dans les cellules prolifératives de la crypte intestinale, E2F4 se localise au noyau alors que dans les cellules quiescentes ou différenciées, E2F4 est cytoplasmique. La localisation cellulaire de E2F4 est un élément important pour le contrôle de son activité transcriptionnelle. Nous avons analysé l'effet de l'expression nucléaire et constitutive de E2F4 dans un modèle de cellules épithéliales intestinales humaines normales (HIEC) pour en mesurer l'impact sur la prolifération et la survie cellulaire. Nous démontrons pour la première fois que E2F4 module l'expression de gènes associés à la régulation de la voie intrinsèque et extrinsèque de l'apoptose, un rôle qui lui était inconnu jusqu'à présent. Par interférence d'ARN, nous avons diminué les niveaux d'expression de p53, un gène au coeur de la régulation de l'apoptose. Nous avons observé que la mort cellulaire est significativement retardée. De plus, nous avons démontré que l'inhibition de l'activité des caspases ne prévient pas non plus la mort cellulaire. L'implication de mécanismes de mort cellulaire alternatifs p53 indépendants a été investiguée. Nos résultats démontrent que l'inhibition de l'activité des calpaïnes/cathepsines, de RIP, de la voie JNK, même en combinaison avec une réduction des niveaux de p53, ne font que retarder la mort cellulaire mais ne l'empêche jamais. Nos résultats indiquent que plusieurs mécanismes de mort cellulaire classiques (voies intrinsèque et extrinsèque) et alternatifs (ROS, autophagie, AIF) sont probablement activés par la surexpression nucléaire de E2F4 dans les cellules épithéliales intestinales. Nous avons aussi évalué l'importance de E2F4 dans le contrôle de la prolifération des cellules épithéliales intestinales humaines normales et cancéreuses. Nous avons observé un ralentissement important de la prolifération et une cinétique d'entrée en phase S ralentie pour les populations HIEC qui expriment des niveaux réduits de E2F4. Ce ralentissement est probablement attribuable à la modulation des niveaux d'expression autant en ARNm et en protéines de nombreux gènes régulateurs de la transition G1/S tels que c-myc, cdk2, les cyclines A et D ainsi que p21 et p27 notamment. L'impact majeur de E2F4 sur le contrôle de la transition Gl/S n'avait jamais encore été décrit dans la littérature. De plus, dans les lignées cellulaires cancéreuses colorectales, E2F4 est surexprimé et se localise préférentiellement dans le noyau. Cette observation est confirmée par l'utilisation d'une banque de tissus où nous avons constaté que dans 24 spécimens sur 30, E2F4 est surexprimé dans la tumeur par rapport au tissu normal et que E2F4 est surtout nucléaire Finalement, nous avons aussi diminué les niveaux d'expression de E2F4 par interférence à l'ARN dans les lignées cellulaires Caco-2/15 et HCT-116 pour en analyser l'impact sur la prolifération et la survie cellulaire. Dans les deux lignées, la réduction de l'expression de E2F4 induit un ralentissement de la prolifération significatif et elle réduit leur capacité à former des colonies en agar mou. Par ailleurs, la réduction des niveaux d'expression de E2F4 entraîne une entrée accélérée en sénescence cellulaire dans les cellules HIEC et induit l'apparition de caractéristiques liées à la sénescence dans la lignée cellulaire Caco-2/15 révélant ainsi un rôle insoupçonné de E2F4 dans le contrôle de la sénescence cellulaire. Pris ensemble, mes résultats démontrent que E2F4 est un acteur majeur du contrôle du cycle cellulaire, de la survie et de la sénescence cellulaire dans les cellules épithéliales intestinales humaines normales et cancéreuses.

Le but de ce travail était d'étudier l'activité anti-leucémique de UNBS1450, un cardénolide semi-synthétique appartenant à la famille des glycosides stéroïdes cardiaques, et qui a été démontré d'être doué d'un puissant potentiel inducteur d'autophagie dans les cellules cancéreuses issues de tumeurs solides. Par cette étude, nous démontrons pour la première fois que des concentrations nanomolaires de UNBS1450 exercent un effet pro-apoptotique sur des cellules leucémiques humaines. Par conséquent, nous avons élucidé les mécanismes moléculaires impliqués : nos résultats mettent en évidence une inhibition de la transactivation de NF-kB et une induction de l'apoptose par clivages des pro-caspases 8,9 et 3/7, en réprimant l'expression de Mcl-1 anti-apoptotique et en recrutant Bak et Bax, deux protéines pro-apoptotiques, aboutissant ainsi à une mort cellulaire apoptotique / The aim of this study was to investigate the anti-leukemic activity of UNBS1450, a hemi-synthetic cardenolide belonging to the cardiac steroid glycoside family, known to be a potent autophagy inducer in solid tumor cells. Interestingly, we hereby report for the first time that at low nanomolar concentrations, UNBS1450 induces apoptotic cell death in human leukemia cell lines. Subsequently, we have investigated the molecular mechanisms induced : Our results show that UNBS1450 inhibits NF-?B transactivation and triggers apoptosis by cleavage of pro-caspases 8, 9 and 3/7, by decreasing the expression of anti-apoptotic Mcl-1 and by recruiting pro-apoptotic Bak and Bax eventually resulting in cell death

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

TNF-Liganden liegen primär in membranständiger Form mit trimerer Struktur vor und die meisten von ihnen können sekundär durch Metalloproteasen in lösliche trimere Liganden prozessiert werden. Während membranständige Formen der TNF-Liganden ihre korrespondierenden Rezeptoren aktivieren können, sind die löslichen Varianten einzelner TNF-Liganden unterschiedlich aktiv beziehungsweise inaktiv an den korrespondierenden Rezeptoren, obwohl sie ebenfalls zur Bindung in der Lage sind. Dies konnte bereits in Studien für TNF und TRAIL gezeigt werden. Die Unterschiede zwischen löslichen Varianten und der membranständigen Form des Liganden betreffen sowohl die Rezeptorselektivität als auch den Aktivierungsgrad am Rezeptor bis hin zu völliger Inaktivität der löslichen Form. Unterschiede finden sich jedoch nicht nur hinsichtlich der Aktivität, sondern auch in der Interaktion des Liganden mit dem Rezeptor. Für die membranständige und die lösliche Form von FasL konnten Unterschiede in der Notwendigkeit intrazellulärer Signalmoleküle bei der Ausbildung Ligand-induzierter Rezeptorsignalcluster gezeigt werden. Für die lösliche und membranständige Form des CD40L werden eine unterschiedliche Rezeptorinternalisierung und eine unterschiedliche Rekrutierung von TRAF-Molekülen angenommen. Bisherige Arbeiten zur Untersuchung der Rezeptor-Ligand-Interaktion stützen sich meist auf lösliche Varianten von TNF-Liganden, die durch artifizielle Multimerisierung oder Antikörper-induzierte Quervernetzung sekundär aktiviert werden müssen. Um für die Untersuchung der Rezeptor-Ligand-Interaktion in Zukunft realitätsnähere Bedingungen zu schaffen, sollten im Rahmen dieser Arbeit multifunktionelle Fusionsproteine des membranständigen FasL und CD40L hergestellt und charakterisiert werden. Die Fusionsproteine wurden im Rahmen der Klonierung so konstruiert, dass von der aminoterminalen Seite beginnend eine GST-Domäne, ein Flag-Tag, ein YFP-Tag und abschließend die vollständige membranständige Form des Liganden (FasL oder CD40L) aneinander gefügt wurden. In FACS-Analysen konnte sowohl die Funktion des YFP-Tag als auch die korrekte Expression des Liganden an der Zelloberfläche durch spezifische Antikörperfärbung nachgewiesen werden. Die funktionelle Aktivität der Liganden wurde durch IL-8-Induktion gezeigt, die eine Aktivierung des NFB-Signalweges durch die GST-Fusionsproteine des membranständigen FasL und des membranständigen CD40L beweist. Im Rahmen von Immunopräzipitationen wurde die Möglichkeit der Detektion der Fusionsproteine über ihr Flag-Tag getestet. Für das in GST-pull-down-Assays genauer untersuchte membranständige GST-Flag-YFP-CD40L-Fusionsprotein gelang eine Koimmunopräzipitation mit dem im Rezeptorkomplex gebundenen TRAF2. Für dieses in der Signaltransduktion des CD40 entscheidende Molekül konnte seine transiente Interaktion mit dem Rezeptorsignalkomplex sowie eine Veränderung in der Assoziation an den Rezeptor durch TNF-abhängige TRAF1-Induktion gezeigt werden. Im Zusammenhang der mit der Rezeptoraktivierung oftmals gleichgesetzten Bildung von Rezeptorsignalclustern durch den entsprechenden TNF-Liganden war die Beobachtung interessant, dass das Konstrukt GST-Flag-YFP-CD40L im Gegensatz zum analog konstruierten GST-Flag-YFP-FasL nicht in der Lage war, Signalcluster des korrespondierenden Rezeptors zu erzeugen, aber dennoch fähig war, eine Rezeptoraktivierung zu bewirken. Hinsichtlich der Untersuchung von Unterschieden in der Rezeptor-Ligand-Interaktion von löslichen und membranständigen Formen sind für FasL und CD40L noch viele Fragen offen, die beispielsweise auch die Stabilität von Rezeptorsignalclustern betreffen. Die in dieser Arbeit erzeugten und charakterisierten multifunktionellen Fusionsproteine sollten helfen, neue Erkenntnisse bezüglich der molekularen Grundlagen der Rezeptor-Ligand-Interaktion zu erzielen. / TNF ligands primary are membranous ligands with a trimeric structure and the most of them can be cleaved to soluble trimeric forms by metalloproteases secondarily. While membranous forms of TNF ligands can activate their corresponding receptors, soluble variants ot some TNF ligands are insufficient for full activity or totally inactive. Nevertheless these variants are able to bind the corresponding receptor properly. This already could be shown in experiments with TNF and TRAIL. The differences between soluble variants and the membranous form of TNF ligands concern their receptor selectivity as well as their degree of activity at the receptor. There also are differences regarding the interaction itself between ligand and receptor. Comparing the membranous and the soluble form of Fas ligand there could be shown differences in terms of dependency for intracellular signaling moleculs regarding the formation of ligand induced clustering of the receptor. The soluble and the membranous form of CD40 ligand are supposed to have differences in receptor internalization and recruting of TRAF molecules. Previous research concentrating on receptor ligand interactions often is based on soluble variants of TNF ligands that have to be activated by artificial multimerization or antibody dependent aggregation. To provide more realistic conditions for the analysis of receptor ligand interactions, multifunctional fusionproteins of the membranous Fas ligand and the membranous CD40 ligand should be developed and characterized in this dissertation. Starting from the N-terminal end the fusionproteins contain a GST-domain, a Flag-tag, a YFP-tag and the complete membranous form of the ligand. In FACS analysis the activity of the YFP-tag as well as the correct expression of the ligand on the cell membrane could be demonstrated by specific antibody staining. The functional activity of the ligand itself has been shown by IL-8-induction, that proves the sucessful activation of the NFB signaling pathway by GST-fusionproteins of the membranous Fas ligand and the membranous CD40 ligand. In the context of immunoprecipitations the possibility of detection of the fusionproteins by Flag-tag has been tested. Concerning the GST-pull-down-assays of the fusionprotein GST-Flag-YFP-CD40L a coimmunoprecipitation with the intracellular adaptor protein TRAF2 could be shown. A transient interaction of TRAF2 with the receptor signaling complex as well as a change of its association with the receptor by TNF-induced TRAF1 upregulation also could be demonstrated. In context with the formation of high molecular receptor clusters that are often equated with receptor activation the observation was interesting that GST-Flag-YFP-CD40L in contrast to the analogous constructed GST-Flag-YFP-FasL could not induce signalling cluster of the corresponding receptor, but still was able to induce receptor activation. Regarding the analysis of differences in receptor ligand interaction between soluble and membranous forms of Fas ligand and CD40 ligand there are still many questions that have to be answered, e.g. in terms of stability of induced receptor clustering. The multifunctional fusionproteins provided by this dissertation shall contribute to gain new findings in respect of molecular fundamentals of the receptor ligand interaction.

O câncer de mama é o tipo mais frequente de neoplasia entre mulheres em todo o mundo e a taxa de mortalidade no Brasil ainda é alta. Os fármacos utilizados nos tratamentos convencionais, em geral, são tóxicos e, muitas vezes, induzem resistência nas células tumorais. Dessa forma, é extremamente importante identificar compostos com atividade antitumoral que possam melhorar as propostas terapêuticas contra o câncer de mama. A 7-epiclusianona é uma benzofenona tetraprenilada isolada a partir da fração hexânica do extrato bruto de Garcinia brasiliensis. Estudos mostraram que 7-epiclusianona apresenta diferentes propriedades biológicas, as quais incluem atividade antimicrobiana, anti-espasmódica, leishmanicida, anti-inflamatória e analgésica. Além disso, estudo prévio mostrou que o referido composto inibe a taxa de proliferação de linhagens celulares derivadas de cânceres humanos. Assim sendo, o objetivo do presente estudo foi analisar os efeitos citotóxicos e/ou antiproliferativo da 7-epiclusianona sobre linhagens celulares derivadas de carcinomas de mama humana. Os resultados mostraram que a 7-epiclusianona reduz a viabilidade celular nas linhagens MCF-7 e Hs 578T, sendo esse efeito dependente da concentração usada e do tempo de tratamento. A atividade antiproliferativa do composto sobre as linhagens estudadas está relacionada à sua capacidade de bloquear o ciclo celular na transição G1/S, enquanto a atividade citotóxica está relacionada ao seu potencial pró-apoptótico. 7-epiclusianona reduziu os níveis de RNA mensageiro para as ciclinas D1 e E na linhagem MCF-7, enquanto que, na Hs 578T, houve redução apenas nos níveis de expressão de ciclina E. Em conjunto, os dados obtidos consistentemente mostraram que 7-epiclusianona apresenta importante atividade antitumoral in vitro contra células derivadas de mama e abrem perpectivas para o uso desse composto em estudos in vivo que possam comprovar sua atividade antineoplásica para o câncer de mama. / Breast cancer is the most common type of cancer among women worldwide and its mortality rate is still high in Brazil. The drugs used in conventional treatments are generally toxic and often induce to tumor cells resistance. Thus, it is extremely important to identify compounds with antitumor activity that can improve the therapeutic approaches against breast cancer. 7-epiclusianone is a tetraprenyladed benzophenone isolated from the hexane extract of Garcinia brasiliensis. Studies have shown that 7-epiclusianone has different biological properties, which include antimicrobial, anti-spasmodic, leishmanicide, anti-inflammatory and analgesic activities. Futhermore, a previous study showed that this compound inhibits the proliferation rate of cell lines derived from human cancers. Therefore, the aim of this study was to analyze the cytotoxic and/or antiproliferative effects of 7-epiclusianone on human breast carcinoma cell lines. Results showed that 7-epiclusianone reduces the cell viability of MCF-7 and Hs 578T lines in a time and concentration dependent manner. Antiproliferative activity of this compound on studied cell lines are relates to its ability to inducing cell cycle arrest in G1/S transition, while the cytotoxic activity was attributed, at least in part, to its pro-apoptotic potential. 7-epiclusianone reduced the mRNA levels of both cyclins D1 and E in MCF-7, but only cyclin E expression was downregulated in Hs 578T. Taken toghether, the data consistently showed that 7- epiclusianone has an important antitumor activity against human breast carcinoma cell lines and open up the prospect of using this compound in further anticancer in vivo studies to confirm its antineoplastic activity against breast cancer.

A leucemia mieloide aguda (LMA) compreende um grupo heterogêneo de doenças hematológicas caracterizadas pela expansão clonal de células mieloides imaturas que apresentam diferentes tipos de alterações genéticas e epigenéticas. O diagnóstico requer a identificação de infiltração da medula óssea e/ou sangue por blastos mieloides leucêmicos em frequência igual ou superior a 20% das células nucleadas. Os tratamentos mais frequentemente empregados para a LMA englobam o uso de quimioterapia convencional com uso de citarabina e antraciclinas, bem como agentes imunoterápicos. Embora a pesquisa da biologia da LMA tenha levado ao desenvolvimento de novos agentes direcionados a alvos específicos como as mutações em FLT3, faltam avanços para os pacientes com outras leucemias que não a leucemia promielocítica aguda (LPA). A halofuginona (HF) é um derivado halogenado de febrifugina, que possui propriedades antifibróticas, anticancerígenas, antiinflamatórias e pró-apoptóticas. No presente estudo, avaliamos a indução de apoptose pela HF nas linhagens de LMA Kasumi-1,THP-1, MV4-11, U937 e OCI-AML3, verificando a sensibilidade ao tratamento. Verificamos que a linhagem Kasumi-1 foi sensível à atividade pró-apoptótica da HF exibindo dose efetiva 50 DE50 de 125,58 ng/ml, e que as células THP-1 foram resistentes exibindo DE50 de 786,15 ng/ml. As células Kasumi-1 sofreram diminuição significativa da percentagem de células na fase S do ciclo celular, enquanto que as percentagens de células THP-1 em qualquer das fases analisadas não se alterou em comparação às amostras controles tratadas com veículo. Usando a metodologia de Western Blot, foi detectada a ativação da via das caspases com aumento da clivagem de caspase 3 após 3 horas de incubação com HF nas amostras de células Kasumi-1 e após 12 horas para as células THP-1. Bandas correspondentes a forma clivada de PARP foram identificadas em amostras de células Kasumi-1 após 12 horas de tratamento e nas amostras de células THP-1 após 3 horas de tratamento. Usando a metodologia de Proteome Profiler TM Array - HumanPhospho-Kinase Array para rastreio de proteinas fosforiladas pelo tratamento com HF, detectamos que houve modulação de 3 proteínas diferencialmente para as duas linhagens, 9 proteínas moduladas exclusivamente nas células Kasumi-1 e 6 exclusivamente nas células THP-1 . Entre as alterações mais relevantes, destacamos a diminuição da fosforilação de Stat3 e Stat5 nas células Kasumi-1 e a diminuição das formas fosforiladas de p53 nas células THP-1. Nossos achados confirmam o efeito pró-apoptótico da HF, sobretudo nas células Kasumi-1, e sugerem que este efeito envolva a diminuição das fosforilações de Stat3 e de Stat5. / Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous hematological disorder characterized by the clonal expansion of immature myeloid cells exhibiting different types of genetic and epigenetic alterations. A diagnosis is established when a patient presents >= 20% of blast in the bone marrow or in the peripheral blood. The WHO classifies AML in seven subtypes depending on the morphology, immunophenotype, genetics and clinical presentation of the cells. The most common treatment until nowadays is chemotherapy in combination with cytarabine and anthracycline and furthermore also the application of immunotherapeutic agents. Although researchers have attempted to develop new agents targeting directly specific mutations such as FLT3, further studies are necessary to find new therapeutic approaches for other leukemic subtypes aside from acute promyelocytic leukemia (APL). Halofuginone (HF) is a halogenated derivate of Febrifugine, which is a molecule isolated from the plant Dichroa febrifuga. It has been demonstrated that Halofuginone exhibits antifibrotic, anti-cancerogenic, anti-inflammatory and pro-apoptotic properties. We evaluated the induction of apoptosis of HF in the AML cell lines Kasumi-1,THP-1, MV4-11, U937 e OCIAML3, we verified the sensitivity and resistance of these cell lines after treatment, performed a cell cycle analysis, analyzed the activation of proteins associated with apoptosis and the proteins associated with cell proliferation and survival. We established that the Kasumi-1 cell line was sensitive to the treatment of HF displaying a dose IC50 of 125, 58 ng/ml, while the THP-1 cell lines presented resistance displaying a dose IC50 of 786,15 ng/ml . When treated with HF, the Kasumi-1 cell line stopped in the S phase of the cell cycle displaying significant decrease of proliferation, while HF showed no significant on THP-1. Furthermore we performed a western blot and It was demonstrated that the cleavage of caspase 3 appeared after 3 hours of treatment in Kasumi-1 and after 12 hours of treatment in THP-1, while cleavage of caspase 9 appeared after 12 hours in both cell lines. PARP was cleaved in Kasumi-1 after 12 hours of HF treatment, whereas the cleavage of PARP in THP-1 remained the same after 3 hours of treatment. Performing the methodology of Proteome Profiler TM Array - HumanPhospho-Kinase Array we detected 3 proteins modulated in both cell lines, 9 proteins were modulated only in Kasumi-1 cells and 6 in THP-1 cells. Amongst the different tyrosine kinases and signaling pathways that were modulated, we observed that the phosphorylation of Stat3 and Stat5 was diminished in Kasumi-1, while THP-1 presented iii decreased phosphorylation of p53. Our findings confirm that HF exhibits pro-apoptotic effect on Kasumi-1 and is capable of modulating the various proteins important for cell survival.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-05-30Bitstream added on 2014-06-13T19:19:40Z : No. of bitstreams: 1 furquim_kcs_dr_rcla.pdf: 3634063 bytes, checksum: c8290792b15c0f58713ff90c2a0aace2 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As glândulas salivares de carrapatos fêmeas: em jejum, com dois e quatro dias de alimentação (em ingurgitamento), alimentadas (ingurgitadas), com três e sete dias pós-alimentação (pós-ingurgitamento); e de machos: em jejum, com dois, quatro e sete dias de infestação e com três e sete dias pós-remoção do hospedeiro, da espécie Rhipicephalus sanguineus, foram analisadas morfológica, histoquímica e citoquimicamente. Nas fêmeas elas são compostas pelos ácinos I (agranulares), II e III (granulares), e nos machos pelos ácinos I (agranulares), II, III e IV (granulares). Em ambos os sexos também foram observados ácinos Indeterminados, assim chamados devido ao processo degenerativo onde perderam suas características e não puderam ser identificados. Histologicamente os ácinos do tipo I sempre apresentaram uma célula central maior e várias periféricas menores, os do tipo II nas fêmeas apresentaram células indiferenciadas, indefinidas 1 e 2, a, b e c1 a c6 e nos machos as indiferenciadas, indefinidas 1 e 2, a, b e c1 a c8, tendo sido as indiferenciadas, as indefinidas 1 e 2 e as c5 a c8 descritas pela primeira vez. As células aqui denominadas de indeterminadas foram observadas nos ácinos II em estágio de degeneração. Os ácinos do tipo III apresentaram as células d, e e f e os do tipo IV células g. Quanto ao estágio, durante todo o processo de alimentação, tanto nas fêmeas quanto nos machos, os ácinos I sofreram apenas alterações no tamanho. Nos ácinos II de fêmeas em jejum apenas as células indiferenciadas, indefinidas 1 e 2 e a, c1 e c3 foram observadas; nos ácinos III os três tipos descritos estavam presentes. Nos machos em jejum os ácinos II e III tinham as mesmas características observadas nas fêmeas em jejum. Nos ácinos IV todas as células (g) estavam pouco ativas. Com o iniciar da alimentação, as glândulas passaram... / The salivary glands of the tick Rhipicephalus sanguineus were analyzed morphologically, histochemically and cytochemicallt at the following conditions: unfed, two and four-day fed, engorged females and females at day three and seven post-engorgement; and unfed males and males at day two, four and seven days post-attachment, and at day three and seven post-detachment from the rabbits. In females, these glands consist of types I (agranular), II and III (granular) acini and in males, of types I (agranular), II, III and IV (granular) acini. In both sexes, Indeterminate acini were also observed, which due to the degeneration process, have lost their characteristics and could not be identified. Histologically, type I acinus always exhibited a large central cell and several smaller peripheral ones. In females, type II acini are composed of undifferentiated, undefined 1 and 2, a, b and c1-c6 ; and in males, undifferentiated, undefined 1 and 2, a, b and c1-c8, with undifferentiated, undefined 1 and 2, and c5-c8 being described here for the first time. The cells termed in this study as indeterminate were observed in degenerating type II acini. Type III acinus exhibited cells d, e and f, while type IV acini, cells g. Regarding the feeding stage, throughout the entire process, in females as well as males, type I acinus only underwent changes in size. In type II acinus of unfed females, only undifferentiated, undefined 1 and 2 and a, c1, and c3 cells were observed, while in type III acinus, the three cell types described were present. In unfed males, type II and III acini exhibited the same characteristics observed in unfed females. In type IV acinus, all cells (g) were little active. With the start of feeding, glands began to secrete actively. In two-day fed females, all cell types were observed in type II acinus, except cells types undifferentiated, undefined 1 and 2... (Complete abstract, click electronic access below)