Les particules ribonucléoprotéiques (ou RNP) sont à la base de nombreuses fonctions cellulaires fondamentales. La formation de ces particules RNP est un processus très complexe qui nécessite de nombreuses étapes de maturation et de multiples facteurs d'assemblage. Par ailleurs, une structure correcte des particules RNP est essentielle à leur fonction. Il est donc critique de comprendre comment ces particules sont formées dans la cellule. Au cours de ma carrière, je me suis intéressée à plusieurs aspects de ces mécanismes.<br /> Au cours de ma thèse dirigée par Chantal Ehresmann (1990-1994), dans l'équipe de Bernard Ehresmann (UPR 9002 du CNRS) j'ai étudié le mode d'interaction de la protéine ribosomique S8 sur l'ARNr 16S d'E. coli. <br /> Mon travail post-doctoral dans l'équipe de David Tollervey (EMBL, Heidelberg (1994-1996) et Université d'Edimbourg (1996-2001) a porté sur l'étude des mécanismes de maturation, d'assemblage et de dégradation de diverses RNP. J'ai notamment contribué à la caractérisation de l'exosome, un complexe d'exonucléases 3'->5' impliqué dans la maturation et la dégradation de divers ARN chez la levure. J'ai également étudié le rôle de protéines chaperons dans la biogenèse des snoARN (biogenèse des ribosomes), des ARN ribosomiques et des ARNt. <br />En 2001, j'ai été recrutée au grade de chargée de recherche au CNRS dans l'équipe d'Alain Krol où nous étudions les mécanismes de synthèse des sélénoprotéines. L'incorporation de sélénocystéine dans les sélénoprotéines fait appel au recodage co-traductionnel d'un codon UGASec en phase. Chez les eucaryotes, ce mécanisme implique l'assemblage d'un complexe ARN-protéine au niveau d'une structure en tige-boucle ou ARN SECIS (Selenocysteine Insertion Sequence) située dans la région 3' non codante de l'ARNm des sélénoprotéines. La protéine SBP2 se fixe spécifiquement à l'ARN SECIS et recrute les facteurs de la machinerie de biosynthèse. Elle fait également partie de complexes supramoléculaires dans le cytoplasme et le noyau, suggérant un possible assemblage nucléaire de la mRNP SECIS. Nous avons montré que la protéine SBP2 présentait une origine évolutive commune avec des protéines de la famille L7Ae. Ces protéines partagent un domaine de liaison à l'ARN similaire et participent à la construction de plusieurs RNP essentielles telles les sous-unités ribosomiques, les snoRNP (biogenèse des ribosomes), les snRNP (épissage), et les mRNP codant pour les sélénoprotéines. Nos objectifs sont d'élucider les principes d'interaction SBP2/SECIS, d'identifier les composants moléculaires des complexes qui se forment autour du SECIS et de comprendre leur assemblage.<br />En collaboration avec Edouard Bertrand (Montpellier) et Bruno Charpentier et Christiane Branlant (Nancy) nous avons identifié une machinerie d'assemblage des RNP L7Ae conservée de la levure à l'homme et d'importance fondamentale pour la cellule. Elle est constituée d'une protéine adaptatrice et d'un complexe de protéines chaperons. Notre objectif est de comprendre son rôle dans l'assemblage des mRNP de sélénoprotéines.

Les bactériophages ARN F-spécifiques sont couramment utilisés comme des modèles de virus entériques pathogènes pour l’homme car ils ont une taille (~ 25 nm) et une structure proches. Néanmoins, en dehors de leurs cellules hôtes, les phages, tout comme les virus pathogènes, sont des particules biologiques inertes dont le comportement dépendra directement des propriétés de surface. Paradoxalement, peu de données sont connues dans ce domaine alors que ce sont des aspects incontournables, tant d’un point de vue théorique pour développer de nouvelles approches adaptées aux particules biologiques, que d’un point de vue industriel pour limiter le risque viral. L’objectif de ce travail est de préciser les propriétés interfaciales de bactériophages ARN Fspécifiques (charge, hydrophobicité) en milieu aqueux et en tenant compte des spécificités des particules biologiques notamment de leur perméabilité hydrodynamique. Nous avons également cherché à relier ces propriétés aux capacités d’adhésion-agrégation des particules virales. Deux aspects sont abordés : l’élimination des virus par des procédés de filtration membranaire et l’impact de l’agrégation sur l’estimation du nombre d’unités infectieuses. Dans la première partie, nous avons défini la nature et les caractéristiques de l’interface du phage MS2 et son impact sur les mesures de mobilités électrophorétiques. Pour la première fois, nous décrivons le comportement électrocinétique de particules biologiques sphériques constituées de plusieurs couches molles (génome, génome accolé à la capside, capside protéique) en prenant en compte l’anisotropie chimique et structurale des particules. Il en résulte des mobilités négatives dues à une perméabilité élevée, d’un ordre de grandeur égal à l’épaisseur de la capside protéique ( 2 nm). Cette perméabilité permet au flux électro-osmotique de « sonder » la charge négative du génome du phage MS2 et montre que les virus ne peuvent pas être assimilés à des particules dures non perméables. Le potentiel zêta (?) n’est donc pas adapté à ce type de particule. Comme le génome a un impact sur la charge du virus, nous nous sommes intéressés à quatre phages ARN F-spécifiques ayant des tailles de génome différentes : ~ 3500 nucléotides pour les phages MS2 et GA, ~ 4200 nucléotides pour les phages Qß et SP. En combinant des mesures de tailles et de mobilités pour différentes valeurs de pH (de 1,5 à 7,5) et de forces ioniques (NaNO3, 1 et 100 mM), nous avons défini l’échelle d’hydrophobicité suivante : GA et SP > Qß > MS2. De même, en nous basant sur les mobilités électrophorétiques, il ressort que la charge négative du phage Qß sous forme isolée est plus importante que celle du phage MS2 (perméabilité hydrodynamique supposée comparable à l’état isolé). Le point isoélectrique (pI) de la littérature pour le phage Qß (5,3) a d’ailleurs été remis en cause (entre 1,9 et 2,7 dans cette étude). Les mobilités des phages SP et GA ne peuvent être comparées aux autres car ces phages sont sous forme agrégée et donc présentent une perméabilité hydrodynamique différente. Ces propriétés interfaciales différentes permettent d’expliquer le comportement des phages MS2 et Qß lors d’un traitement par filtration membranaire. Les membranes classiquement utilisées dans le cadre du traitement de l’eau sont hydrophiles et électronégatives. Or, c’est bien le phage Qß qui est toujours moins bien éliminé, quelle que soit la porosité de la membrane (ultrafiltration ou microfiltration). Nous avons par ailleurs démontré que les techniques rapides de RT-PCR en temps réel sont aussi adaptées que la technique de référence par plages de lyse (UFP). Finalement, dans certains cas, l’agrégation virale pourrait expliquer la baisse des unités infectieuses (UFP) du phage MS2 en solution. Cette agrégation peut entraîner une baisse d’UFP de 1 à 3 log10. La congélation cause également une perte d’UFP mais celle-ci est due à la dégradation du virus et non à son agrégation. Ainsi, les méthodes expérimentales et théoriques développées dans cette thèse ont abouti à une meilleure connaissance des propriétés interfaciales des phages ARN F-spécifiques. Les résultats fondamentaux obtenus ont également mené à des avancées méthodologiques pour des applications industrielles. / thesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Produce un complejo de elongación ternario de la ARN polimerasa de Mycobacterium tuberculosis recombinante independiente del promotor transcripcionalmente activo. Para ello, prueba el efecto de las diferentes proporciones molares de las subunidades en la reconstitución in vitro de la ARN polimerasa de Mycobacterium tuberculosis, compara la coexpresión de la ARN polimerasa de Mycobacterium tuberculosis en Escherichia coli bajo dos temperaturas distintas: 25 y 37 °C y establece un método para la evaluación de la transcripción de dicha polimerasa independiente de promotor. / Tesis

Le nucléole est un compartiment spécialisé où les ARN ribosomiques (ARNr) sont transcrits, maturent et sont assemblés pour former les sous-unités du ribosome. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l'ADN ribosomique est transcrit en un précurseur de 35S qui code pour l'ARN 18S de la petite sous-unité ribosomique ainsi que les ARN 5.8S et 25S de la grande sous-unité du ribosome. Le nucléole contient environ 100 petites ribonucléoprotéines nucléolaires (snoRNP), qui sont constituées d'une molécule d'ARN (snoRNA) et de quelques protéines. Les snoRNA forment deux grandes familles: les familles à boîtes C/D et à boîtes H/ACA. Ces snoRNA servent de guides pour des modifications post-transcriptionnelles des ARNr, i.e. méthylation du ribose en 2'-OH (C/D) et pseudouridylation (H/ACA). Le snoRNA va d'abord s'apparier à l'ARNr et les protéines associées au snoRNA vont effectuer les modifIcations. Certains de ces snoRNA sont requis pour des réactions de clivage du précurseur des ARNr; ces clivages servent à éliminer des régions espaceur dans le pré-ARNr. Les snoRNP de la famille H/ACA contiennent quatre protéines essentielles, Cbf5p, Garlp, Nhp2p, et Nop10p. Contrairement aux autres snoRNA H/ACA, snR30 n'a pas de cible pour la pseudouridylation. Par contre, le snoRNA snR30 est essentiel dans les étapes de maturation menant à la production de l'ARNr 18S, ce qui n'est pas le cas des autres snoRNA H/ACA. Le but de cette recherche est de purifier le complexe snR30 et d'identifier ses composantes protéiques. snR30 possède probablement des protéines qui lui sont spécifiques, en plus des quatre protéines H/ACA, et qui contribuent à ses propriétés fonctionnelles uniques, à savoir, son rôle dans la maturation des ARNr. Afin de purifier snR30, l'aptamère SI a été utilisé et le contenu protéique de snR30 identifié par spectrométrie de masse. L'aptamère SI est une courte séquence d'acides nucléiques qui possède une haute affinité et spécificité pour la streptavidine. Cette séquence a été introduite par mutagenèse dirigée par PCR dans la séquence codant pour SNR30 et cette construction S1-SNR30 a été exprimée in vivo à partir d'un vecteur d'expression de levure. Il a ensuite été possible de purifier le complexe S1-snR30 par chromatographie d'affinité utilisant des billes couplées à la streptavidine. Le snoRNA SI-snR30 est associé non seulement aux protéines H/ACA Garlp et Nhp2p mais aussi à plusieurs autres protéines. Ces protéines doivent maintenant être identifiées afin de les caractériser et élucider leur(s) rôle(s) dans la maturation des ARNr. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : SnR30, Nucléole, Ribosome, ARN ribosomique (ARNr), Petit ARN nucléolaire (snoRNA), petite ribonucléoprotéine nucléolaire (snoRNP), H/ACA, Chromatographie d'affinité, Aptamère.

Récemment, notre laboratoire a identifié un nouveau site commun d'intégration rétrovirale sur le chromosome X chez la souris (S. Landais et al., 2005). Ce site a été associé à un nouveau gène, appelé Kaplan integration site 2 (Kis2), dont l'expression est augmentée dans les cellules tumorales. De façon surprenante, il ne code pour aucune protéine, et produit cinq transcrits d'ARN non codant comportant le précurseur (primiARN) du groupe de six micro-ARN (miARN): miR-106-363 (S. Landais et al., 2007). La compréhension de la fonction des produits de ce gène ainsi que les voies métaboliques dans lesquelles ils sont impliqués pourraient approfondir notre connaissance de la régulation de l'expression des miARN regroupés. L'expression transitoire de ce locus dans des vecteurs d'expression eucaryotes s'est avérée non fructueuse. Afin de contourner cet obstacle, nous avons eu recours à l'infection des cellules par les rétrovirus recombinants contenant le groupe miR-106-363 comme outil permettant l'expression stable du gène d'intérêt. Dans ce travail nous avons établi deux lignées cellulaires, NIH 3T3 (fibroblastes murins) et Ti6 (lymphocytes), qui expriment le gène Kis2 et le groupe miR-106-363 à l'aide de trois constructions rétrovirales. Grâce à la construction pMSCV-Kis2, nous avons surexprimé les miARN du groupe miR-106-363 dans les NIH 3T3 et les Ti6. La construction pLXSN-Kis2 a permis de produire l'un des plus grands transcrits du gène Kis2 (1.7 kb) dans la lignée Ti6. Le test d'indépendance d'ancrage réalisé sur les cellules exprimant le groupe miR-106-363 de façon stable a confirmé son implication dans la transformation maligne et a établi une corrélation entre le niveau d'expression des ces miARN et la gravité de la transformation. L'obtention d'un système d'expression efficace de Kis2/miR-106-363 nous permettra d'étudier plus en détail la fonction de ces miARN, d'identifier leurs cibles et leurs partenaires d'interaction ainsi que d'étudier leur rôle in vivo chez la souris. De plus, les cellules qui expriment le gène de manière stable seront la source infinie du matériel permettant de conduire les expériences à plus grande échelle y compris l'étude des molécules inhibitrices pour le traitement de la leucémie de type T. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : oncogenèse, ARN non codant, miARN, système d'expression rétroviral.

Thèse doctorat : Biologie Moléculaire Végétale : Strasbourg 1 : 2006. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 15 p.

Thèse de doctorat : Sciences du vivant : Strasbourg 1 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 195-221.

Thèse de doctorat : Biologie cellulaire et moléculaire : Evry-Val d'Essonne : 2008. Thèse de doctorat : Biologie cellulaire et moléculaire : Institute of protein Research Russian Academy of Sciences RUSSIE : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

Thèse de doctorat : Biologie Moléculaire : Nancy 1 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

Thèse de doctorat : Sciences du Vivant. Aspects moléculaire et cellulaire de la Biologie : Strasbourg : 2009. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 11 p.