Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement des petites tumeurs localisées, reposant sur l’action conjuguée d’un photosensibilisateur (PS), de la lumière et de l’oxygène. Dans le cadre d’un nouveau mode de PDT, la VTP (vascular targeted photodynamic therapy), notre stratégie a consisté à favoriser l’effet anti-vasculaire du traitement par ciblage de la néo-vascularisation tumorale. Pour cela, nous avons étudié in vitro et in vivo un PS de type chlorine (TPC) couplé, via le bras espaceur (Ahx), à un heptapeptide (ATWLPPR) spécifique d’un co-récepteur du VEGF, la neuropiline-1 (NRP-1). Une étude comparative de la TPC versus le PS conjugué (TPC-Ahx-ATWLPPR), a permis de mettre en évidence in vitro, grâce à une technique d’ARN interférence visant à éteindre l’expression de NRP-1, une incorporation cellulaire récepteur-dépendante du conjugué. In vivo, l’accumulation préférentielle de la TPC-Ahx-ATWLPPR au niveau de l’endothélium vasculaire de la tumeur ainsi que son effet anti-vasculaire après PDT ont été mises en évidence. Une étude de stabilité in vitro et in vivo du conjugué a été réalisée. In vivo, la séquence peptidique est dégradée 4 h après injection par voie intra-veineuse. Des études de pharmacocinétique et de biodistribution tissulaire de la TPC-Ahx-ATWLPPR et de son principal produit de dégradation, TPC-Ahx-A ont été réalisées chez la souris nude xénogreffée. La dégradation de la partie peptidique est majoritaire dans les organes du système réticulo-endothélial où l’accumulation du conjugué est la plus importante. Dans le but d’augmenter la stabilité in vivo du peptide adresseur, de nouveaux peptides ont été synthétisés, puis couplés à la TPC et testés. Le pseudopeptide A?[CH2NH]TWLPPR est prometteur car il reste affin vis-à-vis de NRP-1 et après couplage au PS, il ne subit aucune dégradation dans le 8plasma in vivo 4 h après injection par voie intra-veineuse. / Photodynamic therapy (PDT) is a treatment modality against small localized tumors, based on the combined action of a photosensitizer (PS), light and oxygen. A new method of PDT, the VTP (vascular targeted photodynamic therapy) was studied. The purpose of our strategy is to promote the anti-vascular effect of PDT by targeting the tumor vasculature. We studied the behaviour of the tetraphenylchlorine (TPC) conjugated, via the Ahx spacer, to a VEGF co-receptor (neuropilin-1) specific heptapeptide (ATWLPPR), in vitro and in vivo. A comparative study of TPC versus the conjugated PS, TPC-Ahx-ATWLPPR, allowed us to identify in vitro, using a technique of RNA interference-mediated silencing of NRP-1, a receptor-dependent uptake of the conjugate. In vivo, a preferential accumulation of TPC-Ahx-ATWLPPR in endothelial cells and its anti-vascular effect were demonstrated. A study of stability in vitro and in vivo of the conjugate was conducted. In vivo, the peptide sequence was degraded 4 h after intra-venous injection. Pharmacokinetics and tissue biodistribution studies of TPC-Ahx-ATWLPPR and its main degradation product, TPC-Ahx-A, was performed in bearing nude mice. The degradation process of the peptide is important in the organs of the reticulo-endothelial system, where the accumulation of the conjugate is majority. In order to improve in vivo stability of the targeting-peptide, new peptides were design and tested. The pseudopeptide A?[CH2NH] TWLPPR bound NRP-1, and after coupling with the PS, no degradation is observed in plasma in vivo 4 h after intra-venous injection.

L'ARN d'interférence (ARNi) est un mécanisme de régulation du gène qui permet un ciblage spécifique d'ARNmessager (ARNm) par reconnaissance de séquence. Les effecteurs de l'ARNi sont de petites molécules d'ARN non codants (siARN, microARN et piARN). Evoluant dans le contexte de l'ARNi, les virus de différentes familles ont adopté des stratégies afin utiliser l'ARNipour leur propre bénéfice. Le principal objectif de ma thèse a été d'étudier la fonction de l' ARNmiRTAR, un miARN viral dérivé de l'extrémité 3 'de l'ARN VIH-1 TAR dans la réplication du VIH-1. Nous avons constaté que miRTAR réguleà la fois l'activité basale et la transactivation induite par Tat du promoteur du VIH-1. L'effet de miRTAR ne nécessite pas de sa liaison à l'ARN TAR. miRTAR agit en augmentant l'activité de NF-kB, un facteur important pour la transcription du promoteur du VIH-1. En effet, la mutation des sites NF-kB, mais pas des sites Sp1 dans le LTR, abroge l'amélioration miRTARmédiée par la transcription. De plus, l'inhibition de l'expression de NF-kBpardes siARNspécifiquesdes les sous-unités p50 et p65, entraîne une perte d'activité dumiRTAR. Bien que nous n'avons pas pu identifier le(s) gène(s) cellulaire(s) ciblé par miRTAR, sa surexpression conduit à l'activation de la voie NF-kB. Mutation de l'extrémité 3 'du VIH-1 dans les résultats TAR réduction spectaculaire de la réplication virale Tat sans affecter médiée par la transcription, en raison de la perte de production de miRTARsauvage. Enfin, la surexpression de miRTARrestaure la réplication de ce virus contenant une mutation au niveau de la séquence TAR. En conclusion, nos résultats démontrent clairement que lemiRTARencodé par le VIH-1 joue un rôle clé dans la réplication du virus. Sur la base de ces résultats, nous proposons le modèle suivant pour la fonction de miRTAR. La transcription du LTR du VIH-1 conduit à la production de courts ARN dénommés TAR contenant une structure en épingle à cheveux. TAR est « processé » pour générer le miARN miRTAR. L'ARN miRTAR est ensuite chargé dans le complexe RISC et régule l'expression de plusieurs gènes cellulaires impliqués dans la régulation négative de NF-kB. miRTARmédiée par l'activation de NF-kB résultats dans la régulation de gènes viraux et par conséquent augmente la production de virus. L'ensemble de nos résultats montrent que le VIH-1 utilise la voie de l'ARNiinterférence pour optimiser l'environnement intracellulaire requis pour une réplication optimale. / RNA interference (RNAi) is a gene regulatory mechanism that offers a sequence specific targeting of mRNA. Evolving in the context of RNAi, viruses of different families adopted strategies to use RNAi for their benefit. The main objective of my thesis was to understand the function of miRTAR, a viral miRNA derived from 3' end of the HIV-1 TAR RNA, in HIV-1 replication. We found that miRTAR regulates both basal and Tat-mediated transactivation of HIV-1 promoter. The effect of miRTAR does not require its binding to TAR RNA. miRTAR acts by inducing NF-κB transcription factor important for the LTR activity. Indeed, mutation of NF-κB sites but not Sp1 sites within the LTR abrogate miRTAR-mediated enhancement of transcription from the LTR. Additionally, Inhibition of NF-κB using specific siRNA directed against p50 and p65 subunits results in loss of miRTAR activity. Although, we were unable to identify the cellular gene(s) targeted by miRTAR, its overexpression lead to the activation of NF-κB pathway. Mutation of the 3' end of HIV-1 TAR results in dramatic reduction of viral replication without affecting Tat-mediated transcription. Importantly, overexpression of miRTAR rescued the replication of miRTAR HIV-1 mutant virus.In conclusion, our results strongly demonstrate that the HIV-1 encoded miRTAR plays a key role in virus replication. On the basis of these findings, we propose the following model for the function of miRTAR. Transcription of the HIV-1 LTR leads to production of short, TAR containing, RNA hairpin sequences. TAR is processed to generate miRNA, miRTAR. miRTAR is then loaded into the RISC complex and regulates the expression of several cellular genes involved in the negative regulation of NF-κB. miRTAR-mediated activation of NF-κB results in up regulation of viral genes and consequently enhances virus production. Taken together, our results demonstrate that HIV-1 uses RNAi pathway to optimize the intracellular environment for optimal replication.

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Les travaux présentés dans ce mémoire portent sur la synthèse et à l'étude physico-chimique et biologique de nouveaux tensioactifs fluorés pour la conception de vecteurs non-viraux ayant un intérêt dans le domaine de l'interférence ARN. Dans un premier temps, en se basant sur l'expérience du laboratoire et sur l'étude des vecteurs existants, nous avons proposé un design moléculaire pour la synthèse d'amphiphiles bicaténaires géminis et monocaténaires. La synthèse a été réalisée par des méthodes simples et offre de bons rendements. Les tensioactifs préparés comportent des chaines grasses fluorées pour leurs propriétés spécifiques et des motifs polyaminés ou oxyéthylènique comme partie polaire. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés aux propriétés physico-chimiques de ces familles de molécules. Les tensioactifs géminis sont insolubles dans l'eau et forment des monocouches de Langmuir stables à l'interface air/eau. L'étude de ces monocouches révèle que l'organisation à l'interface est fortement dépendante du bras espaceur entre les deux chaines grasses fluorées. Les molécules monocaténaires quant à elles sont solubles dans l'eau, montrent une forte activité de surface et forment spontanément des vésicules en solution. Nous avons ensuite étudié l'interaction entre les produits synthétisés et un petit monobrin d'ADN de 23 bases. Une interaction relativement forte a été mise en évidence pour la plupart des molécules et nous avons essayé de relier la structure de ces molécules aux propriétés physico-chimiques et biologiques observées. Enfin, des tests préliminaires de viabilité cellulaire ont été effectués sur des cellules issues de poumon humain et montrent une bonne viabilité cellulaire pour des concentrations d'utilisation clinique classiques et une bonne stabilité dans le temps. Ces travaux laissent entrevoir un bon potentiel de vectorisation pour ces tensioactifs fluorés mais cela nécessite encore des études complémentaires comme la caractérisation complète des complexes formés avec l'ADN ainsi que des tests de toxicité cellulaire avant le moindre essai de transfection. / The work presented in this paper focus on the synthesis and characterization of physico-chemical properties of original fluorocarbon surfactants for obtaining nanovectors models to determine the qualifications required for efficient transport of oligonucleotides in the field of RNA interference. Building on the extensive work reported in the literature and the laboratory expertise in the field of fluorinated amphiphiles, we are interested in the synthesis of two major families of compounds. One corresponds to compounds of Géminis type with two fluorocarbon chains, two polar head groups derived from carboxylic acids and an oxyethylene or polyamine spacer arm. The structure of these compounds is conducive to the formation of stable Langmuir films that used to study interactions with the oligonucleotide. The second family corresponds to monocatenar counterparts who spontaneously self-assembled in vesicles, that is to say 3D models nanovectors. The characterization of the behavior at the air / water interface or in solution of these different molecules in the presence and absence of oligonucleotide allowed us to establish a number of relationships between molecular structure, physicochemical properties and complexation of the oligonucleotide. Preliminary tests of cell viability were performed on cells from human lung and have shown good cell viability at conventional clinical used concentrations and good stability over time. These studies suggest good potential for vectorization of these fluorinated surfactants but that still requires further study as the full characterization of complexes formed with DNA as well as tests for toxicity before testing cell transfection.

La protéine de rotavirus NSP3 est impliquée dans l’inhibition de la traduction des ARNm cellulaires polyadénylés et dans la stimulation la traduction des ARNm viraux lors de l’infection par le rotavirus. Ces deux fonctions de NSP3 ont été établies principalement par des essais in vitro et ont été en partie contestées par des expériences utilisant des siRNA sur des cellules infectées. L'objectif de mon travail de thèse a été de mettre au point un essai de traduction in vivo permettant de quantifier l’effet de NSP3 sur la traduction des ARNm viraux et des ARNm cellulaires. Plus particulièrement, nous avons voulu évaluer la part de la circularisation des ARNm (“close loop” : modèle d’initiation de la traduction eucaryote) et de la simple protection de l’ARN sur l‘expression des gènes viraux. Des essais de transfection d’ARN rapporteurs polyadénylés en cellules infectées par le rotavirus m’ont permis de montrer que l’infection par le rotavirus inhibe bien la traduction des ARNm cellulaires mais que la force de cette inhibition est dépendante de la souche de rotavirus utilisée. Parallèlement, j’ai pu montrer que l’infection par le rotavirus stimule bien la traduction d’ARN rapporteurs se finissant par GACC (pseudoviraux) et que l’expression de NSP3 seule est suffisante pour obtenir cette stimulation. La surexpression de NSP3 sauvage ou mutée suivie d’électroporations d’ARN rapporteur pseudoviraux dans des cellules BSR m’ont permis de montrer qu’une petite quantité de NSP3 (difficilement détectables par immunodétection) est suffisante pour induire une bonne stimulation de la traduction. Une analyse par RT-qPCR a permis de montrer que la stabilisation de l’ARN seule ne rend pas compte de la totalité de la stimulation de la traduction des ARNm viraux obtenue avec la protéine NSP3 entière. Par contre, j’ai observé que l’expression de NSP3 (en dehors d’une infection) provoque une augmentation non spécifique de la traduction des ARN quelles que soient leurs extrémités 3’. Ainsi, le blocage de la traduction des ARNm cellulaires au cours de l’infection ne dépend pas uniquement de la protéine NSP3. Enfin, la mise au point de ce système de traduction in vivo m’a permis de montrer que : 1/ seule l’extrémité 3’ GACC permet une forte stimulation de la traduction par NSP3 ; 2/ mis à part des contraintes extrêmes (longueurs très courtes des parties non codantes (UTR)), la traduction dépendante de NSP3 s’effectue correctement quels que soient les UTR sur l’ARN. / The rotavirus protein NSP3 is involved in the translation inhibition of polyadenylated cellular mRNAs and translation stimulation of viral mRNAs. These two functions of NSP3 have been established mainly by in vitro assays, then challenged by experiments using siRNA on cells infected. The objective of my thesis was to develop an in vivo translation assay to quantify the effect of NSP3 on the translation of viral and cellular mRNAs. More specifically, we wanted to assess the role of the circularization of mRNA ("closed loop" model of eukaryotic translation initiation) and the simple protection of the RNA on the expression of viral genes.Transfections of polyadenylated reporters RNA in infected cells showed that rotavirus infection inhibits the translation of cellular mRNAs and that the strength of this inhibition depends on the rotavirus strain used. Meanwhile, I was able to show that rotavirus infection stimulates strongly the translation of reporter RNA with a 3’ end GACC (viral-like) and that the expression of the sole NSP3 is sufficient for this stimulation. Overexpression of wild-type or mutated NSP3s followed by electroporation of viral-like reporter RNA in BSR cells showed that a small amount of NSP3 (hardly detectable by immunodetection) is sufficient to induce a good stimulation of translation. Moreover, quantification of transfected RNA by qRT-PCR showed that stabilization of the RNA does not only account for the totality of the stimulation of viral mRNA translation observed with NSP3wt. On the other hand, expression of NSP3 (without infection) causes a nonspecific increase of RNAs translation whatever their 3' ends. Thus, blocking the translation of cellular mRNAs during infection does not depends on the sole NSP3.Finally, the use of the in vivo translation system allowed me to show that 1/ only a 3' end GACC induces a strong stimulation of translation by NSP3 ; 2/ except for extreme constraints (like very short lengths of noncoding regions), NSP3-dependent translation works fine regardless of the UTR sequence.

Chez les organismes multicellulaires la diversité protéique dans chaque cellule et chaque tissu est obtenue initialement en régulant l’expression d’une partie des gènes d’un génome. Ces gènes sélectionnés peuvent ensuite être soumis à un épissage alternatif de sorte que certains exons sont retenus ou exclus dans l’ARNm final. Nous étudions les détails moléculaires de la protéine MEC-8, un facteur d’épissage tissu spécifique chez Caenorhabditis elegans. Les mutants MEC-8 sont responsables d’un phénotype insensible au touché chez Caenorhabditis elegans. Plus précisément, MEC-8 lie le pré-ARNm de mec-2 un composant des récepteurs mécanosensoriels afin de réguler la production d’un isoforme particulier nécessaire pour la transduction du signal mécanosensoriel. Des études portant sur le motif conservé de reconnaissance à l’ARN (RRM) chez des orthologues des vertébrés (RBPMS) et des insectes (couch potato, CPO) ont démontré la présence d’un motif d’homodimérisation dans le domaine RRM1 de MEC-8. Cependant MEC-8 contient aussi un second domaine RRM dans sa partie C-terminale, domaine qui n’est pas retrouvé dans les protéines RBPMS et CPO. Nous avons donc exprimé chaque domaine RRM de MEC-8 indépendamment ainsi que la protéine entière et ces constructions ont été utilisées pour diverses expériences biophysiques. Nous avons ainsi identifié la séquence de liaison optimale pour les deux domaines RRM1 et RRM2. Ces analyses ont aussi été menées sur les domaines homologues issus des protéines RBPMS et CPO qui présentent une forte affinité pour la même séquence d’ARN. Nous avons donc découvert que malgré des différences de fonction et de localisation les membres de la famille RBPMS lient tous le même motif d’ARN. Les détails atomiques des deux RRM en complexe avec leur motif de liaison ont été obtenus en utilisant de la spectroscopie RMN et de la cristallographique des rayons X. Les deux complexes RRM-ligand de MEC-8 présentent de surprenantes similarités dans leur architecture. / In multicellular organisms, proteomic diversity in each cell and tissue is provided initially by selective expression of gene subsets from the total genome, which are further subjected to alternative splicing, such that a different pattern of exons can be retained or excluded in the final protein coding mRNA. We are investigating the molecular details of the tissue-specific splicing factor protein MEC-8 from the worm Caenorhabditis elegans. The MEC-8 mutant protein is responsible for a touch insensitive phenotype in Caenorhabditis elegans, relating to its role as an alternative splicing factor. More precisely, MEC-8 can bind to the mec-2 pre-mRNA, a component of mechanosensory receptor, to regulate the production of a certain isoform required for transducing the touch signal. Previous studies of the conserved RNA Recognition Motif (RRM) domain in orthologues from vertebrate (RBPMS) and insect (couch potato; CPO) have demonstrated a homodimerization motif in MEC-8 RRM1. However, MEC-8 also contains a second RRM domain in the C-terminus that is not found in the characterized RBPMS and CPO proteins. We have therefore expressed the independent RNA-binding domains of MEC-8 as well as the full-length protein and have used these constructs in a variety of biophysical assays. We identified the optimal RNA binding sequence for both the RRM1 and RRM2, and quantified the penalty of sequence variations. The investigation has also been extended to the homologous domains from human RBPMS and Drosophila CPO, which show a high affinity to the same RNA sequence. We therefore find that despite differences in function and localization, the members of the RBPMS protein family all bind to the same RNA motif. Atomic details of binding have also been obtained by using a combination of NMR spectroscopy and X-ray crystallography. The ligand-bound complexes reveal a surprising similarity in the architecture of the bound ligand for the first and second RRM domains from MEC-8.

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