Les viroïdes sont de petits ARN circulaires simple brin qui infectent les plantes supérieures, causant ainsi d'importantes pertes économiques dans les domaines agro-alimentaire et horticole. Ces ARN ne sont pas encapsidés, ne possèdent pas de région codante et se répliquent de façon presque autonome par un mécanisme en cercle roulant. La seule étape du cycle de vie des viroïdes qui requiert la machinerie de l'hôte est la polymérisation de l'ARN. Par ailleurs, cette étape est certainement la moins bien connue, particulièrement chez le viroïde de la mosaïque latente du pêcher (PLMVd). Le but de ce travail est de découvrir des séquences importantes pour l'initiation de la réplication d'une molécule modèle d'ARN inspirée du PLMVd. Un protocole de sélection de promoteur en ARN a d'abord été mis au point. Dans ce type de protocole, des étapes pertinemment désignées s'enchaînent sous forme de cycles afin de sélectionner une molécule d'intérêt. Toutes les étapes constituant le complexe protocole ont été testées avec un témoin positif, basé sur une région minimale du PLMVd connue pour initier la réplication in vitro. Cette molécule a servi à la vérification et à l'optimisation individuelles des nombreuses étapes. Ce protocole amélioré a ensuite été utilisé pour sélectionner des molécules reconnues par l'ARNP d' E. coli à partir d'une population aléatoire d'ARN. Cette sélection a permis l'isolement de plusieurs variants qui ont rapidement montré des ressemblances en terme de séquence primaire au cours des cycles de sélection. En effet, sur trente positions aléatoires, une boite de six nucléotides (CAGACG) se retrouvant à divers endroits est apparue au quatrième cycle puis a été retrouvée presque intégralement dans toutes les séquences à partir du cinquième cycle. Une investigation sur cette boîte a mis en évidence une analogie avec une séquence retrouvée près du site d'initiation in vivo du PLMVd ainsi qu'avec des produits de sélection pour un promoteur ADN simple brin. Ceci semble pointer vers des éléments impliqués dans la réplication dépendante de l'ARN polymérase d'E. coli . L'effet de la boîte conservée CAGACG sur la réplication a été étudié. Le patron de réplication de molécules dont la boite a été modifiée (délétion ou modification) est distinct de celui de la molécule originale. Aussi, l'analyse de la séquence des petits ARN (pARN) produits lors de la réplication révèle l'implication des 6 nt pour fixer l'initiation de la polymérisation. En conclusion, ces résultats s'ajoutent aux évidences qui mèneront vers la découverte des séquences nécessaires à la réplication d'une molécule modèle d'ARN, autant in vitro (reconstitution d'un monde ARN) que in vivo (dans les viroïdes).

Les maladies infectieuses d’origine alimentaire demeurent un enjeu d'actualité dans les pays industriels comme le Canada. Les différentes agences gouvernementales impliquées dans le suivi et la prévention de ces infections soulèvent l’importance de l'apparition de souches multi-résistantes aux antibiotiques entre autres chez la bactérie pathogène Salmonella. L’antibiothérapie classique n'étant plus une solution au problème, le développement de nouveaux traitements spécifiques aux pathogènes en commençant par une meilleure compréhension de leur virulence devient essentiel. Lors d'une infection, une bactérie du genre Salmonella modifie grandement son transcriptome pour s'adapter et proliférer grâce à des systèmes à deux composants (S2C) tels que PhoP/PhoQ, OmpR/EnvZ et SsrA/SsrB. La régulation de ces systèmes soulève encore énormément de questions principalement au niveau post-transcriptionnel. Dans le cadre de ma maîtrise, j’ai adapté une méthode me permettant d’identifier les partenaires d’interaction des ARN de système à deux composants PhoP/PhoQ et OmpR/EnvZ en plus d’établir une banque d’annotation primaire pour des petits ARN non-codants de la bactérie pathogène Salmonella Typhimurium. Les résultats obtenus m’ont permis de valider un modèle de régulation connu par un petit ARN régulateur (pARNr) pour le gène phoP ainsi que d’identifier un nouveau modèle de régulation des S2C basé sur l’expression d’un ARN antisens en cis. De plus, des données préliminaires suggèrent une double fonction pour l’ARNm ompR.

L'étude des éléments cis et trans intervenant dans le métabolisme des ARN SINE a pour but de mieux appréhender la biologie des éléments mobiles SINE. Nous avons d'une part déterminé la structure secondaire des ARN des SINE de plante SB1 et SB2. Ces deux ARN qui n'ont pas d'homologie de séquence adoptent des structures secondaires similaires. Suite à cette observation, une étude menée par F.J. Sun et al. a mis en évidence un schéma évolutif commun des ARN SINE dérivés d'ARNt. Dans le cadre de la recherche de facteurs trans, nous avons entrepris la caractérisation de la protéine La, un facteur de liaison à l'ARN. Nous avons identifié chez Arabidopsis deux protéines présentant toutes les caractéristiques de la protéine La : At32 et At79. Nous avons montré que seule At32 assure les fonctions nucléaires de la protéine La. At32 et At79 ont des profils d'expression différents et semblent lier des ARN distincts. Nous proposons donc qu'il existe deux homologues de la protéine La Chez Arabidopsis

Mes travaux de recherche sont centrés sur la compréhension des relations structure-fonctions de la région 5' non traduite de l'ARN génomique du VIH-1. Le travail réalisé au cours de ma Thèse de Doctorat dans le groupe de B. et C. Ehresmann (UPR 9002 du CNRS) à l'ULP, a porté sur l'étude de la dimérisation de l'ARN génomique du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) 1. Une propriété ubiquitaire des rétrovirus est l'encapsidation de deux molécules d'ARN génomique associées près de leur extrémité 5'. Cette caractéristique, qui traduit l'existence d'une forte pression de sélection, représente un avantage évident pour la recombinaison pendant la rétrotranscription. Elle permet en particulier au virus de se répliquer malgré la présence de lésions dans l'ARN génomique et favorise la variabilité génétique. Nos travaux nous ont permis d'aboutir à plusieurs résultats importants : (1) la dimérisation implique une séquence localisée en amont du site donneur d'épissage 2. Elle est initiée par un mécanisme de reconnaissance de type boucle-boucle entre les deux monomères, au niveau d'une structure en épingle à cheveux très conservée dans les différents isolats du VIH-1, que nous avons appelée DIS (Dimerization Initiation Site) 3; 4. Cette tige-boucle est également appelée SL1. La boucle du DIS possède 9 nucléotides, dont 6 forment une séquence auto-complémentaire. Nous avons montré que l'étape initiale de la dimérisation est réalisée par des appariements Watson-Crick entre les séquences autocomplémetaires de chacun des deux monomères 5; 6; 7. Cependant, ces appariements ne sont pas les seules interactions stabilisant le dimère. Un modèle tridimensionnel du complexe boucle-boucle du DIS obtenu sur la base de résultats de cartographie en solution montre l'existence d'interactions non-canoniques formées par les purines flanquant la séquence autocomplémentaire 8; 9. (2) Le DIS joue un rôle essentiel dans la réplication du virus au niveau de l'encapsidation de l'ARN génomique et de la synthèse de l'ADN proviral double brin 10. (3) Il est possible d'inhiber la dimérisation in vitro par des oligonucléotides sens et antisens 11; 12.<br />En 1997-1998, j'ai effectué un stage post-doctoral dans le laboratoire du Dr. Heinrich Gottlinger (DFCI, Harvard Medical School, Boston, MA, USA). Mon travail était de comprendre le mécanisme de régulation qui permettrait aux précurseurs protéiques viraux de se fixer à la membrane plasmique, lieu d'assemblage des virions. J'ai ainsi confirmé l'existence d'un switch conformationnel de l'acide myristique localisé en N-terminal de la protéine de Matrice du VIH 13.<br />Depuis mon retour à Strasbourg en 1999 dans l'équipe du Dr. Roland Marquet, je me suis intéressé de nouveau au monde de l'ARN et plus précisément au repliement de l'ARN génomique du VIH-1. Ainsi, après avoir mis en évidence un motif de structure tertiaire dans la région 5'-terminale de cet ARN 14, nous avons, en collaboration avec Markus Dettenhofer (Baltimore, MD, USA), caractérisé pour la première fois la structure secondaire de cet ARN dans les cellules infectées et les particules virales 15; 16. Cette avancée technologique nous a permis par la suite (1) d'analyser avec Valérie Goldschmidt (doctorante) les variabilités structurales existantes au sein du complexe d'initiation de la rétrotranscription 17 et (2) de montrer, en collaboration avec l'équipe de Philippe Dumas (UPR 9002), que des antibiotiques de la famille des aminoglycosides se fixent spécifiquement dans la boucle du DIS de l'ARN génomique du VIH-1 non seulement dans un système in vitro 18 mais également en culture cellulaire 19.<br />Récemment, nous avons initié un nouveau projet sur le rôle de la protéine virale Vif dans la réplication virale du VIH-1 et sa relation avec l'ARN génomique (travail de thèse de Simon Henriet). Outre ses activités sur la synthèse de l'ADN proviral, la stabilité du core viral ou encore l'intégration du provirus, nous avons montré que la protéine Vif se fixe de façon spécifique et de manière coopérative aux régions localisées dans la région 5'-terminale du génome rétroviral 20. En particulier, la tige-boucle TAR (région 1-57) est un point de nucléation nécessaire à la propagation de la fixation de Vif à l'ARN (de 5‘ vers 3') mais semble insuffisante pour stabiliser ces interactions.<br /> De nombreuses perspectives découlent directement de ces travaux. Nous souhaiterions étudier la dimérisation de l'ARN génomique du VIH-1 directement dans la cellule et ainsi répondre à plusieurs questions fondamentales : où se forme le dimère d'ARN génomique ? Le DIS, ou la dimérisation, sont-ils nécessaires au transport et à l'encapsidation de l'ARN génomique ? La maturation du dimère d'ARN dans les particules virales est-elle liée à un remaniement conformationnel au niveau du DIS ? Des résultats préliminaires obtenus en collaboration avec par l'équipe de M. Mougel (UMR 5121, Montpellier) indiquent que le DIS pourrait effectivement être un signal positif pour le transport nucléo-cytoplasmique. Ces résultats nous encouragent ainsi à poursuivre le développement de nouveaux agents antiviraux dérivés des aminoglycosides dirigés contre le DIS (collaboration avec P. Dumas, UPR 9002 et P. Pale, UMR 7123-ULP). <br />Dans les perspectives liées à la compréhension du rôle de Vif dans la réplication virale, nous étudierons en particulier son action sur l'initiation de la rétrotranscription et sur la régulation de l'expression des protéines APOBEC-3G/3F. Les protéines APOBEC sont des cytidines désaminases qui ont été identifiées dernièrement et dont l'action hypermutatrice lors de la synthèse du brin (-) de l'ADN proviral est létale pour le virus. Ces protéines, exprimées exclusivement dans les cellules non permissives, sont exclues des particules virales en présence de Vif et dirigées vers la voie du protéasome. Nous étudierons entre autre la régulation de la traduction des protéines APOBEC par Vif (identification des régions de l'ARNm nécessaires) et analyserons les changements conformationnels éventuels au niveau de la région 5' non traduite de l'ARNm induits par la fixation de Vif. <br /> L'ensemble de ces travaux devrait nous permettre de contribuer à la compréhension des mécanismes qui régulent la structure tridimensionnelle de la région 5' non traduite de l'ARN génomique du VIH-1, et à plus long terme d'identifier des molécules capables d'interagir avec les différents domaines structuraux de cette région.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Dans la première partie j'ai analysé des jeux de données de RNA-seq de transcriptome de petits ARNs disponibles dans les bases de données publiques. J'y ai observé 2 points intrigants : - une grande partie des lectures (bien que courtes) ne peux pas être alignée sur le génome de référence sans discordance et cette fraction non-alignable est parfois majoritaire. - de nombreuses lectures ont des tailles autours de 15-18nt qui ne correspondent à aucun type de petits ARNs connues, cette fraction est également majoritaires dans certains cas. Ces expériences sont souvent conçues pour la détection des miRNAs et l'analyse bioinformatique de ces données passent toujours par un alignement sur le génome de référence ou sur des séquences connues pour donner des petits ARNs. J'ai donc simplement éliminé la contrainte d'alignement dans l'analyse de ces données et effectué un regroupement des lectures par similarité (à la manière des ESTs). Ce regroupement donne une vision différente des données dans laquelle la notion de position génomique n'est plus centrale et ouvre la possibilité d'y découvrir des phénomènes non-standard. La deuxième partie est tirée d'une collaboration avec le laboratoire U675 INSERM. J'ai fait l'analyse bioinformatique des gènes dérégulés par la répression par RNAi du gène REST dans une lignée de neuroblastome de souris (N18). Ce gène est un facteur de transcription qui réprime les gènes neuronaux dans les cellules non neuronales. Ce répertoire de gènes dérégulés est potentiellement constitué de gènes clefs dans la biologie des neurones. / In first part of this thesis I have analysed small RNA-seq transcriptome data. I have noticed : - a large fraction of reads can't be aligned perfectly on reference genome - lot of reads are very short (15-18 nt) and don't match on previously known functionnal small RNAs. These experiments are designed for miRNA discovery and bioinformatics analysis of these data use alignments on genome or on known small RNA precursors sequences. I have eliminated the alignment and I have clustered these sequences. This clustering let me to observe these data with a new view in wich the genomic location is not central and open the gate to discover unconventional events. The second part is the analysis of deregulate genes by the silencing of the gene REST/NRSF in mouse N18 cell line. This gene is a transcription factor and it works as a repressor of neuronal genes in non neuronal cells. This deregulate genes repertoire potentially contains key genes in neuron biology. We found in this repertoire a network of genes centered on SWI/SNF complex including SMARCA2. This gene was associated to schizophrenia (SZ) in association studies and structural variation studies. In this network we found another genes associated to SZ. We show that these genes exhibit positive evolution in primate compare to rodents.

La protéine p120, marqueur de prolifération, a été initialement identifiée dans les cellules humaines tumorales. Son homologue chez la levure, la protéine Nop2, est essentielle à la croissance et à la viabilité des cellules. La délétion du gène NOP2 bloque la maturation du pré-ARNr 27S en ARNr matures. Les protéines p120 et Nop2 possèdent des motifs de la famille des ARN : m5C-méthyltransférase. Dans un premier temps, j'ai démontré l'activité ARN : m5C-méthyltransférase de Nop2p par des expériences de méthylation in vitro en présence de S-adénosylméthionine tritiée. En parallèle, des expériences menées en collaboration avec une équipe allemande nous ont permis de localiser la méthylation catalysée par Nop2p à la position 2870 de l'ARNr 25S. Par la suite, j'ai étudié l'implication de Nop2p et de p120 dans la biogenèse de la sous-unité 60S du ribosome par plusieurs approches. Des expériences de complémentation dans une souche de levure [delta]NOP2 par la protéine humaine p120 et des protéines hybrides Nop2p-p120 ont permis de montrer que le domaine catalytique de p120, en présence du domaine N-terminal de Nop2p, permet une biogenèse normale des ribosomes chez S.cerevisiae. Parallèlement, des expériences d'ARN interférence dirigées contre p120 ont permis de montrer que, lorsque le taux de protéine p120 est diminué de 90% dans des cellules HEK293, la synthèse de l'ARNr mature 28S est ralentie. L'ensemble de ces données montrent que les protéines p120 et Nop2 appartiennent à la famille des protéines pré-ribosomiques essentielles au processus de maturation du pré-ARNr et semblent nécessaires à la structuration des pré-ARNr indispensable à leur maturation / The protein p120 is a proliferation marker that was originally identified in human tumor cells. The yeast homologue of p120, nucleolar protein Nop2p, was shown to be essential for viability of yeast. Alignment of Nop2p with human p120 points out the evolutionary conservation of a large domain that contains a SAM-binding motif and a protein domain having potential RNA: m5C-méthyltransférase activity. By in vitro methylation experiments and a sodium bisulfite approach, we show that Nop2p is a RNA: m5C-methyltransferase specific for 25S rRNA nucleotide 2870. In parallel, we succeeded to complement Nop2-deficient yeasts by human p120 and studied the importance of different sequence and structural domains of Nop2 and p120 for rRNA processing in vivo. In complementation assays, the C-terminal domain of Nop2 was essential for cell viability, whereas the absence of the N-terminal domain led to slow growth phenotype. Chimeric proteins formed by Nop2 and p120 fragments efficiently support growth if the N-terminal domain of Nop2 was present. In the absence of Nop2 or p120, the C1/C2 cleavages required to generate 5.8S and 25S rRNA were strongly reduced. The reduction of p120 content in human cells by specific siRNA leads to decreased 28S rRNA accumulation, supporting the idea on the implication of p120 in human pre-rRNA processing

S. aureus est une bactérie pathogène opportuniste de l’homme qui pose un grave problème de santé publique. Le pouvoir pathogène de S. aureus est conféré par un très grand nombre de facteurs de virulence, dont l’expression est finement régulée à de multiples niveaux. Les effecteurs de cette régulation sont à la fois des protéines et des ARN non codants (ARNnc) aussi appelés ARN régulateurs. Je me suis concentré au cours de ma thèse sur la classe majoritaire qui sont les ARNnc qui régulent la traduction d’ARNm. Ils sont impliqués dans de complexes réseaux de régulation qui permettent de contrôler la physiologie de la cellule ainsi que sa virulence. Pour élargir nos connaissances de ces réseaux, j’ai développé deux approches méthodologiques, appelées MAPS et Grad-seq, que j’ai appliquées in vivo chez S. aureus en utilisant RsaA et RsaC comme modèles. L’application du MAPS a permis d’identifier de nouvelles cibles directes pour RsaA et des cibles potentielles pour RsaC. L’approche Grad-Seq est un outil puissant mais demande encore des ajustements. J’ai également pu déterminer un rôle probable pour l’ARNnc RsaC dans la régulation de l’homéostasie oxydo-réductive de S. aureus, en lien avec la résistance au stress oxydatif et avec la persistance lors de l’internalisation par les ostéoblastes. / S. aureus is an opportunistic pathogen of the human species which can express a large array of virulence factors whose expression is under tight regulation at multiple levels. The regulation can be done by proteins and by particular molecules of RNA called non-coding RNA (ncRNA). I focused during my thesis on the main category of ncRNA in S. aureus, which are regulating the translation of mRNA. These ARNs are involved in complex regulatory networks, impacting the physiology of the bacterial cell and its virulence. To understand further these networks, I developped two methodological approaches in vivo in S. aureus, called MAPS and Grad-seq, which were applied using RsaA and RsaC as models of studies. MAPS allowed to find new direct targets of RsaA and plausible targets for RsaC. The Grad-Seq method showed to be a powerful tool but still needs refinements. I also could determine a possible role for RsaC in the regulation of oxydo-reductive homeostasis, in direct link with oxydative stress resistance and persistance during internalisation by osteoblasts.