Un défi de la transcriptomique est d'explorer l'intégralité du répertoire des transcrits normaux et anormaux. Les analyses de GEP (Gene Expression Profiling) basées sur la technologie des puces à ADN sont largement exploitées en cancérologie depuis plusieurs années. Parallèlement, les nouvelles méthodes basées sur le séquençage à haut débit offrent désormais la possibilité de réaliser des analyses précises et sensibles nécessaires à l'étude des cellules normales et cancéreuses. Quelle que soit la méthode, la caractérisation de l'ensemble des transcrits codants et non-codants représente un réel défi biologique pour la recherche de nouveaux marqueurs de diagnostic et de pronostic, et pour la bonne prise en charge des patients. Dans ce travail, j'ai eu l'occasion de traiter deux aspects différents de la biologie qui convergent vers l'identification de transcrits exprimés de manière aberrante dans les leucémies myéloïdes. Le premier aspect a consisté à proposer une sélection de biomarqueurs moléculaires pour la caractérisation de la leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC). A partir de l'expression de ces gènes, nous avons développé un score de pronostic qui a permis de définir deux groupes de patients cliniquement distincts. Nous avons ensuite complété notre étude par une caractérisation phénotypique par cytométrie en flux des sous-populations cellulaires aberrantes constituant les lignages mono- et granulocytaires. Une partie de ce travail a été étendue aux leucémies aiguës myéloïdes (LAM) à caryotype normal (CN). L'autre aspect a consisté à participer à la mise en place d'une approche computationnelle intégrée pour caractériser de nouveaux ARNs non annotés et fort probablement non-codants. En explorant des données de Digital Gene Expression (DGE), nous avons quantifié et caractérisé la fraction de ces transcrits dans les régions intergéniques. Nous avons vérifié l'expression de ces nouveaux transcrits dans les tissus normaux et cancéreux en croisant avec d'autres données d'expression, telles que le RNA-Sequencing, et regarder leur conservation et leur expression dans d'autres espèces. / A challenge of transcriptomics is to explore the full repertoire of normal and abnormal transcripts. Gene expression profiling analyses based on microarray technology are widely used in cancer research since many years. Meanwhile, new methods based on high-throughput sequencing methods offers henceforth the possibility to undergo accurate and sensitive analyses necessary for studying normal and cancer cells. Despite the method, the characterization of all coding and non-coding transcripts is a real biological challenge in identifying novel diagnostic and prognostic markers, and for the proper care of patients. In the present work, I had the opportunity to address two different aspects of biology, both convergent toward the identification of aberrantly expressed transcripts in myeloid leukemia. The first aspect was to provide a selection of molecular biomarkers for the characterization of chronic myelomonocytic leukemia (CMML). We developed a gene expression-based prognostic score which identified two clinically distinct groups of patients. We then completed our study with a phenotypic characterization by flow cytometry of aberrant subpopulations constituting the myeloid and granulocytic lineages. A part of this work has been extended to acute myeloid leukemia (AML) patients with normal karyotype. The other aspect was to participate in the implementation of an integrated computational approach in order to characterize novel non annotated RNAs, more likely non-coding. We quantified and characterized the proportion of these transcripts in intergenic regions by exploring Digital Gene Expression (DGE) data. We checked their expression in normal and cancer tissues by crossing with RNA-Seq data, and their conservation and expression in other species.

La mucoviscidose (CF, Cystic Fibrosis), maladie autosomique récessive la plus fréquente dans la population caucasienne, se manifeste par l’atteinte de plusieurs organes due à l’absence ou au dysfonctionnement du canal CFTR. Au niveau des poumons, la perte de l’activité du canal se traduit par une déshydration du mucus, des cycles d’infections et d’inflammation aboutissant à terme à la destruction du parenchyme pulmonaire. Les thérapeutiques proposées à l’heure actuelle, sont principalement symptomatiques et l’exploration de nouvelles pistes reste nécessaire. De récents travaux émanant de notre équipe ont révélé qu’une intervention au niveau de la stabilisation des transcrits pourrait être bénéfique pour améliorer la quantité de protéines nécessaires pour restaurer une activité suffisante du canal CFTR. Une autre piste qui pourrait être explorée serait de cibler, en plus de l’expression du gène CFTR, des régulateurs clés qui participent aux processus de réparation cellulaire ou à la réponse inflammatoire. Dans cet objectif, nous nous sommes focalisés sur des régulateurs clés comme les miARN et les ARE-BP (protéines de liaison à l’ARN) qui sont dérégulés dans les tissus CF et qui peuvent agir ensemble dans le contrôle de l’expression de nombreux gènes.Les travaux que nous avons réalisés nous ont permis d’une part, de montrer la dérégulation de miARN dans des échantillons CF ainsi que des isoformes de certains miARN. Deux miARN ont retenu notre attention, le miR-101 dont la distribution de ses séquences isomiR varient dans des cultures CF et le miR-181a-5p qui présente une dérégulation de son expression dans trois modèles ex-vivo CF que nous avons utilisés. Ces miARN ont la particularité de moduler l’expression de gènes clés dans les voies de signalisation PI3K-Akt/MAPK-Erk et Wnt. D’autre part, nos travaux ont révélé la dérégulation de la protéine ARE-BP TTP (Tristétraproline ou ZFP36) en contexte CF. Cette protéine est d’autant plus intéressante qu’elle est connue pour être un régulateur clé de l’inflammation. La suite de ce travail a donc été d’étudier sa régulation et son impact sur ses ARNm cibles. L’activité de cette ARE-BP a été principalement décrite pour être contrôlée par la voie p38-MAPK. Nous montrons l’implication de la voie p42/p44-MAPK (Erk1/2) dans la régulation de la phosphorylation de TTP dans des cultures bronchiques. La recherche des interactions entre TTP et ses cibles a également révélé que cette protéine agissait sur ses propres régulateurs ainsi que sur l’ARNm CFTR. Nous montrons ainsi pour la première fois que TTP se fixe au niveau de la région 3’UTR du transcrit CFTR et joue un rôle de stabilisateur sur ce transcrit.Identifier de nouveaux acteurs de la régulation du gène CFTR mais également des régulateurs centraux des processus altérés en contexte CF offre de nouvelles opportunités pour concevoir des outils ciblés pour combattre cette maladie. / Cystic fibrosis (CF), the most common life-shortening genetic disorder in Caucasians, affects many organs but chronic lung disease is the main cause of morbidity and mortality. This disease, characterized by CFTR gene alterations, results in ions transport dysfunctions that contribute to impair mucociliary clearance, favoring bacterial colonization and inflammation, and ultimately leading to lung destruction. Nowadays, therapeutic drugs have limited benefit, so development of new alternatives or complementary molecules remains essential. Recently, our team demonstrated that the intervention on CFTR mRNA stability leads to an increase in CFTR protein level and an improvement of the CFTR channel activity. An alternative way would be to target key actors such as miRNA and ARE-BP (RNA binding protein), deregulated in CF tissues, that display a pleiotropic activity and act together to control expression of several genes.Our findings led to the identification of dysregulated miRNA in CF samples and revealed multiple isoforms relative to miRNA of reference (i.e. isomiRs). We focused on two miRNA, miR-101, that displays a modification in isomiR distribution and miR-181a-5p that is highly deregulated, in three CF airways models. These miRNA modulate expression of key genes or related genes in PI3K-Akt/MAPK-Erk and Wnt signaling pathways.Our work also revealed the deregulation of an ARE-BP protein, TTP (Tristetraprolin, ZFP36), in CF context. This protein is a master regulator in inflammatory resolution. We next investigated the mechanism whereby this ARE-BP is regulated in bronchial cells and showed that TTP phosphorylation is regulated by MK2 through ERK activation. We also determined for the first time that TTP binds to the 3’UTR of CFTR mRNA where TTP binding stabilizes CFTR mRNA level.These data bring new insights into CF physiopathology and open new research opportunities in CF.

Condensine est un complexe protéique organisateur du génome qui conduit l’assemblage des chromosomes et promeut leur transmission fidèle en anaphase. De nombreuses études ont rapporté des changements dans les niveaux des ARNs cellulaires quand Condensine est défaillante, suggérant un rôle pour Condensine dans la régulation de l’expression génique. Cependant, les mécanismes sous-jacents sont demeurés énigmatiques, et l’on ignore dans quelle mesure le rôle joué par Condensine dans l’expression génique est lié ou non à sa fonction dans l’organisation des chromosomes. Lors de ma thèse, j’ai étudié l’activité de Condensine dans la régulation de l’expression génique en utilisant la levure S. pombe comme organisme modèle. Contrairement à l’idée communément admise, mes résultats montrent que Condensine ne joue aucun rôle direct dans le maintien du transcriptome, ni en interphase, ni en mitose chez cette levure. En accord avec les études précédentes, j’observe des changements de niveau et de qualité des ARNs dans les cellules mutantes pour Condensine au sortir de la mitose ; des ARNs non codants et des ARNs aberrants, étendus en 3’, s’accumulent. En revanche, je démontre que ces changements sont la conséquence de défauts de transmission des chromosomes en anaphase. L’inactivation de Condensine cause la non-disjonction de l’ADN ribosomique et du nucléole, entrainant une déplétion de l’ARN-exosome des cellules filles, lesquelles accumulent alors des ARNs normalement dégradés par l’ARN-exosome. De façon cruciale, je montre qu’empêcher les anomalies de migration des chromosomes restaure une expression normale des gènes malgré l’inactivation de Condensine, démontrant que c’est l’instabilité chromosomique qui est source des changements d’expression génique observés quand Condensine est défaillante, et non le complexe Condensine en tant que tel. Ce travail remet en question le concept de régulation de l’expression génique par les complexes Condensine et appelle à la prudence lorsque l’on cherche à étudier les fonctions de ces complexes en dehors de la condensation de la chromatine en mitose. / Condensin is a genome organiser that shape chromosomes and promote their accurate transmission in anaphase. Several studies have related changes in RNA level when Condensin is defective, suggesting that the complex has also a role in gene expression. However, the mechanisms have remained enigmatic and we still don’t know to what extent it is related to its role in chromosome organization. During my thesis, I studied the role played by Condensin in the regulation of gene expression using S. pombe as a model system. In contrast to previous studies, my results provide compelling evidence that Condensin plays no direct role in the maintenance of the transcriptome, neither during interphase nor during mitosis in this yeast. Accordingly to previous studies, I observed changes in RNA level in cells mutated for Condensin; non coding and 3’ extended RNA accumulate. However, I showed that the changes in gene expression in post-mitotic fission yeast cells that result from Condensin inactivation are largely a consequence of chromosome missegregation during anaphase, which notably depletes the RNA-exosome from daughter cells. Crucially, preventing karyotype abnormalities in daughter cells restores a normal transcriptome despite Condensin inactivation. Thus, chromosome instability, rather than a direct role of Condensin in the transcription process, changes gene expression. This work challenges the concept of gene regulation by canonical Condensin complexes and ask for caution when studying Condensin role outside chromosome condensation in mitosis.

L’objectif de mon projet principal de thèse est de déterminer la fonction biologique d’un lncARN conservés chez le zebrafish que nous avons appelé libra. La séquence de libra étant hautement homologue à la région 3’UTR de la protéine Nrep. Ces deux transcrits, libra et Nrep, contiennent en effet un site de liaison au miARN profondément conservé et inhabituellement complémentaire au miR-29. En utilisant à le modèle souris et les cellules murines, nous avons décrypté la relation régulatrice entre ce transcrit conservé dans l’évolution des vertébrés et la voie métabolique des miARN. Nous avons montré que Nrep limite le domaine d’expression de miR-29 au cervelet, et qu’il le déstabilise en rognant sa séquence. Notre travail révèle donc le premier exemple de dégradation endogène ciblée des miARN (ou TDMD). De plus, un ensemble d’expériences in vivo sur les modèles zebrafish et souris, nous a permis de démontrer que libra et Nrep contrôlent tout les deux le comportement animal. Via la perturbation génétique du site de liaison au miARN de Nrep murin, nous avons observé que ce gène régule le dosage du miR29 de part son site de liaison aux miARN, et que cette régulation est nécessaire à un comportement animal normal. Dans la seconde partie de ma thèse, je décris une stratégie exploré afin de déréguler les lncARN de la manière la moins invasive possible. Les lncARN sont actuellement neutralisés par des approches qui introduisent de vastes changements de séquence au niveau génomique. Nous avons donc développer une stratégie in vivo, appliquée au zebrafish, qui inactive les lncARN via l’insertion génomique d’une séquence ribozyme autoclivante ou d’un signal polyA prématuré. / The goal of my main thesis project was to determine the biological function of a deeply conserved zebrafish long noncoding RNAs (lncRNA) which we called libra. libra shows sequence similarity with the 3'UTR of the NREP a protein coding transcript. Both libra and Nrep contain a deeply conserved and unusually complementary microRNA (miRNA) binding site for miR-29. Using both the mouse model and mouse cell lines, we deciphered the regulatory relationship between this conserved transcript and the miRNA pathway. We showed that Nrep restricts the spatial expression domain of miR-29 in the cerebellum and that it destabilizes miR-29 through 3' trimming. Until now, only viral transcripts and artificial reporters engineered to contain highly complementary miRNA binding sites have been shown to regulate miRNAs in this fashion. Thus, our work uncovers the first example of endogenous target-directed miRNA degradation (TDMD). In addition, through a set of in vivo experiments in zebrafish and mouse, we showed that both libra and Nrep control normal animal behavior. By genetically disrupting the miR-29 binding site in Nrep in mouse, we showed that Nrep regulates miR-29 dosage through its miR-29 site and controls animal behavioral. In a second part of my thesis I describe a strategy to genetically downregulate lncRNAs in a minimally invasive manner. Approaches to knock-out lncRNAs that do not introduce vast sequence changes at the genomic level have not been adequately developed yet. I present our in vivo strategy applied to the zebrafish model using a genomic knock-in of a self-cleaving ribozyme sequence and a premature poly(A) signal to knock-out lncRNAs.

Récemment, des analyses dans divers organismes eucaryotes ont révélé que l'ensemble du génome est transcrit et produit en plus des ARNs messagers, une grande variété d’ARNs non codants de différentes longueurs. Les ARNs non codants de plus de 200 nucleotides, classés comme longs ARNs non codants (LARNnc), représentent la classe la plus abondante de transcripts non codants. Les études des fonctions des LARNnc suggèrent que beaucoup d'entre eux seraient impliqués dans la régulation de la transcription. L'objectif de ma thèse de doctorat était d'élucider les mécanismes de la régulation transcriptionnelle médiée par des LARNnc dans différents systèmes eucaryotes. Dans mon premier projet, j'ai étudié le rôle d'un long ARN non codant antisens dans la régulation transcriptionnelle du gène PHO84, codant un transporteur de phosphate à haute affinité, chez S. cerevisiae. Des études antérieures ont montré que la suppression d’une proteine de l’exosome Rrp6 entraîne une augmentation de l'expression antisens et la répression de PHO84. Il a été suggéré que la perte de Rrp6 entraîne une stabilisation antisens au locus PHO84, entraînant le recrutement de l'histone de-acétylase Hda1 et la répression de PHO84. Cependant, le mécanisme par lequel Rrp6p régule la transcription de PHO84 n’était pas connu. En combinant des méthodes à l’échelle de cellule unique, des approches biochimiques et génétiques, nous avons montré que les niveaux d'ARN antisens sont régulés principalement lors de l'élongation par le complexe Nrd1-Nab3-Sen1, qui nécessite Rrp6 pour un recrutement efficace à l`extrémité 3`de PHO84. De plus, nous révélons l'expression anticorrelé du sens et de l'antisens, En résumé, nos données suggèrent que la transcription antisens régule le seuil d'activation du promoteur PHO84. Dans mon second projet, j'ai étudié les rôles des ARNs dérivés des amplificateurs (ARNa) dans la regulation de la transcription. En utilisant les cellules de cancer du sein MCF7 comme système modèle, nous avons cherché à déterminer comment les ARNa induits par l'oestrogène (E2) participent à la régulation de la transcription médiée par le recepteur d’oestrogène (ERα) au niveau de l'allèle unique. À l'aide de l’hybridation fluorescente à l’échelle de molécule unique (smFISH), nous avons révélé qu`après induction d'E2, les ARNa sont induits avec une cinétique similaire à celle des ARNm cibles, sont localisés exclusivement dans le noyau, principalement associés à la chromatine, et sont moins abondants que les ARNm. De manière surprenante, nous avons constaté que les ARNa sont rarement co-transcrits avec leurs loci cibles, indiquant que la transcription active des gènes ne nécessite pas la synthèse continue ou l'accumulation d'ARNa sur l'amplificateur. En outre, en utilisant des mesures de la distance à sous-diffraction, nous avons démontré que la cotranscription des ARNa et des ARNm se produit rarement dans une boucle amplificateurpromoteur. De plus, nous avons révélé que la transcription basale d'ARNa n'exige pas ERα ou l'histone méthyltransférase MLL1 qui active l'amplificateur par la mono-méthylation H3K4. Dans l'ensemble, nos résultats ont montré que les ARNa peuvent jouer un rôle lors de l'activation du promoteur, mais ne sont pas nécessaires pour maintenir la transcription de l'ARNm ou pour stabiliser les interactions amplificateur-promoteur. / Transcription is the initial step in gene expression and is subject to extensive regulation. Recently, analyses in diverse eukaryotes have revealed that in addition to protein coding genes, transcription occurs throughout the noncoding genome, producing non-coding RNAs of various lengths. Non-coding RNAs longer than 200 nucleotides, classified as long non-coding RNAs (lncRNAs), represent the most abundant class of non-coding transcripts, whose functions however are poorly understood. Recent studies suggest that many lncRNAs might have roles in transcription regulation. The goal of my PhD thesis was to elucidate the mechanisms of lncRNA mediated transcription regulation in different eukaryotic systems. For my first project, I investigated the role of an antisense long noncoding RNA in transcription regulation of the high-affinity phosphate transporter gene PHO84 in the unicellular eukaryote S. cerevisiae. Previous studies showed that deletion of the nuclear exosome component Rrp6 results in increased antisense expression and repression of PHO84. It was suggested that the loss of Rrp6 results in antisense stabilization at the PHO84 locus, leading to recruitment of the histone de-acetylase Hda1 and repression of PHO84. However, most of the mechanistic details of how Rrp6p functions in regulating PHO84 transcription were not understood. Combining single cell methods with biochemical and genetic approaches, we showed that antisense RNA levels are regulated primarily during transcriptional elongation by the Nrd1-Nab3-Sen1 complex, which requires Rrp6 for efficient recruitment to the 3’end of PHO84. Furthermore, we reveal anti-correlated expression of sense and antisense, which have distinct modes of transcription. In summary, our data suggest a model whereby antisense transcriptional read-through into the PHO84 promoter regulates the activation threshold of the gene. For my second project, I investigated the roles of enhancer derived RNAs (eRNAs). eRNAs are lncRNAs transcribed from enhancers that have been suggested to regulate transcription through different mechanisms, including enhancer-promoter looping, RNA polymerase elongation, and chromatin remodeling. However, no coherent model of eRNA function has yet emerged. Using MCF7 breast cancer cells as a model system, we sought to determine how estrogen (E2) induced eRNAs participate in estrogen receptor alpha (ERα) mediated transcription regulation at the single allele level. Using single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH), we revealed that upon E2 induction eRNAs are induced with similar kinetics as target mRNAs, but are localized exclusively in the nucleus, mostly chromatin associated, and are less abundant than mRNAs. Surprisingly, we found that eRNAs are rarely co-transcribed with their target loci, indicating that active gene transcription does not require the continuous synthesis or accumulation of eRNAs at the enhancer. Furthermore, using sub-diffraction-limit distance measurements, we demonstrated that co-transcription of eRNAs and mRNAs rarely occurs within a closed enhancer-promoter loop. Moreover, we revealed that basal eRNA transcription does not require ERα or the histone methyltransferase MLL1, which activates the enhancer through H3K4 mono-methylation. Altogether, our findings showed that eRNAs may play a role during promoter activation, but are not required to sustain mRNA transcription or stabilize enhancer-promoter looping interactions.

La croissance fœtale et postnatale est un processus finement régulé par des facteurs génétiques, épigénétiques et environnementaux complexes. Le système des IGFs (insulin-like growth factors) est l’un des acteurs principaux jouant un rôle crucial dans le développement fœtal et postnatal. Chez l’humain, plusieurs mutations des gènes IGF1 et IGF-1R ainsi qu’une mutation d’origine paternelle d’IGF2 ont été rapportées chez des patients ayant un retard de croissance intra-utérin (RCIU) qui peut persister et/ou s’aggraver en postnatal. Par ailleurs, les phénomènes épigénétiques comme la méthylation de l’ADN et le code histone jouent également un rôle prépondérant dans le développement fœtal et postnatal. L’empreinte parentale, mise en place grâce à des marques épigénétiques, est un des mécanismes important pour le développement fœtal. Chez l’humain, une anomalie de régulation de gènes soumis à empreinte parentale est associée à plusieurs syndromes de retard de croissance intra-utérin et postnatal ou à l’inverse de croissance excessive. Ce travail comporte deux parties: nous nous sommes dans un premier temps particulièrement intéressés à l’étude génétique et épigénétique de la région 11p15.5 et de son centre d’empreinte régulant le domaine IGF2/H19 dans une population de patients ayant une croissance excessive ou bien un RCIU (syndromes de Beckwith-Wiedemann et Silver-Russell respectivement), afin de mieux comprendre la régulation de ce domaine. Puis, la deuxième partie de notre étude a porté sur l’identification de nouvelles causes génétiques et épigénétiques de syndrome de Silver-Russell, altérant l’expression d’IGF2 mais n’étant pas directement secondaires à un défaut moléculaire de la région 11p15.5. / Fetal and postnatal growth is a process finely regulated by genetic, epigenetic and environmental complex. The IGFs system (insulin-like growth factors) is one of the main actors playing a crucial role in fetal and postnatal development. In humans, several mutations of IGF1 and IGF-1R genes and a paternal IGF2 mutation have been reported in patients with intrauterine growth restriction (IUGR), which can persist and/or worsen in postnatal life. Moreover, epigenetic phenomena such as DNA methylation and histone code also play a major role in fetal and postnatal development. Genomic imprinting, established due to epigenetic marks, is one of the major mechanisms for fetal development. In humans, abnormal regulation of genes subject to imprinting is associated with several syndromes of intrauterine and postnatal growth restriction or conversely excessive growth. This work has two parts: we initially particularly interested in the genetic and epigenetic study of the 11p15.5 region and its imprinting control region regulating the IGF2/H19 domain in a population of patients with overgrowth or IUGR (Beckwith-Wiedemann syndrome and Russell-Silver respectively), to better understand the regulation of this area. Then, the second part of our study focused on the identification of new genetic and epigenetic causes of Silver-Russell syndrome, altering the expression of IGF2, without being directly caused by a molecular defect of 11p15.5 region.

La récidive et la progression métastatique du cancer du sein ne sont toujours pas curables. Le concept des cellules souches cancéreuses (CSC) pourrait apporter une explication à ces échecs. Les CSC résisteraient aux thérapies conventionnelles (chimiothérapies, radiothérapie) et seraient responsables de la rechute et de la progression du cancer. L'élimination des CSC semble être un pré-requis indispensable pour le traitement des patientes. L'identité et le destin des cellules souches sont finement régulés par des acteurs épigénétiques. Les travaux de cette thèse se sont intéressés aux conséquences de la dérégulation de deux acteurs épigénétiques en particulier : les enzymes HDAC et le long ARN non-codant Xist. Nous avons montré que la modulation épigénétique via l'inhibition des HDAC (HDACi) permet d'éliminer les CSC en induisant leur différenciation. Nous présentons une nouvelle stratégie thérapeutique pour le cancer du sein : la thérapie différenciante. Nous avons déterminé Xist comme étant le biomarqueur prédictif de la réponse aux HDACi. Xist étant un partenaire clé de la plasticité cellulaire, les travaux de cette thèse se sont ensuite intéressés aux conséquences de la dérégulation de Xist dans l'initiation tumorale. Nous avons observé que l'inhibition de Xist favorise la division des cellules souches mammaires normales. Nous proposons un nouveau modèle de l'initiation tumorale où la dérégulation épigénétique est une modification précoce sans conséquence sur l'homéostasie tissulaire mais pourrait être la première étape de la transformation cancéreuse. / These last decades have allowed deciphering the biology of breast cancer and improving the therapeutic management. However, recurrence and metastatic progression of the disease are still not curable. The concept of cancer stem cells (CSC) could provide an explanation for these failures. CSC would resist conventional therapies (chemotherapy, radiotherapy) and would be responsible for both relapse and progression of cancer. The elimination of CSC seems to be an essential prerequisite for the treatment of patients. The identity and fate of stem cells are tightly regulated by epigenetic mechanisms. The work of this thesis investigated the consequences of deregulation of two epigenetic players: HDAC enzymes and long non-coding RNA Xist. We have shown that epigenetic modulation via HDAC inhibitor (HDACi) eliminates the CSC by inducing their differentiation. We present a new therapeutic strategy for breast cancer: differentiation therapy. We determined Xist as the predictive biomarker of response to HDACi. Xist is a key partner of cell plasticity, the work of this thesis therefore interested in the consequences of Xist deregulation in tumor initiation. We observed that Xist inhibition promotes division of normal breast stem cells. We propose a new model of tumor initiation: epigenetic deregulation is an early change without consequence on tissue homeostasis but could be the first step of the cancerous transformation.

L'une des caractéristiques majeures des microorganismes, et donc des bactéries, est qu'ils sont en contact direct avec l'environnement et doivent donc percevoir et répondre rapidement à ses variations. Pour cela, plusieurs niveaux de contrôle existent, et récemment le rôle des ARN non codants régulateurs, ou riborégulateurs, a été mis en lumière comme un mécanisme de contrôle peu couteux et rapide pour la cellule. Chez le phytopathogène Agrobacterium fabrum (anciennement appelé Agrobaterium tumefaciens), la virulence est principalement régulée au niveau transcriptionnel par le système à deux composants VirANirG. L'implication des riborégulateurs dans la virulence d'A.fabrum est encore mal connue et ces travaux de thèse ont eu pour objectif de déterminer l'implication de riborégulateurs dans le cycle infectieux de cette bactérie.Pour cela, nous avons identifié l'ensemble des transcrits d 'A. fabrum C58 en combinant l'utilisation de plusieurs méthodes d'analyses globales et nous avons étudié la fonction de différents candidats transcrits à partir du plasmide Ti (plasmide de virulence). Des souches modifiées dans la production des riborégulateurs candidats ont été construites, Jeurs ARNm cibles ont été prédits et validés, et des tests phénotypiques, en particulier des tests de virulence, ont été réalisés. Ainsi, le séquençage des transcrits de petite taille a permis d'identifier plus d'un millier de riborégulateurs potentiels dont plusieurs sont exprimés à partir de régions en relation avec le cycle infectieux. Nous avons validé 4 de ces petits transcrits comme étant des riborégulateurs puisqu'ils sont de petite taille, non traduits en protéine et fortement structurés (RNAI 111, RNA1083, RNA1059 et RNA1051) . Plus particulièrement, nous avons montré que le riborégulateur RNAI 111 était nécessaire pour la virulence d'A.fabrum C58, et que son action semblait se faire au travers du contrôle post-transcriptionnel de gènes impliqués dans les fonctions de virulence et de transfert du plasmide Ti. Un rôle plus modéré du riborégulateur RNA1083 dans le contrôle du cycle infectieux a également été observé, potentiellement au travers de la modulation de la mobilité et du transfert conjugatif du plasmide Ti. D'autre part, nous avons mis en évidence deux autres riborégulateurs, RNA1059 et RNA1051, qui sont impliqués dans le contrôle du maintien du plasmide Ti via une implication dans la réplication du plasmide (RNA 1059) et via une implication dans un nouveau system de toxine-antitoxine présent sur le plasmide Ti (RNA1051). Ainsi à partir d'une analyse globale nous avons mis en évidence le rôle des riboregulateurs dans les systèmes de mise en place de l'infection bactérienne , soit via le contrôle de facteurs de virulence, soit via le contrôle de la persistance du plasmide responsable de la virulence / One of the main characteristics of microorganisms, including bacteria., is their direct interaction with their environment. They thus need to perceive and quickly answer to its variations. Several steps of control exist, and recently the role of regulatory non-coding RNA, or riboregulator, was highlighted as a fast and economic mechanism of regulation. In the phytopathogen Agrobacterium fabrum (previously named Agrobacterium tumefaciens), the virulence is mainly controlled transcriptionally by the two components system VirANirG. The implication of riboregulators in the virulence of this bacterium is still unknown . The objectives of this thesis were to identify A .fabrum riboregulators and to determine their involvement in the infectious cycle of the bacteria. To this end, we identified small transcripts of A . fabrum C58 strain by combining several global analyses, and we studied the function of different candidates transcribed from the Ti plasmid (the virulence plasmid). Strains modified in the production of these candidates were constructed, their mRNA targets were predicted and validated, and phenotypic analyses -especially virulence tests­ were realized.Thereby, small transcript deep-sequencing allowed the identification of a thousand potential riboregulators, some of them being transcribed from regions related to the infectious cycle. We validated 4 of these transcripts as riboregulators according to their small size, their strong secondary structure and their non-translation into protein (RNAIOS I, RNA1059, RNA1083 and RNAl ll l). In particular, we showed that RNA 1111 was necessary for the virulence of A. fabrum C58, and that it seems to act through the posttranscriptional control of genes implicated in virulence functions and in Ti plasmid conjugation. A more moderated role of RNA 1083 was also observed, potentially by the modulation of the bacterial mobility and of the plasmid conjugation. Furthermore, we highlighted two riboregulators, RNA1059 and RNA1051, involved in the control of the Ti plasmid persistence, through their implication in the replication of the plasmid (RNA1059) and in a toxin-antitoxin system present on the Ti plasmid (RNA1051) .Thus, from a global analysis, we brought out the role of riboregulators in the control of several steps of the infectious cycle of A. fabrum C58, through the control of virulence factors, or through the contrai of the persistence of the main actor of the virulence, the Ti plasmid

Au cours des cinq dernières années l’existence d’un contrôle de la transcription par les ARN non-codants longs (lncRNAs) a été décrite dans une large variété d’eucaryotes. Cependant, les mécanismes par lesquels les lncRNAs régulent la transcription restent en grande partie méconnus. Les premiers travaux effectués dans le cadre de cette thèse ont participé à la caractérisation du mécanisme mis en jeu par un lncRNA, nommé nam1, dans le contrôle de l’entrée en différenciation sexuelle chez la levure Schizosaccharomyces pombe. Il a ainsi été montré qu’au cours de sa synthèse le lncRNA nam1 est ciblé par la protéine de liaison à l’ARN Mmi1 et une machinerie de surveillance des ARN qui comprend l’exosome, un complexe de dégradation des ARN conservé au cours de l’évolution. La fixation de Mmi1 au lncRNA nam1 contrôle la terminaison de la transcription de nam1 et empêche ainsi la transcription de se poursuivre et d’interférer alors avec la transcription du gène situé en aval (codant pour une MAP kinase essentielle à l’entrée en différenciation). Les travaux suivant montrent l’implication dans ce mécanisme de la protéine Cti1, un des co-facteurs connus de l’exosome. Fait marquant, ces travaux rapportent aussi l’existence d’un mode de production inédit pour un lncRNA. En effet, ils révèlent que la transcription non-interrompue d’un gène codant conduirait à la production d’un ARN bi-cistronique. La maturation co-transcriptionnelle de cet ARN bi-cistronique produirait, d’un côté, un ARN messager et, de l’autre, le lncRNA nam1. Enfin, ils ont permit la caractérisation initiale d’un nouveau composant de la machinerie de surveillance des ARN recrutée sur nam1 par Mmi1. Ainsi, dans leur ensemble, ces travaux contribuent à une meilleure connaissance des mécanismes pouvant être mis en jeu par un lncRNA et agissant en cis pour réguler l’expression génique et, à travers elle, des processus cellulaires majeurs, tel que la différenciation cellulaire. De plus, ils décrivent un nouveau mécanisme de biogénèse d’un lncRNA. / Over the last five years, the control of transcription mediated by long non-coding RNAs (lncRNAs) has been reported to take place in a wide variety of eukaryotes. However, the mechanisms by which lncRNAs regulate transcription remain relatively poorly described. The first work conducted in the context of this PhD thesis has contributed to the characterization of the mechanism used by a lncRNA, named nam1, to control entry into sexual differentiation of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. It was shown that, while the lncRNA nam1 is being produced, it is targeted by the RNA binding protein Mmi1 and a RNA surveillance machinery that includes the exosome, a conserved complex throughout evolution. The binding of Mmi1 to nam1 lncRNA controls the termination of transcription of nam1, which prevents this non-coding transcription from interfering with the transcription of the downstream gene, coding for a MAP kinase essential to entry into differentiation. The following work shows the importance of the protein Cti1, one of the known co-factor of the exosome, in the nam1-dependent control of sexual differentiation. Remarkably, it also strongly suggests the existence of a new way of producing a lncRNA. Indeed, it reveals that read-through transcription of a protein-coding gene leads to the production of a bi-cistronic RNA, which is co-transcriptionally matured to produce on one side a messenger RNA and on the other side the lncRNA nam1. Finally, this work initiated the characterization of a new component of the RNA surveillance machinery targeting nam1. Collectively, this work brings several insights into the mechanisms used by cis-acting lncRNAs to regulate gene expression and, thereby, major cellular processes such as cell differentiation. Moreover, it also provides insights into the biogenesis of lncRNAs by reporting a new mode of production of lncRNAs.

L'étude qu'on a entreprise a pour but d'analyser les facteurs de virulence des espèces "Classiques" et "nouvelles" de Brucella. Dans cette perspective, on a analysé les génomes des espèces récemment découvertes : Brucella inopinata BO1 et Brucella inopinata-like BO2, isolés pour la première fois de patients humains sans réservoir animal connu. On a découvert que ces deux espèces possèdent des profils de restriction uniques. De plus, BO2 possède deux chromosomes de taille identique, un profil jamais décrit pour une autre espèce de Brucella. L'analyse de la réplication intracellulaire de ces deux espèces révèle que BO2 ne se réplique pas dans les macrophages humains et murins alors que BO1 se réplique d'une façon similaire à Brucella suis 1330, ce qui confirme la potentielle implication de BO1 dans la pathogenèse chez l'homme. Sur un autre niveau d'analyse, on a été à la recherche de facteurs de virulence potentiels dans d'autres espèces de Brucella notamment Brucella microti et Brucella suis sur les niveaux génomique et post-transcriptionnel. Sur le niveau génomique, on a découvert que le système GAD (glutamate decarboxylase) confère une résistance à l'acidité à Brucella microti lors de son passage dans l'estomac. Sur le niveau post-transcriptionnel, on a isolé, séquencé et identifié les petits ARNs noncodant associés à la protéine chaperone Hfq, qui joue un rôle important dans la virulence de Brucella. / We have undertaken in this study a multidimensional analysis of the virulence factors of "Classical" and new "Brucella species". In this objective, we have analysed the genomes of newly described species Brucella inopinata BO1 and Brucella inopinata-like BO2 isolated for the first time from human patients with no known animal reservoir. We found that these two species have unique restriction profiles. In addition, BO2 has a unique chromosomal distribution with two chromosomes of the same size, never seen before in Brucella. Analysis of the intracellular replication of these strains reveals that BO2 is unable to replicate in neither human nor mouse macrophages while BO1 successfully entered and replicated as efficiently as Brucella suis 1330 confirming the potential virulence of this species for humans. On an other level of analysis, we looked for potential virulence factors in other Brucella species including Brucella microti and Brucella suis at the genomic and post-transcriptional level. At the genomic level we discovered that the glutamate decarboxylase system confers resistance to acidity to Brucella miroti during its transit in the stomach. On the post-transcriptional level, we isolated, sequenced and identified small noncoding RNAs associated to the chaperone protein Hfq, known to play a role in the virulence of Brucella.