Les approches bioinformatiques développées au cours de cette thèse ont permis d’une part le développement de banques de données concernant les ARNt classiques ainsi que les ARNt mitochondriaux de métazoaires. Celles-ci sont basées sur de nouveaux outils pour la détection de gènes d’ARNt «bizarres» et des alignements de séquences basés sur les propriétés structurales préservées. Les analyses des séquences collectées ont conduit non seulement à une vision globale de la diversité des ARNt dans les génomes mitochondriaux couvrant l’ensemble des groupes taxonomiques des métazoaires, mais également une meilleure connaissance de l’organisation des génomes et d’en proposer des liens évolutifs. Elles ont également permis de confirmer et d’élargir l’existence d’ARNt les plus petits connus à ce jour et de poser les bases de compréhension des repliements tridimensionnaux des ARNt mitochondriaux. Ces travaux permettent de mieux appréhender la compréhension des relations structure/fonction des ARNt mitochondriaux humains, et en particulier les dysfonctionnements dans les pathologies mitochondriales. / The bioinformatic approaches presented in this thesis include the development of databases for classical tRNAs and the mitochondrial tRNAs of metazoans. They are based on new tools for the detection of "bizarre" tRNA genes and sequences, and for the calculation of alignments based on their structural features. The analysis of collected sequences have led to an global overview on the diversity of tRNAs in mitochondrial genomes covering all taxonomic groups of metazoans, but also to a better understanding of genome organization and their evolution. The present study revealed the existence of the smallest known tRNA so far and provides the basis for understanding the three-dimensional folding of mitochondrial tRNA. This work helps to better understand the structure/function relationships of human mitochondrial tRNAs and, in particular, the dysfunctions in mitochondrial pathologies.

La protéine tRip de Plasmodium, l’agent du paludisme, fait l’objet de mon travail de thèse. Identifiée au laboratoire, elle est localisée à la membrane plasmique de P. berghei, le modèle murin étudié in vivo. Elle permet l’import d’ARNt exogènes à l’intérieur du parasite. La génération et l’étude d’une souche P. berghei tRip-KO m’ont permis d’explorer l’importance de ce mécanisme et l’implication de tRip dans un complexe multiprotéique. J’ai démontré que la multiplication de P. berghei est très réduite lors du stade sanguin chez la souche tRip-KO. Par protéomique, j’ai montré qu’en l’absence de tRip, de nombreuses protéines sont sous-exprimées, en particulier celles riches en asparagines. Enfin, j’ai identifié trois partenaires protéiques de tRip, dont le substrat est l’ARNt. Ces résultats suggèrent que les ARNt importés par Plasmodium via tRip pourraient être substrat de protéines plasmodiales et acteurs de la synthèse protéique du parasite. Le transport d’ARNt étrangers dans une cellule est un mécanisme inconnu en dehors de cette étude. Il révèle une interaction inédite entre un hôte et son parasite intracellulaire, propice au développement de ce dernier. / The organism studied in this work is Plasmodium, the malaria parasite. The laboratory identified a membrane protein, called tRip for tRNA import protein, displaying a tRNA binding domain exposed outside of the parasite. In vivo, in P. berghei which is the murine model used, tRip mediates the import of exogenous tRNAs into the parasite cytosol. My PhD work begun with the construction of a tRip-KO strain of P. berghei to investigate the role of tRNA import and the putative involvement of tRip within a proteic complex. The phenotype of the tRip-KO strain is significantly modified compared to the wild-type parasite during the blood stage: its rate of multiplication is much lower. By proteomic analyses, I showed that many proteins are under-regulated in the tRip-KO strain, especially those very rich in asparagines. Moreover, I dentified three protein partners for tRip, being tRNA aminoacylation or modification enzymes. These results suggest that host imported tRNAs could be taken in charge by parasitic enzymes and take part to Plasmodium protein synthesis. This work reveals a new host pathogen interaction and is the first example showing exogenous tRNA import into a cell.

Parmi les petits ARN non codants, les fragments dérivant d’ARNt (tRF) ont été identifiés dans tous les embranchements de la vie. Cependant, très peu de donnée existe sur les tRF de plantes. Les populations de tRF issues de plusieurs banques de petits ARN (différents tissus, plantes soumises à des stress abiotiques, ou fractions immunoprécipitées avec la protéine ARGONAUTE1) ont été analysées. Les populations sont essentiellement constituées de tRF-5D ou des tRF-3T (clivage dans la boucle D ou T respectivement) et elles varient d’une banque à l’autre. Par une approche in silico suivie de tests de clivage in vitro, des RNases T2 d’A. thaliana (RNS) ont été identifiées comme étant capables de cliver les ARNt dans la région de l’anticodon, de la boucle D et de la boucle T. Lors de l’étude de l’expression des RNS, nous avons observé que deux d’entre elles sont fortement exprimées à un stade de maturation tardif des siliques. Ainsi, la population en tRF issue de stades de développement avancés des siliques a été analysée. Des expériences de carences en phosphate nous ont permis de démontrer l’implication d’une des RNS dans la genèse de tRF dans A. thaliana. Au final, nos données ouvrent de nouvelles perspectives quant à l’implication des RNS et des tRF comme des acteurs majeurs dans l’expression des gènes chez les plantes. / Among the small ncRNAs, tRNA-derived RNA fragments (tRFs) were identified in all domains of life. However, only few data report on plants tRFs. Short tRF were retrieved from A. thaliana small RNA libraries (various tissues, plants submitted to abiotic stress or argonaute immunoprecipitated fractions). Mainly tRF-5D or tRF-3T (cleavage in the D or T region respectively) were found, and fluctuations in the tRF population were observed.Using in vitro approaches, A. thaliana RNase T2 endoribonucleases (RNS) were shown to cleave tRNAs in the anticodon region but also in the D or T region. Through a whole study of RNS expression, we show that two RNS are also strongly expressed in the siliques at a late stage of development. Thus, we analyzed the tRF population of this particular developmental stage. Upon phosphate starvation, we demonstrate also the implication of one RNS in the production of tRFs in planta. Altogether, our data open new perspectives for RNS and tRFs as major actors of gene expression inplants.

Les ribozymes sont des ARN naturels ou artificiels possédant une activité catalytique. Les ribozymes artificiels ont été identifiés in vitro par la méthode SELEX, et plusieurs d'entre eux ont été caractérisés par des études cinétiques. Ces molécules sont impliquées dans des réactions de clivage, de ligation, de modification d'extrémités d'ARN, de polymérisation, de phosphorylation et d'activation de groupements acyl. Parce qu'elle est nécessaire à la traduction, l'aminoacylation des ARN joue un rôle évolutif important dans la transition du monde de l'ARN vers le monde moderne de l'ADN et des protéines, et elle est centrale à l'établissement du code génétique. Plusieurs ribozymes catalysant le transfert d'acides aminés à partir de cofacteurs activants ont pu être isolés et caractérisés depuis une vingtaine d'années, ce qui a documenté la possibilité d'aminoacylation d'ARNt en l'absence des aminoacyl ARNt synthétases. En développant un nouveau protocole SELEX basé sur l'oxydation au périodate, le but de notre travail est de découvrir de nouveau ribozymes d'une taille de l'ordre d'une vingtaine de nucléotides pouvant combiner la catalyse de l'activation des acides aminé et la transestérification. Bien que des molécules catalysant l'une ou l'autre des deux réactions ont été identifiées, aucun ribozyme n'existe à ce jour qui puisse utiliser des acides aminés libres et un cofacteur activant pour réaliser l'aminoacylation en 3' dans un même milieu réactionnel. La sélection de molécules actives dans une approche SELEX exige la présence de régions constantes sur les deux extrémités des séquences pools aléatoires initiaux. Ces régions sont nécessaires pour l'amplification par PCR, mais elles imposent des contraintes importantes pour l'identification de ribozymes car elles peuvent complètement inhiber leur activité par interférence structurelle. Nous présentons un protocole optimisé qui minimise la taille de ces régions constantes. D'autre part, notre nouveau design est très spécifique pour la sélection d'ARN aminoacylés sur l'extrémité 3'. Ce protocole a été utilisé pour réaliser 6 à 7 cycles de sélection avec différents pools, et un enrichissement en séquences spécifiques a pu être mis en évidence. Bien que certains tests avec les pools sélectionnés a révélé une activité possible, des essais avec des séquences spécifiques de ces pools n'ont pour l'instant pas pu confirmer l'activité catalytique recherchée. Un protocole basé sur le même principe de sélection a été utilisé dans une étude parallèle pour identifier les ARN aminoacylés présents dans l'ARN total d'Escherichia coli. Dans ce deuxième travail, note but est d'identifier tous les d'ARN aminoacylés par séquençage massif, avec à la clé la découverte possible de molécules autres que les ARNt et ARNtm. En utilisant les ARNt comme modèle, nous nous sommes aperçus qu'un protocole RNAseq standard n'était pas adapté à cause des bases modifiées présentes sur ces molécules. Nous avons développé et mis au point un nouveau protocole pour l'identification de n'importe quelle séquence aminoacylée en 3'. La nouvelle approche présentée devrait permette l'étude exhaustive de l'aminoacylation de toutes les séquences présentes dans l'ARN total. / Ribozymes are natural or in vitro selected RNA molecules possessing a catalytic activity. Artificial ribozymes have been extensively investigated by in vitro SELEX experiments, and characterized by kinetic assays. Ribozymes are involved in RNA cleavage, ligation, capping, polymerization, phosphorylation and acyl activation. Because it is required for translation, RNA aminoacylation plays an important role in the evolution from the late RNA world to the modern DNA and protein world, and is central to the genetic code. Several ribozymes catalyzing amino acid transfer from various activating groups have already been selected and characterized in the past two decades, documenting the possibility of tRNA aminoacylation in the absence of aminoacyl tRNA synthetase. With a newly designed SELEX protocol based on periodate oxydation, the aim of our investigation is to uncover small ribozymes of the order of 20 nucleotides that could catalyze both amino acid activation and transesterification. Although molecules catalyzing either reaction have been identified, no existing ribozyme could use free amino acids and activating cofactor(s) as substrates for 3' esterification in a single reactional context. The selection of active molecules in a SELEX procedure requires the presence of constant tracks on both ends of the sequences constituting the initial random pools. These tracks are required for PCR amplification, but they impose significant burden to the identification of ribozymes because they can prevent any activity through structural inhibition. We present an optimized protocol that significantly minimizes the size of these constant tracks. At the same time, our newly design protocol is very specific for the selection of 3'-end aminoacylated RNA. Working with this protocol, we performed 6 to 7 cycles of selection with different pools, and observed an enrichement with specific sequences. Although some experiments performed with entire pools did reveal a possible activity, no activity could be so far confirmed with specific sequences. A similar protocol was also applied in a parallel study to identify aminoacylated RNA from total RNA in Escherichia coli. In this other approach, our goal is to possibly identify new classes of aminoacylated RNA while using the deep sequencing technology. Using tRNA to validate our protocol, we realized that a standard RNAseq procedure could not work due to the presence of modified bases. We established a new method for bank preparation to identify any sequence aminoacylated at the 3' end. Ultimately, this new approach will allow us to study the level of aminoacylation of any sequence present in total RNA.

Upon ligand binding, the aryl hydrocarbon receptor (AhR) translocates into the nucleus and dimerizes with its partner Ah receptor nuclear translocator (Arnt). The AhR/Arnt heterodimer binds to the enhancer element DRE to regulate target gene expression. It is known that the formation of the ligand-dependent AhR/Arnt/DRE complex requires protein factors in vitro. The first aim is to determine whether two other Hsp90-associated proteins present in rabbit reticulocyte lysate (RRL), namely CyP40 and Hsp70, play any role in forming the AhR/Arnt/DRE complex. Fractionation and immunodepletion experiments revealed that Hsp70 is not necessary for the formation of this complex. In contrast, CYP40 is involved in forming the complex since (1) immunodepletion of CyP40 from a RRL fraction reduces the intensity of the AhR-Arnt-DRE complex by 48% and (2) recombinant human CyP40 alone causes the formation of this complex. In addition, CyP40-interacting proteins appear to be essential for the full CyP40 effect on the AhR gel shift complex. The second aim is to determine the role of β-tubulin in Amt-dependent signaling pathways. From the insect Sf9 cytosol, β-tubulin enriched fraction (F5) was isolated which suppresses the AhR/Arnt/DRE complex formation in a gel shift assay. Tubulin enriched from pig brain had a similar inhibition of the AhR gel shift complex, suggesting that β-tubulin in F5 is likely responsible for the action. Using the TALON resin, β-tubulin was co-precipitated with the baculovirus 6His-Arnt, showing that β-tubulin interacts with Arnt. β-tubulin was examined to decide its role in the hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) signaling which is also Arnt-dependent. Gel shift data using HIF-1α and Arnt showed that F5 suppressed the formation of the HIF-1α/Arnt/HRE complex. Subsequently the Sf9 β-tubulin was cloned and about 95% of its full-length sequence was identified. The amino acid sequence of Sf9 β-tubulin shares high sequence identity with human β-tubulin. Upon transient transfection of a plasmid containing a human β-tubulin cDNA into MGF7 or Hep3B cells, the HRE-driven luciferase activity was clearly suppressed. In conclusion, we have evidence supporting that β-tubulin inhibits the Arnt-dependent signaling and the mechanism may involve the interaction between Arnt and β-tubulin.

Les processus mitochondriaux tels que la réplication et la traduction sont effectués par des complexes multiprotéiques. Par contre, le métabolisme et la voie de maturation des ARN mitochondriaux (p. ex précurseurs des ARNt et des ARNr) sont habituellement traités comme une suite de réactions catalysées par des protéines séparées. L’exécution fidèle et optimale de ces processus mitochondriaux, exige un couplage étroit nécessaire pour la canalisation des intermédiaires métaboliques. Or, les évidences en faveur de l'interconnexion postulée de ces processus cellulaires sont peu nombreuses et proviennent en grande partie des interactions protéine-protéine. Contrairement à la perception classique, nos résultats révèlent l’organisation des fonctions cellulaires telles que la transcription, la traduction, le métabolisme et la régulation en supercomplexes multifonctionnels stables, dans les mitochondries des champignons (ex Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans et Neurospora crassa), des animaux (ex Bos taurus), des plantes (B. oleracea et Arabidopsis thaliana) et chez les bactéries (ex E. coli) à partir desquelles les mitochondries descendent. La composition de ces supercomplexes chez les champignons et les animaux est comparable à celle de levure, toutefois, chez les plantes et E. coli ils comportent des différences notables (ex, présence des enzymes spécifiques à la voie de biosynthèse des sucres et les léctines chez B. oleracea). Chez la levure, en accord avec les changements dûs à la répression catabolique du glucose, nos résultats révèlent que les supercomplexes sont dynamiques et que leur composition en protéines dépend des stimulis et de la régulation cellulaire. De plus, nous montrons que l’inactivation de la voie de biosynthèse des lipides de type II (FASII) perturbe l’assemblage et/ou la biogenèse du supercomplexe de la RNase P (responsable de la maturation en 5’ des précurseurs des ARNt), ce qui suggère que de multiples effets pléiotropiques peuvent être de nature structurale entre les protéines. Chez la levure et chez E. coli, nos études de la maturation in vitro des précurseurs des ARNt et de la protéomique révèlent l’association de la RNase P avec les enzymes de la maturation d’ARNt en 3’. En effet, la voie de maturation des pré-ARNt et des ARNr, et la dégradation des ARN mitochondriaux semblent êtres associées avec la machinerie de la traduction au sein d’un même supercomplexe multifonctionnel dans la mitochondrie de la levure. Chez E. coli, nous avons caractérisé un supercomplexe similaire qui inclut en plus de la RNase P: la PNPase, le complexe du RNA degradosome, l’ARN polymérase, quatre facteurs de transcription, neuf aminoacyl-tRNA synthétases, onze protéines ribosomiques, des chaperons et certaines protéines métaboliques. Ces résultats supposent l’association physique de la transcription, la voie de maturation et d’aminoacylation des ARNt, la dégradation des ARN. Le nombre de cas où les activités cellulaires sont fonctionnellement et structurellement associées est certainement à la hausse (ex, l’éditosome et le complexe de la glycolyse). En effet, l’organisation en supercomplexe multifonctionnel représente probablement l’unité fonctionnelle dans les cellules et les analyses de ces super-structures peuvent devenir la prochaine cible de la biologie structurale. / It is known that processes such as transcription, translation and intron splicing require a multitude of proteins (plus a few non-protein components) organized in large ‘molecular machines’. But, according to traditional views, processing of RNA precursors (e.g., tRNA and rRNA) and metabolic pathways are pools of individual enzymes (single proteins or small complexes), with sequential enzymatic reaction steps connected via diffusible metabolites. This perception is incompatible with the ‘molecular crowding’ in most cellular compartments (e.g., 60% in the mitochondrial matrix). It is also not in line with the cumulating indirect evidence from comprehensive studies of protein-protein interactions and affinity purification, showing that numerous protein complexes involving different metabolic and regulatory processes are interconnected. However, direct evidence of extensive cross-talk among diverse cellular processes remains to be clearly demonstrated. Here we show that in mitochondria of yeast and other fungi (Neurospora crassa and Rhizopus oryzae), animal (Bos taurus), plant (Brassica oleracea), and in E. coli (standing for the “bacterial ancestor” of mitochondria), metabolism is physically interlinked (in supercomplexes) with translation, replication, transcription and RNA processing. Further, the supercomplexes also contain a variety of helper proteins, in support of earlier reports that describe such proteins as important structural units assisting complex assembly. Whereas the composition of supercomplexes in fungi (e.g., Neurospora crassa), animals and yeast is relatively similar, plants and E. coli present substantial compositional differences (e.g., plant-specific enzymes involved in the biosynthesis of sugars and secondary metabolites). In yeast, the supercomplex pattern of glucose-repressed cells is completely different from that of cells grown on galactose/glycerol, and the protein composition perfectly correlates with known regulatory changes under glucose repression. The destabilization of the complex organization is also illustrated by the deletion of genes in the mitochondrial fatty acid type II biosynthetic pathway (mutant strain oar1Δ). Mutants have both, a defect in fatty acid synthesis and in 5’ processing of mitochondrial tRNA, and no longer have a supercomplex containing Oar1p and components of RNase P (5’ tRNA processing). The pleiotropic mutant phenotype is best explained by a structural (assembly) defect. Also in yeast mitochondria, we demonstrate that RNase P and tRNA Z activities are part of a large complex, which further includes the RNA degradosome complex, five additional RNA processing proteins, and several other mitochondrial pathways. 5’ and 3’ tRNA processing enzymes are also associated in a large, multifunctional supercomplex in E. coli that includes six out of the seven proteins of the RNA degradosome, nine aminoacyl-tRNA synthases, RNA polymerase plus four transcription factors, eleven ribosomal proteins plus four translation factors, several components of protein folding and maturation, and a small set of metabolic enzymes. Apparently, not only is RNA processing coordinated, but it is also structurally connected to aminoacylation, transcription and other cellular functions. The number of documented cases where functionally related activities are structurally integrated is definitely increasing (e.g., editosome, glycolysis complex, etc). Indeed, structural integration of related functions and pathways may turn out to be a principle and the analyses of such super-structures may become a next structural biology frontier.

Les processus mitochondriaux tels que la réplication et la traduction sont effectués par des complexes multiprotéiques. Par contre, le métabolisme et la voie de maturation des ARN mitochondriaux (p. ex précurseurs des ARNt et des ARNr) sont habituellement traités comme une suite de réactions catalysées par des protéines séparées. L’exécution fidèle et optimale de ces processus mitochondriaux, exige un couplage étroit nécessaire pour la canalisation des intermédiaires métaboliques. Or, les évidences en faveur de l'interconnexion postulée de ces processus cellulaires sont peu nombreuses et proviennent en grande partie des interactions protéine-protéine. Contrairement à la perception classique, nos résultats révèlent l’organisation des fonctions cellulaires telles que la transcription, la traduction, le métabolisme et la régulation en supercomplexes multifonctionnels stables, dans les mitochondries des champignons (ex Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans et Neurospora crassa), des animaux (ex Bos taurus), des plantes (B. oleracea et Arabidopsis thaliana) et chez les bactéries (ex E. coli) à partir desquelles les mitochondries descendent. La composition de ces supercomplexes chez les champignons et les animaux est comparable à celle de levure, toutefois, chez les plantes et E. coli ils comportent des différences notables (ex, présence des enzymes spécifiques à la voie de biosynthèse des sucres et les léctines chez B. oleracea). Chez la levure, en accord avec les changements dûs à la répression catabolique du glucose, nos résultats révèlent que les supercomplexes sont dynamiques et que leur composition en protéines dépend des stimulis et de la régulation cellulaire. De plus, nous montrons que l’inactivation de la voie de biosynthèse des lipides de type II (FASII) perturbe l’assemblage et/ou la biogenèse du supercomplexe de la RNase P (responsable de la maturation en 5’ des précurseurs des ARNt), ce qui suggère que de multiples effets pléiotropiques peuvent être de nature structurale entre les protéines. Chez la levure et chez E. coli, nos études de la maturation in vitro des précurseurs des ARNt et de la protéomique révèlent l’association de la RNase P avec les enzymes de la maturation d’ARNt en 3’. En effet, la voie de maturation des pré-ARNt et des ARNr, et la dégradation des ARN mitochondriaux semblent êtres associées avec la machinerie de la traduction au sein d’un même supercomplexe multifonctionnel dans la mitochondrie de la levure. Chez E. coli, nous avons caractérisé un supercomplexe similaire qui inclut en plus de la RNase P: la PNPase, le complexe du RNA degradosome, l’ARN polymérase, quatre facteurs de transcription, neuf aminoacyl-tRNA synthétases, onze protéines ribosomiques, des chaperons et certaines protéines métaboliques. Ces résultats supposent l’association physique de la transcription, la voie de maturation et d’aminoacylation des ARNt, la dégradation des ARN. Le nombre de cas où les activités cellulaires sont fonctionnellement et structurellement associées est certainement à la hausse (ex, l’éditosome et le complexe de la glycolyse). En effet, l’organisation en supercomplexe multifonctionnel représente probablement l’unité fonctionnelle dans les cellules et les analyses de ces super-structures peuvent devenir la prochaine cible de la biologie structurale. / It is known that processes such as transcription, translation and intron splicing require a multitude of proteins (plus a few non-protein components) organized in large ‘molecular machines’. But, according to traditional views, processing of RNA precursors (e.g., tRNA and rRNA) and metabolic pathways are pools of individual enzymes (single proteins or small complexes), with sequential enzymatic reaction steps connected via diffusible metabolites. This perception is incompatible with the ‘molecular crowding’ in most cellular compartments (e.g., 60% in the mitochondrial matrix). It is also not in line with the cumulating indirect evidence from comprehensive studies of protein-protein interactions and affinity purification, showing that numerous protein complexes involving different metabolic and regulatory processes are interconnected. However, direct evidence of extensive cross-talk among diverse cellular processes remains to be clearly demonstrated. Here we show that in mitochondria of yeast and other fungi (Neurospora crassa and Rhizopus oryzae), animal (Bos taurus), plant (Brassica oleracea), and in E. coli (standing for the “bacterial ancestor” of mitochondria), metabolism is physically interlinked (in supercomplexes) with translation, replication, transcription and RNA processing. Further, the supercomplexes also contain a variety of helper proteins, in support of earlier reports that describe such proteins as important structural units assisting complex assembly. Whereas the composition of supercomplexes in fungi (e.g., Neurospora crassa), animals and yeast is relatively similar, plants and E. coli present substantial compositional differences (e.g., plant-specific enzymes involved in the biosynthesis of sugars and secondary metabolites). In yeast, the supercomplex pattern of glucose-repressed cells is completely different from that of cells grown on galactose/glycerol, and the protein composition perfectly correlates with known regulatory changes under glucose repression. The destabilization of the complex organization is also illustrated by the deletion of genes in the mitochondrial fatty acid type II biosynthetic pathway (mutant strain oar1Δ). Mutants have both, a defect in fatty acid synthesis and in 5’ processing of mitochondrial tRNA, and no longer have a supercomplex containing Oar1p and components of RNase P (5’ tRNA processing). The pleiotropic mutant phenotype is best explained by a structural (assembly) defect. Also in yeast mitochondria, we demonstrate that RNase P and tRNA Z activities are part of a large complex, which further includes the RNA degradosome complex, five additional RNA processing proteins, and several other mitochondrial pathways. 5’ and 3’ tRNA processing enzymes are also associated in a large, multifunctional supercomplex in E. coli that includes six out of the seven proteins of the RNA degradosome, nine aminoacyl-tRNA synthases, RNA polymerase plus four transcription factors, eleven ribosomal proteins plus four translation factors, several components of protein folding and maturation, and a small set of metabolic enzymes. Apparently, not only is RNA processing coordinated, but it is also structurally connected to aminoacylation, transcription and other cellular functions. The number of documented cases where functionally related activities are structurally integrated is definitely increasing (e.g., editosome, glycolysis complex, etc). Indeed, structural integration of related functions and pathways may turn out to be a principle and the analyses of such super-structures may become a next structural biology frontier.

L'ADN mitochondrial (ADNmt) des animaux est généralement constitué de molécules circulaires monomériques de ~16 kb. Cependant, parmi les rares exceptions qui ont été décrites, deux espèces d'Oniscidea Armadillidium vulgare et Porcellionides pruinosus (Crustacés Isopodes terrestres) présentent un ADNmt atypique composé de molécules monomériques linéaires de ~14 kb associées à des dimères circulaires et palindromiques de ~28 kb. Afin de connaître plus en détail sa structure, l'ADNmt atypique d'A. vulgare a été séquencé. Il contient bien les 13 gènes codants pour des protéines et les deux sous unités ribosomales généralement présents dans l'ADNmt des Métazoaires, mais en revanche il ne présente pas l'ensemble des 22 ARN de transferts (ARNt) attendus. De plus, une étonnante hétéroplasmie générant un ARNt alloaccepteur pour les acides aminés Alanine et Valine (ARNtAla/Val) a été découverte. Cette hétéroplasmie est un exemple unique chez les Eucaryotes par la présence de deux gènes différents sur le même locus mitochondrial. De façon surprenante, cette hétéroplasmie a également été observée chez de nombreuses autres espèces d'Oniscidea qui possèdent aussi un génome mitochondrial atypique. Il semble donc que l'apparition de cet ADNmt atypique chez les Isopodes ait permis l'apparition de l'ARNtAla/Val, et que les forces évolutives permettant le maintien de ces deux gènes essentiels à la traduction mitochondriale soient impliquées dans la conservation de cette structure atypique.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), est un rétrovirus dont le génome est composé de deux molécules d’ARN simple brin. La transcriptase inverse codée par le VIH-1 utilise l’ARNt3Lys de la cellule hôte pour amorcer la réplication de son génome ARN en ADN proviral. L’ARNt3Lys est encapsidé dans les virions lors de l’assemblage; la lysyl-ARNt synthétase (LysRS) cellulaire est impliquée dans ce mécanisme et sert de co-transporteur à l’ARNt3Lys.Chez l’homme, il existe deux formes de LysRS, une forme cytoplasmique (cLysRS) et une forme mitochondriale (pmLysRS) qui donnera la forme mature (mLysRS) après translocation dans la mitochondrie. Les deux LysRS sont issues d’un même gène par épissage alternatif. Il a été démontré que seule la forme mitochondriale est présente dans les particules virales.Nous avons établi un modèle des interactions protéine-protéine impliquées dans la formation du complexe d’encapsidation de l’ARNt3Lys. En recherchant les interactions des précurseurs Gag et GagPol avec les LysRS et leurs domaines, nous avons démontré que seul le domaine Pol du précurseur GagPol a la capacité de s’associer à la LysRS. Ce sont les sous-domaines transframe TF et intégrase IN du domaine Pol qui permettent l’association entre LysRS et GagPol. Cette association se fait via le domaine catalytique de l’enzyme. La sélectivité de l'encapsidation de la forme mitochondriale de LysRS aux dépens de sa forme cytoplasmique pourrait résider dans la stricte compartimentation cellulaire de ces deux formes enzymatiques. Nous avons voulu établir à quel stade l’encapsidation de la LysRS mitochondriale a lieu, soit avant sa translocation mitochondriale sous forme de précurseur pmLysRS, soit après sous forme mLysRS maturée. Nous avons déterminé le site de maturation du précurseur pmLysRS puis caractérisé les deux formes mitochondriales de la LysRS, en déterminant leurs paramètres cinétiques et leur affinité pour l’ARNt3Lys. Alors que la forme pmLysRS ne forme pas de complexe stable avec l’ARNt, la forme maturée mLysRS est la plus apte à interagir avec l’ARNt3Lys. Ce serait donc la mLysRS qui serait impliquée dans le transport de l’ARNt3Lys dans les particules virales lors du bourgeonnement.Comme l'interaction GagPol:LysRS n'est pas spécifique in vitro de la forme mLysRS qui est la seule espèce de LysRS encapsidée, nous avons recherché si d’autres protéines virales pouvaient intervenir dans la formation du complexe d’encapsidation et conférer la spécificité pour la seule mLysRS. Nous avons montré que les protéines auxiliaires Rev et Vpr ont la capacité à s’associer à la LysRS sans distinction d'origine, mais ne peuvent interagir dans le contexte du complexe d'encapsidation GagPol:mLysRS:ARNt3Lys. Les différentes formes de LysRS pourraient ainsi réguler l'activité de Vpr et Rev à d'autres étapes du cycle viral. / The Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is a retrovirus with a genome composed of two molecules of single stranded RNA. The reverse transcriptase encoded by HIV-1 uses the cellular tRNA3Lys to prime the replication of its RNA genome into a proviral DNA. The tRNA3Lys is packaged into the viral particles during their assembly; the cellular lysyl-tRNA synthetase (LysRS) is involved in this mechanism as a co-carrier of tRNA3Lys.In human, there are two forms of LysRS, a cytoplasmic form (cLysRS) and a mitochondrial form (pmLysRS) that will be maturated into mLysRS after translocation into the mitochondrion. Both LysRS arise from the same gene by alternative splicing. It was demonstrated that only the mitochondrial species is present in the viral particles.We established a model of the protein-protein interactions which are implied in the formation of the packaging complex of tRNA3Lys. By searching for interactions of the viral precursors Gag and GagPol with the LysRS species and their domains, we demonstrated that only the Pol domain of the GagPol precursor has the capacity to interact with LysRS. The transframe (TF) and integrase (IN) domains of the Pol region of the polyprotein GagPol are required for association of LysRS with GagPol. This association is mediated by the catalytic domain of the enzyme. The selectivity of the packaging of the mitochondrial species of LysRS but not of its cytoplasmic species would rest on the cellular compartmentalization of these two enzyme forms. To establish at which step the mitochondrial LysRS is packaged, either as the pmLysRS precursor before its mitochondrial translocation, or after as the mature mLysRS, we determined the site of maturation of the pmLysRS precursor, then we characterized both mitochondrial forms of LysRS, by determining their kinetic parameters and their affinity for tRNA3Lys. Whereas the pmLysRS species did not form a stable complex with tRNA, the mature pmLysRS species did. Thus, mLysRS is the only LysRS species which could be implied in the transport of tRNA3Lys into the viral particles during the budding step. In vitro, the interaction GagPol:LysRS is not specific for the mLysRS species, but only the mitochondrial LysRS is packaged into the viral particles. We determined if another viral protein could impact the specificity of mLysRS packaging. We showed that the auxiliary proteins Rev and Vpr have the capacity to interact with LysRS but this intercation is not recovered in the context of the GagPol:mLysRS:tRNA3Lys packaging complex. These data suggest that the different forms of LysRS might regulate the activity of Vpr and Rev at other steps of the viral cycle.

Les ARN de transfert, éléments centraux de la traduction, présentent une grande variété de nucléosides modifiés dérivés des nucléosides canoniques (A, U, G et C), qui modulent la stabilité, la capacité de décodage et l’identité de ces molécules. t6A (thréonylcarbamoyl-N6-Adénosine) est un nucléoside hypermodifié retrouvé en position 37 (adjacent à l’anticodon) au niveau de tous les ARNt qui s’apparient aux codons de la forme ANN. Il joue un rôle essentiel dans la fidélité de traduction à travers deux fonctions principales : (i) il intervient dans le maintien de la bonne conformation de la boucle anticodon ; (ii) il facilite l’appariement codon/anticodon afin d’éviter le décalage de cadre de lecture durant la synthèse protéique. Ce nucléoside modifié est universel, présent chez les Archées, les Bactéries, les Eucaryotes, mais également chez les organites (mitochondries et chloroplastes), ce qui suggère que son apparition représente une acquisition évolutive importante et très ancienne, probablement antérieure au dernier ancêtre commun universel (LUCA). Pourtant, la voie de biosynthèse de t6A est restée inconnue pendant près de quarante ans.Récemment, des études de génétique ont montré que deux protéines universelles, Sua5/YrdC et Kae1/YgjD, sont nécessaires à sa synthèse chez Saccharomyces cerevisiae et Escherichia coli. Chez les Bactéries, la synthèse in vitro de t6A requiert la présence de deux autres protéines spécifiques à ce domaine du vivant : YeaZ et YjeE. Chez les Archées et les Eucaryotes, Kae1 (l’orthologue de YgjD) fait partie d’un complexe protéique conservé appelé KEOPS (pour Kinase Endopeptidase and Other Proteins of Small size), aux côtés de trois autres protéines : Bud32, Cgi121 et Pcc1, qui n’ont pas d’homologues chez les Bactéries. Depuis sa découverte en 2006 chez S.cerevisiae, ce complexe a été impliqué dans plusieurs processus cellulaires (homéostasie des télomères, maintien du génome, régulation de la transcription), sans que sa fonction ne soit clairement élucidée.Nous avons entrepris de caractériser et de comparer par une approche biochimique in vitro les machineries de biosynthèse de t6A issues des trois domaines du vivants, en utilisant comme organismes modèles l’Archée Pyrococcus abyssi, l’Eucaryote Saccharomyces cerevisiae et la Bactérie Escherichia coli. (i) Nous avons montré pour la première fois que le complexe KEOPS et la protéine Sua5 catalysent ensemble la synthèse de t6A chez les Archées et les Eucaryotes. Nos résultats nous ont permis d’élaborer un modèle de mécanisme catalytique, et nous avons montré par des expériences de complémentation in vitro que ce mécanisme est universel : les différents orthologues Sua5/YrdC sont interchangeables, et le complexe KEOPS est l’analogue fonctionnel du trio de protéines YgjD/YeaZ/YjeE Bactérien. (ii) Nous avons alors étudié le rôle de chacune des sous-unités du complexe KEOPS de Pyrococcus abyssi dans la synthèse de t6A. Ainsi, nous avons montré que Kae1 est le seul composant catalytique stricto sensus et que les trois autres partenaires ont des fonctions distinctes dans la régulation de l’activité catalytique. (iii) Enfin, nous avons étudié la synthèse de t6A chez la mitochondrie de S.cerevisiae, et avons montré que Sua5 et la protéine Qri7, l’orthologue mitochondrial de Kae1/YgjD, catalysent ensemble la synthèse de t6A et constituent ainsi un système minimaliste à deux composants.Ces résultats ouvrent la voie à une compréhension détaillée du mécanisme de biosynthèse de t6A dans les trois domaines du vivant, et permettent de proposer des scénarii évolutifs concernant l’histoire de la machinerie de synthèse de ce nucléoside modifié universel. / Transfer RNA are central elements of the translational system and carry a large diversity of modified nucleosides (derived from canonical nucleosides A, U, G, and C), which tune the stability, the decoding capacity and the identity of these oligonucleotides. t6A (threonylcarbamoyl-N6- adenosine) is a hypermodified nucleoside found at the position 37 (next to the anticodon) in all tRNA decoding ANN codons. It plays an essential role in the fidelity of translation through two main functions: (i) it ensures a correct conformation of the anticodon loop; (ii) it enhances codon/anticodon pairing to prevent frameshifting during translation. This nucleoside is universal, found in Archaea, Bacteria, Eukarya and also in organites such as mitochondria, which suggests that it appeared early in the evolution, probably before the last universal common ancestor (LUCA). Despite the importance of t6A and its distribution, its biosynthetic pathway has remained unknown for almost 40 years.Recently, genetic studies have shown that two universal proteins, Sua5/YrdC and Kae1/YgjD, are both necessary for synthesis of t6A in Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli. In Bacteria, the in vitro synthesis of t6A requires two other bacterial specific proteins called YeaZ and YjeE. In Archaea and Eukarya, Kae1 (the YgjD orthologue) is a part of a conserved protein complex called KEOPS (for Kinase Endopeptidase and Other Proteins of Small size), with three other proteins Bud32, Cgi121 and Pcc1, that have no bacterial homologues. Since its discovery in 2006 in yeast, this complex has been involved in several cellular processes (telomere homeostasis, genome maintenance, transcription regulation), but its real function remained unclear.Using an in vitro biochemical approach we aimed to characterize and compare the t6A biosynthesis systems from the three domains of life, using as model organisms Pyrococcus abyssi (Archaea) Saccharomyces cerevisiae (Eukarya), and Escherichia coli (Bacteria). We have reconstituted for the first time an in vitro system for t6A modification in Archaea and Eukarya, using purified KEOPS and Sua5. This allowed us to propose a model for the catalytic mechanism, and using in vitro complementation experiments we demonstrated that this mechanism is universal: Sua5/YrdC orthologues are interchangeable, and the KEOPS complex is the functional analogue of the bacterial trio YeaZ/YgjD/YjeE. In the second part of this work we have studied the role of each sub unit in the synthesis of t6A. Using KEOPS from P. abyssi as model we demonstrated that Kae1 is the only catalytic component while the three other partners have distinct functions in dimerization, tRNA binding and allosteric regulation. Finally, we have focused on the t6A synthesis in the mitochondria of S.cerevisiae, and shown that Sua5 and Qri7, the mitochondrial orthologue of Kae1/YgjD, catalyze together the synthesis of t6A and so represent a minimal two-component system.Overall these findings shed light on the reaction mechanism of t6A synthesis in the three domains of life, and allowed proposing a scenario concerning the history of the t6A synthesis machinery and its evolution.