A Brucella abortus causa diminuição da eficiência reprodutiva em bovinos e é também o agente de uma das zoonoses mais difundidas no mundo. A doença é alvo de programas de controle em muitos países e, no Brasil, seu combate foi melhor organizado a partir de 2001, com o lançamento de programa nacional pelo MAPA. O objetivo do presente estudo foi aperfeiçoar a detecção de B. abortus em homogeneizados de órgãos de fetos abortados por vacas infectadas. Assim, foram comparados diferentes protocolos de extração de DNA, visando à detecção de B. abortus pela PCR em amostras clínicas colhidas de fetos abortados ou bezerros oriundos de vacas experimentalmente desafiadas com B. abortus cepa 2308. Para tanto, foram construídos dois grupos padrão ouro com base na bacteriologia clássica, constituídos por: 32 pulmões (17 positivos ao isolamento), 26 baços (11 positivos ao isolamento), 23 fígados (8 positivos ao isolamento) e 22 linfonodos bronquiais (7 positivos ao isolamento). Todas essas amostras foram submetidas a três distintos protocolos de extração de DNA, seguidos do mesmo processo de amplificação com os primers B4 e B5. A análise dos resultados consolidados mostrou uma sensibilidade de 95% para o protocolo da proteinase K (PK), 86% para o do isotiocianato de guanidina (GT) e de 88% para o de Boom. Os valores encontrados de Sensibilidade para pulmão, baço, fígado e linfonodo foram, respectivamente, 100%, 100%, 100% e 71% (PK), 82%, 100%, 88% e 71% (GT) e 94%, 100%, 63% e 86% (Boom). No grupo dos animais dos quais não foi possível isolar brucellas (gold standard negativo), a PCR resultou positiva em 8 amostras para o protocolo de extração PK (4 pulmões, 1 fígado e 3 linfonodos), em 6 amostras para o protocolo de extração GT (1 pulmão, 3 fígados e 2 linfonodos) e em 37 amostras para o protocolo de extração Boom (10 pulmões, 10 baços, 10 fígados e 7 linfonodos). Esses resultados permitem afirmar que o protocolo de extração PK apresentou a melhor sensibilidade diagnóstica e que o protocolo de extração de Boom apresentou o melhor desempenho nas amostras onde o isolamento foi negativo. Dentre os órgãos estudados, o baço apresentou a maior probabilidade de detecção de B. abortus. Assim, a melhor estratégia para detecção de B. abortus em homogeneizados de órgãos de fetos abortados é a utilização do isolamento e da PCR em paralelo. / Infection by Brucella abortus diminishes the reproductive efficiency in bovines and it is also the agent of one of the most spread zoonosis in the world. In many countries control programs aim this disease, and in Brazil its combat was better organized since 2001 with the creation of the national program by the Ministry of Agriculture, Livestock and Supplies (MAPA). The objective of the present study was to improve the detection of B. abortus in aborted fetus homogenates from infected cows. For that reason, different DNA extraction protocols were compared, focusing the PCR detection of B. abortus in clinical samples collected from aborted fetus or calves obtained from cows experimentally defied with the 2308 B. abortus strain. Therefore, two gold standard groups were built based on classical bacteriology, formed by: 32 lungs (17 isolation positives samples), 26 spleens (11 isolation positives samples), 23 livers (8 isolation positives samples) and 22 bronchial lymph nodes (7 isolation positives samples). All samples were submitted to three distinct DNA extraction protocols, followed by the same amplification process with the primers B4 and B5. The analysis of the consolidated results showed a 95% sensibility for the proteinase K protocol (PK), 86 % for the guanidine isotiocianate (GT) and 88% for the Boom. The sensibility values obtained for lungs, spleen, liver and lymph node were, respectively, 100%, 100%, 100% and 71% (PK), 82%, 100%, 88% and 71% (GT) and 94%, 100%, 63% and 86% (Boom). In the group of animals in which it was not possible to isolate brucellas (negative gold standard), the PCR resulted positively in 8 samples for the PK extraction protocol (4 lungs, 1 liver and 3 lymph nodes), in 6 samples for the GT extraction protocol (1 lung, 3 livers and 2 lymph nodes) and in 37 samples for the Boom extraction protocol (10 lungs, 10 spleens, 10 livers and 7 lymph nodes). These results permit affirming that the PK extraction protocol showed the best diagnostic sensibility and that the Boom extraction protocol showed the best performance in negative isolation samples. Within the studied organs, the spleen showed the highest probability of B. abortus detection. Therefore, the best strategy for B. abortus detection in organs homogenates from aborted fetus is the utilization of isolation and in parallel, the PCR.

A legislação brasileira permite o uso de leite cru na fabricação de queijos curados se o período de cura for superior a 60 dias (a 5°C ou mais). Entretanto, não há evidência científica sólida de que durante a cura ocorre suficiente inativação de Brucella abortus, sob a perspectiva da segurança dos alimentos. Além disso, não há metodologia oficial para quantificação de brucelas em matriz alimentar. Desta forma este projeto propõe um protocolo para estudos da curva de decaimento de Brucella abortus durante a cura de queijos. Três partidas de queijo tipo parmesão foram feitas com leite tipo A pasteurizado, artificialmente contaminado com uma cepa pouco patogênica de Brucella abortus (1119-3). O queijo foi curado a 18°C e analisado a cada 3-4 dias até o 60º dia ou até que duas análises consecutivas fossem negativas. As amostras foram submetidas à pesquisa quantitativa de brucela em meio Farrel (36°C/3 dias). A média do Tempo de Redução Decimal (D18°C), ponderado pelas incertezas, foi de 4,31 ± 0,49 dias. Estes resultados são preliminares e é necessário realizar mais análises para gerar dados mais precisos sobre esse parâmetro, especialmente usando cepas de campo. O Tempo de Redução Decimal associado à cura do queijo é um parâmetro importante para os modelos de avaliação de risco da transmissão de brucelose pelo consumo de queijo. / Brazilian legislation allows the use of raw milk to produce ripened cheeses, when the ripening period is over 60 days (at 5°C or above). However, there is not solid scientific evidence that the ripening process inactivates enough amounts of Brucella abortus, from the food safety perspective. In addition, there is no official methodology for brucela counting in food matrix. So, this project proposes a protocol to study the decay curve of Brucella abortus during cheese ripening. Three batches of parmesan type cheese were made with pasteurized milk artificially contaminated with a less pathogenic strain of Brucella abortus (1119-3). The cheese was ripened at 18°C and analyzed each 3-4 days until 60th or until two consecutive negative results. The samples were submitted to quantitative culture for brucela in Farrel medium (36°C/3 days). The average of Decimal Reduction Time (D18°C), weighted by uncertainties, was 4,31 ± 0,49 days. This is a preliminary result and we need to run more samples to generate more accurate data about this parameter, specially using field strains. The Decimal Reduction Time associated with ripening step is an important data to input risk assessment models for cheese-born brucelosis.

O Pantanal é considerado uma das maiores planícies inundáveis do mundo e possui uma rica biodiversidade. Das onze espécies de tatus registradas no Brasil, sete ocorrem no Pantanal. Os tatus dividem suas áreas de vida com diversas outras espécies silvestres e com o gado, pois a produção extensiva de bovinos de corte é a principal atividade econômica da região. Estudos anteriores demonstraram exposição à Brucella abortus e Leptospira interrogans em diversas espécies silvestres no Pantanal, porém sabe-se pouco quanto à exposição e/ou presença desses agentes em tatus neste bioma. Dessa forma, o presente estudo teve por objetivo determinar a prevalência de anticorpos anti-Brucella e anti-Leptospira interrogans através do teste do Antígeno Acidificado Tamponado (AAT) e Soroaglutinação Microscópica (SAM) em amostras de soro de tatus de vida livre, provenientes do Pantanal da Nhecolândia e realizar a pesquisa direta do DNA dos agentes através do emprego da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em amostras de sangue. Foram testados 48 indivíduos de quatro espécies, sendo Dasypus novemcinctus (n=2), Cabassous unicinctus (n=8), Euphractus sexcinctus (n=16) e Priodontes maximus (n=22). Não foi observado produto amplificado pela PCR em nenhum animal testado, da mesma forma, nenhum tatu apresentou anticorpos anti-Brucella pelo AAT. Na sorologia para L. Interrogans foi encontrada prevalência de 31,25 % (5/16) em E. sexcinctus e 18,18% (4/22) em P. maximus. Esses indivíduos foram positivos para os sorovares Autumnalis/Butembo, Cynopteri/Cynopteri e Pomona/Pomona, com títulos variando de 1: 200 a 1: 1600. Os resultados obtidos reforçam a importância da vigilância de patógenos em populações de vida livre, especialmente quando existe contato com animais de produção, além de contribuir para o conhecimento de agentes infecciosos em tatus da região do Pantanal. / Pantanal is considered one of the worlds largest wetlands. Seven of the eleven species of armadillos that occur in Brazil, from a total of 21 recognized species in the world, have been recorded in this area. The main local economic activity is beef cattle production, which leads to intense wildlife-livestock contact, potentially increasing wildlife exposure to several pathogens, including those with zoonotic and economic relevance. Previous studies demonstrated that several wildlife species have been exposed to Brucella abortus and Leptospira interrogans in Pantanal; however, the exposure and/or presence of zoonotic pathogens in armadillos in this biome is still poorly understood. In order to address this question, we employed conventional polymerase chain reaction (PCR), the Rose Bengal Test (RBT) and the Microscopic Agglutination Test (MAT) to investigate the exposure and/or infection by Brucella abortus and Leptospira interrogans in blood samples of four armadillos species: nine-banded armadillo (Dasypus novemcinctus) (n=2), southern naked-tailed armadillo (Cabassous unicinctus) (n=8), yellow armadillo (Euphractus sexcinctus) (n=16) and giant armadillo (Priodontes maximus) (n=22) caught at Nhecolândia, Pantanal, Brazil. We did not detect Brucella abortus by PCR or exposure to this pathogen via the RBT in the evaluated armadillos. On the other hand, the Microscopic Agglutination Test (MAT) detected Leptospira interrogans exposure in 31.25 % (5/16) of E. sexcinctus and 18.18% (4/22) P. maximus specimens. These individuals were positive to serovars Autumnalis/Butembo, Cynopteri/Cynopteri and Pomona/Pomona, this latter with titers ranging from 1:200 to 1:1600. Our results reinforce the importance of pathogen surveillance in wildlife living in areas of livestock production and further contribute to the study of zoonotic pathogens in armadillos in the Pantanal region.

Este estudo comparou o desempenho de quatro protocolos de extração de DNA a partir de homogeneizados de diferentes órgãos provenientes de vacas infectadas experimentalmente com a B. abortus 2308. Os protocolos de extração comparados foram o método de GT (lise com isotiocianato de guanidina), Boom (lise com GT e tratamento com suspensão carreadora Diatomaceous earth), PK (lise com proteinase K) e Santos (lise por fervura e congelamento com nitrogênio líquido). Foram constituídos os grupos padrão ouro positivo e negativo baseados na bacteriologia clássica e compostos por: 54 cotilédones (27 pos. e 27 neg.), 39 linfonodos supra mamários (12 pos. e 27 neg.), 44 pré-escapulares (17 pos. e 27 neg.), 33 fígados (6 pos. e 27 neg.), 37 baços (10 pos. e 27 neg.), e 34 úberes (7 pos. e 27 neg.). Todas as amostras foram submetidas aos quatro protocolos de extração e a um mesmo processo de amplificação com os primers B4 e B5. Nos resultados consolidados por órgãos, a proporção de positivos no cotilédone foi maior do que a encontrada no linfonodo supramamário (p=0,0001), linfonodo pré-escapular (p<0,0001), fígado (p=0,0006), baço (p<0,0001) ou úbere (p=0,0019). Os resultados acumulados para os métodos de extração mostraram que o protocolo de Santos teve maior sensibilidade relativa do que o método de Boom (p=0,003) e GT (p=0,0506), e foi igual ao PK (p=0,2969). As demais comparações de proporções não resultaram em diferenças estatisticamente significantes. No estudo verificou-se amostas positivas a PCR e negativas ao isolamento e viceversa. Assim, apesar das desvantagens do método bacteriológico clássico, a melhor estratégia para o diagnóstico direto da infecção de vacas por B. abortus em homogeneizado de órgãos é a utilização conjunta do isolamento e da PCR, examinando os cotilédones e utilizando os métodos de extração de DNA Santos ou PK. / This study compared the performance of four protocols of DNA extraction from suspensions of different tissues from experimentally infected cows with 2308 strain. The compared extraction protocols were GT protocol (lyse with guanidine isotiocianate), Boom (lyse with GT and treated with the carrying suspension Diatomaceous earth), PK (lise with proteinase K) and Santos (lyse by boiling and freezing with liquid nitrogen). Based on classical bacteriology, positive and negative gold standard groups were built and consisted of 54 cotyledons (27 pos. and 27 neg.), 39 supramammary lymph nodes (12 pos. and 27 neg.), 44 prescapulars (17 pos. and 27 neg.), 33 livers (6 pos. and 27 neg.), 37 spleens (10 pos. and 27 neg.), and 34 udders (7 pos. and 27 neg.). All the samples were submitted to the four DNA extraction protocols and the same amplification process using the primers B4 and B5. According to consolidated results by tissue, the proportion of positives in cotyledon was bigger than supramammary lymph node (p=0,0001), prescapular lymph node (p<0,0001), liver (p=0,0006), spleen (p<0,0001) and udder (p=0,0019). The consolidated results for the extraction methods show that Santos protocol had bigger relative sensitivity than Boom method (p=0,003) and GT (p=0,0506), and was equal than PK (p=0,2969). There were not significant statistical differences in the others comparisons of proportions. In the study, PCR-positive and isolation-negative samples and vice-versa were verified. However, the disadvantages of the classic bacteriological method, the best strategy for direct diagnosis of the infection of cows for B. abortus in homogenized of tissues is combined use of isolation and PCR, examining the cotyledons and using the methods of DNA extraction from Santos or PK.

Espécies de Brucella são causadoras da brucelose, uma das doenças zoonóticas mais difundidas em todo o mundo, que é causa aborto em animais domésticos e infecção potencialmente debilitante em humanos. Apesar da identificação de diferentes espécies dentro do gênero, baseada na diferença de hospedeiro e patogenicidade, o gênero tem sido descrito como geneticamente homogêneo. Técnicas moleculares têm sido empregadas com o intuito de diferenciar e tipificar estes microrganismos, sendo que a abordagem mais promissora visa a identificação de polimorfismos entre as espécies e biovares. O objetivo do trabalho foi analisar o perfil genético de diferentes cepas de B. abortus obtidos a partir da técnica de SE-AFLP a fim de determinar a sequência dos fragmentos obtidos e genes que poderiam estar presentes nos fragmentos selecionados e compará-las com bancos de genes e de proteínas de procariotos. Foram selecionados 19 fragmentos, que foram purificados, sequenciados e, as sequências obtidas, submetidas a diversas ferramentas de bioinformática visando sua caracterização e identificação. Nenhum dos fragmentos de nucleotídeos apresentou similaridade entre si e/ou com outra sequência já conhecida de outros microrganismos, inclusive com sequências conhecidas do gênero Brucella. Das 114 proteínas hipotéticas geradas pela tradução destas sequências genômicas 57% (65 sequências) apresentaram baixo grau de similaridade com proteínas descritas e disponíveis em BLASTp (proteínas não-redundantes e SwissProt), variando entre 29 e 43. Do total de proteínas similares 85% foram atribuídas e proteínas funcionais e 14% a proteínas hipotéticas. Essas novas sequências deverão ser utilizadas em outros trabalhos visando verificar sua abrangência e especificidade dentro das espécies e biovares de Brucella. / Brucella species are the cause of brucellosis, one of the most widespread zoonotic diseases around the world, which is cause abortion in domestic animals and potentially debilitating infection in humans. Despite the identification of different species within the genus, based on the difference of host and pathogenicity, the genre has been described as genetically homogeneous. Molecular techniques have been employed in order to differentiate and classify these organisms, and the most promising approach aims to identify polymorphisms between species and biovars. The objective of this study was to analyze the genetic profile of different strains of B. abortus obtained by the technique of SE-AFLP to determine the sequence of the fragments obtained and genes that may be present in the selected fragments and compare them to databases of genes and proteins in prokaryotes. We selected 19 fragments that were purified, sequenced and the sequences obtained, subject to several bioinformatics tools aiming at its characterization and identification. None of the fragments showed nucleotide similarity between themselves and / or other sequence already known from other organisms, including known sequences of the genus Brucella. Of the 114 hypothetical proteins generated by translation of genomic sequences 57% (65 sequences) showed low level of similarity to proteins described and available in blastp (protein non-redundant and SwissProt), ranging between 29 and 43. Of the proteins similar 85% were attributed to functional proteins and 14% to hypothetical proteins. These new sequences should be used in other studies to verify its completeness and specificity within the species and biovars of Brucella.

Espécies de Brucella são causadoras da brucelose, uma das doenças zoonóticas mais difundidas em todo o mundo, que é causa aborto em animais domésticos e infecção potencialmente debilitante em humanos. Apesar da identificação de diferentes espécies dentro do gênero, baseada na diferença de hospedeiro e patogenicidade, o gênero tem sido descrito como geneticamente homogêneo. Técnicas moleculares têm sido empregadas com o intuito de diferenciar e tipificar estes microrganismos, sendo que a abordagem mais promissora visa a identificação de polimorfismos entre as espécies e biovares. O objetivo do trabalho foi analisar o perfil genético de diferentes cepas de B. abortus obtidos a partir da técnica de SE-AFLP a fim de determinar a sequência dos fragmentos obtidos e genes que poderiam estar presentes nos fragmentos selecionados e compará-las com bancos de genes e de proteínas de procariotos. Foram selecionados 19 fragmentos, que foram purificados, sequenciados e, as sequências obtidas, submetidas a diversas ferramentas de bioinformática visando sua caracterização e identificação. Nenhum dos fragmentos de nucleotídeos apresentou similaridade entre si e/ou com outra sequência já conhecida de outros microrganismos, inclusive com sequências conhecidas do gênero Brucella. Das 114 proteínas hipotéticas geradas pela tradução destas sequências genômicas 57% (65 sequências) apresentaram baixo grau de similaridade com proteínas descritas e disponíveis em BLASTp (proteínas não-redundantes e SwissProt), variando entre 29 e 43. Do total de proteínas similares 85% foram atribuídas e proteínas funcionais e 14% a proteínas hipotéticas. Essas novas sequências deverão ser utilizadas em outros trabalhos visando verificar sua abrangência e especificidade dentro das espécies e biovares de Brucella. / Brucella species are the cause of brucellosis, one of the most widespread zoonotic diseases around the world, which is cause abortion in domestic animals and potentially debilitating infection in humans. Despite the identification of different species within the genus, based on the difference of host and pathogenicity, the genre has been described as genetically homogeneous. Molecular techniques have been employed in order to differentiate and classify these organisms, and the most promising approach aims to identify polymorphisms between species and biovars. The objective of this study was to analyze the genetic profile of different strains of B. abortus obtained by the technique of SE-AFLP to determine the sequence of the fragments obtained and genes that may be present in the selected fragments and compare them to databases of genes and proteins in prokaryotes. We selected 19 fragments that were purified, sequenced and the sequences obtained, subject to several bioinformatics tools aiming at its characterization and identification. None of the fragments showed nucleotide similarity between themselves and / or other sequence already known from other organisms, including known sequences of the genus Brucella. Of the 114 hypothetical proteins generated by translation of genomic sequences 57% (65 sequences) showed low level of similarity to proteins described and available in blastp (protein non-redundant and SwissProt), ranging between 29 and 43. Of the proteins similar 85% were attributed to functional proteins and 14% to hypothetical proteins. These new sequences should be used in other studies to verify its completeness and specificity within the species and biovars of Brucella.

Espécies de Brucella são causadoras da brucelose, uma das doenças zoonóticas mais difundidas em todo o mundo, que é causa aborto em animais domésticos e infecção potencialmente debilitante em humanos. Apesar da identificação de diferentes espécies dentro do gênero, baseada na diferença de hospedeiro e patogenicidade, o gênero tem sido descrito como geneticamente homogêneo. Técnicas moleculares têm sido empregadas com o intuito de diferenciar e tipificar estes microrganismos, sendo que a abordagem mais promissora visa a identificação de polimorfismos entre as espécies e biovares. O objetivo do trabalho foi analisar o perfil genético de diferentes cepas de B. abortus obtidos a partir da técnica de SE-AFLP a fim de determinar a sequência dos fragmentos obtidos e genes que poderiam estar presentes nos fragmentos selecionados e compará-las com bancos de genes e de proteínas de procariotos. Foram selecionados 19 fragmentos, que foram purificados, sequenciados e, as sequências obtidas, submetidas a diversas ferramentas de bioinformática visando sua caracterização e identificação. Nenhum dos fragmentos de nucleotídeos apresentou similaridade entre si e/ou com outra sequência já conhecida de outros microrganismos, inclusive com sequências conhecidas do gênero Brucella. Das 114 proteínas hipotéticas geradas pela tradução destas sequências genômicas 57% (65 sequências) apresentaram baixo grau de similaridade com proteínas descritas e disponíveis em BLASTp (proteínas não-redundantes e SwissProt), variando entre 29 e 43. Do total de proteínas similares 85% foram atribuídas e proteínas funcionais e 14% a proteínas hipotéticas. Essas novas sequências deverão ser utilizadas em outros trabalhos visando verificar sua abrangência e especificidade dentro das espécies e biovares de Brucella. / Brucella species are the cause of brucellosis, one of the most widespread zoonotic diseases around the world, which is cause abortion in domestic animals and potentially debilitating infection in humans. Despite the identification of different species within the genus, based on the difference of host and pathogenicity, the genre has been described as genetically homogeneous. Molecular techniques have been employed in order to differentiate and classify these organisms, and the most promising approach aims to identify polymorphisms between species and biovars. The objective of this study was to analyze the genetic profile of different strains of B. abortus obtained by the technique of SE-AFLP to determine the sequence of the fragments obtained and genes that may be present in the selected fragments and compare them to databases of genes and proteins in prokaryotes. We selected 19 fragments that were purified, sequenced and the sequences obtained, subject to several bioinformatics tools aiming at its characterization and identification. None of the fragments showed nucleotide similarity between themselves and / or other sequence already known from other organisms, including known sequences of the genus Brucella. Of the 114 hypothetical proteins generated by translation of genomic sequences 57% (65 sequences) showed low level of similarity to proteins described and available in blastp (protein non-redundant and SwissProt), ranging between 29 and 43. Of the proteins similar 85% were attributed to functional proteins and 14% to hypothetical proteins. These new sequences should be used in other studies to verify its completeness and specificity within the species and biovars of Brucella.

Este estudo comparou o desempenho de quatro protocolos de extração de DNA a partir de homogeneizados de diferentes órgãos provenientes de vacas infectadas experimentalmente com a B. abortus 2308. Os protocolos de extração comparados foram o método de GT (lise com isotiocianato de guanidina), Boom (lise com GT e tratamento com suspensão carreadora Diatomaceous earth), PK (lise com proteinase K) e Santos (lise por fervura e congelamento com nitrogênio líquido). Foram constituídos os grupos padrão ouro positivo e negativo baseados na bacteriologia clássica e compostos por: 54 cotilédones (27 pos. e 27 neg.), 39 linfonodos supra mamários (12 pos. e 27 neg.), 44 pré-escapulares (17 pos. e 27 neg.), 33 fígados (6 pos. e 27 neg.), 37 baços (10 pos. e 27 neg.), e 34 úberes (7 pos. e 27 neg.). Todas as amostras foram submetidas aos quatro protocolos de extração e a um mesmo processo de amplificação com os primers B4 e B5. Nos resultados consolidados por órgãos, a proporção de positivos no cotilédone foi maior do que a encontrada no linfonodo supramamário (p=0,0001), linfonodo pré-escapular (p<0,0001), fígado (p=0,0006), baço (p<0,0001) ou úbere (p=0,0019). Os resultados acumulados para os métodos de extração mostraram que o protocolo de Santos teve maior sensibilidade relativa do que o método de Boom (p=0,003) e GT (p=0,0506), e foi igual ao PK (p=0,2969). As demais comparações de proporções não resultaram em diferenças estatisticamente significantes. No estudo verificou-se amostas positivas a PCR e negativas ao isolamento e viceversa. Assim, apesar das desvantagens do método bacteriológico clássico, a melhor estratégia para o diagnóstico direto da infecção de vacas por B. abortus em homogeneizado de órgãos é a utilização conjunta do isolamento e da PCR, examinando os cotilédones e utilizando os métodos de extração de DNA Santos ou PK. / This study compared the performance of four protocols of DNA extraction from suspensions of different tissues from experimentally infected cows with 2308 strain. The compared extraction protocols were GT protocol (lyse with guanidine isotiocianate), Boom (lyse with GT and treated with the carrying suspension Diatomaceous earth), PK (lise with proteinase K) and Santos (lyse by boiling and freezing with liquid nitrogen). Based on classical bacteriology, positive and negative gold standard groups were built and consisted of 54 cotyledons (27 pos. and 27 neg.), 39 supramammary lymph nodes (12 pos. and 27 neg.), 44 prescapulars (17 pos. and 27 neg.), 33 livers (6 pos. and 27 neg.), 37 spleens (10 pos. and 27 neg.), and 34 udders (7 pos. and 27 neg.). All the samples were submitted to the four DNA extraction protocols and the same amplification process using the primers B4 and B5. According to consolidated results by tissue, the proportion of positives in cotyledon was bigger than supramammary lymph node (p=0,0001), prescapular lymph node (p<0,0001), liver (p=0,0006), spleen (p<0,0001) and udder (p=0,0019). The consolidated results for the extraction methods show that Santos protocol had bigger relative sensitivity than Boom method (p=0,003) and GT (p=0,0506), and was equal than PK (p=0,2969). There were not significant statistical differences in the others comparisons of proportions. In the study, PCR-positive and isolation-negative samples and vice-versa were verified. However, the disadvantages of the classic bacteriological method, the best strategy for direct diagnosis of the infection of cows for B. abortus in homogenized of tissues is combined use of isolation and PCR, examining the cotyledons and using the methods of DNA extraction from Santos or PK.

O estudo objetivou avaliar a eficácia do programa de vacinação contra brucelose bovina no estado do Rio Grande do Sul tendo como indicador a prevalência e individualizar os fatores de risco para a doença. O Estado foi dividido em sete regiões. Para cada região foram amostradas aleatoriamente um número preestabelecido de propriedades nas quais foi testado um número também preestabelecido de fêmeas com idade igual ou superior a 24 meses, aleatoriamente selecionadas. O protocolo do sorodiagnóstico foi composto de triagem com o teste do antígeno acidificado tamponado, seguido de teste confirmatório dos sororreagentes com o teste 2-Mercaptoetanol. Nas propriedades foi aplicado um questionário epidemiológico sobre possíveis fatores de riscos associados à brucelose bovina. No estado do Rio Grande do Sul, a prevalência de focos foi de 3,54% [2,49 4,88] e a de animais 0,98% [0,57 1,57]. Nas regiões, as prevalências de focos variaram de 0,66% a 9,03% e a de animais de 0,06% a 2,03%. Rebanhos com 15 ou mais vacas, tipologia corte e compartilhamento de pastagens emergiram como fatores de risco para brucelose bovina no estado. A situação epidemiológica da brucelose bovina no Rio Grande do Sul manteve-se estável desde 2004, a despeito de boas coberturas vacinais terem sido registradas a partir de 2009. Assim, o estado deve continuar seu programa de vacinação, dando ênfase para a qualidade do processo e estimulando a utilização da vacina não indutora de anticorpos. Adicionalmente, o estado deve realizar um grande esforço de educação para que os produtores testem os animais de reprodução para brucelose antes de introduzi-los em suas propriedades e evitem o compartilhamento de pastagens entre rebanhos de condição sanitária desconhecida. / This study aimed to evaluate the effectiveness of a bovine brucellosis vaccination program in Rio Grande do Sul, with prevalence as the indicator, and to identify risk factors for the disease. The state was divided into seven regions. For each region, a predetermined number of properties were randomly sampled, in which a pre-established number of randomly selected females aged over 24 months were tested. The serodiagnosis protocol consisted of a screening test using buffered acidified antigen, followed by a confirmatory test using 2-mercaptoethanol. An epidemiological questionnaire was utilized to identify possible risk factors associated with bovine brucellosis. In the state of Rio Grande do Sul, the prevalence of infected herds was found to be 3.54% [2.49-4.88], and the prevalence of infected animals was 0.98% [0.57-1.57]. In assessments of specific regions, the infected herd prevalence ranged from 0.66% to 3.09%, and among the animals, from 0.06% to 2.03%. In herds comprising 15 or more cows, beef type and pasture sharing emerged as risk factors for bovine brucellosis in the state. The epidemiological status of bovine brucellosis in Rio Grande do Sul has remained unchanged since 2004, even though adequate vaccination coverage has been recorded since 2009. Thus, the state should continue its vaccination program, with emphasis on the quality of the process and on encouraging the use of non-antibody inducing vaccines. In addition, the state must make a greater effort to educate producers on the importance of testing for brucellosis in breeding animals before introducing them onto their properties, and on the importance of avoiding shared grazing among herds whose health conditions are unknown.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-08-30T18:28:46Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 13316435 bytes, checksum: b0412364dab9dd00515656dc38ddb78d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-30T18:28:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 13316435 bytes, checksum: b0412364dab9dd00515656dc38ddb78d (MD5) Previous issue date: 2018-03-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A brucelose bovina, causada pela bactéria Brucella Abortus, é uma doença presente em to- das as regiões do Brasil e provoca elevados prejuízos econômicos. O Programa Nacional de Controle e Erradicação de Brucelose e Tuberculose Animal (PNCEBT) estabeleceu os testes AAT, 2-ME, FC e DBac para realizar o diagnóstico da brucelose bovina. Na ausência de um teste Padrão Ouro, é necessário que o desempenho desses testes diagnósticos seja validado. O presente estudo, teve como objetivo empregar o modelo de classe latente Bayesiano para es- timar as sensibilidades e as especificidades dos testes diagnósticos AAT, 2-ME, FC e DBac, aplicados em amostras de sangue e carcaças de animais suspeitos de brucelose bovina, bem como a prevalência da doença. O conjunto de dados utilizado foi obtido junto ao Laboratório Nacional Agropecuário de Minas Gerais (LANAGRO-MG). Os testes foram avaliados em dois cenários: individualmente e combinados. Os modelos para a avaliação dos testes combinados foram ajustados considerando-se a independência condicional entre os quatro testes e também incorporando-se ao modelo a dependência condicional entre os testes AAT, 2-ME e FC. As aná- lises foram realizadas em R 3.2.5 usando o pacote R2OpenBUGS. Quanto à avaliação dos testes combinados, os resultados mostraram que os testes AAT, 2-ME e FC são condicionalmente in- dependentes. O teste FC foi o mais sensível, o DBac o menos sensível e os testes AAT, FC e DBac foram os mais específicos. Concluiu-se que nenhum dos quatro testes pode ser utilizado sozinho para o diagnóstico da brucelose bovina. Uma baixa sensibilidade foi encontrada para o teste AAT, resultado que diverge dos relatos geralmente encontrados na literatura. Portanto, recomenda-se que contínuos estudos sejam realizados para que a tomada de decisão dos pesqui- sadores não seja comprometida. Adicionalmente, concluiu-se que o modelo de classe latente bayesiano permitiu estimar os parâmetros de interesse satisfatoriamente. / Bovine brucellosis, caused by the bacterium Brucella Abortus, is a disease present in all regions of Brazil and causes high economic losses. The National Program for the Control and Eradi- cation of Brucellosis and Animal Tuberculosis (PNCEBT) established the AAT, 2-ME, FC and DBac tests for the diagnosis of bovine brucellosis. In the absence of a Gold Standard test, the performance of these diagnostic tests must be validated. The aim of the present study was to use the Bayesian latent class model to estimate the sensitivities and specificities of the AAT, 2- ME, FC and DBac diagnostic tests applied to blood samples and carcasses of animals suspected of bovine brucellosis, as well as the prevalence of the disease. The dataset used was obtained from the National Agricultural Laboratory of Minas Gerais (LANAGRO-MG). The tests were evaluated in two scenarios: individually and in combination. The models for the evaluation of the combined tests were adjusted considering the conditional independence between the four tests and also incorporating to the model the conditional dependence between the AAT, 2-ME and FC tests. Analyses were performed in R 3.2.5 using the R2OpenBUGS package. Regarding the evaluation of the combined tests, the results showed that the AAT, 2-ME and FC tests are conditionally independent. The FC test was the most sensitive, the DBac the least sensitive and the AAT, FC and DBac tests were the most specific. It was concluded that none of the four tests can be used alone for the diagnosis of bovine brucellosis. A low sensitivity was found for the AAT test, a result that diverges from the reports generally found in the literature. Therefore, it is recommended that continuous studies be carried out so that the decision-making of the researchers is not compromised. Additionally, it was concluded that the Bayesian latent class model employed allowed to estimate the parameters of interest satisfactorily.