Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-11-24 / Tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina permitem investigações retrospectivas valiosas para estudos moleculares, especialmente em estudos genéticos, nos casos em que o DNA não se encontra disponível em amostras congeladas e/ou frescas. Entretanto, de acordo com alguns autores, é difícil obter um DNA de boa qualidade, uma vez que o processo de fixação resulta na fragmentação dos ácidos nucleicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o DNA extraído de tecidos parafinados, após 1 e 5 anos de armazenamento, através de 3 métodos de extração. Para isso, foram utilizados o gene da β-actina (136pb), a fim de detectar a viabilidade e fragmentação do DNA extraído, e da amelogenina (X: 212pb e Y: 218pb) para diferenciação do sexo do indivíduo e viabilidade na utilização de primers com comprimento maior. O estudo envolveu 12 casos de autópsia recentes, onde amostras normais de fígado (n=10), baço (n=10) e cérebro (n=10) foram coletadas em duplicata, de modo que um grupo seguiu para o processo de fixação e inclusão em parafina, e outro grupo seguiu para o congelamento. Além disso, foram utilizados os mesmos tipos de tecidos, normais (n=10 cada), oriundos de 13 casos de autópsia armazenados por 1 ano e 15 casos armazenados por 5 anos. Após a remoção da parafina, as amostras foram submetidas às extrações com kit comercial (QIAGEN QIAamp Mini), Salting-Out e fenol-clorofórmio. O DNA extraído foi quantificado no aparelho Nanodrop® e ajustado para PCR (10ng/μl). Os produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose a 1%. As amostras de baço e fígado apresentaram maior rendimento em relação à extração de DNA quando comparado ao cérebro, em todos os tempos. Todas as amostras arquivadas apresentaram boas condições de extração de DNA, porém deve-se levar em consideração o processo de fixação e inclusão dos tecidos, que podem comprometer a qualidade do DNA. A extração pelo fenol rendeu maior quantidade de DNA e grau de pureza em relação aos outros métodos estudados, porém o kit comercial mostrou melhores resultados quanto à amplificação do DNA obtido. Houve amplificação do gene da amelogenina em todas as amostras utilizadas, porém recomenda-se a utilização de primers menores para uma completa análise do fragmento a ser estudado. / Formalin fixed and paraffin embedded tissues provide valuable retrospective investigations for molecular studies, especially for genetic studies, when the DNA is not available in fresh and/or frozen samples. However, according to some authors, is difficult to obtain a DNA of good quality, since the fixation process results in nucleic acids fragmentation. The aim of this study was to evaluate the DNA extracted from paraffin embedded tissues, after 1 and 5 years of storage, by 3 methods of extraction. For this, the gene of β-actin (136pb) were used, to detect the viability and DNA fragmentation, and the gene of amelogenin (X: 212pb e Y: 218pb) for sexual differentiation and viability in primers with greater length. The study involved 12 recent autopsy cases, where samples of liver (n=10), spleen (n=10) and brain (n=10) were collected in duplicate, which one group followed to the process of fixation and inclusion and the other group followed to freezing. Moreover, the same kind of tissues, normal (n=10 each), from 13 autopsy cases archived for 1 year and 15 cases archived for 5 years were used. After paraffin remove, the samples were submitted to DNA extraction with commercial kit (QIAGEN QIAamp Mini), Salting-Out and phenol-chlorophorm. The DNA extracted was quantified in Nanodrop® and adjusted for PCR (10ng/μl). The PCR products were visualized in agarose gel 1%. The samples of spleen and liver showed more yield in DNA extraction than the brain samples, in all the times. All the samples archived showed good extraction conditions, however should take in consideration the fixation and embedded process, which could compromise the DNA quality. The extraction by phenol-chloroform yielded more DNA quantity and purity than the other methods. However, the commercial kit extraction showed better results in DNA amplification. The primer of the gene of amelogenin was amplified in all utilized samples, however recommends the utilization of smaller primers for a complete analyze of the fragment studied. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1563_1.pdf: 981921 bytes, checksum: 6dbb35cbfc792ecdfea9f1605456633b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / O uso de tecido ósseo como substrato na obtenção de DNA para estudo de loci STR (Repetições Curtas em Tandem) é bastante útil em ciência forense, especialmente na identificação de restos mortais e de vítimas de desastres em massa. Algumas técnicas de extração de DNA de material ósseo incluem uma incubação prévia do material pulverizado em EDTA (Ácido Etilenodiamino Tetra- Acético) como etapa de descalcificação. Nosso trabalho apresenta um protocolo de obtenção de DNA de ossos bastante eficiente, no qual é feita uma descalcificação da matriz óssea com o auxílio do quelante EDTA, não sendo necessária a pulverização da amostra por moinhos mineralógicos ou criogênicos. Nesse sentido, alíquotas de amostras de osso foram submetidas à extração de DNA pelo método orgânico tradicional com pré-tratamento de descalcificação em EDTA, seguidas por uma amplificação com um sistema multiloci e seqüenciadas através de eletroforese capilar. Os resultados mostraram quantidades de DNA compatíveis com a obtenção de perfis genéticos completos, com amplificação simultânea de 16 regiões (loci) STR. Portanto, foi visto que este novo protocolo de extração de DNA de amostras ósseas é adequado para emprego na identificação humana com finalidades forenses

Orientador: Lígia Souza Lima Silveira da Mota / Resumo: O Brasil é um país megadiverso detentor de grande parte da riqueza ecológica do mundo, porém seus biomas, importantes devido aos serviços ecossistêmicos, sofrem com a pressão antrópica. Assim, os grandes predadores, que possuem efeito regulatório no ecossistema, geram conflitos direto com o homem. O Puma concolor é um predador generalista, atuando no perfil trófico onde reside. Estudos de populações in situ são importantes na elaboração de planos de manejo e a utilização de amostras não invasivas nos permitem ter acesso a informações biológicas a baixo custo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso de amostras não invasivas para contribuir com informações nos planos conservacionistas da região. Foram percorridas bordas de mata e áreas de transição da APA-Botucatu. As amostras de fezes encontradas foram georreferenciadas, coletadas, selecionadas, fotografadas, classificadas e seu DNA extraído por meio da técnica empregando fenol/clorofórmio. O DNA obtido foi quantificado em espectrofotômetro e sua qualidade avaliada em eletroforese. Trinta e cinco amostras foram classificadas quanto ao seu grau de degradação, submetidas à extração de DNA e seu produto avaliado. A presença de material genético nas fezes frescas ou pouco degradadas apresentaram maiores concentrações de DNA além de melhor qualidade quando comparadas com as mais degradadas. Estes resultados evidenciam que, o DNA obtido empregando metodologia de baixo custo, possui quantidade e qualidade suficientes para seu em... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2001Bitstream added on 2014-06-13T19:14:37Z : No. of bitstreams: 1 barea_ja_me_botfm.pdf: 626955 bytes, checksum: 85be35c50f78253f7b270023ffe7687e (MD5) / Este trabalho visou a comparação de 5 diferentes métodos de extração de DNA, a partir de amostras de materiais de arquivo (tecido incluído em parafina, lâmina de hemograma corada e não corada com Leishman, lâmina de mielograma, gotas de sangue em Guthrie card) e fontes escassas (células bucais, 1 e 3 bulbos capilares, 2 mL de urina), para avaliar a facilidade de aplicação dos mesmos e possibilidade de amplificação desse DNA pela técnica de PCR. Os métodos incluíram digestão por proteinase K, seguida e não seguida por purificação com fenol/clorofórmio, utilização de Chelex 100 Ò, utilização de InstaGeneÒ e fervura em água estéril. O DNA obtido, foi testado por PCR, para a amplificação de três fragmentos gênicos: de Brainderived neutrophic factor (764 pb), de Fator V Leiden (220 pb) e de Abelson (106 pb), sendo que, a amplificação para o primeiro, eliminava a necessidade dos demais. Conforme o tamanho do fragmento gênico estudado, a fonte potencial de DNA e o método de extração utilizado, os resultados caracterizaram o melhor caminho para padronização dos procedimentos técnicos a serem incluídos e apresentados no manual de Procedimentos Operacionais Padrão do Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro – HC – UNESP – Botucatu. / The present work aimed to compare five different methods of DNA extraction of archieved materials samples (paraffin-embedded tissues, periferic blood smear – stained or non-stained with Leshman, aspired bone marrow smears and blood guts in Guthrie card) and rare sources (oral cells, 1 and 3 capilar bulbs, 2 mL urine), to avaliate the aplication facility and the amplification possibility one for PCR. The methods included proteinase K digestion – followed or non by phenol/chloroform purification, Chelex 100Ò (BioRad), InstaGeneÒ (BioRad) and boilling in sterile water. The DNA obteined, was tested for amplification of 3 genic fragments: from Brainderived neutrophic factor gene (764 bp), Factor V Leiden gene (220 bp) and Abelson gene (106 bp). According to the genic fragment lenght studed, the DNA potential source and the extraction method used, the results characterized better guidelines for padronization of the techniques procedures for to Good Manufacturing Practices from Molecular Biology Laboratory from Blood Center – Medicine School – UNESP - Botucatu .

Made available in DSpace on 2018-08-01T22:56:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_6434_DISSERTAÇÃO GABRIELA PORFIRIO-PASSOS.pdf: 872492 bytes, checksum: 4693b33b1f6f17af259a9c2b1b3878cb (MD5) Previous issue date: 2013-02-26 / Com o objetivo de realizar o diagnóstico de leishmaniose tegumentar americana (LTA) em cães, foram utilizados métodos de cultura e isolamento, testes sorológicos de ELISA e Western Blot (WB) e pesquisa de DNA do parasito para dois grupos de animais, um grupo composto de animais sem lesões clínicas sugestivas de LTA, mas residentes em torno de casos clínicos humanos confirmados para LTA, e outro grupo de animais com lesões sugestivas de LTA que serviram como controle dos protocolos realizados. O estudo foi realizado no município de Iúna, ES, Brasil, região endêmica para enfermidade. No primeiro grupo, foram analisadas amostras de soro de 109 animais sem histórico ou lesões indicativas de LTA, estas foram submetidas às técnicas de ELISA e WB que resultaram em 20 animais sorologicamente positivos para as duas técnicas. O teste ELISA apresentou sensibilidade de 100,00% (IC95% - 0,83 a 1,00) e especificidade de 77,53% (IC95% - 0,67 a 0,86), em relação à técnica de WB. O teste WB apresentou maior acurácia e mostrou-se mais adequado para diagnóstico dos animais assintomáticos, enquanto a técnica de ELISA para a triagem. Para a pesquisa do DNA do parasito nos 20 animais assintomáticos e positivos pela técnica de WB utilizou-se sangue total e biópsia de tecido íntegro do pavilhão auricular pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). Os resultados para PCR da biópsia de tecido íntegro e PCR de tecido sanguíneo mostraram sensibilidade de 30,0% (IC95% - 0,12 a 0,54) e 20,0% (IC95% - 0,06 a 0,44), respectivamente. A especificidade, 99,0% (IC95% - 0,93 a 0,99) e 100% (IC95% - 0,96 a 1,00), para a PCR da biópsia de tecido íntegro e PCR de tecido sanguíneo quando comparadas ao WB. Os resultados mostram que tecido íntegro do pavilhão auricular e sangue de animais assintomáticos submetidos à técnica de PCR, apresentaram baixa sensibilidade e alta especificidade, assim, a PCR da biópsia de tecido íntegro é melhor indicador para animais assintomáticos que a PCR de tecido sanguíneo. Para o segundo grupo, foram identificados três animais com lesões sugestivas para LTA e sorologicamente positivo. A partir de uma amostra de biópsia de lesão sugestiva de LTA presente no pavilhão auricular, parte desta foi destinada a cultura e isolamento e outra parte para comparação de três protocolos de extração do DNA de tecido animal para diagnóstico da LTA canina. Os protocolos utilizados tiveram como base o Fenol-Clorofórmio, Acetato de Potássio e associação entre as duas metodologias. Em comparação com os padrões moleculares de concentração de DNA concluiu-se que o protocolo com Acetato de Potássio foi o mais indicado para o tipo de tecido empregado. Por fim, de posse dos dados apresentados para os animais sorologicamente positivos e assintomáticos estudados, foi possível concluir que estes não representaram potenciais reservatórios do parasito, o que evidencia ainda que para avaliação deste perfil da enfermidade seja indicada a associação de métodos de diagnóstico.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-29T19:15:47Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-29T19:16:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-29T19:16:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2011-08-31 / Dermatophytes comprise a group of filamentous fungi of great interest on public health because of their ability to parasitize keratinized tissues, such as skin, hair and nails, and for their wide distribution in the world. As a consequence of this parasitism, an infectious process of dermatophytosis is established, from which a variety of clinical manifestations can occur, affecting people of both genders and all age groups. Laboratory methods for mycological diagnosis do not always allow a clear an especific definition of the agent. In this study, different strategies for extraction of DNA, and molecular typing by PCR-RFLP, of seven dermatophyte species were assessed. Two target regions: ITS/rDNA and the topoisomerase II gene were evaluated, by testing three PCR protocols and three restriction enzymes (DdeI, HinfI, HaeIII). For the DNA extraction, the glass bead shaking technique for cell lysis, followed by Gustincich (1991) based mehod for DNA separation, demonstrated more advantages. Our results has demonstrated that the topoisomerase II gene is a suitable target region for identification of the seven major pathogenic dermatophyte fungal species, reinforcing previous studies, and pointed to a new PCR-RFLP protocol, which is based on a PCR of this gene using dPsD2 primer, followed by digestion of PCR products with HaeIII restriction enzyme. / Os dermatófitos compreendem um grupo de fungos filamentosos de grande interesse na área da saúde, devido à sua capacidade de parasitar os tecidos queratinizados, como a pele, pêlos e unhas, e à sua ampla distribuição no mundo. Como conseqüência desse parasitismo instala-se um processo infeccioso de dermatofitose, a partir do qual pode ocorrer uma diversidade de manifestações clínicas, acometendo pessoas de ambos os gêneros e de todos os grupos etários. Os métodos laboratoriais para o diagnóstico micológico nem sempre permitem uma clara definição do agente em nível de espécie. No presente estudo foram analisadas diferentes estratégias para a extração de DNA e para a identificação molecular por PCR-RFLP das principais espécies de dermatófitos. Duas regiões alvo, a região ITS/DNAr e o gene da topoisomerase II foram analisadas, testando-se três protocolos de PCR e três enzimas de restrição (DdeI, HinfI, HaeIII). Na extração do DNA, o método de lise utilizando pérolas de vidro e a separação do DNA com base no método de Gustincich (1991) demonstrou importantes vantagens. Nossos resultados demonstraram que o gene da topoisomerase II é uma região alvo adequada para identificação das sete principais espécies de fungos dermatófitos patogênicos, reforçando estudos anteriores, e apontaram para um novo protocolo de RFLP-PCR, que se baseia em uma PCR desse gene utilizando o primer dPsD2, seguido da digestão dos produtos obtidos com a enzima de restrição HaeIII.

Submitted by Cibele Nogueira (cibelenogueira@ufgd.edu.br) on 2016-04-11T18:17:18Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) VANESSACALADO.pdf: 932249 bytes, checksum: 1c7ef0a0203cbe692b36ff255ce5a041 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-11T18:17:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) VANESSACALADO.pdf: 932249 bytes, checksum: 1c7ef0a0203cbe692b36ff255ce5a041 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Trichospilus diatraeae Cherian & Margabandhu e Palmistichus elaeisis Delvare &LaSalle (Hymenoptera: Eulophidae) are endoparasitoids pupal, preferably lepidopteran and has the potential to be used exclusively or associated with other parasitoids, for the control of insect pests in different agricultural and forest crops. The mass rearing of these parasitoids is known, but nothing is known about the quality of the insects produced after several generations in the laboratory. The objective of this study is to compare biological characteristics of three populations of Trichospilus diatraeae and Palmistichus elaeisis created in pupae of D. saccharalis for twenty generations and to evaluate possible changes in the genetic variability of these parasitoids using molecular markers. In F1, F5, F10, F15 and F20, each parasitoid, the duration of the life cycle, the parasitism, emergence percentage, the number of parasitoids emerged per pupa, longevity of the children, the sex ratio were evaluated, was also evaluated test of two DNA extraction protocols and the transferability of molecular markers for optimization of genetic testing. The creation of T. diatraeae and P. elaeisis in pupae of D. saccharalis for 20 successive generations did not affect parasitism and the sex ratio of their offspring. There were variations in the progeny, but the life cycle, longevity and the size of the head capsule of parasitoids remained at good levels, ie absence of drastic reductions in biological variables. The protocol A (Chelex®) is possible and feasible to be used, the optimization of this technique allowed the use of DNA samples T. diatraeae and P. elaeisis in the PCR reaction with satisfactory results. In T. diatraeae and P. elaeisi reared in the laboratory on two polymorphisms were found microsatellite markers, this indicates that may be considered to be implemented as markers for identifying individuals belonging tothe same family. / Trichospilus diatraeae Cherian & Margabandhu e Palmistichus elaeisis Delvare & LaSalle (Hymenoptera: Eulophidae) são endoparasitoides pupais, preferencialmente de lepidópteros e, tem potencial para serem utilizados exclusivamente ou associados à outros parasitoides, visando o controle de insetos-praga em diferentes culturas agrícolas e florestais. A técnica de produção desses parasitoides é conhecida, porém nada se sabe sobre a qualidade dos insetos produzidos após várias gerações em laboratório. O objetivo foi comparar características biológicas de três populações de T. diatraeae e de P. elaeisis criados em pupas de Diatraea saccharalis (Fabricius) (Lepidoptera: Crambidae) por vinte gerações. Nas gerações F1, F5, F10, F15 e F20, de cada parasitoide, a duração do ciclo de vida (ovo-adulto), as porcentagens de parasitismo e de emergência, o número de parasitoides emergidos por pupa, a longevidade dos descendentes, a razão sexual foram avaliados. Além disso, foi avaliado dois protocolos de extração de DNA e a transferibilidade de marcadores moleculares para otimização das análises genéticas. A criação de T. diatraeae e P. elaeisis em pupas de D. saccharalis por 20 gerações sucessivas não afetou o parasitismo e a razão sexual de seus descendentes. Houve variações na progênie, porém o ciclo de vida, a longevidade e o tamanho da cápsula cefálica dos parasitoides se mantiveram em níveis bons, ou seja, ausência de reduções drásticas das variáveis biológicas. O protocolo A (Chelex®) é possível e viável de ser utilizada, a otimização desta técnica permitiu utilizar as amostras de DNA de T. diatraeae e P. elaeisis na reação de PCR com resultados satisfatórios. Em T. diatraeae e P. elaeisi criados em laboratório foram encontrados polimorfismo em dois marcadores microssatélites, o que indica que podem ser consideradas como marcadores para ser aplicados na identificação de indivíduos pertecentes a mesma família.

O protozoário parasita Cryptosporidium parvum tem sido reconhecido como um importante patógeno emergente. Para estudos moleculares, a maioria das técnicas para extração do DNA requer o uso de kits importados para concentrar, romper a parede muito resistente do oocisto e purificar o DNA das matrizes das amostras. O objetivo do estudo foi desenvolver um método simples e rápido, baseado na reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detectar Cryptosporidium em fezes preservadas. Oocistos foram concentrados das amostras fecais pela flutuação em gradiente de sacarose. Dos oocistos purificados foi extraído o DNA genômico através de incubação em tampão de lise contendo 70 mM -mercaptoetanol, digerido com proteinase K e extraído com fenol-clorofórmio-álcool isoamílico. A padronização foi iniciada com a PCR única para detectar Cryptosporidium spp usando um par de primer genérico (AWA). Para identificar C. parvum foi realizada a PCR única com o par de primer especifico (LAX). Para aumentar a sensibilidade do método, foi testada a nested-PCR, usando o primer externo XIA. Foram analisadas 39 amostras de DNA do bezerro padrão, 52 amostras de 17 pacientes e 45 amostras de 14 animais. Os resultados foram: 54,28% de positividade na PCR AWA, e 71,42% na nested-PCR XIA/AWA, 67,74% na PCR LAX e 44,44% na nested-PCR XIA/LAX das amostras do bezerro. A positividade geral nas amostras de pacientes e de animais foi: 34,48% pela PCR and 54,83% pela nested-PCR para Cryptosporidium spp e 16,00% pela PCR e 50,00% pela nested-PCR para C. parvum. O emprego do corante Vistra Green melhorou significativamente a visualização do gel. Os resultados mostram que este método simples e de baixo custo pode ser melhorado para aplicação na rotina do laboratório. / The protozoan parasite Cryptosporidium parvum has become recognised as important emerging human pathogens. For molecular studies, most of the techniques to extract genomic DNA require the use of imported kits to concentrate, rupture the very resistant oocyst wall, and purify the DNA from the samples matrix. The aim of this study was to develop a simple and rapid method based on polymerase chain reaction (PCR) to detect Cryptosporidium in preserved faeces. Oocysts were concentrated from faecal specimens by flotation on sucrose gradient. Genomic DNA was prepared from purified oocysts by adding a lysis buffer containing 70 mM -mercaptoethanol, digested with proteinase K and extracted with phenol-chlorophorm-isoamyl. The standardization was started by performing a one step PCR to detect Cryptosporidium spp using a generic set of primer (AWA). To detect C. parvum a one step PCR was assayed using the specific primer (LAX). To increase the sensitivity of the method, were tested nested-PCR assays, using an outer primer (XIA). Thirty nine DNA samples were analysed from the standard calf, 52 samples from 17 patients and 45 samples from 14 animals. The results were: 54.28% positive samples by single PCR AWA, 71.42% by nested-PCR, 67.74% by single PCR LAX and 44.44% by nested-PCR for the standard calf. The overall positivity for human and animal samples were: 34.48% by single PCR and 54.83% by nested-PCR for Cryptosporidium spp and 16.00% by single PCR and 50.00% by nested-PCR for C. parvum. Using Vistra Green for staining agarose gel, yielded the visualisation of the amplicons. These results show that this simple and cheap method could be improved to be used on the routine laboratory work.

O protozoário parasita Cryptosporidium parvum tem sido reconhecido como um importante patógeno emergente. Para estudos moleculares, a maioria das técnicas para extração do DNA requer o uso de kits importados para concentrar, romper a parede muito resistente do oocisto e purificar o DNA das matrizes das amostras. O objetivo do estudo foi desenvolver um método simples e rápido, baseado na reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detectar Cryptosporidium em fezes preservadas. Oocistos foram concentrados das amostras fecais pela flutuação em gradiente de sacarose. Dos oocistos purificados foi extraído o DNA genômico através de incubação em tampão de lise contendo 70 mM -mercaptoetanol, digerido com proteinase K e extraído com fenol-clorofórmio-álcool isoamílico. A padronização foi iniciada com a PCR única para detectar Cryptosporidium spp usando um par de primer genérico (AWA). Para identificar C. parvum foi realizada a PCR única com o par de primer especifico (LAX). Para aumentar a sensibilidade do método, foi testada a nested-PCR, usando o primer externo XIA. Foram analisadas 39 amostras de DNA do bezerro padrão, 52 amostras de 17 pacientes e 45 amostras de 14 animais. Os resultados foram: 54,28% de positividade na PCR AWA, e 71,42% na nested-PCR XIA/AWA, 67,74% na PCR LAX e 44,44% na nested-PCR XIA/LAX das amostras do bezerro. A positividade geral nas amostras de pacientes e de animais foi: 34,48% pela PCR and 54,83% pela nested-PCR para Cryptosporidium spp e 16,00% pela PCR e 50,00% pela nested-PCR para C. parvum. O emprego do corante Vistra Green melhorou significativamente a visualização do gel. Os resultados mostram que este método simples e de baixo custo pode ser melhorado para aplicação na rotina do laboratório. / The protozoan parasite Cryptosporidium parvum has become recognised as important emerging human pathogens. For molecular studies, most of the techniques to extract genomic DNA require the use of imported kits to concentrate, rupture the very resistant oocyst wall, and purify the DNA from the samples matrix. The aim of this study was to develop a simple and rapid method based on polymerase chain reaction (PCR) to detect Cryptosporidium in preserved faeces. Oocysts were concentrated from faecal specimens by flotation on sucrose gradient. Genomic DNA was prepared from purified oocysts by adding a lysis buffer containing 70 mM -mercaptoethanol, digested with proteinase K and extracted with phenol-chlorophorm-isoamyl. The standardization was started by performing a one step PCR to detect Cryptosporidium spp using a generic set of primer (AWA). To detect C. parvum a one step PCR was assayed using the specific primer (LAX). To increase the sensitivity of the method, were tested nested-PCR assays, using an outer primer (XIA). Thirty nine DNA samples were analysed from the standard calf, 52 samples from 17 patients and 45 samples from 14 animals. The results were: 54.28% positive samples by single PCR AWA, 71.42% by nested-PCR, 67.74% by single PCR LAX and 44.44% by nested-PCR for the standard calf. The overall positivity for human and animal samples were: 34.48% by single PCR and 54.83% by nested-PCR for Cryptosporidium spp and 16.00% by single PCR and 50.00% by nested-PCR for C. parvum. Using Vistra Green for staining agarose gel, yielded the visualisation of the amplicons. These results show that this simple and cheap method could be improved to be used on the routine laboratory work.

Este estudo comparou o desempenho de quatro protocolos de extração de DNA a partir de homogeneizados de diferentes órgãos provenientes de vacas infectadas experimentalmente com a B. abortus 2308. Os protocolos de extração comparados foram o método de GT (lise com isotiocianato de guanidina), Boom (lise com GT e tratamento com suspensão carreadora Diatomaceous earth), PK (lise com proteinase K) e Santos (lise por fervura e congelamento com nitrogênio líquido). Foram constituídos os grupos padrão ouro positivo e negativo baseados na bacteriologia clássica e compostos por: 54 cotilédones (27 pos. e 27 neg.), 39 linfonodos supra mamários (12 pos. e 27 neg.), 44 pré-escapulares (17 pos. e 27 neg.), 33 fígados (6 pos. e 27 neg.), 37 baços (10 pos. e 27 neg.), e 34 úberes (7 pos. e 27 neg.). Todas as amostras foram submetidas aos quatro protocolos de extração e a um mesmo processo de amplificação com os primers B4 e B5. Nos resultados consolidados por órgãos, a proporção de positivos no cotilédone foi maior do que a encontrada no linfonodo supramamário (p=0,0001), linfonodo pré-escapular (p<0,0001), fígado (p=0,0006), baço (p<0,0001) ou úbere (p=0,0019). Os resultados acumulados para os métodos de extração mostraram que o protocolo de Santos teve maior sensibilidade relativa do que o método de Boom (p=0,003) e GT (p=0,0506), e foi igual ao PK (p=0,2969). As demais comparações de proporções não resultaram em diferenças estatisticamente significantes. No estudo verificou-se amostas positivas a PCR e negativas ao isolamento e viceversa. Assim, apesar das desvantagens do método bacteriológico clássico, a melhor estratégia para o diagnóstico direto da infecção de vacas por B. abortus em homogeneizado de órgãos é a utilização conjunta do isolamento e da PCR, examinando os cotilédones e utilizando os métodos de extração de DNA Santos ou PK. / This study compared the performance of four protocols of DNA extraction from suspensions of different tissues from experimentally infected cows with 2308 strain. The compared extraction protocols were GT protocol (lyse with guanidine isotiocianate), Boom (lyse with GT and treated with the carrying suspension Diatomaceous earth), PK (lise with proteinase K) and Santos (lyse by boiling and freezing with liquid nitrogen). Based on classical bacteriology, positive and negative gold standard groups were built and consisted of 54 cotyledons (27 pos. and 27 neg.), 39 supramammary lymph nodes (12 pos. and 27 neg.), 44 prescapulars (17 pos. and 27 neg.), 33 livers (6 pos. and 27 neg.), 37 spleens (10 pos. and 27 neg.), and 34 udders (7 pos. and 27 neg.). All the samples were submitted to the four DNA extraction protocols and the same amplification process using the primers B4 and B5. According to consolidated results by tissue, the proportion of positives in cotyledon was bigger than supramammary lymph node (p=0,0001), prescapular lymph node (p<0,0001), liver (p=0,0006), spleen (p<0,0001) and udder (p=0,0019). The consolidated results for the extraction methods show that Santos protocol had bigger relative sensitivity than Boom method (p=0,003) and GT (p=0,0506), and was equal than PK (p=0,2969). There were not significant statistical differences in the others comparisons of proportions. In the study, PCR-positive and isolation-negative samples and vice-versa were verified. However, the disadvantages of the classic bacteriological method, the best strategy for direct diagnosis of the infection of cows for B. abortus in homogenized of tissues is combined use of isolation and PCR, examining the cotyledons and using the methods of DNA extraction from Santos or PK.