Cell surface transport proteins play a crucial role in all cells, from unicellular organisms to mammals, by conferring to the plasma membrane selective permeability to a wide range of ions and small molecules. The activity of these proteins is very often regulated by controlling their amount at the plasma membrane where they are removed by means of selective endocytosis in response to signals and changes in the environment.<p>One of the membrane proteins of the yeast Saccharomyces cerevisiae whose regulation has been extensively studied is the general amino acid permease. Previous studies on Gap1 and other yeast permeases revealed that ubiquitin plays a key role in the membrane trafficking of these proteins by providing a signal that triggers their internalization in endocytic vesicles and that promote their sorting into intra-endosomal vesicles for subsequent delivery into the lumen of the vacuole, the lysosome of yeast. <p>In the first part of this work, we report the isolation of 64 mutant forms of the Gap1 protein and their exploitation in a systematic functional study of the predicted intracellular regions of the permease. The phenotypic analysis of these mutants revealed an important role of certain amino acid sequences in the (i) transport of the permease through the secretory pathway (ii) intrinsic activity of the permease at the plasma membrane (iii) stability of the protein at the cell surface (iv) sorting of the protein into intra-endosomal vesicles. Further investigation of some of these mutants allowed us to unravel an original mechanism for the degradation of the permease that is independent of its ubiquitylation.<p>In the second part of the work, we used yet other Gap1 mutants to study the signals and pathways inducing the ubiquitylation and endocytosis of the permease. Also, we further investigated the molecular mechanisms inducing Gap1 ubiquitylation. <p>All these results together allow us to better understand the mechanisms controlling the ubiquitin dependent down-regulation of plasma membrane proteins. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le carisbamate est la 1ère molécule à avoir un effet modificateur de l’épileptogenèse, dont environ 50% des animaux traités développent des crises d’absence, au lieu des crises limbiques normalement observées dans le modèle de la pilocarpine. Le principal objectif de cette thèse a été celui d’étudier les altérations qui se produisent par le traitement par le carisbamate. Pour cela nous avons effectué une cartographie de l’activité cérébrale, avec un immunomarquage de la protéine c-Fos, et nous avons vérifié les concentrations des monoamines et acides aminés dans l’hippocampe, le thalamus et dans le cortex piriforme par HPLC, 4h après le début du status epilepticus (SE). Enfin, nous avons vérifié le profil d’expression protéique dans l’hippocampe, 2 mois après le SE par électrophorèse bidimensionnelle.Les résultats indiquent que le carisbamate augmente l’activité des noyaux MD et LD du thalamus. Les résultats suggèrent aussi que la dopamine, la noradrenaline, le GABA et la sérotonine peuvent participer à la significative neuroprotection et à l’effet modificateur de l’épileptogenèse du carisbamate. L’étude de protéomique suggère également une réduction globale du métabolisme énergétique cellulaire chez les rats traité par le carisbamate qui développent des crises d’absence. / The carisbamate is the 1st molecule showing an epileptogenesis modifying effect, that about 50% of treated animals develops absence instead limbic seizures, commonly seen in the pilocarpine model. The aim of this thesis was to study the changes that follows carisbamate treatment. Therefore, we made a brain activity cartography, by labelling c-Fos protein, and we quantified the concentrations of amino acids and monoamines in hippocampus, thalamus and piriform cortex, 4h after the status epilepticus (SE). Moreover, we studied the protein expression profile in the hippocampus, 2 month after SE, by two-dimensional electrophoresis.The results points towards an increased activity of MD and LD thalamic nuclei in carisbamate treated rats. Furthermore, dopamine, noradrenaline, GABA and serotonin appears to play a role in neuroprotection and in the epileptogenesis modifying effect of carisbamate. The proteomic study revealed a global reduction of cellular energetic metabolism of carisbamate treated rats that develops absence seizures.

La synthèse stéréosélective d'une nouvelle classe d'amino acides boronatés est réalisée par réaction de Wittig, puis borylation catalysée par un complexe d'iridium. Des amino esters portant un noyau aromatique en position δ de la chaîne latérale, sont tout d'abord préparés par réaction de Wittig d'un sel de phosphonium dérivé d'amino acide avec l'aldéhyde aromatique correspondant, puis estérification et hydrogénation. La borylation de ces amino esters avec le bis(pinacolato)diborane (B2Pin2) en présence d'un complexe d'iridium comme catalyseur, conduit aux dérivés correspondants boronatés avec des rendements atteignant 74% . Enfin, des dérivés iodés ou trifluoroboratés sont facilement obtenus à partir des amino acides boronatés, par réaction avec Nal ou avec KHF2. L'hydrolyse des trifluoroborates d'amino acides en solution tampon a été étudiée par RMN 19F. Dans le cas des amino esters difluorophényle et thiophényle, ces composés montrent une très bonne stabilité à l'hydrolyse. D'un autre côté, la synthèse stéréosélective d'amino acides silylés est également obtenue par réaction de Wittig du sel de phosphonium dérivé d'amino acide avec le 4-di-t-butylsilanobenzaldéhyde. L'amino acide silylé a été utilisé pour la préparation d'un dipeptide avec un rendement de 80%, puis son dérivé fluorosilane sans racémisation, par réaction avec KF. Le dipeptide fluorosilylé obtenu montre une excellente stabilité à l'hydrolyse après 10 jours. Finalement, la méthode de synthèse mise au point, se révèle très efficace pour la préparation d'amino acides boronatés et silylés, et pour leur application au marquage par l'iode ou les fluorures / The stereoselective synthesis of new boronato amino acid derivatives, using Wittig and C-H iridium-catalyzed borylation as key step reactions, is described. Firstly, the synthesis of amino ester precursors bearing an aromatic moiety in -position of the lateral chain, was achieved by Wittig reaction of a phosphonium salt derived from amino acid with the corresponding aromatic aldehyde, then esterification and hydrogenation. The reaction of the amino esters with the bis(pinacolato)diborane reagent (B2Pin2) in presence of an iridium complex as catalyst, leads to the corresponding boronato derivatives in yields up to 74 %. Finally, the iodo- or trifluoroborato derivatives were easily prepared from the boronato amino acid by reaction either with NaI or with KHF2. The hydrolysis of the trifluoroborato amino acid derivatives was studied in buffer solution using 19F NMR monitoring. In the case of the difluorophenyl and thiophenyl amino esters, the corresponding trifluoroborates derivatives show good to excellent stability toward hydrolysis. In addition, the stereoselective synthesis of silano amino acid has been developped by Wittig reaction of the phosphonium salt derived from amino acid with the 4-di-t-butylsilanobenzaldehyde. The silano amino acid was used to prepare a dipeptide with 80% yield, and the corresponding fluorosilane derivative without racemization, by reaction with KF. The hydrolysis of the fluorosilylated dipeptide in aqueous media shows an excellent stability, up to 10 days. Finally, this stereoselective synthesis of hetero substituted amino acids, offers a promising tool for the application of the boronated and silyled derivatives to the fluoride labeling

La nutrition est un élément clé du maintien de la performance opérationnelle chez le chien de service, lequel fait souvent face à des périodes de travail intense suivies de périodes de récupération de courte durée, l’enchaînement des efforts se répétant fréquemment sur plusieurs jours. Afin d’optimiser la performance, d’éviter l’émergence de pathologies liées à l’effort physique et aux contraintes mentales, et d’améliorer la récupération, l’alimentation est maintenant intégrée de manière prépondérante dans la préparation des athlètes de haut niveau que sont ces chiens. Les objectifs de ce travail furent de : (1) concevoir un supplément nutritionnel de mise/maintien en condition et en étudier les impacts biologiques lorsqu’il est distribué avant et pendant l’effort physique, en s’intéressant plus particulièrement à son adaptation au métabolisme spécifique de l’effort demandé ; (2) concevoir un supplément nutritionnel de récupération et en étudier les impacts biologiques lorsque distribué après l’effort physique en s’axant sur les capacités de récupération à court terme. Le premier supplément développé dans cette thèse se présente sous forme extrudée spécialement conçu, et contenant des acides gras à chaînes courtes et moyennes, associés à un complexe antioxydant. Distribué une heure avant, et au bout de vingt minutes d’effort dans un protocole de course en continu chez le chien de recherche de personnes, il a généré une amélioration de la réponse de l’organisme à l’exercice via un impact positif sur les paramètres physiologiques cardiovasculaires, l’augmentation des triglycérides circulants en début d’effort, et la moindre expression plasmatique de marqueurs pro-inflammatoires et du stress oxydatif dans le groupe supplémenté. Notre deuxième étude, portant sur une supplémentation post-effort chez le chien militaire, a pour objectif d’observer l’impact d’un mélange de maltodextrines (1,5g/kg de poids corporel) et protéines auparavant sélectionnée (0,3g/kg de poids corporel) distribué immédiatement après effort, durant trois périodes d’exercice intense séparées par une heure de repos au cours d’une même journée. Nos résultats montrent une moindre augmentation plasmatique des marqueurs de l’inflammation et des témoins de lésions musculaires dans le groupe supplémenté. Des études complémentaires sont indispensables à envisager pour adapter la supplémentation à chaque typologie d’effort (endurance, mixte, résistance), en testant différents apports qualitatifs et quantitatifs. Elles permettront également de préciser les moments optimaux de distribution de celle-ci (prise unique ou fractionné, délai par rapport à l’effort), et de l’adapter aux conditions environnementales (en particulier les climats chauds, sources de nombreux problèmes chez les chiens de service projetés en opérations extérieures). / Nutrition is a key point in order to maintain performance during operationnal missions in the service dog, who often faces intense periods of work, followed by short resting periods, with a high number of working periods during several consecutive days. To optimise performance, reduce pathologies related to an intense physical exercise and mental stress and improve recovery, nutrition is now considered as one of the most important point in those elite athletes. This work objective were : (1) to develop a nutritionnal supplementation to set and maintain physical conditions when distributed before and during physical exercise, focusing our approach on the necessary adaptation to the specific metabolism involved during the exercise ; (2) to develop a nutritionnal supplementation for the recovery period, distributed just after the exercise and study the consequences of its distribution on biological markers during short term recovery period. The first supplement develop in this work contain short and medium chains fatty acids associated with an antioxidant complex. Given one hour before the work, and after a twenty minutes run during a continuous running test performed on search and rescue dogs, this supplement shows positive impacts on cardiovascular parameters, an increase of triglycerids at the onset of exercise, a reduction of plasmatic expression of proinflammatory and oxidative stress markers in the supplemented group. Our second study focusses on postexercise nutritionnal supplementation in the military dog, in order to observe impacts on a mix of maltodextrins (1.5g/kg body weight) and proteins (0.3g/kg body weight) provided just after the exercise, during three periodsof intense exercise separated by one hour rest periods during a single day. Our results include a reduction of plasmatic inflammatory markers production and of mucular lesions markers in the supplemented group. Further studies are required in order to adapt nutitionnal supplementation to each type of exercise (endurance, mix, resistance), by testing different qualitative and quantitative inputs. They will also permit to precise optimal timing for its distribution (single or fractionned inputs, timing before or after the exercise), and to adapt it to environmental conditions (especially hot climate, that is a cause of numerous problems for service dogs sent to oversees operations).

Les nuages représentent un milieu multiphasique complexe et réactif. Une grande partie de composés chimiques atmosphériques de la phase particulaire ou gazeuse se dissout dans les gouttelettes de nuage où peuvent subir des transformations chimiques, photochimiques et microbiologiques. L'eau de nuage a été échantillonnée à la station du puy de Dôme et caractérisée par des mesures physico-chimiques. La première partie de mon travail de thèse est focalisée sur la réactivité de l’eau du nuage. La formation d’espèces réactives, le radical hydroxyle, est étudiée par photolyse directe de sources inorganiques et photolyses nano-pulsée et sa vitesse de formation a été corrélée à la concentration de sources. Les propriétés spectroscopiques et la dégradation d'un composé modèle, l'acide tartronique, ont été étudiés. Les expériences faite par irradiation continue (photolyse directe et induite par le radical hydroxyle) et par photolyse pulsée ont permis de comprendre la réactivité de ce composé dans le milieu nuageux. La deuxième partie de mon travail est focalisée sur la caractérisation et la réactivité de la matière organique dans la phase aqueuse des nuages. La détection et la quantification de tryptophane par spectroscopie de fluorescence et l'étude de sa réactivité ainsi que la détection et quantification d‘acides aminés représente une partie importante de ce travail. Les acides aminés ont été détectés pour la première fois dans l'eau de nuage grâce à l'utilisation d'une méthode chromatographique de dérivation et détection par fluorescence. Ce travail à démontré que les acides aminés peuvent représenter entre 4 et 21 % de la concentration en carbone de la matière organique dissoute dans le nuage. La réactivité des acides aminés avec le radical hydroxyle a été comparée avec celle des acides carboxyliques et de la matière organique dissoute. Ce résultat montre clairement que le rôle des acides aminés comme piège de radicaux hydroxyles ne peut plus être négligé. / Clouds represent a multiphase complex and reactive medium in which gases, liquid particles and aerosols are in continuous interaction. A large fraction of atmospheric chemical compounds present in the particulate and gaseous phases can be transferred to the cloud droplets where can undergo chemical, photochemical and microbiological transformations. Cloud waters were sampled at the puy de Dôme station. The first part of my PhD work is focused on the photoreactivity of cloud water. Formation of a reactive species such as hydroxyl radical, by direct photolysis of inorganic sources was investigated, as well as the correlation between the concentration of sources and the hydroxyl radical formation rate. The spectroscopic proprieties and fate of tartronic acid, were investigated under cloud water conditions. Moreover, photochemical experiments were performed using continuous irradiation (direct and hydroxyl radical mediated photolysis) and nanosecond flash photolysis in order to assess the reactivity of this compound in cloud aqueous phase. The second part of my work is centered on the characterization of organic matter in clouds. Two studies are presented: i) Detection and quantification of tryptophan by fluorescence spectroscopy and the assessment of its reactivity; ii) detection and quantification of amino acids. Amino acids are detected for the first time in cloud water using a derivatization method and this work show that they represent the 9% of the dissolved organic matter in cloud. Their reactivity with hydroxyl radical was compared to the reactivity of carboxylic acids and dissolved organic matter. These results clearly demonstrate that amino acids represent a major sink of hydroxyl radicals in cloud water.

La nicotianamine est une molécule naturelle qui joue un rôle essentiel dans la régulation des concentrations en métaux de transition dans les plantes. Sa structure comprend trois acides carboxyliques et trois fonctions amines. L'objectif du travail présenté dans ce manuscrit est d'établir un protocole permettant de reproduire les propriétés de chélation de cette molécule grâce à des calculs de chimie quantique. L'intérêt est d'appliquer ce protocole à des analogues synthétiques de la nicotianamine, afin de prédire leurs propriétés.Le protocole que nous avons mis au point s'articule autour de quatre axes : le calcul des pKa, l'étude des propriétés de chélation, le calcul de tenseur g de résonance paramagnétique électronique et l'analyse des propriétés vibrationnelles. Ces différents points ont nécessité le développement de méthodes de calcul et d'outils innovants. Les calculs de chimie quantique qui ont été effectués sont basés sur la théorie de la fonctionnelle de la densité. On a utilisé des fonctionnelles hybrides, associées à un modèle de solvant implicite ou semi-explicite qui permet de prendre en compte l'effet du milieu.Nous avons proposé une méthode graphique originale adaptée à la nicotianamine permettant le calcul de ses six pKa ainsi que celui des pka des complexes formés avec les métaux de transition. Cette méthode conduit à une bonne précision sur les calcul de pKa dans l'intervalle de pH physiologique. Ces pKa renseignent sur le comportement de la nicotianamine dans différents milieux végétaux. Nous avons aussi envisagé plusieurs protocoles pour l'étude des propriétés de chélation de la nicotianamine.Pour compléter l'étude des complexes de la nicotianamine, nous avons paramétré une méthode simple et rapide de calcul du tenseur g de systèmes moléculaires contenant du cuivre paramagnétique. Enfin, nous avons développé un programme graphique permettant l'analyse des modes de vibration infrarouges de systèmes moléculaires comme les complexes métal-nicotianamine étudiés. / Nicotianamine is a triamino acid that plays an essential role in regulation and transportation of transition metals in plants by a chelation process. Functional analogues of this molecule have already been synthesised that we hope to use for selective soil decontamination thanks to their property changes with respect to nicotianamine. Therefore, the aim of the present work is to find a predictive protocol for the chelating properties of these analogues, using the know example of nicotianamine. We worked out a predictive protocol focusing on the four following points : pKas, chelation, EPR tensors and vibrational properties. It uses quantum chemistry methods such as hybrid DFT functionals and implicit solvent models.The pKa calculations for nicotianamine and metal-nicotianamine complexes were performed using a novel graphical method well suited to these systems. The pKas are useful to understand the effect of the various plants pHs on the complexes. Then we computed the chelation constants and the structures of metal-nicotianamine complexes. As a complement to the study of these complexes, we set up protocols to calculate the EPR tensors of the copper-nicotianamine complex and to analyse the infra-red vibrations of the complexes, using respectively a parametrised method and a local code.

L’enrichissement préférentiel (PE) est un procédé de brisure de symétrie spontanée non-usuel développé par le groupe du Pr Tamura à la fin des années 90. En commençant avec une solution avec un léger excès énantiomèrique et une haute sursaturation, le système dévie de la cristallisation classique, en conditions stagnantes (hors équilibre) vers une solution très enrichie et des cristaux légèrement enrichis dans le contre énantiomère. L’objectif de cette thèse est d’évaluer le procédé de PE avec le cas d’étude du Fumarate d’Arginine dans un mélange eau/éthanol, pour obtenir une meilleure compréhension de son mécanisme. Les principaux résultats de ce travail peuvent être résumé ainsi :– En réalisant un suivi temporel conduit par l’arrêt d’expérience à 11 différents temps le PE apparaît être un procédé continu ;– Les expériences de diffraction des rayons X montrent que les transitions polymorphiques ne sont pas requises pour le procédé de PE, différentes phases ou successions de phases peuvent conduire à des résultats identiques de PE ;– Des échanges entres énantiomères de la solution mère et des cristaux déposés ont été démontrés par addition de L-Arginine marquée comme contre énantiomère durant des expériences commençant avec un excès de D-Arginine. Pour conclure ce manuscrit un mécanisme révisé du PE comme procédé continu est proposé. Les critères pour faire fonctionner le PE sont réduits à quatre : i) une forte différence de solubilité entre les énantiomères purs et le composé racémique ; ii) le composé racémique doit avoir un domaine de solution solide ; iii) le système doit rester stagnant durant tout le procédé ; iv) la composition initiale doit être dans une zone appropriée du diagramme de phase (pour le cas du Arg-Fum : un e.e. < 12% et un β ≥ 4). / Preferential Enrichment (PE) is an unusual spontaneous symmetry breaking phenomenon developed by Prof. Tamura’s group in the late nineties. Starting with a slightly enriched in one enantiomer, highly supersaturated solution, this out of equilibrium process permits the system to deviate from standard crystallization, in stagnant conditions, in order to obtain a highly enriched mother liquor and deposited crystals slightly enriched in the opposite enantiomer. The objective of this thesis is to assess the process of PE with the case study of Arginine Fumarate in water/ethanol mixture to obtain a better understanding of its mechanism. The main results of this work can be summarized as:– Using time monitoring performed by stopping experiments at 11 different times, PE appeared as a continuous process;– In situ X-Ray powder diffraction experiments showed that polymorphic transitions are not required for PE, different phases or successions of phases can achieve identical results of preferential enrichment;– Exchanges between enantiomers of mother liquor and the deposited crystals were demonstrated by addition of labeled-L-Arginine as counter enantiomer during experiments starting with an excess of D-Arginine.To conclude this work a revised mechanism for PE as a continuous process is proposed. Criteria to achieve PE are reduced to four: i) a strong difference of solubility between pure enantiomers and racemic compound; ii) the racemic compound should crystallize with a solid solution domain; iii) the system should stay stagnant during the complete process; iv) the initial composition should be in the appropriate zone of the phase diagram (e.g. for Arg-Fum system a e.e. < 12% and a β ≥ 4).

L’intérêt des composés organiques fluorés est de nos jours de plus en plus important en raison de leur large domaine d’application (agrochimie, nucléaire, matériaux, chimie médicinale…). Par exemple, en chimie médicinale, la présence d’un ou plusieurs atomes de fluor au sein de biomolécules conduit très souvent à une amélioration de leur profil thérapeutique. Par ailleurs, le cyclopropane, le plus petit et le plus tendu des cycloalcanes, permet également de modifier les caractéristiques pharmacologiques de composés biologiques de par sa géométrie inhabituelle. En effet, la rigidification structurale apportée par ce motif influe sur la biodisponibilité d’une biomolécule en améliorant sa sélectivité et son affinité pour un récepteur biologique. Dans ce contexte, nous avons choisi d’associer les propriétés remarquables de l’atome de fluor à la contrainte structurale du cyclopropane dans le but d’élaborer deux nouvelles classes de fluoropeptidomimétiques.Tout d’abord, nous nous sommes intéressés à la modification de la chaîne latérale d’acides aminés naturels en développant la synthèse des analogues cyclopropaniques fluorés de la méthionine, de la leucine, de la lysine et de l’arginine. Nous avons ensuite appliqué l’un de nos acides aminés cyclopropaniques fluorés à la synthèse totale de l’analogue fluoré d’un inhibiteur de la sérineprotéase NS3/4A, le TMC 435.Enfin, dans le but de proposer une voie de synthèse générale permettant l’accès aux pseudopeptides fluorés comportant un monofluorocyclopropane à la place du lien peptidique, nous avons développé une nouvelle stratégie basée sur une étape d‘addition nucléophile de réactifs organométalliques sur des N-(tert-butanesulfinyl)-α-fluoroimines chirales. / Fluoroorganic compounds are increasingly popular owing to their wide range of applications. For instance, in the field of medicinal chemistry, fluorinated molecules often lead to an improvement of the therapeutic profile compared to non-fluorinated derivatives. Besides, with its unique bonding properties, the cyclopropane ring provides unusual physical and pharmacological properties to structures that incorporate it. Indeed, the structural constraint provided by the cyclopropane ring clearly alters the selectivity and the affinity for a binding site. In this context, we decided to combine the cyclopropane and the fluorine atom to develop two new classes of peptidomimetics. First, we focused on the modification of the side chain of natural aminoacids (methionine, leucine,lysine and arginine) and the synthesis of fluorinated cyclopropyl analogues was achieved. Then, we applied our strategy to the synthesis of the fluorinated analogue of the TMC 435, a NS3/4A serine protease inhibitor involved in the replication cycle of Hepatitis C virus. Finally, in our project aiming at proposing a general method to access pseudopeptides featuring a fluorinated cyclopropane moiety as the peptide bond isostere, we develop a new strategy based on the nucleophilic addition of organometallic reagents to N-(tert-butanesulfinyl)-α-fluoroimines. This methodology allows us to control the asymmetric center on the N-terminal side of the peptide.

Titre de l'écran-titre (visionné le 30 octobre 2023) / L'épilepsie est une condition neurologique caractérisée par la survenue spontanée de crises résultant d'une activité neuronale synchrone et excessive. Récemment, des mutations dans les gènes du complexe GATOR1 (DEPDC5, NPRL2 et NPRL3) ont été impliquées dans les épilepsies focales familiales (EFF). Bien que les mécanismes moléculaires sous-jacents de la maladie ne soient pas encore compris, une hyperactivité de la voie de signalisation mTORC1 constitue une caractéristique bien établie des EFF reliées à GATOR1. Dans la cellule, GATOR1 est un complexe protéique essentiel dans la détection des acides aminés et il agit comme répresseur de la voie de signalisation mTORC1 lorsque les niveaux d'acides aminés intracellulaires sont bas. mTORC1 joue un rôle central dans la régulation de la croissance cellulaire et contrôle plusieurs processus cellulaires incluant la synthèse protéique et l'autophagie. Une dérégulation de la voie mTORC1 est impliquée dans plusieurs maladies, dont l'épilepsie. Malgré l'importance biologique et clinique de GATOR1, les mécanismes régulant son activité demeurent peu connus. Par l'utilisation de lignées de cellules mutantes, ce projet vise donc à identifier de nouveaux mécanismes biochimiques de régulation de GATOR1 afin de contrôler l'activité de mTORC1 et de mieux comprendre les conséquences moléculaires des mutations de GATOR1 contribuant à l'EFF. En déterminant l'impact fonctionnel de variants de NPRL2 reliés à l'EFF, j'ai montré qu'une portion de ces variants ont perdu leur capacité à réprimer mTORC1 dans des conditions nutritionnelles sous-optimales, ce qui supporte l'hyperactivité de mTORC1 comme mécanisme pathogénique sous-jacents de la maladie. Ce projet a également montré que le variant pathogénique L105P de NPRL2 est incapable de s'associer avec NPRL3 and DEPDC5, ce qui semble souligner le rôle crucial du résidu leucine 105 (Leu105) de NPRL2 dans la formation du complexe GATOR1. Par ailleurs, ce projet a montré que l'acétylation se produit sur certains résidus lysine de NPRL2 retrouvés à proximité du site Leu105. L'acétylation sur ces résidus s'est révélée plus abondante sur le mutant L105P que sur la protéine sauvage. Ces résultats proposent donc NPRL2 comme une cible potentielle sujette à la régulation par l'acétylation, laquelle pourrait avoir pour effet d'abolir les interactions protéiques entre les membres de GATOR1. / Epilepsy is a complex neurological disorder characterized by spontaneous seizures due to excessive neuronal activity. Mutations in the GATOR1 genes (DEPDC5, NPRL2 and NPRL3) have recently been linked to familial focal epilepsy (FFE). The molecular mechanisms underlying the disease are currently unknown, yet hyperactive mTORC1 signaling is an established feature of GATOR1-related epilepsies. The GATOR1 complex is an essential amino acids sensor that acts to repress the mTORC1 signaling pathway when intracellular amino acids levels are low. mTORC1 is a master regulator of cell growth that controls multiple cellular processes such as protein synthesis and autophagy. Dysregulation of mTORC1 contributes to many diseases including epilepsy. Despite the clinical and biological importance of GATOR1, little is known about its regulation. Through the use of mutant cell lines, this project aims to investigate novel biochemical regulatory mechanisms of GATOR1 that control mTORC1 activity, and to understand the molecular mechanisms underlying GATOR1-dependent epilepsies. Functional assessments of FFE-related NPRL2 variants in NPRL2-null cells revealed that some variants completely prevent the ability of GATOR1 to repress mTORC1 under starvation conditions. This further supports the dysregulation of mTORC1 as the main pathogenic mechanism underlying the disease. Additionally, I demonstrated that the pathogenic NPRL2 variant L105P is unable to associate with NPRL3 and DEPDC5, suggesting the critical role of NPRL2 Leu105 residue in organizing the assembly of GATOR1 complex. Finally, I showed that NPRL2 is acetylated on conserved lysine residues that are adjacent to the Leu105 site. Acetylation on Lys103 and Lys104 residues was more abundant in the mutant L105P compared to the wild-type NPRL2. These results suggest NPRL2 as a potential novel target of regulation by lysine acetylation, which may act as an impediment to protein interactions within the GATOR1 complex. Future work aimed at determining the functional consequences of lysine acetylation in NPRL2 will be necessary.

L'alimentation protéique des vaches laitières à un coût important pour l'entreprise laitière, autant sur le plan économique qu'environnemental. De plus, les unités de base de la formulation protéique ont aussi changé passant de la protéine brute pour utiliser les acides aminés plus récemment, tout en gardant le concept de protéine métabolisable. Les objectifs généraux de cette thèse étaient de : 1) déterminer si un changement dans l'alimentation protéique des bovins laitiers peut réduire l'empreinte environnementale, tout en maintenant ou améliorant les revenus nets de l'entreprise laitière canadienne; 2) évaluer comment les différences de structure des principaux modèles de formulation disponibles peuvent affecter leur capacité à prédire la production de protéine du lait sur les fermes commerciales québécoises. Le premier projet consistait à évaluer le potentiel d'un système d'alimentation basé uniquement sur les acides aminés, avec une efficacité d'utilisation variable, au lieu du système basé sur les protéines métabolisables actuellement utilisé. Les résultats ont démontré certains avantages économiques avec un gain potentiel sur les revenus nets de la ferme de 0 à 9 % selon la région et le contexte de la ferme. Combiné à cela, on a aussi observé un maintien ou même une réduction de l'empreinte environnementale par une réduction potentielle du bilan azoté de 0 à 7 % et une réduction des gaz à effet de serre de 0 à 4 %. Pour être sûr qu'un changement de l'alimentation protéique soit valable, il faut déterminer si les modèles existants sont capables de bien prédire la production de la protéine du lait, et par conséquent l'utilisation de la protéine, directement sur les fermes commerciales québécoises. La première phase du second projet consistait à évaluer les prédictions de la protéine du lait sur des fermes québécoises avec 4 modèles de formulation couramment utilisés lorsque l'information collectée était contrôlée. Les résultats ont montré que le modèle scandinave NorFor avait la meilleure capacité de prédiction avec un coefficient de concordance de corrélation (CCC) de 0,82 suivi par le Cornell Net Carbohydrate and Protein System (CNCPS) avec 0,76, le National Research Council. (NRC) 2001 et Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) 2018 avec 0,75 chacun. Avec tous les modèles, les animaux avec des rations à plus haute teneur en énergie avaient des estimations plus élevées que pour les animaux avec des rations à plus faible teneur énergétique. De plus, avec tous les modèles, les animaux en début de lactation avaient des sous-estimations plus importantes que ceux plus avancés en lactation. La seconde phase de ce projet consistait à évaluer les effets potentiels des incertitudes de mesures à la ferme sur la prédiction de la production de la protéine du lait. Elle a démontré que, pour ces 4 modèles, l'estimation de la consommation volontaire de matière sèche, le poids vif et la composition des fourrages étaient les facteurs les plus à risque de créer des erreurs sur la prédiction de production de la protéine du lait. Finalement, pour valider les performances en contexte réel d'application, le dernier projet comparait encore les performances de prédiction de la protéine du lait, mais cette fois-ci avec des données provenant de la base de contrôle laitier de Lactanet. La qualité de l'information recueillies était alors non contrôlée, et ainsi plus à risque d'erreur, ce qui pouvait avoir un impact négatif sur les prédictions. Dans ce contexte, le modèle scandinave avait toujours les meilleures prédictions avec une CCC de 0,76. Cependant cette fois-ci, le modèle INRA 2018 avait les deuxièmes meilleures prédictions avec une CCC de 0,75, suivis du NRC 2001 avec 0,70 et finalement le CNCPS avec 0,62. Les prédictions moins précises de ce projet sont liées à la qualité diminuée de l'information disponible, mais aussi à l'absence de certaines données, qui étaient collectées dans le précédent projet. Finalement, on peut conclure que lorsque l'information nécessaire au bon fonctionnement de chacun des modèles est disponible, ils performent en moyenne de façon adéquate, malgré un certain avantage pour le modèle NorFor. Entre 4 et 38% de l'erreur de prédiction sont au niveau des troupeaux et une adaptation à ce niveau par les conseillers est donc nécessaire. / Dairy cow protein feeding management is an important cost for dairy farms as much on economics than on the environment. The standard units used to represent diet protein changed throughout time to pass from crude protein in the old days to amino acids more recently, while still using metabolizable protein. The general objectives of this thesis were to 1) determine whether a change in the protein diet of dairy cattle can reduce the environmental footprint, while maintaining or improving the bottom line of the Canadian dairy farms; 2) evaluate how the differences in the structure of the main formulation models available can affect their ability to predict milk protein production on Quebec commercial farms. The first project was about evaluating the potency of an amino acids-based diet formulation, with variable efficiency, instead of the current metabolizable protein system currently in use. Results showed a potential enhancement of up to 9% of the farm net income, depending on the farm situation. We also observe a potential reduction in N farm balance by 0 to 7% and a reduction in emission of greenhouse gases by 0 to 4%. However, to make sure that changes in protein feeding is effective, it is important to determine if existing models are able to predict protein yield, and consequently protein utilization, directly on commercial dairy farm. The first part of the second project was about evaluating milk protein yield prediction of 4 common feed evaluation models on commercial farms when quality information is available. Results have shown that the Scandinavian model NorFor had the best prediction capabilities with a concordance correlation coefficient (CCC) of 0.82, followed by Cornell Net Carbohydrate and Protein System (CNCPS) with 0.76, NRC 2001 and INRA 2018 both at 0.75. Furthermore, we observed for all models that animal with higher energy content in their diet had usually higher estimation than animal with lower energy content in their diet. Also, in all models, animals in a later lactation stage had higher overestimation then animals in an earlier stage. These observations indicate evolution in the efficiency of utilization of protein throughout lactation. The second phase of this project was about the evaluation of potential uncertainties of measurements at the farm on milk protein yield prediction. It showed that for the four models, dry matter intake, body weight and forage characterization were the main factors at risk of affecting milk protein yield predictions. Finally, to validate performances in real context of the application, the last project compared milk protein yield prediction, but with dairy herd improvement data, from Lactanet. Information quality was uncontrolled and at risk to have negative impacts on predictions. The Scandinavian model still had the best prediction capabilities with a CCC of 0.76. INRA 2018 had the second-best prediction performances this time on with a CCC of 0.75, followed by NRC 2001 with 0.70 and CNCPS with 0.62. Lower data quality and unavailability of some data that were collected in the previous project are the main reasons for these lower predictions in this third project. Finally, we can conclude that, when information needed for each model is available, they on average perform well, while NorFor has better performances. Between 4 and 38% of total errors were at herd level. So an adaptation is needed by advisors on each herd for the models to perform well.