Ce travail s'inscrit dans le cadre général de la mise au point et de l'étude d'agents potentiellement photothérapeutiques. Dans cette optique, les recherches menées dans notre laboratoire sont consacrées principalement à l'étude de complexes photooxydants de ruthénium(II) contenant des ligands &61552;-déficients TAP (1,4,5,8-tétraazaphénanthrène). Ces composés sont en effet capables, sous illumination, d'oxyder différentes biomolécules pour mener, notamment, à la formation de photoadduits qui pourraient perturber le fonctionnement d'enzymes cellulaires in vivo.<p><p>La première partie de ce travail a été consacrée à la mise au point d'un nouveau système d'ancrage de ces complexes. Elle décrit les voies de synthèse et de purification de deux nouveaux ligands fonctionnalisés: la phen" et le TAP", ainsi que celles de trois nouveaux complexes chélatés par ces nouveaux ligands: le &61531;Ru(TAP)2phen"&61533;2+, le &61531;Ru(TAP)2TAP"&61533;2+ et le &61531;Ru(phen)2phen"&61533;2+. Ces composés ont été attachés, via une liaison oxime, sur oligonucléotides synthétiques et sur polymères biodégradables.<p>La seconde partie de notre travail a été consacrée à l'étude photochimique de conjugués oligonucléotide-complexe sous forme de simples et de doubles brins. Pour les conjugués à base du &61531;Ru(TAP)2phen&61533;2+, nous avons pu mettre en évidence un photocrosslinking lorsque des guanines étaient présentes dans le brin complémentaire. La formation de ce photoadduit est moins efficace que celle observée avec l'ancien système et montre une dépendance en l'extrémité d'ancrage du complexe (5' ou 3'). Pour les conjugués fonctionnalisés avec le &61531;Ru(TAP)3&61533;2+, nous avons montré que le photocrosslinking, dans le duplexe avec guanines, était moins efficace à cause de la photodéchélation de ce composé. De plus, nous avons pu mettre en évidence un quenching de la luminescence par les bases adénines dans les conjugués simples et doubles brins sans guanine ainsi qu'un photocrosslinking dans le duplexe sans guanine. Enfin, nous avons pu déterminer pour la première fois le rendement quantique de la réaction de photojonction via les bases guanines.<p>Nous avons ensuite étudié, d'un point de vue photophysique et photochimique, des conjugués complexe-polymère biodégradable dont le rôle sera de faire pénétrer les composés photoréactifs à l'intérieur des cellules. D'une part, nous avons montré que la présence du polymère avait peu d'influence sur les propriétés photophysiques des complexes. D'autre part, l'utilisation de différentes techniques, nous a permis de démontrer que les complexes ancrés chimiquement sur ces macromolécules sont toujours capables de photooxyder la guanine et de mener à la formation de photoadduits sur GMP et sur oligonucléotides.<p>Finalement, la dernière partie de notre travail a été consacrée à l'étude des complexes photoréactifs &61531;Ru(TAP)2phen&61533;2+ et &61531;Ru(TAP)3& / Doctorat en sciences, Spécialisation chimie / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Francisella tularensis, agent étiologique de la tularémie, est un pathogène intracellulaire facultatif capable d’infecter de nombreuses cellules de mammifères. Pour se multiplier activement dans le cytoplasme des cellules hôtes, la bactérie doit être en mesure de capter dans cet environnement tous les composés nécessaires à son métabolisme, et notamment des acides aminés qui représentent ses principales sources de carbone et d’azote. Les pathogènes à multiplication intracellulaire ont mis en place un ensemble de mécanismes, visant i) la manipulation des voies métaboliques de l’hôte, pour accroître le pool de nutriments disponibles, et ii) l’expression de transporteurs dédiés, pour la captation optimale de ces nutriments. Cet ensemble de mécanismes est regroupé sous le terme de « virulence nutritionnelle ». Chez Legionella pneumophila, plusieurs membres d’une sous-famille de transporteurs actifs secondaires (désignés Pht, ou transporteurs phagosomaux), responsables de la captation des acides aminés lors de la phase intracellulaire de la bactérie, ont été caractérisés. Dans ce travail, nous avons établi le rôle de deux membres de la sous-famille des transporteurs Pht (désignés AnsP et IleP), dans le transport d’acides aminés et la virulence de Francisella. La protéine AnsP est un transporteur d’asparagine. La délétion du gène codant pour ce transporteur n’a pas d’effet sur la croissance de Francisella en milieu synthétique, mais entraîne une diminution drastique de sa multiplication intracellulaire dans tous les types cellulaires testés, ainsi qu’une atténuation importante de la virulence chez la souris. La perte de virulence du mutant asnP est réversible aussi bien in vivo qu’in vitro par ajout d’asparagine en excès. F. tularensis, qui est prototrophe pour l’asparagine en milieu minimum, devient donc auxotrophe dans le cadre de sa croissance intracellulaire, et nécessite un transport de cet acide aminé via AnsP. Ce changement de besoins en asparagine entre le milieu extérieur et le milieu intracellulaire illustre bien le phénomène d’adaptation nutritionnel que réalise la bactérie dans le cadre d’une infection. La délétion du second transporteur, IleP, entraine un défaut de croissance en milieu minimum, réversible par ajout de thréonine, un précurseur métabolique de l’isoleucine chez F. tularensis subsp. novicida. Des expériences d’incorporation d’isoleucine marquée ont permis de mettre en évidence la fonction de transporteur d’isoleucine de la protéine IleP. La délétion du gène codant pour IleP entraine également un défaut de multiplication in vitro, associé à un léger retard de sortie du phagosome ainsi qu’une atténuation importante de la virulence chez la souris. Ce transporteur assure donc la captation de l’isoleucine dans des conditions où l’utilisation de la thréonine, ne permet pas d’assouvir les besoins de la bactérie. De façon remarquable, la voie de biosynthèse de l’isoleucine via la thréonine est interrompue chez les sous-espèces tularensis et holarctica. La croissance de ces sous espèces, plus virulentes que novicida, dans la cellule infectée devient donc strictement dépendante du transport de l’isoleucine par IleP. Cet exemple constitue une parfaite illustration de la spécialisation des souches pathogènes aux conditions nutritionnelles de leur hôte. En conclusion, l’ensemble des travaux présentés dans cette thèse a permis de démontrer la participation de deux transporteurs d’acides aminés à la virulence nutritionnelle de la bactérie Francisella. / Francisella tularensis is the causative agent of tularemia. This facultative intracellular pathogen can infect a broad variety of mammalian cells. To multiply actively in the cytoplasm of host cells, the bacteria must be able to capture in this environment all necessary nutrients, including amino acids, that constitute its principal carbon and nitrogen sources. Intracellular pathogens have established a set of mechanisms aimed at: i) hijacking the metabolic pathways of the host, to increase the pool of nutrients available, and ii) expressing transporters dedicated to the optimal transport of these nutrients. These mechanisms are grouped under the term "nutritional virulence." In Legionella pneumophila, several members of a sub-family of secondary active transporters (designated Pht for phagosomal transporter), responsible for the uptake of amino acids in the intracellular phase of the bacteria, have been characterized. In this work, we have established the role of two Pht members (designated AnsP and IleP) in amino acid transport and virulence of Francisella. The AnsP protein is an asparagine transporter. Deletion of the gene encoding the transporter has no effect on the growth of Francisella in synthetic medium, but lead to a drastic decrease in intracellular multiplication in all cell types tested, and significant attenuation of virulence in mouse. The loss of virulence of the ansP mutant was reversible in vivo and in vitro by addition of excess asparagine. F. tularensis, which is prototrophic for asparagine in minimum medium, becomes auxotrophic under its intracellular growth and requires transport of the amino acid via AnsP. This change of asparagine requirement between an environmental and an intracellular lifestyle illustrates the nutritional adaptation achieved by bacteria during infection. The deletion of the second transporter, IleP, causes a growth defect in minimum medium, reversible by adding threonine, a metabolic precursor of isoleucine in F. tularensis subsp. novicida. Transport asays with radiolabelled isoleucine have highlighted the role of IleP protein in isoleucine uptake. Deletion of the ileP gene caused a severe defect in intracellular multiplication, combined with a slight delay exit the phagosome and a significant attenuation of virulence in mice. Notably, the biosynthesis pathway of isoleucine via the threonine is interrupted in holarctica and tularensis subspecies. The growth of these subspecies, more virulent than novicida, in the infected cell becomes strictly dependent on the transport of isoleucine by IleP. This example is a perfect illustration of the specialization of pathogenic strains to nutritional condition of their host. In conclusion, the work presented in this thesis has demonstrated the participation of two amino acid transporters to the nutritional virulence of the Francisella.

Ce travail de thèse avait pour objectif d’étudier la régulation de l’expression des gènes du métabolisme intermédiaire par les acides aminés alimentaires dans le foie de truite arc-en-ciel. Ces études ont permis de caractériser, pour la première fois dans le foie de truite, les principaux acteurs de la voie de signalisation Akt/TOR et leurs régulations. Nos résultats in vitro montrent qu’un mélange d’acides aminés, seul ou avec l’insuline, est capable de réguler l’expression de nombreux gènes impliqués dans la lipogenèse, la néoglucogenèse et la glycolyse. Les régulations observées en présence conjointe d’un mélange d’acides aminés et d’insuline semblent être, pour la plupart, dépendantes de la voie TOR. Par la suite, nous avons étudié l’effet de certains acides aminés comme la leucine (connue pour son effet « signal ») ainsi que la lysine et la méthionine (souvent ajoutées dans les aliments piscicoles riches en matières premières végétales afin d’atteindre l’équilibre en acides aminés). En présence d’insuline, la leucine, contrairement à la lysine et la méthionine, active la voie de signalisation TOR et régule l’expression de certains gènes (néoglucogenèse et lipogenèse) de façon similaire à un mélange d’acides aminés. Parallèlement, in vivo, nous avons étudié la régulation de l’expression des gènes du métabolisme intermédiaire lors d’un remplacement partiel ou total des huiles et farines de poisson par des produits végétaux dans l’aliment piscicole. Cette expérimentation a montré que, ni les voies de signalisation Akt/TOR, ni l’expression des gènes cibles ne sont affectés par ces nouveaux aliments. En conclusion, ces travaux ont montré que les acides aminés semblent jouer un rôle important dans la régulation de l’expression des gènes hépatiques du métabolisme intermédiaire chez la truite arc-en-ciel. / The objective of my PhD was to characterize the regulation of the intermediary metabolism related gene expression by dietary amino acids in the liver of rainbow trout. This work allowed us to characterize, for the first time in the liver of trout, the main proteins of the Akt/TOR signalling pathway and their regulations. In vitro results showed that a mixture of amino acids, in the presence or absence of insulin, is able to regulate the expression of numerous genes involved in lipolysis, gluconeogenesis and glycolysis. Such regulations induced by an amino acid mix together with insulin appear to be, at least partly, TOR-dependent. Afterwards, I studied the effect of specific amino acids known to be a signalling molecule (leucine) or having potential application as supplements to reach essential amino acid balance in plant ingredients-rich diet (lysine and methionine). In the presence of insulin, leucine, in contrast to lysine and methionine, is able to activate the TOR signalling pathway and regulate the expression of several genes involved in gluconeogenesis and lipogenesis in the same way as a mixture of amino acids. Furthermore, we studied in vivo, the effect of partial or total replacement of fish oil and fish meal by plant products in fish feed on .the regulation of intermediary metabolism related gene expression. This study showed that neither Akt/TOR signalling pathway nor the expression of the target genes were affected by such diets. In conclusion, these studies showed that amino acids seem to play an important role in the hepatic regulation of intermediary metabolism gene expression in the rainbow trout.

Ce travail est consacré au développement d’une nouvelle méthode de synthèse d’analogues bioactifs de protéinesen utilisant des réactions successives de cycloaddition entre les alcynes terminaux et les azotures (CuAAC).Pour pouvoir effectuer des cycloadditions itératives, nous avons étudié la stabilité et les conditions de coupure dedifférents groupements masquants des alcynes terminaux. Cette étude a été valorisée par le développement d’unestratégie originale pour réaliser un triple cycloaddition successive une même molécule basée sur la protectiontemporaire de la fonction alcyne.La méthode a été appliquée à la synthèse d'un analogue de la stéfine A humaine, un inhibiteur naturel deprotéases à cystéine d’intérêt thérapeutique. Pour cela, nous avons mis au point des conditions de CuAACsuccessive compatibles avec des peptides déprotégés de façon beaucoup à obtenir in fine un analogue bis-triazolede la stéfine A. Les études par dichroïsme circulaire et d’inhibition de diverses protéases à cystéines confirmentque notre analogue synthétique conserve la structure et l’activité biologique de la protéine native.La stratégie de ligation triazole successive a été étendue par la mise au point de conditions pour réaliser desligations sur phase solide. La méthodologie développée permet la synthèse de protéines de façon plus rapide etplus simple que par des procédés classiques de ligation successive en solution. Dans l’optique de la synthèse destructures glycopeptidiques capables d’induire une réponse immunitaire contre MUC1 tumorale, nous avons réaliséla synthèse d’analogues peptidiques de MUC1 par ligation successive sur phase solide de 160 acides aminés. / The aim of this work was the development of a novel method for the synthesis of triazolo-proteins by multiplesuccessive copper-catalyzed azide-alkyne cycloadditions (CuAAC).In order to achieve several successive cycloadditions, we have studied the stability and cleavage conditions ofseveral alkyne protective groups. This study leaded us to the development of an original strategy in order toachieve three successive cycloadditions on a same scaffold by temporal protection of alkyne functionalities.The method has been applied to the synthesis of an analogue of human stefin A, a natural inhibitor of severaltherapeutically relevant cysteine proteases. Therefore, we have developed CuAAC conditions compatible withunprotected peptide ligation. The strategy allowed us to obtain a bis-triazolo analogue of human stefin A. Circulardichroism and enzymology assays on several cysteine cathepsins revealed that the synthetic analogue hasretained the folding and full biological activity of the native protein.In order to expand the possibilities of this strategy, we have developed reaction conditions allowing us to performsuccessive triazole ligation on solid phase. This methodology avoids the need for a time-consuming and laborintensivepurification step before and after each ligation. With the aim of exploring the use of analogues of thetumor-associated form of the glycoprotein MUC1 to induce a specific immune response, we have synthesized atriazolo-analogue of MUC1 of 160 aminoacids using solid phase peptide ligation.

Les procédés multi-colonnes de chromatographie ont connu depuis quelques années un développement tel qu'ils sont devenus des standards industriels à toutes échelles, depuis celle des produits pharmaceutiques à haute valeur ajoutée jusqu'à celle des grands intermédiaires chimiques. La spécificité du présent travail consiste à étudier, pour ces procédés, l'influence d'un gradient d'élution. Il s'agit de faire varier au cours du temps la force éluante de la phase mobile. L'objectif est d'augmenter la productivité et le taux de récupération d'un produit à haute valeur ajoutée, tout en répondant à des contraintes de pureté. L'utilisation d'un gradient de solvant, courante en chromatographie analytique, fait l'objet d'un intérêt plus récent en chromatographie préparative. Les applications visées concernent des séparations de mélanges complexes où l'espèce cible a une affinité intermédiaire pour le support solide par rapport à celle des autres espèces, ce qui est souvent le cas lors de la purification de biomolécules issues de matières premières naturelles ou issues des biotechnologies. Dans ce cas, la séparation conduit à trois fractions, des impuretés faiblement retenues, la fraction intermédiaire et des impuretés fortement retenues. Pour notre étude, un mélange modèle, peu coûteux et non toxique, de cinq acides aminés a été choisi. Ces acides aminés ont été choisis en tenant compte de leur caractère apolaire et hydrophobe. Les séparations ont été réalisées par chromatographie en phase inverse. Dans un premier temps, une étude expérimentale, réalisée à l'aide d'une chaîne HPLC, a permis de déterminer les paramètres des isothermes d'adsorption de chaque acide aminé pour différentes teneurs en solvant organique de l'éluant. Une loi empirique a permis de relier le facteur de rétention k à la composition de la phase mobile (K = f (xméthanol)). Un travail de modélisation/simulation, reposant sur l'approche d'une cascade de mélangeurs, a ensuite permis de simuler les séparations obtenues dans le cas d'une seule colonne, puis dans le cas d'un système multi-colonnes. L'utilisation des lois reliant les facteurs de rétention k à la concentration en modifieur a alors permis de réaliser des simulations pour différents gradients de solvants. Dans le cas d'une seule colonne, le gradient a été optimisé en minimisant la durée de la séparation et en respectant une contrainte sur la résolution des pics des 2 espèces les plus difficiles à séparer. Une bonne adéquation a été observée entre les simulations et les résultats expérimentaux obtenus avec un gradient sur une seule colonne. Des expérimentations numériques ont alors été réalisées dans le cas du système multi-colonnes. Les paramètres opératoires optimaux ont été déterminés dans le cas du mélange étudié. Ces réglages seront ainsi utilisés lors de la validation expérimentale qui sera réalisée sur l'unité pilote. Cette unité comporte trois colonnes. Il s'agit d'un procédé séquentiel cyclique. Pour le mode opératoire retenu, chaque cycle comporte 8 étapes. A chaque étape les alimentations et soutirages des différentes colonnes sont modifiées. Pour le soutirage qui correspond à la fraction de l'espèce cible, les critères étudiés seront la pureté et le taux de récupération / Multi-column chromatographic processes have known, for a few years, a development on all scales, from high added value pharmaceutical products to major chemical intermediates. The specificity of the present work is to study the influence of a gradient elution for these processes. It consists in varying the eluent strength of the mobile phase over the time. The aim is to increase the productivity and the recovery ratio of a high added value product, while satisfying the constraints of purity. Solvent gradient is currently used in analytical chromatography and presents a recent interest in preparative chromatography. The applications concern separations of complex mixtures where the target species has an intermediate affinity for the solid phase compared to other species, which is often the case during the purification of biomolecules extracted from natural raw materials or resulting from biotechnologies. In this case, separation leads to three fractions, impurities weakly retained, an intermediate fraction and impurities strongly retained. For our study, a model mixture, inexpensive and nontoxic, of five amino acids was selected considering their nonpolar and hydrophobic character. The separations were carried out by reversed phase chromatography. An experimental study using a HPLC system was first carried out with single-element solution of each amino acid in isocratic mode. This enabled to determine adsorption isotherm parameters. An empirical law giving the retention factor as a function of eluent composition was determined (K = f (xmethanol)). A work of modeling / simulation, assuming linear isotherm and based on the mixed cells approach, permitted to simulate the separations obtained in the case of a one-column process, then in the case of a multi-column system. The use of retention factors laws allowed to carry out simulations for different solvent gradients. In the case of a single column, a simple methodology was developed to calculate the optimal solvent gradient. The gradient was optimized by minimizing the separation time and by respecting a constraint on the peaks resolution of the two species which are the most difficult to separate. A really good adequacy was observed between simulations and the experimental results. Numerical experimentations, executed in the case of the multi-columns process, made it possible, yet, to find the optimal operating parameters in the case of the studied mixture. These settings will be applied in the experimental validation which will be realized on the pilot unit. This unit has three columns. It is a cyclic sequential process. For the selected operating mode, each cycle contains eight steps. At each step, inlets ant outlets streams of different columns are switched. The criteria for the target species fraction are purity and recovery

Les acides aminés sont des molécules importantes pour la synthèse des protéines, la fourniture de substrats énergétiques ou la production de facteurs de régulation de l'activité cellulaire. L'ornithine aminotransférase {OAT} est une enzyme clef du métabolisme des acides aminés qui relie l'arginine, un acide aminé indispensable à la synthèse protéique au cours de la croissance, et le glutamate, la glutamine et l'a-cétoglutarate, qui peuvent être transformées en glucose. Nous nous sommes intéressés à la caractérisation biochimique de l'activité de l'OAT et à ses variations chez la souris, en utilisant deux contraintes physiologiques, le développement postnatal et l'exposition au froid. Au cours d'une première étude, nous avons caractérisé une activité OAT fonctionnelle dans tous les organes étudiés. Nous avons démontré l'existence d'un dimorphisme sexuel de l'activité, en faveur des femelles, dans la plupart des organes. Dans une seconde étude, nous avons montré des variations organe et sexe spécifiques de l'activité OAT au cours du développement postnatal en réponse aux besoins spécifiques en acides aminés : une régulation de l'expression de l'OAT par la testostérone et le changement de régime alimentaire lors du sevrage ; une contribution potentielle importante et insoupçonnée du muscle squelettique au métabolisme de l'ornithine. Enfin, nous avons mis en évidence que l'exposition au froid augmente ou diminue l'activité OAT de façon tissu-spécifique en liaison avec les besoins énergétiques de l'organisme. Nos résultats montrent que l'activité OAT est modulée dans les différents organes en fonction des besoins en acides aminés et en substrats. Cela suggère un rôle important du métabolisme des acides aminés dans les réponses adaptatives des organismes à leur environnement / Amino acids are important molecules for protein synthesis and energetic substrates supply. Ornithine aminotransferase {OAT} is a key enzyme of amino acids metabolism linking arginine, an essential amino acid for protein synthesis during growth, and glutamate, glutamine and alpha-ketoglutarate which could be converted into glucose. We principally focused on biochemical characterization of OAT activity and its variations in the mouse using two physiological constraints, postnatal development and cold exposition. During a first study, we characterized a functional OAT activity in all the males and females mice organs studied. We showed the existence of a sexual dimorphism of OAT activity in almost all the organs studied, with a higher OAT activity in females. ln a second study, we showed that the variations of OAT activity were organ and sex specific during the postnatal development in response to the specific needs in amino acids during the growth. We linked these variations to the regulation of OAT expression by testosterone and the change of the diet during weaning. We demonstrated an important and unsuspected contribution of skeletal muscles in pups' ornithine metabolism. Finally, we showed that cold exposition modulates OAT activity in a tissue specific way, in relation with energetic needs and the multiple roles of the substrates generated by the metabolic pathways of OAT. Our results show that in the different organs, OAT activity is modulated in function of amino acids needs, energetic substrates or detoxification needs of the organism during the different metabolic constraints. This is suggesting an important role for the amino acids metabolism in adaptive responses of organisms to their environment

Les complexes polyazaaromatiques de ruthénium (II) présentent un certain nombre de propriétés remarquables qui conduisent à des applications aussi variées que l'élaboration d'agents anticancéreux, l'inhibition de l'activité de certaines protéines ou encore la conversion d'énergie solaire en énergie chimique. Au cours de ce travail, nous avons exploré en partie chacune de ces trois thématiques. Dans la première partie, nous avons synthétisé un nouveau complexe polyazaaromatique de ruthénium (II), le [Ru(phen)2(HATPHE)]2+. Ce complexe se différencie du [Ru(phen)2(PHEHAT)]2+ qui possède les trois mêmes ligands car dans ce cas, le PHEHAT est chélaté au ruthénium via son second site de chélation. Cette différence, apparemment anodine, se traduit par une modification drastique des propriétés photophysiques du complexe. Alors que le [Ru(phen)2(PHEHAT)]2+ n'émet pas dans l'eau et ne s'aligne pas sur la droite de corrélation spectroélectrochimique, le [Ru(phen)2(HATPHE)]2+ se comporte comme la plupart des autres complexes de Ru(II). En étudiant et en comparant les propriétés photophysiques de ces deux complexes, nous sommes parvenus à rationaliser leurs différences et à proposer un schéma qui reprend leurs différents états excités. Parallèlement, le comportement du [Ru(phen)2(HATPHE)]2+ a été examiné en présence de polynucléotides. L'un deux, l'ADN- (double brin d'oligonucléotide fermé à ses deux extrémités), nous a permis de démontrer l'importance de la déformation de la double hélice lors de l'intercalation d'un ligand plan étendu entre les paires de bases d'un polynucléotide. La deuxième partie de ce travail est consacrée à la photochimie d'un complexe Ru-TAP en présence d'un acide aminé. Cette étude fondamentale a permis de mettre en évidence la formation d'un photoadduit entre le [Ru(TAP)2(phen)]2+ et le tryptophane. Nous avons également étudié les mécanismes qui régissent la synthèse de cet adduit par le biais de l'étude cinétique de la formation et de la recombinaison des espèces transitoires générées au cours de la photoréaction. Enfin, la troisième partie est consacrée à la synthèse et l'étude spectroscopique de complexes trinucléaires de ruthénium (II), l'un d'entre-eux pouvant servir de dendron pour la synthèse de composés de plus haute nucléarité. L'étude des propriétés photophysiques de ces complexes utilisant le PHEHAT comme ligand pontant, nous a permis de mettre en évidence un transfert d'électron intramoléculaire de l'extérieur vers l'intérieur pour un de ces trois composés. Cette propriété est particulièrement intéressante pour la synthèse de nouvelles antennes collectrices d'énergie lumineuse. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les transformations photochimiques sont des outils puissants pour créer de la diversité moléculaires à partir de substrats facilement accessibles; elles requièrent le réactif le plus simple : un photon. Les réactions de cycloaddition [2+2] photochimiques de composés carbonylés ou carboxylés α,β-insaturés avec des oléfines sont les réactions photochimiques les plus largement utilisées en synthèse organique. Les photoadduits cyclobutaniques sont très appliqués en synthèse multi-étapes de produits naturels ou dérivés et sont également prisés comme intermédiaires de synthèse du fait de la grande réactivité intrinsèque liée à leur tension de cycle. Dans la première partie de cette thèse, nous nous sommes intéressés à une approche photochimique pour la synthèse de β-acides aminés cyclobutaniques substitués. Notre objectif était de mettre en place une synthèse robuste et efficace sur l’échelle du gramme des acides cis- et trans-2-aminocyclobutane-1-carboxyliques (cis- et trans-ACBC) diversement substitués en position 3 ou 4. La construction du cycle à quatre chaînons a été réalisée via une réaction de cycloaddition [2+2] photochimique entre le tert-butoxyéthène et le maléimide ou l’anhydride maléique. Les fonctions amine et acide carboxylique ont ensuite été générées par des processus consécutifs ou “one-pot” impliquant un réarrangement de Hofmann. Les mélanges racémiques des 3- et 4-cis-syn-hydroxy-ACBCs ont été dédoublés via l’utilisation d’une oxazolidinone chirale, donnant accès aux β-acides aminés énantiopures ciblés sur grande échelle, sous la forme déprotégée ou protégée orthogonalement. Le contrôle d’une procédure d’épimérisation cis-trans a permis l’accès aux composés trans-syn-3-hydroxy-ACBC à partir des substrats cis-syn-3-hydroxy-ACBC. Enfin, les composés ACBCs diversement substitués en position 3 et de configuration cis-anti ou trans-anti ont pu être préparés grâce à une réaction de Mitsunobu ou d’autres transformations de type SN2, à partir des réactifs cis-syn- ou trans-syn-3-hydroxy-ACBC correspondants. Dans la seconde partie de cette thèse, nous avons étudié des processus photochimiques tandem et cascade initiés par une réaction de cycloaddition [2+2] photochimique. En collaboration avec un chercheur post-doctorant, nous avons réalisé la synthèse contrôlée d’une librairie d’acétals cyclobuténiques et d’oxétanes polycycliques, via des photoréactions tandem et cascade entre des cyclopent-2-énones et des partenaires alcènes. Le processus tandem résulte d’une réaction de cycloaddition [2+2] photochimique suivie d’une fragmentation de type Norrish I et d’un transfert d’hydrogène en position γ, conduisant aux aldéhydes cyclobuténiques protégés in situ sous la forme de dérivés acétals stables. La triple cascade réactionnelle a permis l’accès à de nouveaux oxétanes tricycliques angulaires par le biais d’une réaction de Paternò-Büchi intramoléculaire à partir des aldéhydes cyclobuténiques précédemment cités. La généralisation de ces deux processus domino a été étudiée à partir d’un panel de cyclopent-2-énones et de trois partenaires alcènes représentatifs. La formation de certains des composés obtenus a pu être expliqué par à une réaction supplémentaire de type SN’. Une étude préliminaire de cette transformation non-attendue a été réalisée. / Photochemical transformations are powerful tools for the creation of molecular diversity from simple and readily available starting materials; they employ the simplest of reagents, a photon. Photochemical [2+2] cycloaddition reactions of α,β-unsaturated carbonyl or carboxyl compounds with olefins are one of the most widely applied photochemical reactions in organic synthesis. The cyclobutane photoadducts have been used ubiquitously in multi-step syntheses of a wide array of natural products or related derivatives, and they have also been used as intermediates in other synthetic procedures which exploit their strained molecular skeletons and their resulting intrinsic chemical reactivity.In the first part of this thesis, we focused on a photochemical approach for the synthesis of ring-substituted cyclobutane β-amino acids. Our objective was to establish a robust, large-scale and efficient synthesis of cis- and trans-2-aminocyclobutane-1-carboxylic acids (cis- and trans-ACBC) diversely substituted at the 3- or 4-positions. The cyclobutane ring was constructed using a photochemical [2+2] cycloaddition reaction between tert-butyl vinyl ether and either maleimide or maleic anhydride. The amine and carboxylic acid functions were subsequently installed through consecutive or one-pot protocols including a Hofmann rearrangement. The protected racemates of 3- and 4-cis-syn-hydroxy-ACBCs obtained in this way were resolved using a chiral oxazolidinone auxiliary to provide a large scale access to enantiomerically pure samples of the target β-amino acids in either free or orthogonally protected form. A controlled cis-to-trans epimerization procedure from cis-syn-3-hydroxy-ACBC substrates permitted facile access to target trans-syn-3-hydroxy-ACBCs. Finally, diversely substituted 3-ACBCs with cis-anti or trans-anti relative configurations were synthesized using Mitsunobu or other SN2-type reactions, starting from corresponding cis-syn- or trans-syn-3-hydroxy-ACBC derivatives.In the second part of the thesis, we investigated photochemical tandem and cascade processes which began with a photochemical [2+2] cycloaddition reaction. In collaboration with a post-doctoral researcher, we reacted cyclopent-2-enones and alkenes to afford libraries of cyclobutene acetals and polycyclic oxetanes, in a controlled manner, via tandem and triple cascade photoreactions. The tandem process consisted of a photochemical [2+2] cycloaddition followed by Norrish I/γ-H transfer which led to cyclobutene aldehydes; these reactive photoadducts were trapped in situ as stable acetal derivatives. The triple cascade process provided access to unprecedented angular tricyclic oxetanes via an intramolecular Paternò-Büchi reaction of the above-mentioned cyclobutane aldehydes. The scope of these two domino processes was investigated using panels of 2- and 4-substituted cyclopent-2-enones and three representative alkene partners. The formation of some of the compounds obtained during this study was attributed to an additional SN’ reaction. Preliminary investigations on this unexpected transformation were performed.

L'homéostasie cellulaire implique une régulation fine de la production ainsi que de l'élimination des protéines. La dérégulation de cette homéostasie entraîne des effets néfastes touchant de nombreuses voies de signalisation et de métabolisme et pouvant conduire à diverses maladies telles que le cancer ou la neurodégénérescence. De ce fait, la dégradation des protéines est un processus hautement contrôlé effectué par le système ubiquitine-protéasome (UPS) qui permet le ciblage, l’étiquetage et la dégradation des protéines mal repliées, endommagées ou en fin de vie. Le protéasome est un complexe multiprotéique vital présent dans toutes les cellules eucaryotes dont la biogenèse, la fonction de dégradation et la régulation dans le cytoplasme sont bien connues. Cependant, la fonction du protéasome dans le noyau, notamment en réponse au stress, est encore peu comprise. Les cellules ont développé de nombreux mécanismes adaptatifs en réponse à la variation de l'apport en nutriments comme l’augmentation de la dégradation et le recyclage des protéines. Chez l’humain, le protéasome est dégradé dans le cytoplasme par autophagie lors d’une privation de nutriments mais les mécanismes de régulation du protéasome nucléaire en réponse au stress métabolique restent peu connus. Nous avons trouvé que le protéasome 26S et la sous-unité régulatrice PSME3 forment des foyers nucléaires dans différents types cellulaires de mammifère en réponse à une privation en nutriments. Les foyers, nommés SIPAN pour Starvation-Induced Proteasome Assemblies in the Nucleus, ne sont colocalisés avec aucune structure ou corps nucléaires connus. La formation des SIPAN est réversible lors d’une réintégration des nutriments, suggérant une réponse spécifique liée à un stress métabolique. La manipulation de la quantité d’acides aminés intracellulaire a révélé que les acides aminés non-essentiels jouent un rôle important dans la formation et la résolution des SIPAN. Une analyse métabolomique a permis de trouver des voies reliées au métabolisme des nucléotides et des acides aminés qui pourraient fournir des facteurs clés pour la dissipation des foyers du protéasome. Le fort dynamisme des SIPAN, la présence d’événements de fusion et leur instabilité vis-à-vis des conditions cellulaires suggèrent que les SIPAN résultent d’une séparation de phase liquide-liquide (LLPS). De plus, nous avons trouvé que l’ubiquitine conjuguée est présente dans les SIPAN et que l’ubiquitination et la déubiquitination semblent être impliquées dans la formation et la résolution, respectivement. Nous avons ensuite découvert que la perte du récepteur à l’ubiquitine RAD23B empêche la formation des SIPAN. En effet, les domaines de liaison au protéasome UBL et de liaison à l’ubiquitine UBA1/UBA2 sont nécessaires pour la formation des SIPAN. De manière intéressante, la perte de RAD23B ou du complexe régulateur PSME3 retarde l’induction de l’apoptose et promeut la survie cellulaire. Enfin, en utilisant un inducteur de l’apoptose, nous avons observé l’apparition de ces foyers du protéasome dans le noyau des cellules dont certaines caractéristiques sont similaires aux SIPAN. Notre étude aborde une question très importante dans la compréhension des rôles et du dynamisme du protéasome nucléaire, en particulier dans l'adaptation au stress, qui peut réguler le niveau des protéines nucléaires. De façon générale, cela nous aidera à mieux comprendre le rôle du protéasome dans l’homéostasie nucléaire et son implication dans les maladies humaines. / Cellular homeostasis involves specific regulation of the production as well as the elimination of proteins. The deregulation of this equilibrium leads to harmful effects affecting many signaling and metabolic pathways and can lead to various diseases, such as cancer or neurodegeneration. Hence, protein degradation is a highly controlled process performed by the ubiquitin-proteasome system (UPS) that allows targeting, labeling and degradation of misfolded, damaged, or end-of-life proteins. The proteasome is a vital multiprotein complex found in all eukaryotic cells whose biogenesis, degradative function, and regulation in the cytoplasm are well known. However, the function of the proteasome in the nucleus, particularly in response to stress, is still poorly understood. Cells have evolved many adaptive mechanisms in response to varying nutrient supply such as increased protein degradation and recycling. In humans, the proteasome is degraded in the cytoplasm by autophagy during nutrient deprivation, but the regulatory mechanisms of the nuclear proteasome in response to metabolic stress remain poorly understood. We have found that the 26S proteasome and regulatory subunit PSME3 form nuclear foci in different mammalian cell types in response to nutrient deprivation. These foci, called SIPAN for Starvation-Induced Proteasome Assemblies in the Nucleus, do not colocalize with any known nuclear structures or bodies. The formation of SIPAN is reversible upon nutrient replenishment, suggesting a specific response to metabolic stress. Manipulation of the intracellular amino acid pool revealed that non-essential amino acids play important roles in the formation and resolution of SIPAN. A metabolomics study has identified pathways related to nucleotide and amino acid metabolism that may provide key factors for the dissipation of the proteasome foci. The strong dynamism of SIPAN, the presence of fusion events and their instability towards cellular conditions suggest that SIPAN result from liquid-liquid phase separation (LLPS). Additionally, we have found that conjugated ubiquitin is present in SIPAN and that ubiquitination and deubiquitination appear to be involved in their formation and resolution, respectively. We then discovered that the depletion of the ubiquitin receptor RAD23B prevents the formation of SIPAN. Indeed, the UBL proteasome binding domain and UBA1/UBA2 ubiquitin binding domains are required for SIPAN formation. Interestingly, the depletion of RAD23B or the proteasome regulatory particle PSME3 delays the induction of apoptosis and promotes cell survival. Finally, we found that an apoptosis-inducing agent promotes proteasome foci formation in the nucleus of cells, and these organelles share similarities with SIPAN. Our study addresses a very important question in understanding the roles and dynamism of the proteasome in the nucleus, specifically during stress adaptation, which can regulate the level of nuclear proteins. In general, this will help us to better understand the role of the proteasome in nuclear homeostasis and its involvement in human diseases.

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