Thesis (Ph.D.)--University of Alabama at Birmingham, 2007. / Title from first page of PDF file (viewed on June 25, 2009). Includes bibliographical references.

Thesis (Ph.D.) -- University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2005. / Embargoed. Vita. Bibliography: 99-113.

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is one of many bacterial and viral pathogens that can exploit the eukaryotic actin cytoskeleton for its own purposes. EPEC injects its own receptor, Tir, into the host cell plasma membrane where, upon binding the bacterial adhesin, intimin, can trigger actin assembly beneath bound bacteria resulting in characteristic actin "pedestals". The formation of these lesions is thought to be critical for bacterial colonization; and can also provide insight into actin dynamics of mammalian cells. EPEC Tir stimulates multiple signaling pathways converging on a central actin nucleation promoting factor, N-WASP. The best-characterized pathway of actin pedestal formation also involves the eukaroytic adaptor protein, Nck, but at least two Nck-independent signaling cascades have also been identified. Multiple aspects of Tir-mediated signaling cascades remain unclear. For example, although Nck can directly bind and activate N-WASP, current models of Tir-mediated, Nck-dependent actin signaling postulate an indirect interaction between Nck and N-WASP mediated by one or more unidentified host factors. Additionally, the relationship of this pathway to the Nck-independent pathways is unknown. To better understand Tir-mediated actin assembly, a detailed and quantitative analysis of the domain requirements of Nck and N-WASP for pedestal formation was conducted. The results indicate that, contrary to previously favored models, Nck is unlikely to require additional host factors to bind N-WASP during pedestal formation, but apparently directly stimulates this nucleation promoting factor. In addition, the results show that the Nck-dependent and -independent pathways target distinct regulatory domains of N-WASP.

Toxoplasma gondii, l'agent causal de la toxoplasmose appartient au phylum des Apicomplexes. Comme son nom l'indique, le parasite possède un complexe unique d'organites sécrétoires apicaux, les micronèmes, rhoptries et le conoïde, qui jouent un rôle essentiel dans l’invasion de la cellule hôte et la survie du parasite. T. gondii est devenu un modèle populaire de biologie cellulaire et aussi un outil de référence pour l'étude de l’organisation ultra-structurale et des différentes fonctions des autres parasites du phylum Apicomplexa tel que Plasmodium, l’agent causal de la malaria. Cette thèse porte sur deux facteurs essentiels à la survie du parasite : le complexe adapteur de la clathrine AP1 et la petite GTPase Rab11A qui jouent un rôle crucial dans la régulation de certaines voies du trafic intracellulaire de T. gondii. Ainsi, nos travaux ont permis de démontrer un rôle pour AP1 dans le triage différentiel et le transport vésiculaire des protéines MIC et ROP depuis le Trans-Golgi-Network (TGN) et les compartiments endosomaux, respectivement. D’autre part, nos résultats ont révélé un rôle original de AP1 dans la division parasitaire aux stages tardifs de la cytokinèse. Nous avons également identifié un partenaire de AP1, la protéine unique de T. gondii possédant un domaine ENTH : EpsL (pour Espin-Like Protein). Dans les autres Eucaryotes, les protéines epsines sont connues pour activer la formation des vésicules à clathrine en co-opération avec les complexes AP1 et AP2. Nos résultats ont effectivement démontré un rôle de EpsL, similaire à AP1, pour la biogénèse des rhoptries et micronèmes. Nous avons, dans un deuxième temps, examiné les différentes fonctions de la petite GTPase Rab11A. Notre étude par vidéo-microscopie, semble indiquer que Rab11A régule le transport de vésicules depuis le TGN vers la périphérie cellulaire et en particulier, les pôles basal et apical du parasite. Après sur-production de la forme mutée inactive de Rab11A, nous avons démontré un nouveau rôle de la protéine dans la sécrétion des protéines membranaires de surface et dans l'exocytose des granules denses, lors de l'invasion de la cellule hôte mais aussi durant la réplication parasitaire. Finalement, des expériences de pull-down ont permis d’identifier un partenaire intéressant liant Rab11A seulement sous sa forme activée, la protéine unique de T. gondii contenant un domaine HOOK (TgHOOK), que nous avons caractérisée au niveau fonctionnel. Nos résultats suggèrent que TgHOOK régule le transport des vésicules positives pour Rab11A d’une manière dépendante des microtubules. Par conséquent, cette dernière étude a permis de révéler de nouveaux aspects encore inexplorés, bien qu’essentiels, des mécanismes régulant la sécrétion de molécules à la surface parasitaire. / Toxoplasma gondii, the causative agent for the disease Toxoplasmosis belongs to the phylum Apicomplexa. As the name implies, the parasite possesses a unique complex of apical secretory organelles namely the micronemes, rhoptries and conoid, which favor host cell invasion and intracellular survival. T.gondii has become a popular cell biology model and also a reference tool for studying the structure and functions of other important parasites that belong to the same phylum, such as plasmodium, but also higher eukaryotes. The recent advances in dissecting protein trafficking pathways have led to a better understanding of the biogenesis of apical organelles and also to the identification of crucial protein molecules that could determine the fate of the parasite. This thesis focuses on two different molecules, the Clathrin Adaptor complex AP1 and the small GTPase Rab11A that play a crucial role in distinct trafficking pathways of the parasite contributing to a wide range of functions. First, we reveal a role of AP1 in the differential sorting of microneme and rhoptry proteins at the Tran-Golgi-Network and endosomal level, respectively. Accordingly, depletion of AP1 leads to a defect in apical organelle biogenesis. In addition, we reveal an original role of AP1 in parasite division by regulating late stages of cytokinesis. We also identified and studied a partner of AP1, the unique ENTH domain containing protein of the parasite, EpsL (for Espin-like protein). In other Eukaryotes, epsin proteins are well known regulators of clathrin-mediated vesicular budding in co-operation with AP1 and AP2. We demonstrated that EpsL shares similar functions to AP1 in regulating rhoptry and microneme formation. We next worked on the small GTPase Rab11A and defined the dynamics of the protein within the parasite by live imaging. In addition to its known role in cytokinesis, we unravelled a novel function for the molecule in the secretion of surface membrane proteins and the exocytosis of dense granules during both, parasite invasion and replication. Further, pull down experiments on active Rab11A helped us fish an interesting partner molecule, the unique HOOK-domain containing protein that we functionally characterized for the first time in T.gondii. Our data suggest a role of Rab11A in microtubule-dependent transport of vesicules in a HOOK-regulated manner. Therefore, our study provides novel molecular insights into a yet unexplored but essential aspect of constitutive secretion in the parasite.

La protéine Nef des virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1 et VIH-2) joue un rôle essentiel dans la physiopathologie de l’infection et induction du SIDA. La capacité de Nef à perturber le trafic intracellulaire de protéines membranaires, et notamment du récepteur CD4, circulant entre les compartiments de la voie d’endocytose pourrait rendre compte de son importance comme facteur de virulence au cours de l’infection naturelle. Les mécanismes responsables des perturbations de la voie d’endocytose induites par Nef au cours de l’infection ne sont pas totalement élucidés, mais il est admis qu’elles résultent d’interactions avec les complexes adaptateurs (AP) associés à la clathrine et participant au transport vésiculaire entre les différents compartiments de la voie d’endocytose. Notre objectif était de déterminer les mécanismes par lesquels Nef influe positivement sur le pouvoir infectieux du VIH-1 en interagissant avec la machinerie cellulaire de la voie d’endocytose. Notre programme s’est organisé autour de deux axes principaux: le premier a consisté à étudier l’implication respective des différents types de complexes AP (AP-1, -2 et -3) sur les perturbations du fonctionnement de la voie d’endocytose induites par Nef en analysant son impact sur le niveau d’expression de surface de CD4; le deuxième axe a consisté à évaluer l’impact de l’interaction de Nef avec les complexes AP sur les capacités infectieuses des particules virales. Le rôle respectif des différents complexes AP dans ces fonctions de Nef a donc été étudié après déplétion de l’expression des complexes AP-1, AP-2 et AP-3 par une approche d’ARN interférence. Les résultats obtenus montrent que contrairement à certaines données de la littérature, la déplétion des complexes AP de la voie d’endocytose ne semble pas avoir un impact majeur sur la capacité de Nef à moduler l’expression de surface de CD4, même si une légère diminution de l’activité de Nef a pu être révélée dans notre étude réalisée sur des cellules HeLa-CD4 transduites par les shRNA ciblant les complexes AP-2. Inversement, nos résultats confirment que la déplétion des complexes AP-1, AP-2 et AP-3 dans les cellules productrices des particules virales se traduit par une diminution importante des propriétés infectieuses de ces particules sur lesquelles l’impact positif de Nef n’est plus alors capable de se manifester. En conclusion, ce travail a donc permis de montrer que les complexes AP de la voie d’endocytose sont indispensables pour que Nef puisse exercer son rôle positif sur le pouvoir infectieux du VIH-1. Il est maintenant important de confirmer ces résultats en analysant le rôle fonctionnel des complexes AP sur les activités de Nef dans les cibles cellulaires naturelles du VIH-1, lymphocytes et macrophages. / Nef protein of human immunodeficiency virus (HIV-1 and HIV-2) plays an essential role in the pathophysiology of infection and induction of AIDS. The ability of Nef to disrupt intracellular trafficking of membrane proteins, including the CD4 receptor, moving between the compartments of the endocytic pathway could account for its importance as a virulence factor during natural infection. The mechanisms responsible for disruption of the endocytic pathway induced by Nef during infection are not fully understood, but it is accepted that they arise from interactions with adaptor complexes (AP) associated with clathrin and participant in vesicular transport between the different compartments of the endocytic pathway. Our objective was to determine the mechanisms by which Nef positively affects the infectivity of HIV-1 by interacting with the cellular machinery of the endocytic pathway. Our program has been organized around two main axes: the first was to investigate the respective involvement of different types of complexes (AP-1, -2 and -3) on the Nef induced disruption of the endocytic pathway by analyzing its impact on the level of surface expression of CD4; the second axis was to evaluate the impact of the interaction of Nef with AP complexes on the infectious capacity of the viral particles. The respective roles of the different AP complexes in these functions of Nef has been studied after depletion of the expression of complex AP-1, AP-2 and AP-3 by RNA interference approach. The results show that, contrary to some literature data, depletion of AP complex endocytic pathway does not appear to have a major impact on the ability of Nef to modulate the surface expression of CD4, although a slight decreased activity of Nef could be revealed in our study on HeLa-CD4 cells transduced with the shRNA targeting complex AP-2. Conversely, our results confirm that the depletion of complex AP-1, AP-2 and AP-3 in the cells producing viral particles resulted in a significant decrease in infectious properties of these particles on which the positive impact of Nef is no longer able to manifest. In conclusion, this work has shown that complex AP of endocytic pathway are essential for Nef to exercise its positive role in the infectivity of HIV-1. It is now important to confirm these findings by analyzing the functional role of AP complexes on the activities of Nef in the natural cellular targets of HIV-1, lymphocytes and macrophages.

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