A hipertensão arterial é um problema de saúde pública no Brasil, pois aproximadamente 20 % da população adulta desenvolve hipertensão essencial, cujas causas ainda não são conhecidas. No entanto, sua gênese pode estar relacionada com disfunção nas áreas do sistema nervoso central (SNC) que regulam o sistema cardiovascular. O núcleo do trato solitário (NTS) e o bulbo ventrolateral são áreas importantes no controle neural da pressão arterial. Os receptores de adenosina A2a (rA2a) são encontrados em todo o SNC e estão relacionados com estudos terapêuticos de diversas doenças. No NTS a estimulação dos rA2a provoca ajustes pontuais em outros sistemas de neurotransmissão, além de diminuir a pressão arterial. A nicotina é uma molécula com uma vasta faixa de efeitos modulatórios em nosso organismo. Entre esses efeitos se destacam a capacidade de interagir com diversos sistemas de neurotransmissão nas áreas do bulbo relacionadas com a regulação da pressão arterial e de antecipar e/ou intensificar o desenvolvimento da hipertensão em sujeitos com pré-disposição genética. Desta forma, o objetivo do presente trabalho é avaliar o efeito modulatório da nicotina sobre o rA2a em cultura mista de neurônios e células gliais da porção dorso-medial do bulbo de ratos geneticamente hipertenso (SHR) e normotensos (WKY). Para isso, utilizaram-se técnicas como a de PCR em tempo real, Western Blotting e análise de ligação do receptor. Nossos resultados demonstraram que: 1) em condição basal células de ratos normotensos apresentam maior ligação do rA2a do que células de ratos hipertensos; 2) tratamento com nicotina resultou na diminuição da ligação do receptor em ambas as cepas, com um efeito de maior magnitude em células de ratos WKY; 3) nas duas linhagens o tratamento com nicotina alterou os níveis protéicos do rA2a, assim como o RNAm do receptor; 4) a linhagem e o tratamento separadamente, como a interação entre ambos influenciaram na expressão do RNAm , níveis protéicos e ligação do rA2a nas células dos ratos WKY e SHR. Por fim, os resultados apresentados aqui indicam que o rA2a em células de ratos hipertensos tem sua função deprimida em comparação com as células de ratos normotensos; e que a nicotina foi capaz de modular o funcionamento do rA2a, o qual pode influenciar no controle da pressão arterial. Esses dados são bastante interessantes, pois abrem novas perspectivas de análise dos mecanismos intracelulares envolvidos na modulação dos rA2a pela nicotina, assim como a importância desse sistema no desenvolvimento da hipertensão / Hypertension is one of the most common worldwide diseases afflicting humans. Because of the associated with morbidity and mortality and the cost to the society, it became an important public health challenge in Brazil. The mechanisms involved in development of hypertension still remain unclear However, hypertension can result from neuronal network imbalance in areas of the central nervous system that control blood pressure. The nucleus tractus solitarius (NTS) plays an important role in cardiovascular control. Within the NTS there are several neurotransmitters and neuromodulatory substances, such as adenosine, which acts on purinoreceptors A2a (A2ar). The A2ar modulates neurotransmission in the NTS and its activation may induce decrease in blood pressure by different mechanisms. Nicotine is a molecule that cross the blood-brain barrier and acts in several areas of central nervous system including the NTS. In this nucleus, nicotine is able to interact with some neurotransmitter systems and contributes for the development of hypertension in subjects with genetic predisposition to this disease. The goal of this study was to analyze the modulatory effects of nicotine on A2ar in cultured neurons and glial cells from medulla oblongata of normotensive (WKY) and spontaneously hypertensive rats (SHR). By means of real time PCR, Western Blotting and binding receptor assay. We have demonstrated that in basal condition cells of WKY presents increased binding of A2ar than the cells of SHR. Nicotine treatment induced a decrease in the binding of A2ar in both strains, however, this response was more pronounced in cells of WKY than SHR. Changes in mRNA and protein levels of A2ar was also observed in response to nicotine treatment. The strains and treatment separately, as well as the interaction between them influenced mRNA expression, protein level and binding of A2ar in NTS cells of WKY and SHR rats. Finally, these results show for the first time changes in A2ar mRNA expression, protein level and binding in cells from the medulla oblongata of WKY and SHR rats, as well as, the nicotine modulation upon this system, which might influence cardiovascular control. These data open up new approaches for the study of intracellular mechanisms involved in the modulation of adenosine A2a receptor by nicotine, as well as the importance of this interaction in the development of hypertension.

A hipertensão arterial é um problema de saúde pública no Brasil, pois aproximadamente 20 % da população adulta desenvolve hipertensão essencial, cujas causas ainda não são conhecidas. No entanto, sua gênese pode estar relacionada com disfunção nas áreas do sistema nervoso central (SNC) que regulam o sistema cardiovascular. O núcleo do trato solitário (NTS) e o bulbo ventrolateral são áreas importantes no controle neural da pressão arterial. Os receptores de adenosina A2a (rA2a) são encontrados em todo o SNC e estão relacionados com estudos terapêuticos de diversas doenças. No NTS a estimulação dos rA2a provoca ajustes pontuais em outros sistemas de neurotransmissão, além de diminuir a pressão arterial. A nicotina é uma molécula com uma vasta faixa de efeitos modulatórios em nosso organismo. Entre esses efeitos se destacam a capacidade de interagir com diversos sistemas de neurotransmissão nas áreas do bulbo relacionadas com a regulação da pressão arterial e de antecipar e/ou intensificar o desenvolvimento da hipertensão em sujeitos com pré-disposição genética. Desta forma, o objetivo do presente trabalho é avaliar o efeito modulatório da nicotina sobre o rA2a em cultura mista de neurônios e células gliais da porção dorso-medial do bulbo de ratos geneticamente hipertenso (SHR) e normotensos (WKY). Para isso, utilizaram-se técnicas como a de PCR em tempo real, Western Blotting e análise de ligação do receptor. Nossos resultados demonstraram que: 1) em condição basal células de ratos normotensos apresentam maior ligação do rA2a do que células de ratos hipertensos; 2) tratamento com nicotina resultou na diminuição da ligação do receptor em ambas as cepas, com um efeito de maior magnitude em células de ratos WKY; 3) nas duas linhagens o tratamento com nicotina alterou os níveis protéicos do rA2a, assim como o RNAm do receptor; 4) a linhagem e o tratamento separadamente, como a interação entre ambos influenciaram na expressão do RNAm , níveis protéicos e ligação do rA2a nas células dos ratos WKY e SHR. Por fim, os resultados apresentados aqui indicam que o rA2a em células de ratos hipertensos tem sua função deprimida em comparação com as células de ratos normotensos; e que a nicotina foi capaz de modular o funcionamento do rA2a, o qual pode influenciar no controle da pressão arterial. Esses dados são bastante interessantes, pois abrem novas perspectivas de análise dos mecanismos intracelulares envolvidos na modulação dos rA2a pela nicotina, assim como a importância desse sistema no desenvolvimento da hipertensão / Hypertension is one of the most common worldwide diseases afflicting humans. Because of the associated with morbidity and mortality and the cost to the society, it became an important public health challenge in Brazil. The mechanisms involved in development of hypertension still remain unclear However, hypertension can result from neuronal network imbalance in areas of the central nervous system that control blood pressure. The nucleus tractus solitarius (NTS) plays an important role in cardiovascular control. Within the NTS there are several neurotransmitters and neuromodulatory substances, such as adenosine, which acts on purinoreceptors A2a (A2ar). The A2ar modulates neurotransmission in the NTS and its activation may induce decrease in blood pressure by different mechanisms. Nicotine is a molecule that cross the blood-brain barrier and acts in several areas of central nervous system including the NTS. In this nucleus, nicotine is able to interact with some neurotransmitter systems and contributes for the development of hypertension in subjects with genetic predisposition to this disease. The goal of this study was to analyze the modulatory effects of nicotine on A2ar in cultured neurons and glial cells from medulla oblongata of normotensive (WKY) and spontaneously hypertensive rats (SHR). By means of real time PCR, Western Blotting and binding receptor assay. We have demonstrated that in basal condition cells of WKY presents increased binding of A2ar than the cells of SHR. Nicotine treatment induced a decrease in the binding of A2ar in both strains, however, this response was more pronounced in cells of WKY than SHR. Changes in mRNA and protein levels of A2ar was also observed in response to nicotine treatment. The strains and treatment separately, as well as the interaction between them influenced mRNA expression, protein level and binding of A2ar in NTS cells of WKY and SHR rats. Finally, these results show for the first time changes in A2ar mRNA expression, protein level and binding in cells from the medulla oblongata of WKY and SHR rats, as well as, the nicotine modulation upon this system, which might influence cardiovascular control. These data open up new approaches for the study of intracellular mechanisms involved in the modulation of adenosine A2a receptor by nicotine, as well as the importance of this interaction in the development of hypertension.

Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2008. / In title: [A] is subscript upper case A; [B] is subscript upper case B. Includes bibliographical references. Also available online through Digital Dissertations.

A transmissão sináptica é essencial para o funcionamento do sistema nervoso. A neuromodulação permite regular esse processo de forma precisa. Um desses mecanismos modulatórios é a regulação da liberação de neurotransmissores. A adenosina é um importante modulador da transmissão sináptica. Além disso, a ativação do subtipo A2a dos receptores para adenosina está envolvida com a facilitação da liberação de neurotransmissores no sistema nervoso central. O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos modulatórios da ativação do receptor A2a de adenosina sobre a liberação de neurotransmissores e sua via de sinalização intracelular em modelo in vitro. Além disso, a tese contempla a construção histórica dos conceitos abordados no trabalho permitindo uma visão clara de sua evolução. Esse projeto foi o pioneiro no Brasil a utilizar o sensor biossintético fluorescente de liberação de vesículas sinápticas (supereclipse sinapto-pHluorina), o qual foi gentilmente cedido pelo professor Gero Miensenboeck do Sloan-Kettering Institute for Cancer Research. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com o agonista do receptor A A2a de adenosina aumentou a fluorescência do supereclipse sinapto-pHluorina, assim como os níveis de glutamato e noradrenalina. Além disso, foi demonstrado que o inibidor da proteína cinase dependente de AMPc aboliu o aumento nos níveis do glutamato e noradrenalina, tal como a fosforilação da proteína sináptica sinapsina I evocado pelo agonista do receptor A2a de adenosina. Desta forma, nossos dados sugerem que a ativação do receptor A2a de adenosina em cultura de células do bulbo de ratos Wistar modula a liberação de neurotransmissores e a fosforilação da sinapsina I, assim como a proteína cinase dependente do AMPc pode ser o modus operandi desse fenômeno modulatório / Synaptic transmission is a sine qua non process for nervous system physiology. Such precise process is accomplished in part due to modulation of neurotransmitter release. Adenosine is a putative synaptic transmission modulator. Moreover, adenosine A2a receptor facilitates neurotransmitter release in the Central Nervous System. The present study focuses on the modulation of neurotransmission by adenosine A2a receptor and its intracellular signaling pathway in in vitro model. Here, we provided evidence that adenosine A2a receptor agonist increases an optical biosynthetic sensor of synaptic vesicle release (supereclipct synapto-pHluorin), as well as glutamate and noradrenaline. Furthermore, it was demonstrated that cAMP-dependent protein kinase inhibitor abolished glutamate and norepinephrin increase, as well as synapsin I phosphorylation evoked by adenosine A2a receptor agonist. Therefore, our data suggest that adenosine A2a receptor activation modulates neurotransmitter release and synapsin I phosphorylation in cultured cells from medulla oblongata of Wistar rats, as well as cAMP-dependent protein kinase might be the modus operandi of this modulatory phenomenon

A transmissão sináptica é essencial para o funcionamento do sistema nervoso. A neuromodulação permite regular esse processo de forma precisa. Um desses mecanismos modulatórios é a regulação da liberação de neurotransmissores. A adenosina é um importante modulador da transmissão sináptica. Além disso, a ativação do subtipo A2a dos receptores para adenosina está envolvida com a facilitação da liberação de neurotransmissores no sistema nervoso central. O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos modulatórios da ativação do receptor A2a de adenosina sobre a liberação de neurotransmissores e sua via de sinalização intracelular em modelo in vitro. Além disso, a tese contempla a construção histórica dos conceitos abordados no trabalho permitindo uma visão clara de sua evolução. Esse projeto foi o pioneiro no Brasil a utilizar o sensor biossintético fluorescente de liberação de vesículas sinápticas (supereclipse sinapto-pHluorina), o qual foi gentilmente cedido pelo professor Gero Miensenboeck do Sloan-Kettering Institute for Cancer Research. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com o agonista do receptor A A2a de adenosina aumentou a fluorescência do supereclipse sinapto-pHluorina, assim como os níveis de glutamato e noradrenalina. Além disso, foi demonstrado que o inibidor da proteína cinase dependente de AMPc aboliu o aumento nos níveis do glutamato e noradrenalina, tal como a fosforilação da proteína sináptica sinapsina I evocado pelo agonista do receptor A2a de adenosina. Desta forma, nossos dados sugerem que a ativação do receptor A2a de adenosina em cultura de células do bulbo de ratos Wistar modula a liberação de neurotransmissores e a fosforilação da sinapsina I, assim como a proteína cinase dependente do AMPc pode ser o modus operandi desse fenômeno modulatório / Synaptic transmission is a sine qua non process for nervous system physiology. Such precise process is accomplished in part due to modulation of neurotransmitter release. Adenosine is a putative synaptic transmission modulator. Moreover, adenosine A2a receptor facilitates neurotransmitter release in the Central Nervous System. The present study focuses on the modulation of neurotransmission by adenosine A2a receptor and its intracellular signaling pathway in in vitro model. Here, we provided evidence that adenosine A2a receptor agonist increases an optical biosynthetic sensor of synaptic vesicle release (supereclipct synapto-pHluorin), as well as glutamate and noradrenaline. Furthermore, it was demonstrated that cAMP-dependent protein kinase inhibitor abolished glutamate and norepinephrin increase, as well as synapsin I phosphorylation evoked by adenosine A2a receptor agonist. Therefore, our data suggest that adenosine A2a receptor activation modulates neurotransmitter release and synapsin I phosphorylation in cultured cells from medulla oblongata of Wistar rats, as well as cAMP-dependent protein kinase might be the modus operandi of this modulatory phenomenon

La maladie d’Alzheimer (MA) est la maladie neurodégénérative touchant le plus de personnes dans le monde. Jusqu’à présent, aucun traitement curatif n’existe pour soigner cette maladie, d’où la nécessité d’identifier et d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques.La découverte des effets bénéfiques de la caféine, antagoniste du récepteur à adénosine A2A (A2AR), conjuguée à une surexpression de ce dernier chez les patients atteints de la MA, font de ce récepteur une cible d’intérêt. En effet, des antagonistes des A2ARs ont montré leur capacité à améliorer les performances cognitives de par une diminution de la charge amyloïde associée à une diminution la phosphorylation de la protéine Tau.Bien que plusieurs antagonistes aient été développés pour le traitement de maladies neurodégénératives, ceux-ci présentent un manque d’efficacité corrélée à de faibles propriétés pharmacocinétiques. Ainsi, à partir d’études de modélisation moléculaire, deux nouvelles familles d’antagonistes présentant un noyau central benzoxazole ou quinazoline ont été conçus, synthétisés et évalués pharmacologiquement. Trois composés ont été sélectionnés et font actuellement l’objet d’études pharmacologiques complémentaires sur modèles animaux. / Alzheimer’s disease (AD) is the most prevalent form of dementia in the aged population. So far, there is no way to halt or slow-down AD. Therefore, there is a constant need of developing novel therapeutic strategies.In recent years, adenosine A2A receptor (A2AR) has attracted a growing interest since it has been proved that this receptor is over-expressed during AD. Also, epidemiological studies showed that people consuming regularly caffeine-based beverages over a lifetime are substantially less likely to develop this disease. Indeed, A2AR antagonists improve memory performance as it reduces β-amyloid deposits and Tau-phosphorylation.Though several antagonists have been developed for the treatment of neurodegenerative diseases, current research efforts are focus on developing new antagonists with relevant ADME properties and a better efficacy. Based on a molecular modeling-guided design, we synthesised new A2AR antagonists with benzoxazole and quinazoline as central scaffold. Three molecules were selected and will be subject to evaluation on animal’s model.

O canabidiol (CBD), o principal canabinóide não psicotrópico extraído da marijuana (Cannabis sativa), é reconhecido por sua potente propriedade imunosupressora e anti-inflamatória. A injúria pulmonar aguda (ALI) é uma doença inflamatória para qual ainda não foi desenvolvida terapias específicas e a única alternativa de tratamento é meramente de suporte em UTI. Desta forma, foi proposta uma investigação sobre os efeitos anti-inflamatórios do CBD em um modelo murino de ALI, induzida pela instilação intra-nasal de LPS (lipopolissacarídeo), dentro de uma perspectiva imune-neuro-endocrinológica. Para a análise do potencial anti-inflamatório do CBD, avaliou-se a contagem total e diferencial de células do lavado broncoalveolar (LBA) (análise da migração de leucócitos para os pulmões), a atividade de mieloperoxidase (MPO) no tecido pulmonar (análise indireta da atividade de neutrófilos), a produção de citocinas e quimicionas no sobrenadante do LBA (análise do perfil inflamatório pulmonar), a concentração de proteínas (albumina) no sobrenadante do LBA (análise indireta da permeabilidade vascular pulmonar) e a expressão de moléculas de adesão (ICAM-1 e VLA-4) em leucócitos do LBA. Analisou-se, ainda, o mecanismo farmacológico dos efeitos anti-inflamatórios do CBD no modelo de ALI, utilizando-se de um antagonista altamente seletivo para o receptor de adenosina A2A (ZM241385). Por fim, avaliou-se os efeitos neuroendócrinos do CBD na vigência da inflamação pulmonar; analisou-se a atividade geral dos animais no campo aberto (análise do comportamento doentio) e os níveis séricos de corticosterona (análise da ativação do eixo Hipotálamo-Hipófise-Adrenal (HPA)). Mostrou-se que tanto o tratamento prolifático (antes da indução da inflamação) como o tratamento terapêutico (depois da indução da inflamação), com uma dose única de CBD (20 ou 80 mg/kg) apresenta um efeito anti-inflamatório prolongado em camundongos submetidos ao modelo de ALI (principalmente 1 e 2 dias após a indução da inflamação). Mostrou-se que o CBD diminuiu a migração de leucócitos para os pulmões (neutrófilos, macrófagos e linfócitos), diminuiu a produção de citocinas (TNF e IL-6) e quimicinas (MCP-1 e MIP-2) no LBA, diminuiu a atividade MPO no tecido pulmonar, diminuiu a concentração de albumina no LBA e diminuiu a expressão de moléculas de adesão (ICAM-1) em neutrófilos do LBA. Mostrou-se, ainda, que o receptor de adenosina A2A está envolvido nos efeitos anti-inflamatórios do CBD na ALI, uma vez que o tratamento com o ZM241385 aboliu todos os efeitos anti-inflamatórios descritos previamente. Por fim, mostrou-se que o CBD apresentou poucos efeitos comportamentais no campo aberto e que não ativou o eixo HPA. Desta forma, mostrou-se pela primeira vez que o tratamento profilático e, também, o tratamento terapêutico com CBD (20 ou 80 mg/kg) tem um efeito anti-inflamatório prolongado em um modelo murino de ALI, muito provavelmente em decorrência de um aumento da sinalização via receptor de adenosina A2A. Por esta razão, acredita-se que o CBD possa ser considerado, no futuro, uma ferramenta terapêutica útil no tratamento de doenças inflamatórias pulmonares. / Cannabidiol (CBD), the major non-psychotropic plant (Cannabis sativa)-derived cannabinoid, is recognized for its immunossupressant and anti-inflammatory properties. Acute lung injury (ALI) is an inflammatory condition for which treatment is mainly supportive (ICU patients), because effective therapies have not been developed. Therefore, it was proposed an investigation in order to address the anti-inflammatory effects of CBD in a murine model of LPS-induced ALI, within an immune-neuro-endocrine perspective. To analyze the potential anti-inflammatory effect of CBD, it was evaluated total and differencial cell count of leukocytes present in the bronchoalveolar lavage (BAL) (migration of leukocytes into the lungs), myeloperoxidase activity in the lung tissue (indirect analysis of neutrophil activity), production of cytokines and chemokines in the BAL (analysis of the pulmonar inflammatory profile), protein (albumin) concentration in the BAL (indirect analysis of pulmonar vascular permeability), and expression of adhesion molecules (ICAM-1 and VLA-4) in leukocytes of the BAL. It was also analyzed the pharmacologic mechanism of the anti-inflammatory effects of CBD in the model of ALI, by using a highly selective antagonist of the adenosine A2A receptor (ZM241385). Finally, it was analyzed the neuro-endocrine effects of CBD in the context of lung inflammation; it was analyzed the general activity of the mice in the open field (analysis of sickness behavior) and the seric levels of corticosterone (activation of HPA (Hypothalamus-Hypophysis-Adrenal) axis). It was shown that both prophylactic (before the induction of inflammation) and therapeutic (after the induction of inflammation) protocols of treatment, with a sigle dose of CBD (20 or 80 mg/kg), has a long-term anti-inflammatory effect in mice submitted to the model of ALI (specially, after 1 and 2 days of the induction of inflammation). It was shown that CBD decreased leukocyte (neutrophil, macrophage, and lymphocytes) migration into the lungs, decreased cytokines (TNF and IL-6) and chemokines (MCP-1 and MIP-2) in the BAL, decreased MPO activity in the lung tissue, decreased albumin concentration in the BAL, and decreased adhesion molecule expression (ICAM-1) in neutrophils of the BAL. It was also shown that adenosine A2A receptor is involved in the anti-inflammatory effects of CBD on LPS-induced ALI, because ZM241385 abrogated all of the anti-inflammatory effects of cannabidiol previously described. Finally, it was shown that CBD has discreet behavioral effects in the open field and was not able to activate the HPA axis. Thus, it was shown for the first time that both prophylactic and also therapeutic treatment with CBD (20 or 80 mg/kg) has a long-term anti-inflammatory effect in a murine model of ALI, most likely associated with an increase in the signaling through the adenosine A2A receptor. Hence, it is possible that in the future CBD may prove useful as a therapeutical tool in the treatment of pulmonar inflammatory conditions.

O canabidiol (CBD), o principal canabinóide não psicotrópico extraído da marijuana (Cannabis sativa), é reconhecido por sua potente propriedade imunosupressora e anti-inflamatória. A injúria pulmonar aguda (ALI) é uma doença inflamatória para qual ainda não foi desenvolvida terapias específicas e a única alternativa de tratamento é meramente de suporte em UTI. Desta forma, foi proposta uma investigação sobre os efeitos anti-inflamatórios do CBD em um modelo murino de ALI, induzida pela instilação intra-nasal de LPS (lipopolissacarídeo), dentro de uma perspectiva imune-neuro-endocrinológica. Para a análise do potencial anti-inflamatório do CBD, avaliou-se a contagem total e diferencial de células do lavado broncoalveolar (LBA) (análise da migração de leucócitos para os pulmões), a atividade de mieloperoxidase (MPO) no tecido pulmonar (análise indireta da atividade de neutrófilos), a produção de citocinas e quimicionas no sobrenadante do LBA (análise do perfil inflamatório pulmonar), a concentração de proteínas (albumina) no sobrenadante do LBA (análise indireta da permeabilidade vascular pulmonar) e a expressão de moléculas de adesão (ICAM-1 e VLA-4) em leucócitos do LBA. Analisou-se, ainda, o mecanismo farmacológico dos efeitos anti-inflamatórios do CBD no modelo de ALI, utilizando-se de um antagonista altamente seletivo para o receptor de adenosina A2A (ZM241385). Por fim, avaliou-se os efeitos neuroendócrinos do CBD na vigência da inflamação pulmonar; analisou-se a atividade geral dos animais no campo aberto (análise do comportamento doentio) e os níveis séricos de corticosterona (análise da ativação do eixo Hipotálamo-Hipófise-Adrenal (HPA)). Mostrou-se que tanto o tratamento prolifático (antes da indução da inflamação) como o tratamento terapêutico (depois da indução da inflamação), com uma dose única de CBD (20 ou 80 mg/kg) apresenta um efeito anti-inflamatório prolongado em camundongos submetidos ao modelo de ALI (principalmente 1 e 2 dias após a indução da inflamação). Mostrou-se que o CBD diminuiu a migração de leucócitos para os pulmões (neutrófilos, macrófagos e linfócitos), diminuiu a produção de citocinas (TNF e IL-6) e quimicinas (MCP-1 e MIP-2) no LBA, diminuiu a atividade MPO no tecido pulmonar, diminuiu a concentração de albumina no LBA e diminuiu a expressão de moléculas de adesão (ICAM-1) em neutrófilos do LBA. Mostrou-se, ainda, que o receptor de adenosina A2A está envolvido nos efeitos anti-inflamatórios do CBD na ALI, uma vez que o tratamento com o ZM241385 aboliu todos os efeitos anti-inflamatórios descritos previamente. Por fim, mostrou-se que o CBD apresentou poucos efeitos comportamentais no campo aberto e que não ativou o eixo HPA. Desta forma, mostrou-se pela primeira vez que o tratamento profilático e, também, o tratamento terapêutico com CBD (20 ou 80 mg/kg) tem um efeito anti-inflamatório prolongado em um modelo murino de ALI, muito provavelmente em decorrência de um aumento da sinalização via receptor de adenosina A2A. Por esta razão, acredita-se que o CBD possa ser considerado, no futuro, uma ferramenta terapêutica útil no tratamento de doenças inflamatórias pulmonares. / Cannabidiol (CBD), the major non-psychotropic plant (Cannabis sativa)-derived cannabinoid, is recognized for its immunossupressant and anti-inflammatory properties. Acute lung injury (ALI) is an inflammatory condition for which treatment is mainly supportive (ICU patients), because effective therapies have not been developed. Therefore, it was proposed an investigation in order to address the anti-inflammatory effects of CBD in a murine model of LPS-induced ALI, within an immune-neuro-endocrine perspective. To analyze the potential anti-inflammatory effect of CBD, it was evaluated total and differencial cell count of leukocytes present in the bronchoalveolar lavage (BAL) (migration of leukocytes into the lungs), myeloperoxidase activity in the lung tissue (indirect analysis of neutrophil activity), production of cytokines and chemokines in the BAL (analysis of the pulmonar inflammatory profile), protein (albumin) concentration in the BAL (indirect analysis of pulmonar vascular permeability), and expression of adhesion molecules (ICAM-1 and VLA-4) in leukocytes of the BAL. It was also analyzed the pharmacologic mechanism of the anti-inflammatory effects of CBD in the model of ALI, by using a highly selective antagonist of the adenosine A2A receptor (ZM241385). Finally, it was analyzed the neuro-endocrine effects of CBD in the context of lung inflammation; it was analyzed the general activity of the mice in the open field (analysis of sickness behavior) and the seric levels of corticosterone (activation of HPA (Hypothalamus-Hypophysis-Adrenal) axis). It was shown that both prophylactic (before the induction of inflammation) and therapeutic (after the induction of inflammation) protocols of treatment, with a sigle dose of CBD (20 or 80 mg/kg), has a long-term anti-inflammatory effect in mice submitted to the model of ALI (specially, after 1 and 2 days of the induction of inflammation). It was shown that CBD decreased leukocyte (neutrophil, macrophage, and lymphocytes) migration into the lungs, decreased cytokines (TNF and IL-6) and chemokines (MCP-1 and MIP-2) in the BAL, decreased MPO activity in the lung tissue, decreased albumin concentration in the BAL, and decreased adhesion molecule expression (ICAM-1) in neutrophils of the BAL. It was also shown that adenosine A2A receptor is involved in the anti-inflammatory effects of CBD on LPS-induced ALI, because ZM241385 abrogated all of the anti-inflammatory effects of cannabidiol previously described. Finally, it was shown that CBD has discreet behavioral effects in the open field and was not able to activate the HPA axis. Thus, it was shown for the first time that both prophylactic and also therapeutic treatment with CBD (20 or 80 mg/kg) has a long-term anti-inflammatory effect in a murine model of ALI, most likely associated with an increase in the signaling through the adenosine A2A receptor. Hence, it is possible that in the future CBD may prove useful as a therapeutical tool in the treatment of pulmonar inflammatory conditions.

Les Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines membranaires chez l’Homme, et leur implication dans un grand nombre de processus physiologiques justifie pleinement l’intérêt de leur étude. Les anticorps spécifiques de ces récepteurs sont des outils polyvalents à haute valeur ajoutée, qui restent toutefois encore trop rarement disponibles, notamment en raison des difficultés techniques posées par leur génération. Ce manuscrit présente la mise au point d’une méthode d’immunisation alternative et innovante, mettant en jeu des particules virales recombinantes dérivées du Virus de la Forêt de Semliki (SFV) codant pour le récepteur d’intérêt. Appliquée au récepteur de l’adénosine A2A humain, l’immunisation permet d’engendrer la surexpression de celui-ci à la surface des cellules de l’animal infecté, et de provoquer l’apparition d’une réponse immunitaire. Cette approche permet d’une part de générer un sérum polyclonal de souris spécifique au récepteur, et ouvre donc une nouvelle voie pour l’obtention d’anticorps monoclonaux murins. Elle semble d’autre part prometteuse pour la génération de nanobodies. / G Protein Coupled Receptors (GPCRs) constitute the largest membrane protein family represented in the human genome. Their involvement in a wide number of biological processes fully supports their study. GPCR-targeting antibodies are versatile and valuable tools, which remain scarcely available, chiefly because their generation is a challenging process. This thesis presents an alternative and innovative strategy in which recombinant Semliki Forest Virus (SFV) particles coding for the receptor of interest are used as immunogens. When applied to the human version of the Adenosine A2A receptor, this method enables to cause the receptor’s overexpression at the surface of the infected animal cells, which generates an immune response. This strategy enables to raise receptor-specific mouse polyclonal serum. It opens a new path towards the generation of monoclonal mouse antibodies. Additionally, it seems to also be a promising approach to develop nanobodies.

Esse estudo foi realizado para verificar se a exposição a separações repetidas (por diferentes intervalos de tempo) de mães dos seus filhotes no período neonatal poderiam ser classificadas como indutoras de um estado do tipo deprimido em genitoras. Sessenta ratas Wistar prenhes foram divididas em 3 grupos: controle, separação por 10 minutos e separação por 3 horas. As intervenções neonatais foram realizadas nos dias 1-10 pós parto. Após o desmame as genitoras foram submetidas ao teste do nado forçado, ao teste do labirinto em cruz elevado e ao teste do odor de predador. Também foi avaliado o comportamento alimentar e os padrões de reatividade a um sabor doce e a um sabor amargo. Foi medido os níveis de ocitocina no líquido cefaloraquidiano, corticosterona plasmática e atividade hipocampal Na+, K+-ATPase, assim como a atividade das enzimas antioxidantes catalase, glutationa peroxidase, superoxido dismutase, produção de radicais livres, e a produção de óxido nítrico, além dos níveis dos receptores A2A de adenosina e D2 de dopamina no estriado dorsoventral e no hipocampo. Foi observado que somente a separação por 3 h induziu um aumento significativo no tempo de imobilidade no teste do nado forçado, o que é consistente com estudos prévios. A atividade hipocampal da Na+, K+-ATPase se mostrou diminuída no grupo separado por 10 minutos e mais significativamente diminuída nas genitoras submetidas a separação por 3 horas de seus filhotes. Adicionalmente, os níveis de ocitocina no líquido cefaloraquidiano se encontravam aumentados no grupo separado por 10 minutos, o que pode estar relacionado a um aumento no cuidado materno, induzido por esta manipulação dos filhotes, por parte das genitoras, como reportado na literatura. Uma redução nos níveis de óxido nítrico no hipocampo das genitoras separadas por 3 horas foi observado Nessas genitoras também foi verificado um aumento no comportamento de risco, uma diminuição no sentimento prazeroso frente a uma solução doce e aumento na sensibilidade a uma solução aversiva, o que é congruente a um perfil de estado do tipo deprimido. Além disso, nós verificamos uma diminuição na quantidade do receptor de dopamina D2 no estriado das mães submetidas a separação por 3 horas dos filhotes, o que poderia ser relacionado com uma diminuição no prazer (anedonia) que acontece na depressão. Conclui-se que a retirada dos filhotes das mães por longos períodos tornam essas mães mais susceptíveis ao desenvolvimento de características depressivas. / This study was carried out to ascertain whether exposure to repeated separations (different times) of mothers from their pups in the neonatal period could be classified as an induction of a depressive-like state in dams. Sixty Wistar rats were divided into 3 groups: control, brief separation and long-term separation. The neonatal interventions were done on postpartum days 1-10. After weaning, the dams were subjected to the forced swimming test, elevated plus maze and predator odor test. It was also evaluated the feeding behavior and the taste reactivity patterns to a sweet and to a bitter solution. It was mesaured cerebral spinal fluid oxytocin, plasma corticosterone, and hippocampal Na+, K+-ATPase activity, as well as the activity of the antioxidant enzymes catalase, glutathione peroxidase, superoxide dismutase, free radicals production, and the production of nitric oxide and the levels of adenosine A2A and dopamine D2 receptors in the dorsoventral striatum and hippocampus. It was observed that only the 3 h separation induced a significant increase in the immobility time of rats in the forced swimming test, which is consistent with previous studies. Hippocampal Na+, K+-ATPase activity was decreased in the brief separated group and more significantly decreased in dams subjected to 3h separation from their pups. Additionally, cerebral spinal fluid oxytocin was increased in dams of the brief separated group, which may be related to the increased handled-induced maternal care, as reported in the literature. A reduction in nitric oxide levels in the hippocampus in dams of the long separated group was also observed. It was also verify an increase in the risk-taking behavior by the 3h separated mothers. The 3h separated mother also demonstrated a diminished feeling of pleasure with a sucrose solution and a increased sensibility to a aversive solution, wich is congruent with a depressive like state profile. Furthermore, we shown a decrease in the dopamine D2 receptor quantity in the striatum of the 3 h separated mothers, wich could be related to a decrease in pleasure feeling (anhedonia) experienced in depression. It is concluded that the withdrawal of pups from their mothers for long periods make the mothers more susceptible to the development of depressive features.