Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Les autotransporteurs monomériques, appartenant au système de sécrétion de type V, correspondent à une famille importante de facteurs de virulence bactériens. Plusieurs fonctions, souvent essentielles pour le développement d’une infection ou pour le maintien et la survie des bactéries dans l’organisme hôte, ont été décrites pour cette famille de protéines. Malgré l’importance de ces protéines, notre connaissance de leur biogenèse et de leur mécanisme d’action demeure relativement limitée. L’autotransporteur AIDA-I, retrouvé chez diverses souches d’Escherichia coli, est un autotransporter multifonctionnel typique impliqué dans l’adhésion et l’invasion cellulaire ainsi que dans la formation de biofilm et d’agrégats bactériens. Les domaines extracellulaires d’autotransporteurs monomériques sont responsables de la fonctionnalité et possèdent pratiquement tous une structure caractéristique d’hélice β. Nous avons mené une étude de mutagenèse aléatoire avec AIDA-I afin de comprendre la base de la multifonctionnalité de cette protéine. Par cette approche, nous avons démontré que les domaines passagers de certains autotransporteurs possèdent une organisation modulaire, ce qui signifie qu’ils sont construits sous la forme de modules fonctionnels. Les domaines passagers d’autotransporteurs peuvent être clivés et relâchés dans le milieu extracellulaire. Toutefois, malgré la diversité des mécanismes de clivage existants, plusieurs protéines, telles qu’AIDA-I, sont clivées par un mécanisme qui demeure inconnu. En effectuant une renaturation in vitro d’AIDA-I, couplée avec une approche de mutagenèse dirigée, nous avons démontré que cette protéine se clive par un mécanisme autocatalytique qui implique deux acides aminés possédant un groupement carboxyle. Ces résultats ont permis la description d’un nouveau mécanisme de clivage pour la famille des autotransporteurs monomériques. Une des particularités d’AIDA-I est sa glycosylation par une heptosyltransférase spécifique nommée Aah. La glycosylation est un concept plutôt récent chez les bactéries et pour l’instant, très peu de protéines ont été décrites comme glycosylées chez E. coli. Nous avons démontré que Aah est le prototype pour une nouvelle famille de glycosyltransférases bactériennes retrouvées chez diverses espèces de protéobactéries. La glycosylation d’AIDA-I est une modification cytoplasmique et post-traductionnelle. De plus, Aah ne reconnaît pas une séquence primaire, mais plutôt un motif structural. Ces observations sont uniques chez les bactéries et permettent d’élargir nos connaissances sur la glycosylation chez les procaryotes. La glycosylation par Aah est essentielle pour la conformation d’AIDA-I et par conséquent pour sa capacité de permettre l’adhésion. Puisque plusieurs homologues d’Aah sont retrouvés à proximité d’autotransporteurs monomériques putatifs, cette famille de glycosyltranférases pourrait être importante, sinon essentielle, pour la biogenèse et/ou la fonction de nombreux autotransporteurs. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse apportent de nouvelles informations et permettent une meilleure compréhension de la biogenèse d’une des plus importantes familles de protéines sécrétées chez les bactéries Gram négatif. / Monomeric autotransporters, a family of proteins that use the type V secretion pathway, are important mediators of virulence for many bacterial pathogens. Many functions important for host colonization and survival have been described for these proteins. Despite the recognized importance of this family of proteins, the mechanisms that are required for the biogenesis and functionality of monomeric autotransporters still remain poorly understood. The Escherichia coli adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I) is a classical multifunctional autotransporter protein that mediates bacterial aggregation and biofilm formation, as well as adhesion and invasion of cultured epithelial cells. Extracellular domains of autotransporters are responsible for the protein function and fold into a characteristic β-helical structure. We performed a random mutagenesis of the AIDA-I passenger domain in order to identify regions involved in the various phenotypes associated with the expression of this protein. Our study suggests that the passenger domain of AIDA-I possesses a modular organization, which means that AIDA-I is built with individual functional modules. Autotransporter passenger domains can be cleaved from the β-domain and released into the extracellular milieu. However, despite the fact that diverse cleavage mechanisms have been previously described, many autotransporters, like AIDA-I, are cleaved by an unknown mechanism. By monitoring the in vitro refolding and cleavage following by site-directed mutagenesis, we showed that AIDA-I processing is an autocatalytic event that involves two acidic residues. Our results unveil a new mechanism of auto-processing in the autotransporter family. AIDA-I is one of the few glycosylated proteins found in Escherichia coli. Glycosylation is mediated by a specific heptosyltransferase encoded by the aah gene, but little is known about the role of this modification and the mechanism involved. Our findings suggest that Aah represents the prototype of a new large family of bacterial protein O-glycosyltransferases that modify various substrates recognized through a structural motif. Furthermore, we showed that glycosylation occurs in the cytoplasm by a cotranslational mechanism. These observations are unique in bacteria and represent a significant advance in our comprehension of prokaryotic glycosylation. We also showed that glycosylation is required to ensure a normal conformation of AIDA-I and, as a consequence, is necessary for its cell-binding function. The finding that other autotransporters or large adhesin-encoding genes are linked to Aah homologue-encoding genes suggests that glycosylation may be important, if not essential, for the function of these proteins, as for AIDA-I. In conclusion, the results presented in this thesis bring new information about the autotransporter family and also give new insight into the mechanisms that are important for different aspects of the biogenesis of monomeric autotransporters.

AIDA-I (adhesin involved in diffuse adherence) est une importante adhésine autotransporteur exprimée par certaines souches de Escherichia. coli impliquée dans la colonisation des porcelets sevrés causant la diarrhée post-sevrage et la maladie de l’œdème. Une précédente étude de notre laboratoire a identifié l’apolipoprotéine AI (ApoAI) du sérum porcin, la protéine structurale des lipoprotéines à haute densité, comme récepteur cellulaire putatif de AIDA-I. L’interaction entre ces deux protéines doit être caractérisée. Ici, nous montrons par ELISA que AIDA-I purifiée est capable d’interagir avec l’ApoAI humaine, mais également avec les apolipoprotéines B et E2. L’ApoAI est rencontrée sous deux formes, soit libre ou associée aux lipides. Nous montrons que la forme libre n’interagit pas avec les bactéries AIDA-I+ mais s’associe spécifiquement à l’ApoAI membranaire de cellules épithéliales HEp-2. Afin d’étudier le rôle de l’ApoAI dans l’adhésion des bactéries, nous avons infecté des cellules HEp-2 en présence d’anticorps dirigés contre l’ApoAI, mais l’adhésion des bactéries AIDA I+ n’a jamais été réduite. De plus, l’induction de l’expression de l’ApoAI par fénofibrate et GW7647 chez les cellules Caco 2 polarisée et Hep G2, n’a pas permis l’augmentation de l’adhésion cellulaire des E. coli exprimant AIDA-I. Notre étude suggère davantage que l’interaction entre AIDA-I et ApoAI n’intervient pas dans les mécanismes d’adhésion cellulaire. / The adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I) is an important autotransporter adhesin expressed by some strains of Escherichia coli and is involved in the intestinal colonisation of weaned piglets, causing the postweaning diarrhea and the edema disease. A previous study from our laboratory identified the apolipoprotein AI (ApoAI) from porcine serum, the structural protein of high density lipoproteins, as a putative receptor of AIDA-I. The interaction between these two proteins must be characterized. Here, we show that purified AIDA-I, using an ELISA assay, is able to bind the human ApoAI and the apolipoprotein B and E2. The ApoAI is found under two forms, either free or bound to lipid. We show that the free form of ApoAI does not interact with AIDA-I+ bacteria but specifically interact with membrane bound ApoAI on Hep-2 epithelial cells. To study the role of ApoAI in the adhesion of bacteria, we infected Hep-2 cells preincubated with antibodies to ApoAI. The adhesion of AIDA-I+ bacteria to the cells couldn’t be reduced. Additionally, the induction of ApoAI synthesis using fenofibrate and GW7647 on polarized Caco-2 or Hep G2 cells did not increase the adhesion of AIDA-I+ bacteria. Our study suggests that the interaction between AIDA-I and ApoAI is not involved in the cellular adhesion of the bacteria.

Les autotransporteurs monomériques représentent le système de sécrétion le plus simple et le plus utilisé chez les bactéries à Gram négatif. Les autotransporteurs monomériques sont des protéines modulaires qui contiennent toute l’information pour leur sécrétion dans leur séquence. Les phénotypes associés à l’expression d’un autotransporteur peuvent être très variés et, souvent, les autotransporteurs sont des protéines multifonctionnelles. C’est le cas notamment des autotransporteurs AIDA-I, TibA et Ag43 d’Escherichia coli qui promouvoient l’adhésion et l’invasion de cellules épithéliales, l’auto-agrégation des bactéries et la formation de biofilm. Ces trois autotransporteurs ont d’ailleurs été regroupés dans une même famille, appelée les autotransporteurs auto-associatifs (SAATs). À cause de leur fonctionnalité, les SAATs sont considérés comme étant d’importants facteurs de virulence d’Escherichia coli. Toutefois, il existe plusieurs différences entre les SAATs qui ne sont pas bien comprises, si bien que leur rôle pour les bactéries n’est toujours pas bien compris. Nous avons donc d’abord caractérisé TibA, le membre des SAATs le moins bien étudié à l’aide d’une étude structure-fonction. Nous avons observé que TibA était une protéine modulaire et que son domaine fonctionnel était composé de deux modules : un module d’auto-agrégation en N-terminal et un module d’adhésion en C-terminal. En comparant nos résultats avec ceux obtenus pour les autres SAATs, nous avons réalisé que l’organisation des trois SAATs était très variée, c’est-à-dire que les trois SAATs sont composés de modules différents. Nous avons par ailleurs observé cet arrangement en modules lorsque nous avons analysé plusieurs séquences d’aidA, suggérant qu’un mécanisme d’échange et d’acquisition de modules était à la base de l’évolution des SAATs. Sans surprise, nous avons aussi observé que la famille des SAATs ne se limitait pas à AIDA-I, TibA et Ag43 et ne se limitait pas à Escherichia coli. La comparaison a aussi révélé l’importance du phénotype d’auto-agrégation dans la fonctionnalité des SAATs. Nous avons donc entrepris une étude du mécanisme d’auto-agrégation. Nos résultats on montré que l’auto-agrégation était le résultat d’une interaction directe SAAT/SAAT et ont mis en évidence un mécanisme similaire à celui utilisé par les cadhérines eucaryotes. De plus, nous avons observé que, comme les cadhérines, les SAATs étaient impliqués dans des interactions homophiliques; un SAAT interagit donc spécifiquement avec lui-même et non avec un différent SAAT. Finalement, les SAATs font parties des quelques protéines qui sont glycosylées chez Escherichia coli. Nous avons déterminé que le rôle de la glycosylation de TibA était de stabiliser la protéine et de lui donner la flexibilité nécessaire pour moduler sa conformation et, ainsi, être pleinement fonctionnelle. Globalement, nos résultats suggèrent que les SAATs sont des molécules « cadhérines-like » qui permettent la reconnaissance de soi chez les bactéries. Une telle habilité à discriminer entre le soi et le non-soi pourrait donc être utilisée par les bactéries pour organiser les communautés bactériennes. / Autotransporters are versatile virulence factors of Gram-negative bacteria and use one of the simplest and most widespread secretion system in bacteria. The name autotransporter originate from the observation that all the information needed for the secretion of the protein is encoded in its own sequence, meaning that autotransporters do not need a specialized secretion apparatus. Many autotransporters are multifunctional proteins and can perform a large variety of functions. The self-associating autotransporters (SAATs), represented by AIDA-I, TibA and Ag43, are such multifunctional proteins and can mediate the adhesion and invasion of epithelial cells, the auto-aggregation of bacteria and the formation of biofilm. Because of these functionalities, SAATs are considered important virulence factors of Escherichia coli. However, there are many differences between the SAATs and we still do not know their exact role for the bacteria. Therefore, we have realized a structure-function study of TibA, the least studied SAAT. Our study showed that TibA is a modular protein and that the functional domain of TibA is composed of two modules: an N-terminal module responsible for auto-aggregation and a C-terminal module responsible for adhesion. Our results showed that the organization of AIDA-I, TibA and Ag43 is different and that the SAATs represent different assemblies of modules. We also observed the modular organization when we analyzed various sequence of aidA, suggesting that the SAATs have evolved by a mechanism of domain shuffling. Not surprisingly, we have found new SAATs in Escherichia coli and in other proteobacteria. Our results also highlighted the importance of auto-aggregation in the functionality of the SAATs. We therefore assessed the mechanism of SAAT-mediated auto-aggregation of bacteria. Our results showed that SAATs mediate auto-aggregation of bacteria through direct SAAT/SAAT interactions and that these interactions were reminiscent of the interactions made by cadherin molecules in eukaryotes. We further observed that the SAATs were involved in homophilic interactions, as it is the case with cadherin molecules. SAATs are part of the few proteins that are glycosylated in Escherichia coli. We therefore characterized the glycosylation of TibA and found that glycosylation of TibA stabilized the protein and allowed the protein to modulate its conformation, resulting in a fully functional protein. Taken together, our results suggest that the SAATs may be cadherin-like molecules by bacteria in order to discriminate between self and non-self. Such an ability to discriminate self from non-self is rarely evoked in bacteria, but could play a role in the organization of multicellular communities.

L’apport disproportionné aux taux de criminalité des membres des gangs de rue est, nul doute, une proposition empirique robuste. De nombreuses études ont conclu que l’association aux gangs de rue est un facteur de risque supplémentaire à celui que constitue déjà la fréquentation de pairs délinquants au nombre des meilleurs prédicteurs de la délinquance avec les antécédents criminels et les traits antisociaux de la personnalité. Pourtant, la contribution spécifique de l’association aux gangs de rue à l’explication de la délinquance est largement méconnue. Au nombre des variables les plus souvent citées pour l’expliquer figure néanmoins le concept de l’adhésion à la culture de gang qui n’a toutefois jamais été spécifiquement opérationnalisé. Le but de la thèse est d’étudier la contribution spécifique de l’adhésion d’un contrevenant à la culture des gangs de rue à l’explication de la délinquance. Plus précisément, elle a comme objectifs de définir la culture des gangs de rue, d’opérationnaliser l’adhésion à la culture des gangs de rue, d’examiner la fidélité de la mesure de l’adhésion à la culture de gang et d’étudier sa relation avec la nature, la variété et la fréquence des conduites délinquantes de contrevenants placés sous la responsabilité des centres jeunesse et des services correctionnels du Québec. Trois articles scientifiques, auxquels un chapitre régulier est joint, ont servi la démonstration de la thèse. D’abord, le premier article présente les démarches relatives au développement de la première Mesure de l’adhésion à la culture de gang, la MACg. Plus précisément, l’article présente la recension des écrits qui a permis de proposer une première définition de la culture de gang et d’opérationnaliser le concept. Il fait aussi état de la démarche de la validation de la pertinence de son contenu et des données préliminaires qui révèlent la très bonne cohérence interne de la MACg. Cette première étude est suivie de la présentation, dans le cadre d’un chapitre régulier, des résultats de l’examen de la cotation des principaux indicateurs de la culture de gang. Cette démarche constitue un complément nécessaire à l’examen de la validité apparente de la MACg. Les résultats révèlent des degrés de concordance très satisfaisants entre les observations de divers professionnels des centres jeunesse et des services correctionnels du Québec qui ont été invités à coter les indicateurs de la culture de gang à partir de deux histoires fictives d’un contrevenant mineur et d’un second d’âge adulte. Puis, le deuxième article présente les résultats d’un premier examen de la fidélité de la MACg à l’aide du modèle de Rasch de la Théorie de la réponse aux items. Ses résultats soutiennent l’unidimensionnalité de la MACg et sa capacité à distinguer des groupes d’items et de personnes le long d’un continuum de gravité d’adhésion à la culture de gang. Par contre, le fonctionnement différentiel et le mauvais ajustement de certains items sont observés, ainsi que l’inadéquation de la structure de réponses aux items (de type Likert) privilégiée lors de l’élaboration de la MACg. Une version réaménagée de cette dernière est donc proposée. Enfin, le troisième et dernier article présente les résultats de l’examen de la relation entre la délinquance et l’adhésion d’un contrevenant à la culture de gang telle que mesurée par la MACg. Les résultats soutiennent l’apport unique de l’adhésion d’un contrevenant à la culture de gang à la diversité et à la fréquence des conduites délinquantes auto-rapportées par des contrevenants placés sous la responsabilité des centres jeunesse et des services correctionnels du Québec. Le score à l’échelle originale et réaménagée de la MACg s’avère, d’ailleurs, un facteur explicatif plus puissant que l’âge, la précocité criminelle, les pairs délinquants et la psychopathie au nombre des meilleurs prédicteurs de la délinquance. L’étude met aussi en lumière l’étroite relation entre une forte adhésion à la culture de gang et la présence marquée de traits psychopathiques annonciatrice de problèmes particulièrement sérieux. Malgré ses limites, la thèse contribuera significativement aux développements des bases d’un nouveau modèle explicatif de l’influence de l’association aux gangs de rue sur les conduites des personnes. La MACg pourra aussi servir à l’évaluation des risques des hommes contrevenants placés sous la responsabilité du système de justice pénale et à l’amélioration de la qualité des interventions qui leur sont dédiées. / The disproportionate contribution of street gang members to a city's crime rate is, no doubt, a strong empirical proposition. Numerous studies have concluded that street gang association is an additional risk factor tied to the association with delinquent peers which constitutes among the best predictors of delinquency along with criminal history and antisocial personality traits. However, the specific role that street gang association plays in explaining delinquency is largely unknown. Nevertheless, among the variables most often cited to explain this is the concept of adherence to the gang culture which has however never been specifically operationalized. The aim of this thesis is to study the specific contribution of an offender's adherence to the street gang culture to an explanation of delinquency. More specifically, its objectives are to define the street gang culture, operationalize adherence to the street gang culture, examine the reliability of the measurement of adherence to the street gang culture, and study its relationship with the nature, variety and frequency of delinquent behaviour of offenders placed under the responsibility of youth centres and correctional services in Quebec. Three scientific papers, to which a regular chapter has been attached, were used to demonstrate the thesis. The first paper presents the steps taken toward the development of the first Measurement of Adherence to the Gang Culture, the MACg. More specifically, the paper reviews the literature that led us to propose an initial definition of the gang culture and operationalize the concept. It also describes the approach to validating the relevance of its content and the preliminary data that demonstrate the measurement's strong internal consistency. This first study is followed by an examination of scoring of the main indicators of the gang culture, presented as a regular chapter. This approach is a necessary complement to the examination of the face validity of the MACg. The results indicate very satisfying levels agreement between observations of the various Quebec youth centre and correctional services professionals who were invited to score indicators of the gang culture based on two fictional stories of a juvenile offender and an adult offender.   Then, the second paper presents results of an initial study of the reliability of the MACg using the Rasch model approach to item response theory. Its findings support the one-dimensional nature of the MACg and its ability to distinguish groups of items and persons along a severity continuum of adherence to the gang culture. However, the differential functioning and poor fit of certain items were observed, in addition to the inadequacy of the type of response structure (Likert scale) chosen during the development of the MACg. Therefore, an adjusted version of the measurement is proposed. The third and final paper presents the results of a study examining the relationship between delinquency and an offender's adherence to the gang culture as measured by the MACg. The results support the unique contribution of an offender's adherence to the gang culture to the diversity and frequency of self-reported delinquent behaviour by offenders placed under the responsibility of youth centres and correctional services in Quebec. Moreover, the score on the original and adjusted MACg scales turned out to be a more powerful explanatory factor than age, criminal precocity, delinquent peers and psychopathy when it came to the best predictors of delinquency. The study also highlights the close relationship between a strong adherence to the gang culture and the marked presence of psychopathic traits which were warning signs of particularly serious problems. Despite its limitations, this thesis will significantly contribute to developing the foundation of a new model to explain the influence of street gang association on human behaviour. The MACg can also aid the risk assessment of male offenders placed under the responsibility of the criminal justice system and improve the quality of the treatments available to them.

Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) est l’agent responsable de la fièvre typhoïde et cause environ 200 000 morts et 27 millions de cas annuellement. C’est un pathogène entérique dont le réservoir est restreint à l’Homme. Les raisons de cette restriction d’hôte sont méconnues et pourraient dépendre de l’expression de facteurs d’adhésion à des étapes importantes au cours de la pathogenèse. L’annotation bioinformatique du génome de S. Typhi identifie 12 fimbriae de type chaperon-placier (FCP), un curli ainsi qu’un pilus de type IV. L’objectif de ce projet de recherche est d’étudier ces systèmes d’adhésion peu caractérisés. D’abord, le niveau d’expression de ces gènes a été évalué dans différentes conditions de culture in vitro en utilisant une approche de gènes rapporteurs. L’expression des 14 systèmes d’adhésion a été détectée. Nos résultats indiquent qu’une carence en fer favorise l’expression des opérons bcf et csg. Indépendamment du fer, l’expression de bcf, csg, pil, sef, sta, stc, stg et sth est influencée par la richesse nutritive du milieu. L’incubation en milieu LB liquide favorise l’expression de la plupart des systèmes d’adhésion par rapport à un milieu LB liquide sans agitation ou un milieu LB solide. En somme, l’expression des systèmes d’adhésion de S. Typhi a été observée et est influencée par des conditions environnementales. Dans un second volet, nous avons tent de surexprimer les différents systèmes d’adhésion chez une souche d’E. coli ou de S. Typhi afimbriaire. Avec cette approche, nous avons été en mesure de démontrer que l’opéron tcf encode pour un fimbria fonctionnel que l’on a pu observer en microscopie électronique. L’expression de tcf chez une souche afimbriaire d’E. coli et S. Typhi a également diminué leur capacité d’adhésion à des cellules épithéliales intestinales humaines lors d’essais in vitro. Nos observations démontrent que l’expression des systèmes d’adhésion retrouvés chez S. Typhi est influencée par les conditions enviroi9onnementales. Au moins un de ces systèmes est fonctionnel. Ceci suggère une contribution des systèmes d’adhésion retrouvés chez S. Typhi lors de l’interaction de ce pathogène avec l’humain. / Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) is the etiological agent of typhoid fever which causes more than 200 000 deaths and 27 million cases worldwide, mostly in south Asia. This pathogen can only cause significant symptoms in humans, which are the only recognized animal reservoir. This host restriction is not clearly understood and could depend on the expression of adhesion systems during critical pathogenesis steps. Bioinformatic studies on S. Typhi predict 12 chaperone-usher fimbriae, one curli and one type IV secretion system. The aim of the project was to study those poorly described adhesion systems using two different methodologies. First, transcription levels were evaluated in different in vitro growth conditions using both gfp and β-galactosidase reporter genes. The expression of the 14 adhesion systems was detected, even if some of them were poorly expressed. The expression of bcf and csg was higher during iron-deficiency. Also, the availability of nutrients had an impact on bcf, csg, pil, sef, sta, stc, stg and sth expression, independently of the presence of iron. Most of the adhesion systems showed higher expression levels in liquid LB media with aeration compared to the same media without aeration or supplemented with agar. Secondly, several S. Typhi adhesion systems were cloned into an inducible expression plasmid introduced in both an afimbriated E. coli K-12 strain (ORN172) and an afimbriated S. Typhi strain (ISP1820). This approach enabled us to directly observe the presence of tcf by electron microscopy. Furthermore, the expression of tcf was correlated with a reduction of the capacity of bacteria to adhere to INT-407 human intestinal epithelial cells in an in vitro assay. In summary, this work demonstrates that the putative adhesion systems found in S. Typhi can indeed be expressed and this expression can be regulated by environmental signals. Furthermore, tcf encodes for a functional fimbria which has never before been observed. Taken together, our results suggest a significant contribution of the putative adhesion systems during normal pathogenesis.

Les trois projets que j’ai développés au cours de ma thèse s’inscrivent dans un même contexte, celui de l’étude de l’acétylcholinestérase (AChE) et des molécules apparentées à l’AChE au plan structural ou fonctionnel. Existence, identification et caractérisation du fonctionnement d’une « porte arrière » dans l’AChE. Caractérisation de la « protéine X », un récepteur non AChE de la fasciculine. Recherche d’un partenaire protéique endogène de l’AChE dans le cerveau de rat. / The three projects I developed during my thesis are related to the study of acetylcholinesterase (AChE) and of molecules related to AChE in their function or structure. Existence, identification and characterization of the functioning of a back door in AChE. Characterization of “protein X”, a non-AChE receptor for fasciculin. Search for an endogenous proteic partner of AChE in rat brain.

Le but de la conception d’un biomatériau est de mimer les modèles qui puissent être représentatifs de la matrice extracellulaire (MEC) existant in vivo. Cet objectif peut être atteint en associant une combinaison de cellules et des facteurs biologiques à un biomatériau sur lequel ces cellules peuvent se développer pour reconstruire le tissu natif. Dans cet étude, nous avons crée des surfaces bioactives nanostructurées en combinant la nanolithographie et la fonctionnalisation de surface, en greffant un peptide RGD ou BMP-2 (bone morphogenetic protein 2). Nous avons étudié l’effet de cette nanodistribution sur le comportement des cellules souches mésenchymateuses en analysant leur adhésion et différentiation. Nous notons que la nanodistribution des peptides induit une bioactivité qui a un impact sur l’organisation du cytosquelette, la conformation des fibres de stresse de l’actin, la maturation des adhésions focales (AFs), et le commitment des cellules souches. En particulier, l’aire, la distribution, et la conformation des AFs sont affectes par la présence des nanopatterns. En plus, le RGD et le BMP-2 changent le comportement cellulaire par des voies et des mécanismes différents en variant l’organisation des cellules souches et la maturation de leurs AFs. La nanodistribution influence de façon évidente les cellules souches en modifiant leur comportement (adhésion et différenciation) ce qui a contribué et ce qui contribuera à améliorer la compréhension des interactions des cellules avec la MEC. / The aim of biomaterials design is to create an artificial environment that mimics the in vivo extracellular matrix for optimized cell interactions. A precise synergy between the scaffolding material, bioactivity, and cell type must be maintained in an effective biomaterial. In this work, we present a technique of nanofabrication that creates chemically nanopatterned bioactive silicon surfaces for cell studies. Using nanoimprint lithography, RGD and mimetic BMP-2 peptides were covalently grafted onto silicon as nanodots of various dimensions, resulting in a nanodistribution of bioactivity. To study the effects of spatially distributed bioactivity on cell behavior, mesenchymal stem cells (MSCs) were cultured on these chemically modified surfaces, and their adhesion and differentiation were studied. MSCs are used in regenerative medicine due to their multipotent properties, and well-controlled biomaterial surface chemistries can be used to influence their fate. We observe that peptide nanodots induce differences in MSC behavior in terms of cytoskeletal organization, actin stress fiber arrangement, focal adhesion (FA) maturation, and MSC commitment in comparison with homogeneous control surfaces. In particular, FA area, distribution, and conformation were highly affected by the presence of peptide nanopatterns. Additionally, RGD and mimetic BMP-2 peptides influenced cellular behavior through different mechanisms that resulted in changes in cell spreading and FA maturation. These findings have remarkable implications that contribute to the understanding of cell-extracellular matrix interactions for clinical biomaterials applications.

Le transfert horizontal participe à l'évolution rapide des génomes bactériens. Les éléments intégratifs et conjugatifs (ICE) sont des îlots génomiques capables de se transférer par conjugaison vers une bactérie receveuse. Streptococcus agalactiae est une bactérie pathogène opportuniste qui est à l'origine de problèmes sanitaires et économiques majeurs. Des études ont révélé la présence de nombreux ICE chez cette espèce, notamment à l'extrémité 3' d?un gène codant un ARNtLys. La fonctionnalité de l'ICE intégré à ce locus chez la souche 515 de S. agalactiae a été démontrée. Les fonctions véhiculées par ICE_515_tRNALys et pouvant conférer un avantage adaptatif ont été caractérisées et leur transfert vers d'autres espèces a été évalué. Les résultats ont montré que l'ICE confère à S. agalactiae des propriétés d'adhésion à l'hôte et de formation de biofilm et pourrait être impliqué dans l'agrégation cellulaire. Un antigène I/II codé par l'ICE est impliqué dans des phénotypes d'adhésion. De plus, un nouveau facteur co-hémolytique de type CAMP, codé par l'ICE et qui pourrait être impliqué dans la virulence et la survie des souches, a été caractérisé. La fonctionnalité de ces facteurs de virulence chez des espèces bactériennes pathogènes et non pathogènes a été établie. Les travaux ont également révélé la prévalence et la dynamique évolutive des ICE appartenant à la famille d'ICE_515_tRNALys et des fonctions adaptatives codées par ces éléments chez plusieurs espèces de streptocoques. En conclusion, les ICE de la famille d'ICE_515_tRNALys représentent des vecteurs de traits phénotypiques importants pour la virulence et la survie chez les streptocoques / Horizontal gene transfer is a rapid mechanism of evolution. Integrative and conjugative elements (ICEs) are genomic islands which can transfer by conjugation to recipient bacteria. Streptococcus agalactiae is a human and animal opportunistic pathogen that is responsible for major health and economic problems. Studies revealed the presence of numerous ICEs in S. agalactiae, in particular at the 3' end of a tRNALys encoding gene. The functionality of the element present in strain S. agalactiae 515 was demonstrated and was thus chosen as a model for this study. This work focused on the characterization of adaptive and virulence functions encoded by ICE_515_tRNALys and their transfer to other species. Results indicated that this ICE confers adhesion properties to host, increases biofilm formation and may be involved in cell aggregation. A new protein belonging to the antigens I/II family is involved in fibronectin binding and contributes to the biofilm phenotype. In addition, a new co-hemolytic CAMP factor encoded by ICE_515_tRNALys, which could be involved in virulence and bacterial survival, was identified and characterized. These virulence factors are functional in other bacterial species. This work also revealed the prevalence and evolutionary dynamics of ICE belonging to the family of ICE_515_tRNALys and adaptive functions encoded by these elements in several species of streptococci. In conclusion, ICEs of the ICE_515_tRNALys family represent vectors of phenotypic features important for virulence and survival in streptococci

Le silicium poreux est un biomatériau prometteur pour l'ingénierie tissulaire car il est non toxique et biorésorbable. Des modifications de surface permettent de contrôler sa vitesse de dégradation et peuvent favoriser l'adhésion cellulaire. Les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) sont des cellules souches mésenchymateuses retrouvées dans la pulpe dentaire, à l'intérieur des dents, et constituent une source accessible de cellules souches. Regrouper les capacités de prolifération et différenciation des DPSC avec les propriétés morphologiques et biochimiques du pSi représente une approche intéressante pour des applications thérapeutiques de médecine régénératrice. Dans cette thèse, nous avons étudié le comportement de DPSC humaines sur des supports de pSi, avec des pores variant de quelques nanomètres à plusieurs centaines de nanomètres. Nous avons travaillé sur différentes fonctionnalisations chimiques afin d'optimiser l'adhésion cellulaire et de stabiliser le matériau : oxydation thermique, silanisation et hydrosilylation. L'adhésion, la prolifération et la différenciation osseuse ont été évaluées par microscopie à fluorescence, microscopie électronique à balayage, activité enzymatique, tests de prolifération (activité mitotique), immunofluorescence et spectroscopie FTIR. Le pSi avec des pores de 30 à 40 nm de diamètre s'est révélé être le plus approprié pour l'adhésion, la prolifération cellulaire et la différenciation ostéoblastique. De plus, la structure nanométrique et le relargage d'acide silicique par le pSi a démontré un effet positif sur l'induction osseuse et la formation d'une matrice minéralisée. Le pSi est donc apparu comme un matériau prometteur pour l'adhésion de cellules souches mésenchymateuses, que ce soit pour une transplantation immédiate in vivo ou pour expansion et différenciation in vitro. / Porous silicon (pSi) is a promising biomaterial for tissue engineering as it is both non-toxic and bioresorbable. Moreover, surface modification can offer control over the degradation rate of pSi and can also promote cell adhesion. Dental pulp stem cells (DPSC) are mesenchymal stem cells found within the teeth and constitute a readily source of stem cells. Coupling the good proliferation and differentiation capacities of DPSC with the textural and chemical properties of the pSi substrates provides an interesting approach for therapeutic use. In this thesis, the behavior of human DPSC is analyzed on pSi substrates presenting pore of various sizes, from few to hundreds nanometers. We investigated different chemical surface treatments, in order to enhance cell adhesion and stabilize the material: thermal oxidation, silanization and hydrosilylation. DPSC adhesion, proliferation and further osteodifferentiation were followed for up to 3 weeks by fluorescence microscopy, scanning electron microscopy (SEM), enzymatic activity assay, BrdU assay for mitotic activity, immunostaining and FTIR spectroscopy. Porous Silicon with pore size ranging from 30 to 40 nm was found to offer the best adhesion, the fastest growth rate for DPSC and the highest osteoinductive effect. Moreover, the pSi nanostructure and the release of silicic acid had a positive effect on precursor cells osteodifferentiation and mineralized matrix formation. Porous silicon appeared to be an appropriate biomaterial for mesenchymal stem cells adhesion and immediate in vivo transplantation, or for long term in vitro culture, for stem cells proliferation and differentiation.