SF-1 e LRH-1 são fatores de transcrição que exercem um papel fundamental na produção de esteroides nas gônadas e na suprarrenal, além de estarem envolvidos no processo tumorigênico desses órgãos. Por outro lado, POD-1 apresenta menor expressão em carcinomas adrenocorticais, e parece regular Sf-1. Nesse trabalho foi analisado o papel de POD-1 na regulação de SF-1 e de LRH-1 em células de tumores adrenocorticais. A hiperexpressão de POD-1 resultou em redução da expressão SF-1/SF-1. Em contraste, houve um aumento da expressão gênica de LRH-1, devido à diminuição da expressão de SHP, um regulador negativo de LRH-1. Nas células transfectadas com siRNA-POD-1, os níveis de POD-1 foram reduzidos e de SF-1 aumentado, reforçando o mecanismo regulatório entre os fatores. No ChIP assay, POD-1 se ligou a sequência E-box do promotor de SF-1. Por outro lado, não foi caracterizado a ligação de POD-1 no promotor LRH-1, embora POD-1 tenha se ligado ao E-box do promotor SHP. A redução de SF-1 diminuiu a expressão de StAR, mas não modulou a proliferação das células tumorais. Em resumo, POD-1 pode ter um papel mais amplo como regulador da transcrição de fatores que controlam o processo tumorigênico, e é um candidato a gene supressor de tumor nas células adrenocorticais. / SF-1 and LRH-1 have played a critical role in steroid production, adrenal and gonads. Moreover, there are evidences that they have acted in tumorigenesis process in these organs. POD-1 is downregulated in adrenocortical carcinoma (ACC) it seems to regulate Sf-1. In this work, it has been to analyse the role of POD-1 in SF-1 and LRH-1 regulation in adrenocortical tumor cells. The POD-1 overexpression has reduced SF-1/SF-1 expression. However, there was an increase of LRH-1 gene expression due to SHP expression decrease which is negative regulate of LRH-1. The POD-1 and SF-1 gene expression in transfected cells with siRNA-POD-1 has shown POD-1 decrease and SF-1 increase emphasizing a regulatory mechanism between POD-1 and SF-1. By ChIP assay it was shown that POD-1 binded in SF-1 promoter E-box sequence. It was not characterized that POD-1 binded in LRH-1 promoter, although POD-1 can bind in SHP promoter E-box sequence. The reduction of SF-1 expression by POD-1 has decreased the StAR expression, however, it was not enough to change tumor cell proliferation. In summary, POD-1 must have a wider role as regulator of fator transcription which controls tumorigenese process being a possible candidate as tumor supressor gene in adrenocortical cells.

Les récepteurs Erythropoietin-producing hepatocyte (EPH) constituent la plus grande famille de récepteurs à activité tyrosine kinase transmembranaires. Leur activité kinase peut être induite par leurs ligands, les éphrines (EFN). Une fois activés, ces récepteurs sont impliqués dans la régulation de la fonction cellulaire par transduction antérograde ou rétrograde du signal EPH-EFN. Au cours de la dernière décennie, nos études ont démontré que les EPH / EFN jouent un rôle important dans la régulation de la pression artérielle par la modulation de la contractilité des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC). EPHB6, EFNB1 et EFNB3 ont un effet négatif sur la contractilité des VSMC et la pression artérielle, tandis que EPHB4 et EFNB2 montrent un effet positif. La famille EPH / EFN est donc un nouveau système yin et yang qui ajuste finement l'homéostasie de la pression artérielle. Nous avons également constaté que les catécholamines urinaires de 24 h sont réduites chez les souris mâles EPHB6 knockout (KO), suggérant que l’EPHB6 régule la pression artérielle non seulement via les VSMC mais aussi par la sécrétion de catécholamine (CAT). La régulation de CAT par l’EPHB6 dépend de la testostérone car (1) les niveaux réduits de CAT ne sont pas observés chez les souris femelles EPHB6 KO ; et (2) la castration chez les souris mâles EPHB6 KO ramène la CAT à des niveaux normaux. Durant ma thèse, nous avons étudié le mécanisme impliqué dans la régulation de la sécrétion et de la synthèse des catécholamines chez les cellules chromaffines des glandes surrénales (AGCC) par la voie de signalisation de l’EPHB6. En ex vivo, la teneur totale en épinéphrine et la sécrétion d'épinéphrine déclenchée par l'acétylcholine (ACh) sont toutes deux réduites dans les glandes surrénales venant des souris KO mâles mais pas dans celles venant des femelles ou de mâles castrés. Ensuite, nous avons observé une diminution de l’afflux de Ca2+ dépendant de l'ACh dans les AGCC venant des souris mâles EPHB6 KO, ce qui découle de l'effet non-génomique de la testostérone. En appliquant le patch clamping de cellules entières sur les AGCC, nous avons démontré que la diminution d’afflux de Ca2+ dans ces cellules est causée par l’augmentation des courants de potassium à grande conductance activé par le calcium (BK). En utilisant l'enregistrement ampérométrique, nous avons constaté que la sécrétion de CAT par les AGCC est compromise en l'absence d'EPHB6. Nous avons également observé une diminution du désassemblage de la F-actine corticale dans les AGCC venant de souris mâles KO associée à une diminution de l'exocytose des vésicules contenant es catécholamines. Ces deux phénomènes n’ont pas été observés chez les femelles KO ni chez les mâles castrés. Des études complémentaires ont montré que le désassemblage défectueux de la F-actine dans les AGCC est régulé par la signalisation inverse de l'EPHB6 à l'EFNB1 via deux voies de signalisations différentes : la voie du membre A de la famille des homologues Ras (RHOA) et la voie de la tyrosine kinase proto-oncogène de la famille Src (FYN) / proto-oncogène c-ABL / la calponine monooxygénase associée aux microtubules et le domaine LIM contenant 1 (MICAL-1). En outre, nous avons observé que la diminution de la teneur totale en épinéphrine dans la glande surrénale venant des souris mâles KO est causée par une expression altérée de la tyrosine hydroxylase (TH), qui est l’enzyme limitant la vitesse dans la biosynthèse des CAT. L'effet non génomique de la testostérone a également participé dans ce processus. Nous avons révélé que la signalisation inverse d'EPHB6 à EFNB1 contribue à la surexpression de TH dans les AGCC par l’augmentation de son niveau de transcription. La voie en aval de cette signalisation inverse implique la petite famille Rac GTPase 1 (RAC1) / MAP kinase kinase 7 (MKK7) / c-Jun N-terminal kinase (JNK) / proto-oncogène c-Jun / activator protein 1 (AP1) / réponse de croissance précoce 1 (EGR1). Ces travaux démontrent pour la première fois un rôle spécifique de la famille EPH / EFN dans la régulation de la biologie médullaire de la glande surrénale. La signalisation rétrograde d’EPHB6 via EFNB1 régule la synthèse et la sécrétion des catécholamines de concert avec la testostérone dans les AGCC. / Erythropoietin-producing hepatocyte (Eph) receptors are the largest family of cell surface transmembrane receptor tyrosine kinases. Their kinase activity can be activated by their ligands, ephrins (EFNs), and involved in cell function regulation through either EPH-EFN forward or reverse signaling transduction. In the last decade, we have revealed the previously unknown function of EPHs/EFNs in the regulation of blood pressure by modulating the contractility of vascular smooth muscle cells (VSMCs). EPHB6, EFNB1, and EFNB3 have a negative effect on the VSMCs contractility and blood pressure, while EPHB4 and EFNB2 show a positive effect instead. Thus, EPH/EFN family is a novel yin and yang system that finely tunes blood pressure homeostasis. EPHB6 also targets cells responsible for catecholamine (CAT) secretion in addition to the VSMCs, since we found that the 24-h urine catecholamines are reduced in male EPHB6 knockout (KO) mice. This phenotype in EPHB6 KO mice is testosterone-dependent because the reduced CAT levels are not observed in female KO mice; castration in KO male mice reverts the CAT levels to a normal range. In this research, we investigated the mechanism for the regulation of catecholamine secretion and synthesis in adrenal gland chromaffin cells (AGCCs) by EPHB6 signaling. In ex vivo, the total content of epinephrine and the acetylcholine (ACh)-triggered epinephrine secretion were both reduced in the adrenal gland from KO male but not female or castrated mice. Then, we found a reduced ACh-dependent Ca2+ influx in AGCCs from male EPHB6 KO mice, and this effect depended on the non-genomic effect of testosterone. The results of whole-cell patch clamping on AGCCs indicated that the enhanced large-conductance calcium-activated potassium (BK) currents were responsible for the reduced Ca2+ influx in these cells. Using amperometry recording, we found that CAT secretion by AGCCs was compromised in the absence of EPHB6. The cortical F-actin disassembly in AGCCs from KO male but not female or castrated mice was reduced, accompanied by decreased catecholamine vesicle exocytosis. Further study showed such defective F-actin disassembly in AGCCs was regulated by the reverse signaling from EPHB6 to EFNB1 via the Ras homolog family member A (RHOA) and proto-oncogene Src family tyrosine kinase (FYN)/proto-oncogene c-ABL/microtubule-associated monooxygenase calponin and LIM domain containing 1 (MICAL-1) pathways. Further, we observed that the reduced total content of epinephrine in the adrenal gland from male KO mice was caused by impaired expression of tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme in CAT biosynthesis. The non-genomic effect of testosterone was also involved in this process. We revealed that the reverse signaling from EPHB6 to EFNB1 contributed to the up-regulation of TH expression in AGCCs by enhancing its transcription. The downstream pathway of this reverse signaling involved Rac family small GTPase 1 (RAC1)/MAP kinase kinase 7 (MKK7)/c-Jun N-terminal kinase (JNK)/ proto-oncogene c-Jun/activator protein 1 (AP1)/early growth response 1 (EGR1). The present research, for the first time, revealed the specific role of the EPH/EFN family on the regulation of the adrenal gland medullary biology. The EPHB6 reverse signaling through EFNB1 in concert with testosterone regulates the catecholamine synthesis and secretion in AGCCs.

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The mammalian adrenal gland (or suprarenal gland) is a small organ located on the superior aspect of the kidney. The central region of the gland, the medulla, consists of chromaffin cells, which release catecholamines into the blood during periods of stress. This is best known as the 'fight or flight' response and is regulated, in the adult animal, by neuronal signals from the cholinergic sympathetic fibres of the splanchnic nerve. Interestingly, in some mammals, such as rat and human, sympathetic innervation is immature at birth, yet the chromaffin cells can still secrete catecholamines in response to physiological stessors, e.g. hypoxia. Increased plasma catecholamines is thought to provide a vital protective role for the neonatal animal during, and following birth. This is mediated in part by promoting lung fluid absorption, surfactant secretion, heart rate stabilization, and brown fat mobilization. The observation that, in the neonate, catecholamines are secreted in the absence of functional sympathetic innervation suggests that the chromaffin cells possess other mechanisms for directly 'sensing' a fall in blood O2 tension (hypoxia). The primary goal of this thesis was to uncover the mechanisms of oxygen-sensing in developing chromaffin cells from the rat and mouse, using primary short-term cell cultures of chromaffin cells. The experimental approaches relied on patch clamp techniques to record ionic currents and membrane potential, carbon fibre electrochemistry to record catecholamine secretion from cell clusters, and fluorescent indicators to measure reactive oxygen species generation. Hypoxic chemosensitivity was found in embryonic and neonatal, but not juvenile chromaffin cells from both the rat and mouse. Exposure to hypoxia or anoxia caused a reversible suppression of whole-cell current, which was comprised of the differential modulation of three K+ currents: (1) suppression of a large-conductance Ca2+-dependent K+ current; (2) suppression of a delayed rectifier K+ current; and (3) activation of an ATP-sensitive K+ current. Hypoxia also induced membrane depolarization that was not initiated by any of these three voltage-dependent K+ currents. Additionally, hypoxia broadened action potentials in chromaffin cells that showed spontaneous activity, and this was mediated by a prolongation of the time course of membrane repolarization. All of these factors likely contribute to catecholamine secretion by enhancing the influx of Ca2+ through depolarization-activated L-type Ca2+ channels. Two sets of experiments were designed to identify the oxygen sensor in neonatal chromaffin cells. First, cells from transgenic mice, deficient in the gp91^phox component of the putative O2-sensor protein, NADPH oxidase, responded to hypoxia in the same way as wild type cell, indicating that NADPH oxidase is not primarily responsible for oxygen sensitivity in these cells. Second, inhibitors of the proximal electron transport chain (e.g. rotenone and antimycin A) mimicked and attenuated the hypoxic response, while inhibitors of the distal electron transport chain (cyanide) and uncouplers of oxidative phosphorylation (2,4-dinitrophenol) had no effect. Furthermore, reactive oxygen species production, primarily H2O2, decreased during exposure to hypoxia or inhibitors of the proximal electron transport chain, revealing a potential mitochondrial mechanism for 'sensing' of the hypoxic stimulus. Reduced oxygen availability to the electron transport chain is proposed to cause a fall in cellular reactive oxygen species (ROS), principally H2O2. This fall in ROS signals closure of Ca2+-dependent and Ca2+-independent K+ channels, which causes broadening action potentials and increases Ca2+ influx. The latter is further enhanced by the hypoxia-induced membrane depolarization, which in turn increases the probability of cell firing. The rise in intracellular Ca2+ then acts as the signal for catecholamine release from the chromaffin cells. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)

La voie de signalisation Hippo est composée classiquement des kinases mammalian sterile twenty-like 1 et 2 (MST1/2) et des kinases large tumor suppressor 1 et 2 (LATS1/2) qui régulent les effecteurs transcriptionnels Yes-associated protein (YAP) et transcriptional coactivator with PDZ-binding motif (TAZ). Elle est impliquée dans plusieurs mécanismes cellulaires tels que la prolifération, la différenciation et l’apoptose ainsi que dans le maintien de l’homéostasie de différents tissus. Cependant, bien qu’il ait été démontré que YAP/TAZ contribuent au maintien de la glande surrénale, le rôle joué par les principales kinases de la voie Hippo dans ce tissu n’a jamais encore été évalué. L’objectif de ce projet de thèse est donc d’identifier les rôles des différentes kinases de la voie Hippo dans le développement et le maintien du cortex surrénalien par la création de cinq modèles de souris transgéniques. Grâce au modèle d’inactivation des kinases Mst1/2 dans le cortex surrénalien (Mst1flox/flox;Mst2flox/flox;Nr5a1-cre), nous avons démontré que Mst1/2 empêchent l’apparition prématurée de cellules ressemblant aux cellules du primordium adrénogonadique (AGP-like) dans la couche sous-capsulaire. Les analyses du transcriptome de ce modèle ont de plus démontré que les kinases MST1/2 régulent finement l’activité de YAP et des cellules de la zone glomérulée (zG) du cortex surrénalien à l’âge adulte mais pas l’activité des cellules de la zone fasciculée (zF). Ceci suggère que MST1/2 sont surtout impliqués dans la régulation de la fonction et de la différenciation des cellules de la zG. Contrairement à l’inactivation de Mst1/2, l’inactivation des kinases Lats1/2 dans tout le cortex en utilisant la même lignée Cre (Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;Nr5a1-cre), a démontré que LATS1/2 empêchent la transdifférenciation des cellules du cortex en cellules ressemblant à des myofibroblastes et à la formation de fibrose durant le développement embryonnaire. De plus, l’inactivation de LATS1/2 spécifiquement dans les cellules de la zG (Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;AS-cre) a démontré que LATS1/2 empêchent la transdifférenciation des cellules de la zG en cellules partageant des caractéristiques avec des ostéoblastes et des cellules de Sertoli. Cette inactivation est également responsable de l’induction d’une importante réponse immuno-inflammatoire chez les animaux juvéniles. De plus, l’inactivation de Yap/Taz simultanément à l’inactivation de Lats1/2 dans les cellules de la zG (Yapflox/flox;Tazflox/flox;Lats1flox/flox; Lats2flox/flox;AS-cre) a permis de confirmer que l’augmentation de l’activité transcriptionnelle de YAP et de TAZ était responsable du phénotype observé à la suite de l’inactivation de Lats1/2. Finalement, l’utilisation d’un modèle exprimant une forme constitutivement active de YAP humain dans les cellules de la zG (Rosa26YAP5SA/+;AScre/+) nous a permis de démontrer que l’augmentation de l’activité transcriptionnelle de YAP seule ne pouvait reproduire pleinement le phénotype observé suite à l’inactivation de Lats1/2 mais conduit plutôt à l’hyperplasie de la glande surrénale. Ensemble, nos modèles murins démontrent un rôle important pour la voie Hippo, et particulièrement les kinases LATS1/2 et les effecteurs YAP/TAZ, dans la différenciation des cellules stéroïdogéniques du cortex surrénalien et le maintien de l’homéostasie de la glande surrénale chez la souris. Ces travaux ouvrent non seulement la voie à l’étude plus poussée de cette voie dans des pathologies de la glande surrénale, comme les tumeurs surrénaliennes, mais mettent également en évidence la voie Hippo en tant que cible thérapeutique pour les troubles surrénaliens. / The Hippo pathway canonical signaling is composed of the mammalian kinases sterile twenty-like 1 and 2 (MST1/2) and large tumor suppressor 1 and 2 (LATS1/2) which ultimately regulate the transcriptional co-activators Yes-associated protein (YAP) and the transcriptional coactivator with PDZ-binding motif (TAZ). This pathway plays critical roles in maintaining the homeostasis of various tissues and regulating biological processes such as cellular proliferation, differentiation, and apoptosis in a tissue-specific manner. Although previous studies have shown that the effectors YAP/TAZ are involved in the maintenance of the adrenal gland, the roles played by their main upstream kinases in this tissue have not yet been evaluated. The objective of this thesis project is therefore to identify the importance of these distinct Hippo pathway kinases in the development and maintenance of the adrenal cortex by generating five different conditional transgenic mouse models. Using a Mst1/2 inactivation model (Mst1flox/flox;Mst2flox/flox;Nr5a1-cre), we first demonstrated that loss of Mst1/2 in the entire cortex leads to premature appearance of spindle-shaped cells resembling adrenogonadal primordium “AGP-like” cells in the sub-capsular region of the adrenal cortex. Further transcriptomic analyses performed on this model showed that MST1/2 can regulate the activity of YAP and of cells forming the zona glomerulosa (zG) in adult mice but not the activity of cells of the zona fasciculata (zF). This finding suggested that kinases MST1/2 are mainly involved in the regulation of zG cell function or differentiation. The inactivation of Lats1/2 using the same Cre line (Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;Nr5a1-cre) demonstrated that LATS1/2 prevent the transdifferentiation of cortical cells into myofibroblast-like cells and the onset of fibrosis during embryonic development. Moreover, the inactivation of Lats1/2 specifically in the zG cells (Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;AS-cre) demonstrated that LATS1/2 prevent the transdifferentiation of zG cells into cells sharing characteristics with osteoblast and Sertoli cells. This inactivation is also responsible for the induction of an immune-inflammatory response in juvenile mice. Most importantly, the concomitant inactivation of Yap/Taz with Lats1/2 in zG cells (Yapflox/flox;Tazflox/flox;Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;AS-cre) demonstrated that the increase in the transcriptional activity of YAP/TAZ was responsible for the phenotype observed following the loss of Lats1/2. To complete our studies, we employed a mouse model expressing a constitutively active human form of YAP in zG cells (Rosa26YAP5SA/+;AScre/+) which demonstrated that increased transcriptional activity of YAP alone is not sufficient to recapitulate the phenotype observed following the loss of Lats1/2 but induces adrenal gland hyperplasia. Together, these findings indicate an important role for the Hippo signaling pathway, particularly LATS1/2 kinases and YAP/TAZ effectors, in the differentiation of steroidogenic cells of the adrenal cortex and the maintenance of adrenal gland homeostasis in mice. These findings not only pave the way for further studies of this pathway in important adrenal gland pathologies, such as adrenal tumors, but also highlight the Hippo pathway as a potential target for therapeutic treatments of adrenal disorders.

Les tumeurs du cortex surrénalien sont variées et fréquentes dans la population. Bien que des mutations aient été identifiées dans certains syndromes familiaux, les causes génétiques menant à la formation de tumeur du cortex surrénalien ne sont encore que peu connues. Un sous-type de ces tumeurs incluent les hyperplasies macronodulaires et sont pressenties comme la voie d’entrée de la tumorigenèse du cortex surrénalien. L’événement génétique le plus fréquemment observé dans ces tumeurs est l’expression aberrante d’un ou plusieurs récepteurs couplés aux protéines G qui contrôle la production de stéroïdes ainsi que la prolifération cellulaire. L’événement génétique menant à l’expression aberrante de ces récepteurs est encore inconnu. En utilisant le récepteur au peptide insulinotropique dépendant du glucose (GIP) comme modèle, cette étude se propose d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’expression aberrante du récepteur au GIP (GIPR) dans les tumeurs du cortex surrénalien. Une partie clinique de cette étude se penchera sur l’identification de nouveaux cas de tumeurs surrénaliennes exprimant le GIPR de façon aberrante. Les patients étudiés seront soumis à un protocole d’investigation in vivo complet et les tumeurs prélevées seront étudiées extensivement in vitro par RT-PCR en temps réel, culture primaire des tumeurs, immunohistochimie et biopuces. Le lien entre le GIP et la physiologie normal sera également étudiée de cette façon. Une autre partie de l’étude utilisera les nouvelles techniques d’investigation à grande échelle en identifiant le transcriptome de différents cas de tumeurs exprimant le GIPR de façon aberrante. L’importance fonctionnelle des gènes identifiée par ces techniques sera confirmée dans des modèles cellulaires. Cette étude présente pour la première des cas de tumeurs productrices d’aldostérone présentant des réponses aberrantes, auparavant confinées aux tumeurs productrice de cortisol ou d’androgènes surrénaliens. Le cas probant présenté avait une production d’aldostérone sensible au GIP, le GIPR était surexprimé au niveau de l’ARNm et un fort marquage a été identifié dans la tumeur spécifiquement. Dans les surrénales normales, cette étude démontre que le GIP est impliqué dans le contrôle de la production d’aldostérone. Ces résultats ont été confirmés in vitro. Finalement, le profilage à grande échelle des niveaux d’expression de tous les gènes du génome a permis d’isoler une liste de gènes spécifiquement liés à la présence du GIPR dans des hyperplasies du cortex surrénalien. Cette liste inclus la périlipine, une protéine de stockage des lipides dans les adipocytes et la glande surrénale, dont l’expression est fortement réprimée dans les cas GIP-dépendant. Des études dans un modèle cellulaire démontrent que la répression de ce gène par siRNA est suffisante pour induire l’expression du récepteur au GIP et que cette protéine est impliquée dans la stimulation de la stéroïdogénèse par le GIP. En alliant des méthodes d’investigation in vivo de pointe à des techniques in vitro avancée, cette étude offre de nouveaux regards sur les liens entre le GIP et la physiologie de la glande surrénale, que ce soit dans des conditions normales ou pathologiques. / Tumors of the adrenal cortex are varied and frequently found in the population. Aside from rare family cases in which mutations have been identified, the genetic events leading to the formation of adrenocortical tumors remain obscure. A subtype of these tumors includes macronodular hyperplasias, now percieved as the entry point of adrenocortical tumorigenesis. The most commonly observed molecular event in these cases is the presence of aberrantly expressed G-protein coupled receptor that drive steroid production and cellular proliferation. The genetic events leading to these aberrant levels of expression are unknown. This study will use the Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide (GIP) receptor as a model to identify the molecular mecanisms leading to the aberrant expression of the GIP receptor (GIPR) in adrenocortical tumors. The first part of the study will be a clinical investigation of new cases of adrenocortical tumors to screen for aberrant responses to GIP in various types of these tumors. The patients will be evaluated by a thorough clinical investigation protocol and the resected tumors will be extensively analysed in vitro, using real-time RT-PCR, immunohistochemistry, microarray and primary cultures of the tumors. The link between GIP and the normal physiology of the adrenal cortex will also be assessed in normal subjects. The second part of the study will use novel large-scale investigation techniques to determine the transcriptome of different cases of adrenocortical tumors expressing aberrant levels of the GIPR. The functional importance of identified genes will be assessed in cellular models. This study presents the first cases of aldosterone-producing tumors with aberrant responses to hormones, previously confined to cortisol- or androgen producing tumors. The case presented showed an aldosterone production sensitive, among others, to GIP. The GIPR’s mRNA was strongly over expressed and a specific staining was observed in immunohistochemistry. The responses were confirmed in primary cultures of the tumor. In normal adrenals, a role for the control of aldosterone by GIP was also demonstrated. Finally, large-scale profiling of the transcriptome led to the identification of a list of genes with expression levels strictly related to the presence of the GIPR in adrenocortical hyperplasias. One of these genes, perilipin, was strongly repressed specifically in GIP-dependent cases. siRNA techniques were used in a cellular model and confirmed that the repression of perilipin is sufficient to induce the expression of GIPR and that this protein is implicated in the GIP induced steroidogenesis. Allying state-of-the-art in vivo investigation methods to advanced in vitro techniques, the present study identifies novel insights on the link between GIP and the normal adrenal physiology, in normal and pathological conditions.

Les tumeurs du cortex surrénalien sont variées et fréquentes dans la population. Bien que des mutations aient été identifiées dans certains syndromes familiaux, les causes génétiques menant à la formation de tumeur du cortex surrénalien ne sont encore que peu connues. Un sous-type de ces tumeurs incluent les hyperplasies macronodulaires et sont pressenties comme la voie d’entrée de la tumorigenèse du cortex surrénalien. L’événement génétique le plus fréquemment observé dans ces tumeurs est l’expression aberrante d’un ou plusieurs récepteurs couplés aux protéines G qui contrôle la production de stéroïdes ainsi que la prolifération cellulaire. L’événement génétique menant à l’expression aberrante de ces récepteurs est encore inconnu. En utilisant le récepteur au peptide insulinotropique dépendant du glucose (GIP) comme modèle, cette étude se propose d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’expression aberrante du récepteur au GIP (GIPR) dans les tumeurs du cortex surrénalien. Une partie clinique de cette étude se penchera sur l’identification de nouveaux cas de tumeurs surrénaliennes exprimant le GIPR de façon aberrante. Les patients étudiés seront soumis à un protocole d’investigation in vivo complet et les tumeurs prélevées seront étudiées extensivement in vitro par RT-PCR en temps réel, culture primaire des tumeurs, immunohistochimie et biopuces. Le lien entre le GIP et la physiologie normal sera également étudiée de cette façon. Une autre partie de l’étude utilisera les nouvelles techniques d’investigation à grande échelle en identifiant le transcriptome de différents cas de tumeurs exprimant le GIPR de façon aberrante. L’importance fonctionnelle des gènes identifiée par ces techniques sera confirmée dans des modèles cellulaires. Cette étude présente pour la première des cas de tumeurs productrices d’aldostérone présentant des réponses aberrantes, auparavant confinées aux tumeurs productrice de cortisol ou d’androgènes surrénaliens. Le cas probant présenté avait une production d’aldostérone sensible au GIP, le GIPR était surexprimé au niveau de l’ARNm et un fort marquage a été identifié dans la tumeur spécifiquement. Dans les surrénales normales, cette étude démontre que le GIP est impliqué dans le contrôle de la production d’aldostérone. Ces résultats ont été confirmés in vitro. Finalement, le profilage à grande échelle des niveaux d’expression de tous les gènes du génome a permis d’isoler une liste de gènes spécifiquement liés à la présence du GIPR dans des hyperplasies du cortex surrénalien. Cette liste inclus la périlipine, une protéine de stockage des lipides dans les adipocytes et la glande surrénale, dont l’expression est fortement réprimée dans les cas GIP-dépendant. Des études dans un modèle cellulaire démontrent que la répression de ce gène par siRNA est suffisante pour induire l’expression du récepteur au GIP et que cette protéine est impliquée dans la stimulation de la stéroïdogénèse par le GIP. En alliant des méthodes d’investigation in vivo de pointe à des techniques in vitro avancée, cette étude offre de nouveaux regards sur les liens entre le GIP et la physiologie de la glande surrénale, que ce soit dans des conditions normales ou pathologiques. / Tumors of the adrenal cortex are varied and frequently found in the population. Aside from rare family cases in which mutations have been identified, the genetic events leading to the formation of adrenocortical tumors remain obscure. A subtype of these tumors includes macronodular hyperplasias, now percieved as the entry point of adrenocortical tumorigenesis. The most commonly observed molecular event in these cases is the presence of aberrantly expressed G-protein coupled receptor that drive steroid production and cellular proliferation. The genetic events leading to these aberrant levels of expression are unknown. This study will use the Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide (GIP) receptor as a model to identify the molecular mecanisms leading to the aberrant expression of the GIP receptor (GIPR) in adrenocortical tumors. The first part of the study will be a clinical investigation of new cases of adrenocortical tumors to screen for aberrant responses to GIP in various types of these tumors. The patients will be evaluated by a thorough clinical investigation protocol and the resected tumors will be extensively analysed in vitro, using real-time RT-PCR, immunohistochemistry, microarray and primary cultures of the tumors. The link between GIP and the normal physiology of the adrenal cortex will also be assessed in normal subjects. The second part of the study will use novel large-scale investigation techniques to determine the transcriptome of different cases of adrenocortical tumors expressing aberrant levels of the GIPR. The functional importance of identified genes will be assessed in cellular models. This study presents the first cases of aldosterone-producing tumors with aberrant responses to hormones, previously confined to cortisol- or androgen producing tumors. The case presented showed an aldosterone production sensitive, among others, to GIP. The GIPR’s mRNA was strongly over expressed and a specific staining was observed in immunohistochemistry. The responses were confirmed in primary cultures of the tumor. In normal adrenals, a role for the control of aldosterone by GIP was also demonstrated. Finally, large-scale profiling of the transcriptome led to the identification of a list of genes with expression levels strictly related to the presence of the GIPR in adrenocortical hyperplasias. One of these genes, perilipin, was strongly repressed specifically in GIP-dependent cases. siRNA techniques were used in a cellular model and confirmed that the repression of perilipin is sufficient to induce the expression of GIPR and that this protein is implicated in the GIP induced steroidogenesis. Allying state-of-the-art in vivo investigation methods to advanced in vitro techniques, the present study identifies novel insights on the link between GIP and the normal adrenal physiology, in normal and pathological conditions.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Uppsala universitet, 2009.

La voie de signalisation Hippo est une cascade de kinases hautement conservée entre les espèces qui contrôle des processus cellulaires fondamentaux comme la prolifération, l’apoptose et la différenciation. Dans la cascade, les kinases Large tumor suppressor 1 et 2 (LATS1/2) phosphorylent et inactivent les co-activateurs transcriptionnels Yes-associated protein (YAP) et Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif (TAZ) pour réguler finement le développement, la taille et l’homéostasie de nombreux tissus. Bien qu’il ait été démontré que YAP/TAZ étaient essentiels au maintien du cortex surrénalien durant la vie adulte, le rôle des kinases en amont n’a jamais été étudié. L’objectif de ce projet était donc d’élucider le rôle de LATS1 et de LATS2 dans le développement corticosurrénalien. Pour ce faire, un modèle de souris Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;Nr5a1-cre, permettant l’inactivation conditionnelle de Lats1/2 dans les tissus stéroïdiens, a été créé. La caractérisation de ce modèle a révélé que Lats1/2 étaient indispensables pour maintenir l’identité des cellules adrénocorticales durant le développement embryonnaire. En l’absence de Lats1/2, les cellules du cortex acquièrent des propriétés myofibroblastiques et perdent progressivement leur capacité de stéroïdogenèse, causant une insuffisance surrénalienne fatale vers 2 à 3 semaines d’âge chez les deux sexes. Cette transdifférenciation est probablement causée, du moins en partie, par une augmentation de l’activité transcriptionnelle de YAP/TAZ puisqu’une augmentation de l’expression nucléaire de YAP/TAZ et de l’expression de certains gènes cibles de la voie Hippo ont été observées dans les cellules myofibroblastiques. Ces résultats révèlent donc un tout nouveau rôle de la voie Hippo dans le développement du cortex surrénalien. / The Hippo signaling pathway is a highly conserved kinase cascade that controls fundamental cellular processes such as proliferation, apoptosis and differentiation. In this cascade, the Large tumor suppressor kinase 1 and 2 (LATS1/2) phosphorylate and inactivate the main downstream effectors, Yes-associated protein (YAP) and Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif (TAZ), to finely regulate the development, size and homeostasis of several organs. It was recently demonstrated that YAP and TAZ were essential for the maintenance of the adrenal cortex during adult life, but the role of the upstream kinases has never been studied. The objective of the present project was therefore to elucidate the role of LATS1 and LATS2 in adrenocortical development. We generated a Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;Nr5a1-cre mouse model in which Lats1/2 were conditionally inactivated in steroidogenic cells. The characterization of this model revealed that Lats1/2 were required to maintain proper adrenocortical cell identity during embryonic development. In the absence of Lats1/2, adrenocortical cells acquire myofibroblastic properties and lose their steroidogenic capacity, leading to adrenal deficiency and death at 2 to 3 weeks of age. This transdifferentiation is probably caused, at least in part, by an increased transcriptional activity of YAP/TAZ since a stronger nuclear expression of YAP/YAZ and higher expression levels of Hippo target genes were observed in the myofibroblastic population. These results suggest an important novel role of Hippo signaling in adrenal cortex development.

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