Orientador: Lea Rodrigues Simioni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T09:48:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Abreu_ValdemirAparecidode_D.pdf: 2741527 bytes, checksum: 8d40cb65f4500adbbbd0961f047f41b1 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Neste trabalho, foi estudada a ação do veneno de Micrurus altirostris (cobra coral Uruguaiana) nas concentrações de 0,1; 0,5; 1; 5 e 10 µg/mL sobre a junção neuromuscular em preparações isoladas de ave (biventer cervicis de pintainho) e de mamífero (nervo frênico-diafragma de camundongo) e também a habilidade do antiveneno comercial produzido pelo Instituto Butantan e do anti-soro específico, produzido em coelhos em neutralizar a neurotoxicidade e a letalidade em pintainhos e camundongos (DL50 0,042 e 0,255 mg/kg), injetados i.m. e i.p., respectivamente, com misturas de veneno (5 DL50): antiveneno ou anti-soro específico (n=6), na razão de 1:1; 1:2,5; 1:5; 1:10 e 1:20. Somente a razão de 1:20 do veneno: antiveneno ou anti-soro neutralizou o bloqueio neuromuscular in vitro e protegeu pintainhos e camundongos contra 5 DL50 do veneno. O veneno causou um completo bloqueio neuromuscular em ambas as preparações, ligando-se aos receptores colinérgicos sub-sinápticos, de maneira irreversível. Inibiu as contraturas causadas por ação da acetilcolina e do carbacol, sem interferir nas respostas ao KCl. O bloqueio neuromuscular causado pelo veneno não apresentou qualquer alteração na ausência de íons Ca2+ ou com a diminuição da temperatura, tampouco foi revertido por ação da neostigmina. A resposta ao estímulo direto não foi afetada na vigência do bloqueio neuromuscular completo, indicando pela perfeita resposta muscular, que a membrana manteve-se íntegra, o que sugere a ausência de uma atividade miotóxica. Os resultados indicaram que o veneno de Micrurus altirostris interfere com a neurotransmissão pós-sináptica e que o antiveneno comercial, bem como o anti-soro específico, produzido em coelhos, possuem baixa eficácia em neutralizar a neurotoxicidade e a letalidade deste veneno. A neutralização da ação neurotóxica e também da letalidade do veneno foi obtida apenas quando a proporção de 1:20 (veneno:antiveneno) foi utilizada / Abstract: In this work, we studied the neuromuscular blockade caused by Micrurus altirostris venom (0.1-10 µg/mL) in indirect stimulated chick biventer cervicis and mouse phrenic nerve-diaphragm preparations and the ability of commercial antivenom (Instituto Butantan) and antiserum raised in rabbits to neutralize neurotoxicity and lethality in chicks and mice (LD50 0.042 and 0.255 mg/kg), injected i.m. and i.p., respectively, with venom (5 LD50):antivenom or antiserum mixtures (n=6) of 1:1, 1:2.5, 1:5, 1:10 and 1:20. The venom caused a complete and irreversible neuromuscular blockade in both preparations, binding in the subsynaptics colynergic receptors; inhibited the acetylcholine and carbachol contractures, without interfering on KCl response. The neuromuscular blockade was not Ca2+ or temperature-dependent and did not affect the response to direct stimulation. Only a venom:antivenom or antiserum ratio of 1:20 neutralized the neuromuscular blockade in vitro and protected chicks and mice against 5 LD50 of venom. Our results indicated that Micrurus altirostris venom interferes with postsynaptic neurotransmission and that commercial antivenom and rabbit antiserum have low efficacy in neutralizing the neurotoxicity and lethality of this venom / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Orientador: Flavio Ailton Duque Zambrone / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T12:16:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ramos_MarciaMariaReisVieira_M.pdf: 2283119 bytes, checksum: b53803c737ba4b24f8ee8fab9274456a (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A ocorrência de neurotoxicidade crônica secundária à exposição em longo prazo a níveis baixos de agrotóxicos é ainda controversa. O presente estudo teve por objetivo analisar a relação da exposição ao longo prazo aos agrotóxicos e a ocorrência de efeitos neurotóxicos crônicos. Consiste em uma revisão crítica e sistemática da literatura, de estudos epidemiológicos publicados entre 1996 e 2006, que abordaram a ocorrência de neurotoxicidade crônica em humanos, secundária à exposição a baixas doses de agrotóxicos. A revisão da literatura identificou estudos descritivos de prevalência, estudos de coorte, estudos de caso-controle e ecológicos que investigaram a relação entre neuropatologias crônicas adquiridas e a exposição aos pesticidas. Foram incluídos sessenta e três estudos nesta revisão (quarenta e seis estudos caso-controle, sete estudos seccionais e nove estudos de coorte). Somente um estudo ecológico foi identificado. Vinte e dois dos estudos caso-controle se relacionaram à doença de Parkinson ou parkinsonismo e vinte e quatro abordaram outras alterações neurológicas. Uma grande parte dos estudos documentou exposição humana a uma mistura de agrotóxicos Os organofosforados formam os mais estudados, seguidos dos carbamatos. A grande maioria dos estudos utilizou métodos indiretos para a avaliação da exposição (85%). Poucos estudos levaram em consideração a história de intoxicação aguda prévia. A maioria dos estudos mostrou uma associação positiva entre a exposição aos agrotóxicos e a ocorrência de doenças neurológicas, no entanto muitas destas associações são limitadas, fracas ou não estatisticamente significantes. Diversos efeitos neurológicos eram de detecção subjetiva e de difícil confirmação diagnóstica. Esta revisão constatou que alguns efeitos neurotóxicos crônicos podem estar associados à exposição de longo prazo, aos agrotóxicos, embora nenhuma associação com substâncias específicas pode ser detectada. Muitos dos resultados dos estudos apresentaram uma relação fraca; inconsistente; ou estatisticamente insignificante. Os estudos epidemiológicos que estão por vir devem tentar sanar os vieses encontrados nos estudos desta revisão, em especial devem proceder a uma avaliação da exposição mais cuidadosa. Um programa de pesquisa é necessário para um maior esclarecimento do risco representado por exposição em longo prazo e às baixas doses destas substâncias / Abstract: The occurrence of secondary chronic neurotoxicity to the exposition in long stated period to low levels of pesticideds is still controversial. The present study it had for objective to analyze the relation of the exposition in long stated period to the pesticides and the occurrence of chronic neurotoxic effect. It consists of a critical and systematic review of literature, in epidemiologists studies published between 1996 and 2006, that they had approached the occurrence of chronic neurotoxicity in human beings, secondary to the exposition the low doses of pesticides. The review of literature identified descriptive studies of prevalence, ecological studies, coorte studies and case-control studies that had investigated the relation between acquired chronic neuropathologies and the exposition to pesticides. They had been enclosed sixty and three studies in this revision (forty and six case-control studies, seven sectional studies and nine coorte studies). Only one ecological study it was identified. Twenty and two of the case-control studies had related to the Parkinson illness or parkinsonism and twenty and four had approached other neurologic alterations. A great part of the studies registered exposition human being to a mixture of pesticides. The organophosphates ones forms the most studied, followed of the carbamates. The great majority of the studies used indirect methods for the evaluation of the exposition (85%). Few studies had taken in consideration the history of previous acute poisoning. The majority of the studies showed a positive association between the exposition to the pesticides and the occurrence of neurological illnesses, however many of these associations are limited, weak or not statistically significant. Diverse neurological effect were of subjective detection and with difficult diagnostic confirmation. This review evidenced that some chronic neurotoxic effects can be associate to the long stated period exposition to the pesticides, even so no association with specific substances can be detected. Many of the results of the studies had presented a weak relation, inconsistent, or statistically insignificant. The epidemiologists studies who are for coming must try to cure the bias found in the studies of this revision, in special must proceed to a most careful evaluation of the exposition. A research program is necessary for a bigger clarification of the risk represented for exposition in long stated period and to the low doses of these substances / Mestrado / Epidemiologia / Mestre em Saude Coletiva

Orientador: Maria Alice da Cruz Hofling / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T14:48:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rocha_Thalita_D.pdf: 12491560 bytes, checksum: ab548083ce9ee87e876b9cd018db9d32 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Venenos e toxinas de animais peçonhentos são importantes ferramentas farmacológicas para o estudo de fenômenos biológicos. Os venenos produzidos por insetos sociais da ordem Hymenoptera têm chamado a atenção de bioquímicos, imunologistas, farmacologistas e neurologistas, tanto do ponto de vista clínico como biotecnológico. Neste trabalho o mastoparano (MP) Polybia-MPII (INWLKLGKMVIDAL-NH2), do veneno da vespa Polybia paulista, serviu de ferramenta para avaliar se o peptídeo tem ação miotóxica e neurotóxica, bem como determinar a natureza dessa ação em biomembranas. A ação miotóxica foi avaliada pela análise morfológica ao microscópio de luz e eletrônico e morfometria durante as fases degenerativa (3 e 24 horas) e regenerativa (3, 7 e 21 dias) após a injeção intramuscular de 0,25 mg/ml do peptídeo. Com o objetivo de identificar os eventos celulares e moleculares que acompanham essas alterações nos diferentes períodos analisados, foi avaliada a expressão das citocinas pró-inflamatórias, o fator de necrose tumoral (TNF-a) e o interferon gama (IFN-g). Em geral, na avaliação da ação local de venenos e toxinas, tem sido dado ênfase à capacidade de induzir mionecrose e tem-se negligenciado a capacidade de induzir apoptose por parte dessas substâncias. No presente trabalho, através da técnica de TUNEL e da imunomarcação de caspases 3 e 9, foi analisado a capacidade do Polybia-MPII em promover morte celular programada por apoptose no músculo tibial anterior. A ação neurotóxica do Polybia-MPII foi avaliada por microscopia confocal e microscopia eletrônica de transmissão e consistiu em investigar a organização da inervação dos terminais em secções longitudinais através da marcação com alfa-bungarotoxina conjugada com tetrametilrodamina (TRITC-aBTX) ou com isotiocianato de fluoresceína (FITC-aBTX), e contra-imunomarcados com sinaptofisina (marcador específico para vesículas sinápticas) e neurofilamentos, e pela contagem de vesículas sinápticas nos terminais colinérgicos. Os resultados mostraram pela primeira vez que o mastoparano de P. paulista é um potente indutor de mionecrose e apoptose. A atividade miotóxica do peptídeo mostrou iniciar-se pela lise do sarcolema seguida por diferentes estados patológicos comprometendo a organização miofibrilar, seguida pela lise das miofibras e das miofibrilas, com preservação da lâmina basal. A indução de apoptose pelo peptídeo foi demonstrada morfologicamente pela técnica de TUNEL, presença de caspase 3 e 9 e pela severa alteração mitocondrial e alteração da cromatina dos núcleos observadas por microscopia eletrônica, as quais coincidiram com expressão aumentada de IFN-g e TNF-a, esta uma citocina que medeia a ativação de uma das via das caspases que leva à morte celular programada por apoptose. Com relação à atividade neurotóxica, os resultados mostraram que o Polybia-MPII possui ação pré-sináptica, devido à significativa diminuição no conteúdo de vesículas sinápticas nos terminais pré-sinápticos, corroborando com dados do nosso grupo que evidenciaram através de estudos eletrofisiológicos a mesma ação neurotóxica pré-sináptica causada pelo veneno bruto de P. paulista. Esses efeitos foram variáveis ao longo dos diferentes períodos analisados, mostrando que as alterações eram transitórias e que os fenômenos regenerativos permitiam o restabelecimento da morfologia original. Os estudos biofísicos feitos em membranas artificiais mostraram que o Polybia-MPII interage com a bicamada lipídica da membrana, provavelmente utilizando o triptofano como ancoragem através de um mecanismo conhecido como ¿carpet¿, desestabilizando o equilíbrio iônico e promovendo a ruptura da membrana. Os estudos biofísicos mostraram-se consistentes com as observações morfológicas ao microscópio de luz e eletrônico. Os dados permitem concluir que o mastoparano Polybia-MPII é um potente indutor de mionecrose em músculo esquelético e sua atividade neurotóxica periférica pode ser qualificada como moderada e pré-sináptica; além de induzir apoptose em fibra muscular, cujo significado precisa ser investigado. A reversibilidade dos efeitos causados pelo mastoparano está de acordo com os dados clínicos observados em acidentes com ferroadas de P. paulista em indivíduos não alérgicos, os quais se caracterizam na maioria por serem de pouca gravidade, curta duração e auto-limitantes / Abstract: Venoms and toxins of poisonous animals are important pharmacological tools to study biological phenomena. The venom of social insects as those produced by Hymenoptera get attention from biochemistries, immunologists, biologists, pharmacologists and neurologists, as in a clinic view as biotechnologically. In this study the mastoparan (MP) Polybia-MPII, (INWLKLGKMVIDAL-NH2) from Polybia paulista wasp venom, was used as a tool to analyze if the peptide has myotoxic and neurotoxic effects, as well to determine its action on biomembranes. The myotoxicity of the mastoparan was evaluated during the degenerative phase (3 and 24 hours) and regenerative phase (3, 7 and 21 days) after the intramuscular injection of 0.25 mg/ml of the peptide using light microscopy, transmission electron microscopy and morphometry. With the purpose of determining the cellular and molecular events accompanying the alterations caused by P. paulista wasp mastoparan in these time-points the expression of proinflammatory cytokines, such as the tumor necrosis factor alpha (TNF-a) and interferon gamma (IFN-g) were evaluated. In general, studies on the local effects of venom and toxins have focused on their myotoxic potential, whereas the potential to induce apoptosis has been neglected. In this work, the ability of Polybia-MPII in inducing cell death by apoptosis on the tibial anterior muscle was assessed by TUNEL technique and immunohistochemistry for caspase 3 and caspase 9. The neurotoxic action of Polybia-MPII was evaluated by examining the organization of terminals innervation in longitudinal sections labelled with tetramethylrhodamineconjugated- or isothiocyanate fluorescein-conjugated-alpha-bungarotoxin (TRITC or FITC a-BTX receptor, respectively) and counter labelled with a combination of antisynaptophysin (a specific marker to synaptic vesicles) and anti-neurofilament protein using confocal microscopy and transmission electron microscopy, and by counting the synaptic vesicle within the cholinergic terminals. The results showed for the first time that the Polybia-MPII is a potent inducer of myonecrosis and apoptosis. The myotoxic action of the peptide initiated with the lyses of the sarcolemma followed by the development of different pathologic stages affecting myofibrillar organization, and eventually myofibrils and myofibre lyses, but maintaining unaffected the basal lamina. The ability of the peptide to induce apoptosis was demonstrated by TUNEL technique, immunolabelling of caspase 3 and 9, severe mitochondrial damage and alteration of the structure of nuclei chromatin seen by electron microscopy. Such effects were positively correlated with increased IFN-g and TNF-a expression, being the last one a cytokine which mediates the caspase pathway leading to programmed cell death by apoptosis. Concerning Polybia-MPII neurotoxicity, the results showed a pre-synaptic action of the peptide which was inferred by a decrease in synaptic vesicles content of pre-synaptic terminals, in agreement with electrophysiological studies done by our group with the P. paulista crude venom. These alterations varied along the time intervals analyzed, evidencing that the alterations were transitory and the regenerative phenomena allow to morphological reestablishment. The biophysical studies performed on artificial membranes, showed that the peptide interacted with the lipid bilayer probably anchored by tryptophan and by a mechanism known as carpet. As a result, the ionic balance is impaired inducing membrane leakage. The biophysical data were consistent with the morphological observations by light and electron microscopy. Data allow concluding that Polybia-MPII mastoparan is a mighty inducer of myonecrosis whereas the peripheral neurotoxicity could be considered as moderate and pres-synaptic. Besides, the peptide has an apoptotic-inducing potential on skeletal muscle fibre, the meaning of which deserves further investigation. The reversibility of the mastoparan effects is in accordance with clinical data in non-allergic patients stung by P. paulista, whose outcome is considered of mild, short-lived and self-limiting in severity / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T11:18:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ponce-Soto_LuisAlberto_D.pdf: 2824712 bytes, checksum: 7aeb46c8d2e647484f7c95e4df5cfb42 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Através de metodologias otimizadas de purificação em HPLC, foram purificadas novas toxinas a partir do veneno total de Crotalus durissus collilineatus (V-1), Bothrops jararacussus PLA2 D49 Bj-V (isoforma de Bj-IV) obtida da fração BthTX-II e Bothrops alternatus PLA2 K49 Bt II-2; com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular, sem perda da atividade biológica. A nova neurotoxina V-1 de Crotalus durissus collilineatus caracterizada físico-quimicamente como desprovida de atividade catalítica, ácida e com uma massa molecular de 9859.45 Da, uma única cadeia polipeptídica, induz uma facilitação contínua no modelo biológico nervo frênico diafragma isolado de camundongo e uma facilitação pronunciada seguida de um bloqueio súbito em biventer cervicis de pintainho, na junção neuromuscular. Os estudos estruturais, neurotóxicos e miotóxicos da PLA2 F6 do complexo crotoxina de Crotalus durissus collilineatus mostram que a PLA2 F6 precisa da crotapotina (estudos de re-associação) para potencializar seu efeito neurotóxico na preparação nervo frênico diafragma isolado de camundongo, mas a PLA2 F6 é capaz de induzir neurotoxicidade in vitro na ausência de crotapotina na preparação biventer cervicis de pintainho. Foram purificadas, a partir da fração BthTX-II, duas PLA2 D49 Bj-IV e V, sendo consideradas como isoformas devido ao fato de que compartilham de várias características físico-químicas, tais como: massa molecular, tempo de retenção na re-purificação em HPLC de fase reversa, análise de composição de aminoácidos, pI e estrutura primária, embora a isoforma Bj-V apresente algumas mutações com respeito à isoforma Bj-IV: W3 -> F3, Q4 -> E4, F5 -> W5, I16 -> N16 e G41 -> 41D; importantes para a atividade catalítica, os efeitos neurotóxicos in vitro foram mantidos e, quando foram inibidas cataliticamente por crotapotinas crotálicas de Crotalus durissus collilineatus (F3 e F4), continuaram diminuindo a resposta contrátil na junção neuromuscular nas preparações nervo frênico diafragma isolado de camundongo e biventer cervicis de pintainho, mostrando que são mais pronunciadas no músculo esquelético de camundongo. A nova toxina Bt II-2 purificada, com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular, do veneno de Bothrops alternatus, foi caracterizada como uma PLA2 básica K49, em função das características físico-químicas, evidenciadas: massa de 13898.71 Da, possui caráter básico e uma alta homologia seqüencial na sua estrutura primária, quando comparada com outras PLA2 K49 procedentes de veneno de serpentes.Essa nova PLA2 K49 Bt II-2 revelou um potente efeito neurotóxico in vitro na preparação nervo frênico diafragma isolado de camundongo (1 µg/mL) pré-sináptico, como foi mostrado nos estudos de estímulo indireto via nervo e potencial de membrana ou repouso, diferentemente de qualquer PLA2 neurotóxica botrópica que, para causar um efeito neurotóxico, precisa de dosagem acima de 50 µg/mL. Outros perfis biológicos foram estudados para a Bt II-2, que mostrou uma miotoxicidade local ¿in vivo¿, citotoxicidade em mioblastos e miotubos C2C12, atividade inflamatória e letalidade, corroborando que se enquadra dentro da família de proteínas PLA2 homólogas K49, mas com características únicas nos estudos de neurotoxicidade in vitro. A reprodutibilidade da atividade biológica, através dos efeitos farmacológicos, só é possível com a utilização de frações quimicamente homogêneas que mantenham a integridade da função biológica. Essas frações são obtidas com metodologias de alta eficiência: HPLC, LC, espectrometria de massa, cujos resultados podem ser associados com sua atividade biológica, eliminando a subjetividade causada por veneno total ou frações impuras. Essa abordagem pode ser aplicada nos estudos bioquímicos, estrutura-função, fisiológicos e farmacológicos, podendo revelar mecanismos ainda desconhecidos na relação estrutura-função das PLA2 procedentes de veneno de serpentes. A presença de um sítio farmacológico distinto do sítio catalítico presente nas PLA2 pode ser usada como ferramenta molecular para o reconhecimento dos receptores de membrana desconhecidos em células ou tecidos / Abstract: Through optimized methodologies of purification in HPLC, new toxins were purified from total venom of Crotalus durissus collilineatus (V-1), Bothrops jararacussus PLA2 D49 Bj-V (Bj-IV isoform) obtained from the fraction BthTX-II and Bothrops alternatus PLA2 K49 Bt II-2; with a high level of purity and molecular homogeneity, with no loss of biological activity. The new neurotoxin V-1 of Crotalus durissus collilineatus, chemically and physically characterized as unproved of catalytic, acid activity and with a molecular mass of 9859.45 Da, an only polypeptide sequence, induces to a continual facilitation in the biological isolated mouse phrenic nerve diaphragm model of mouse and a pronunciated facility of a subital block in chick biventer cervicis preparation en, in the neuromuscular junction. The structural, neurotoxic and miotoxic studies on PLA2 F6 from crotoxin complex of Crotalus durissus collineatus show crotapotin is necessary (re-association studies) to increase its neurotoxic effect in nerve phrenic diaphragm isolated preparation of mouse, but the PLA2 F6 is able to induce neurotoxity in vitro in ausency of crotopatin in the preparation chick biventer cervicis. Two PLA2 D49 Bj-IV and V were purified from the fraction BthTX-II and considered isoform because they share several chemical and physical characteristics, such as molecular mass, retention time in re-purification in reverse phase HPLC, analyses of amino acid composition, pI and primary structure, although the Bj-V isoform shows some mutations regarding Bj-IV: W3 -> F3, Q4 -> E4, F5 -> W5, I16 -> N16 e G41 -> 41D isoform. Important for the catalytic activity, neurotoxic in vitro effects were maintained and, when catalytically inhibited by crotapotin crotalic of Crotalus durissus collilineatus (F3 e F4), they continued dimishing the contractile reply in neuromuscular junction in nerve phrenic diaphragm isolated preparations of mouse and preparation chick biventer cervicis, which shows they are more pronunciated in the skeleton muscle of the mouse. The new and purified BtII-2 toxin of venom of Bothrops alternatus, with a high level of purity and molecular homogeneity, was characterized as a PLA2 basic K49, because its chemical and physical evidenced characteristics, mass of 13898.71 Da, basic character and a high sequential homology in its primary structure, when it is compared with other PLA2 K49 from venom of serpents. This new PLA2 K49 Bt II-2 has revealed a potent neurotoxic effect in vitro in neuromuscular junction in nerve phrenic diaphragm isolated preparation of mouse (1 µg/mL) ante-synaptic, as it was proved by studies on indirect stimulus through nerve and potential of membrane or rest, differently of some neurotoxic botropic PLA2 that needs a dose above 50 µg/mL to cause a neurotoxic effect. Other biological profiles were studied for the Bt II-2, and the conclusion was a local myotoxic ¿living¿, a cytotoxic in myoblasts and myotubes C2C12, imflammatory and letality activity, showing they are fitted in the family of proteins PLA2 homologous K49, but with particular characteristics in studies on neurotoxic in vitro. The reprodubility of biological activity, through pharmacological effects, is just possible with the utilization of chemically homogenous fractions that maintain the integrity of biological function. These fractions were obtained with high efficient methodologies as HPLC, LC, and mass spectrometry, whose results may be associated with their biological activities, eliminating the subjectivity caused by total venom or impure fractions. This approximation may be applied in the biochemical studies, structure-function, physiological and pharmacological, and it may reveal still unknown mechanisms in the relation structure-function of PLA2 from the venom of serpents. The presence of a pharmacological site different of the catalytic one in the PLA2 may be used as a molecular instrument to the recognition of the receptors of unknown membranes in cells or tissues / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Lea Rodrigues Simioni,Yoko Oshima Franco / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T13:41:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bueno_LilianGobbodeFreitas_M.pdf: 986839 bytes, checksum: 048ec75c1469d547de311f325aab2cc3 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Manganês, um bloqueador neuromuscular com atividades pré e pós-sinápticas, foi utilizado neste trabalho com o objetivo de estudar a neurotoxicidade e miotoxicidade induzida pelos venenos das serpentes Crotalus durissus terrificus (Cdt) e Bothrops jararacussu (Bjssu) em preparações biventer cervicis de pintainho (BCp). O pré-tratamento das preparações com Mn2+ (0,66 e 1,6 mM) não impediu o bloqueio neuromuscular induzido pelo veneno de Cdt, reduziu parcialmente a resposta contraturante à adição exógena de ACh, mas não à de KCl. Embora o bloqueio neuromuscular induzido pelo veneno de Bjssu seja irreversível, o pré-tratamento com ambas as concentrações de Mn2+ (0,66 e 1,6 mM) tornou o bloqueio parcialmente reversível após a lavagem das preparações com solução de Krebs, e somente nas preparações pré-tratadas com 1,6 mM Mn2+ houve redução do bloqueio da resposta contraturante à adição exógena de ACh (p<0,05). Os tipos de miotoxicidade induzidos pelos venenos de Cdt e Bjssu interferiram diferentemente na resposta contrátil. Em preparações pré-tratadas com Mn2+ (1,6 mM) houve redução parcial da porcentagem de dano muscular e da atividade miotóxica (CC, U/L) induzida por ambos os venenos. Os resultados desta pesquisa indicam que: Mn2+ interfere na contratura induzida pela ACh nos receptores nicotínicos; Mn2+ não evitou a neurotoxicidade do veneno de Cdt, mas reduziu parcialmente sua miotoxicidade in vitro, por sua ação estabilizante da membrana muscular; Mn2+ reduziu parcialmente a miotoxicidade e o bloqueio neuromuscular induzido pelo veneno de Bjssu. A dupla ação do Mn2+, pré- e pós-sináptica, é considerada útil para o estudo dos venenos de serpentes, uma vez que a maioria desses venenos apresenta também estas ações. Além disso, com a utilização deste cátion foi possível resgatar a coerência entre a interpretação dos resultados experimentais e clínicos / Abstract: In this study, we examined the effects of Mn2+, a neuromuscular blocker with pre and postsynaptic actions, on the neurotoxicity and myotoxicity induced by Crotalus durissus terrificus and Bothrops jararacussu venoms in chick biventer cervicis preparations. Pretreating the preparations with Mn2+ (0.66 or 1.6 mM) did not affect the blockade induced by C. d. terrificus venom or KCl-induced contractures, but partially reduced ACh-induced contractures. On the other hand, both concentrations of Mn2+ partially prevented the blockade induced by B. jararacussu venom (seen after washing the preparations with Krebs solution), whereas only 1.6 mM Mn2+ significantly restored ACh-induced contractures. Pretreatment with Mn2+ (1.6 mM) partially prevented the muscle damage and the release of creatine kinase induced by both venoms. These results show that Mn2+ did not prevent the neurotoxicity of Cdt venom, but partially reduced its myotoxicity, whereas this metal partially attenuated the myotoxicity and neuromuscular blockade caused by B. jararacussu venom. The pre- and postsynaptic actions of Mn2+ may be useful for studying snake venoms that show one or both of these activities / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Lea Rodrigues Simioni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T13:45:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Floriano_RafaelStuani_D.pdf: 3786286 bytes, checksum: a2855e3dd5b20280b1bf65e08007ab09 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Neste trabalho, nós examinamos a atividade neuromuscular do veneno de Bothriopsis bilineata smaragdina (serpente de floresta) e de sua toxina Bbil-TX (fosfolipase A2 Asp49) em preparações nervo-músculo isoladas de vertebrados. Em preparações BC, o veneno causou bloqueio neuromuscular concentração-dependente (0,1-30 ?g/mL) que não foi reversível por lavagem, com 50% de bloqueio ocorrendo em 90-15 min. Contratura muscular em resposta à ACh exógena e ao KCl não foram afetadas pelo veneno, mas houve um discreto aumento na liberação de CK após 60 min [UI/mL: de 80 ± 15 (basal) para 113 ± 22; n = 6; p > 0,05]. Em preparações NFD, o veneno (1, 10 e 30 ?g/mL) produziu marcante facilitação da neurotransmissão (~120% de aumento acima do basal) com a maior concentração seguida por bloqueio neuromuscular completo após 120 min; os efeitos com as menores concentrações foram considerados menos marcantes. O veneno aumentou o conteúdo quântico após 15 e 30 min de incubação seguido por significativa inibição ?90 min. No entanto, o veneno não alterou o potencial de membrana muscular ou a resposta despolarizante ao carbacol. Em ambas as preparações, incubação a 22-24 °C ao invés de 37 °C atrasou o início do bloqueio, como fez também a inibição da atividade PLA2 do veneno. Em preparações NFD curarizadas, o veneno produziu apenas uma discreta facilitação muscular. Estes resultados indicam que o veneno de B. b. smaragdina causa bloqueio neuromuscular in vitro por um mecanismo pré-sináptico envolvendo PLA2. Também foi investigada a atividade neuromuscular de Bbil-TX, uma PLA2 com atividade catalítica isolada do veneno de B. b. smaragdina, em preparações BC e NFD. Em preparações BC, Bbil-TX (35-702 nM) causou bloqueio tempo- e concentração-dependente que não foi reversível por lavagem; os tempos para causar 50% de bloqueio foram 87 ± 7, 41 ± 7 e 19 ± 2 min (média ± EPM; n = 4-6) para 70, 351 and 702 nM, respectivamente. Contraturas musculares à ACh exógena e KCl não foram alteradas. A toxina (702 nM) também não alterou as respostas contráteis de preparações BC curarizadas (d-Tc; 14,8 ?M) e diretamente estimuladas. No entanto, Bbil-TX (702 nM) produziu moderada alteração morfológica (fibras edemaciadas e/ou hipercrômicas) em BC; houve também uma progressiva liberação de CK [UI/mL: de 116 ± 17 (basal) para 961 ± 48 após 60 min; n = 6; p < 0,05]. O bloqueio neuromuscular induzido por Bbil-TX (351 nM) foi significativamente inibido a 22-24 °C e o pré-tratamento com p-BPB aboliu seu bloqueio. Bbil-TX (210 nM, 702 nM e 2 ?M; n = 4-6) causou bloqueio parcial tempo- e concentração-dependente em preparações NFD (52 ± 2% com a maior concentração). Bbil-TX (2 ?M) também reduziu significativamente a frequência de PsPTM/min [de 26 ± 2,5 (basal) para 10 ± 1 após 60 min; n = 5; p < 0,05] e o conteúdo quântico [de 94 ± 14 (basal) para 24 ± 3 após 60 min; n = 5; p < 0,05] de preparações NFD, mas causou apenas uma discreta alteração do potencial de membrana em repouso [de -80 ± 1 mV (basal) para -66 ± 2 mV após 120 min; n = 5; p < 0,05], com nenhuma alteração significativa na resposta despolarizante ao carbacol. Estes resultados mostram que Bbil-TX é uma PLA2 pré-sináptica que contribui para o bloqueio neuromuscular causado pelo veneno de B. b. smaragdina. A atividade neuromuscular do veneno de B. b. smaragdina e o mecanismo de ação de Bbil-TX no sistema nervoso periférico foi examinado também em outras preparações neuromusculares isoladas de camundongo. Em preparações NFD mantidas em solução fisiológica com baixo Ca2+, o veneno de B. b. smaragdina (3 ?g/mL) produziu uma alteração trifásica nas respostas contráteis enquanto que a maior concentração (10 ?g/mL) produziu uma abrupta e marcante contratura inicial a qual foi seguida por facilitação neuromuscular, oscilações rítmicas das contrações evocadas, alterações na linha de base e progressivo bloqueio neuromuscular. O veneno também atrasou a fase de relaxamento da resposta contrátil aumentando o tempo de decaimento constante. Em condições de baixo Ca2+, Bbil-TX (210 nM) causou um progressivo aumento na amplitude das respostas contráteis (83 ± 19 % acima dos valores basais após 120 min) em preparações NFD; não houve alteração no tempo de decaimento constante após tratamento com a toxina. O veneno de B. b. smaragdina (10 ?g/mL) e Bbil-TX (210 nM) causaram discreta alteração na amplitude do potencial de ação composto registrado em preparações NC de camundongo (veneno: 20 ± 2,1% e toxina: 17 ± 2,4% de redução abaixo dos valores basais; n = 3; p < 0,05) e nenhum efeito significativo sobre o tempo de subida e a latência; Tetrodotoxina (3,1 nM) bloqueou os potenciais no final dos experimentos. Em preparações TSn-m, veneno (10 ?g/mL) e Bbil-TX (210 nM) causaram significativa redução na forma de onda perineural associada à corrente K+ (veneno: 35 ± 7,2% e toxina: 26 ± 1,4% de redução abaixo dos valores basais; p < 0,05; n = 3-5) enquanto que a amplitude da corrente de Na+ não foi significativamente afetada (veneno: 18 ± 3,3% e toxina: 15 ± 2,4% de redução abaixo dos valores basais; p > 0,05; n = 3-5). Bbil-TX (210 nM) causou aumento nos valores de conteúdo quântico de preparações TSn-m mantidas em baixo Ca2+ [de 9,6 ± 1,1 (t0) para 31,4 ± 7,7 (t60), p < 0,05; n = 4]. O veneno (3 ?g/mL) e toxina (210 nM) induziram aumento na fluorescência ao cálcio em células SK-N-SH marcadas com indicador sensível ao Ca2+ Fluo3 AM (4 ?M) e mantidas em solução fisiológica com normais condições de Ca2+ ou com baixo Ca2+. Em células mantidas em Ca2+ normal, o aumento na amplitude de fluorescência foi acompanhado por irregular e frequente movimento de Ca2+. Em preparações TSn-m marcadas com Fluo4 AM (4 ?M), o veneno de B. b. smaragdina causou imediato aumento na concentração de Ca2+ intracelular de fibras musculares seguido por frequente oscilação na fluorescência e contratura muscular; Bbil-TX não induziu nenhuma alteração na fluorescência ao cálcio em fibras musculares de preparações TSn-m. Secções de preparações NFD pré-tratadas com Bbil-TX (210 nM) destinadas à imunohistoquímica foram marcadas positivamente para receptores juncionais de ACh mas houve perda de marcação para as proteínas pré-sináptica sinaptofisina e SNAP25. Juntos, estes dados indicam que Bbil-TX tem alta seletividade de ação sobre a região pré-sináptica semelhantemente a outras neurotoxinas PLA2 modulando a atividade neuromuscular do veneno de B. b. smaragdina / Abstract: In this work, we examined the neuromuscular activity of Bothriopsis bilineata smaragdina (forest viper) venom and its toxin Bbil-TX (Asp49 phospholipase A2) in vertebrate isolated nerve-muscle preparations. In chick biventer cervicis preparations (BC) the venom caused concentration-dependent (0.1-30 ?g/ml) neuromuscular blockade that was not reversed by washing, with 50% blockade occurring in 15-90 min. Muscle contractures to exogenous acetylcholine and KCl were unaffected by the venom, but there was a slight increase in creatine kinase release after 60 min [IU/ml: from 80 ± 15 (basal) to 113 ± 22; n = 6; p > 0.05]. In mouse phrenic nerve-diaphragm preparations (PND), the venom (1, 10 and 30 ?g/ml) produced marked facilitation (~120% increase above basal) at the highest concentration followed by neuromuscular blockade; the effects at lower concentrations were considerably less marked. The venom increased quantal content values after 15 and 30 min followed by significant inhibition at ?90 min. However, the venom did not alter the muscle membrane resting potential or the response to exogenous carbachol. In both preparations, incubation at 22 °C instead of 37 °C delayed the onset of blockade, as did inhibition of venom PLA2 activity. In curarized mouse preparations, the venom produced only muscle facilitation. These results indicate that B. b. smaragdina venom causes neuromuscular blockade in vitro by a presynaptic mechanism involving PLA2. It was also investigated the neuromuscular activity of Bbil-TX, a PLA2 with catalytic activity isolated from B. b. smaragdina venom, in BC and PND preparations. In BC preparations, Bbil-TX (35-702 nM) caused time- and concentration-dependent blockade that was not reversed by washing; the times for 50% blockade were 87 ± 7, 41 ± 7 and 19 ± 2 min (mean ± SEM; n = 4-6) for 70, 351 and 702 nM, respectively. Muscle contractures to exogenous ACh and KCl were unaffected. The toxin (702 nM) also did not affect the twitch-tension of directly stimulated, curarized (d-Tc, 14.8 ?M) BC preparations. However, Bbil-TX (702 nM) produced mild morphological alterations (edematous and/or hyperchromic fibers) in BC; there was also a progressive release of CK [IU/ml: from 116 ± 17 (basal) to 961 ± 48 after 60 min; n = 6; p < 0.05]. Bbil-TX (351 nM)-induced blockade was markedly inhibited at 22-24 °C and pretreatment with p-BPB abolished the neuromuscular blockade. Bbil-TX (210 nM, 702 nM and 2 ?M; n = 4-6) caused partial time- and concentration-dependent blockade in PND preparations (52 ± 2% at the highest concentration). Bbil-TX (2 ?M) markedly reduced the MEPPs frequency/min [from 26 ± 2.5 (basal) to 10 ± 1 after 60 min; n = 5; p < 0.05] and the quantal content [from 94 ± 14 (basal) to 24 ± 3 after 60 min; n = 5; p < 0.05] of PND preparations, but caused only minor depolarization of the membrane resting potential [from -80 ± 1 mV (basal) to -66 ± 2 mV after 120 min; n = 5; p < 0.05], with no significant change in the depolarizing response to exogenous carbachol. These results show that Bbil-TX is a presynaptic PLA2 that contributes to the neuromuscular blockade caused by B. b. smaragdina venom. The neuromuscular activity of B. b. smaragdina venom and the mechanism of action of Bbil-TX on peripheral nervous system have been further examined in mouse nerve-muscle preparations in vitro. In PND preparations maintained in low Ca2+ physiological salt solution (PSS), B. b. smaragdina venom (3 ?g/ml) caused a triphasic change in twitch height while the xv highest concentration (10 ?g/ml) produced an abrupt and marked initial contracture which was followed by neuromuscular facilitation, rhythmic oscillation of nerve evoked twitch, alteration in base line and progressive blockade. The venom also slowed the relaxation phase of the muscle twitch increasing the constant decay time. Under low Ca2+ conditions, Bbil-TX caused a progressive increase in twitch amplitude (83 ± 19 % above basal values after 120 min) in PND preparations; there was no change in the constant decay time after treatment with toxin. B. b. smaragdina venom (10 ?g/ml) and Bbil-TX (210 nM) caused minor changes in the amplitude of the compound action potential (CAP) recorded from SN preparations (venom: 20 ± 2.1 % and toxin: 17 ± 2.4 % of reduction below basal values; n = 3; p < 0.05) and no significant effect on rise time and latency; tetrodotoxin (3.1 M) blocked the CAP at the end of the experiments. In TSn-m preparations, both venom (10 ?g/ml) and Bbil-TX (210 nM) caused significant reduction in the perineural waveform associated with the outward K+ current (venom: 35 ± 7.2 % and toxin: 26 ± 1.4 % of reduction below basal values; p < 0.05; n = 3-5) while the amplitude of the inward Na+ current was not significantly affected (venom: 18 ± 3.3 % and toxin: 15 ± 2.4 % of reduction below basal values; p > 0.05; n = 3-5). Bbil-TX (210 nM) caused progressive increase in quantal content in TSn-m preparations maintained in low Ca2+ PSS [from 9.6 ± 1.1 (t0) to 31.4 ± 7.7 (t60), p < 0.05; n = 4]. Venom (3 ?g/ml) and toxin (210 nM) induced increase in calcium fluorescence in neuroblastoma cell line SK-N-SH loaded with calcium sensitive indicator Fluo3 AM (4 ?M) and maintained in low Ca2+ or normal Ca2+ PSS. In those cells maintained in normal Ca2+ PSS, the increase in fluorescence amplitude was accompanied by irregular and frequent calcium transients. In TSn-m preparations loaded with Fluo4 AM (4 ?M), B. b. smaragdina venom (10 ?g/ml) caused immediate increase in Ca2+ intracellular of muscle fibres followed by frequent oscillation in fluorescence and muscle contracture; Bbil-TX did not induce any change in calcium fluorescence in TSn-m preparations. Immunohistochemical sections of PND preparations pretreated with Bbil-TX (210 nM) were labeled positively for junctional ACh receptors but there was loss of labeling for presynaptic proteins synaptophysin and SNAP25. Together, these data indicate that Bbil-TX has high selectivity of action under the presynaptic region similarly as other PLA2 neurotoxins modulating the neuromuscular activity of B. b. smaragdina venom / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia

Orientadores: Lea Rodrigues Simioni, Yoko Oshima Franco / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T01:04:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_SandroRostelato_M.pdf: 1413633 bytes, checksum: 6030097384697994f16895f8fb1a4c92 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O veneno de Bothrops jararacussu (Bjssu) e sua miotoxina bothropstoxina-I (BthTX-I), induzem neurotoxicidade e miotoxicidade. Como o tratamento com o antiveneno é pouco eficaz contra a miotoxicidade, muitos estudos têm sido realizados utilizando substâncias que neutralizem a atividade miotóxica induzida pelo veneno, entre elas, a heparina. Os objetivos deste trabalho foram: 1) verificar o efeito da heparina sobre a miotoxicidade induzida pelo veneno e toxina, utilizando-se uma baixa concentração de heparina, porém capaz de impedir o bloqueio neuromuscular e, 2) esclarecer o papel protetor da heparina contra Bjssu. Controles foram realizados com antiveneno botrópico (AVB) comercial ou solução nutritiva de Tyrode ou salina. Para avaliar a neurotoxicidade empregou-se técnica miográfica convencional em preparações nervo frênico-diafragma de camundongos (in vitro) e nervo ciático poplíteo externo-tibial anterior de ratos (in vivo); para avaliar a miotoxicidade in vitro empregou-se a técnica histológica (microscopia óptica) e in vivo a dosagem bioquímica da creatinoquinase (CK); para avaliar o papel protetor da heparina empregou-se a protamina, um antagonista farmacológico. Os resultados obtidos in vitro mostraram que a resposta contrátil de 12 ± 2% (n=6) frente à incubação com Bjssu (40 µg/mL) por 120 min foi aumentada para 79,6 ± 5,9% (n=6) quando pré-incubado com heparina (5 UI/mL) e 68,3 ± 6,2% (n=6) quando pré-incubado com AVB (120 µL/mL); na mesma situação a BthTX-I (2,9 µM) passou de 5 ± 1,3% (n=8) para 78,8 ± 6,8% (n=8) com heparina e 62,3 ± 6,1% (n=6) com AVB. A média da quantificação do dano morfológico (leitura de três diferentes observadores) mostrou que o veneno provocou lesões de 27% e a toxina de 40%, que passaram para níveis de 5% e 9%, respectivamente, quando tratadas com heparina e 11% e 3% quando com AVB. Os pré-tratamentos não apresentaram diferença significativa em relação ao controle Tyrode. Os resultados in vivo (em ratos) mostraram que as mesmas concentrações de veneno e toxina utilizadas nos ensaios in vitro não provocaram alterações na resposta contrátil; contudo, quando injetados no músculo gastrocnêmio de camundongos, apresentaram níveis plasmáticos de CK (U/L) de: 1454 ± 185 (Bjssu, n=6) diminuindo (P<0,05) para 236 ± 40 (com heparina, n=6) e 47 ± 5 (com AVB, n=6); 1531 ± 166 (BthTX-I, n=5) diminuindo (P<0,05) para 900 ± 149 (com heparina, n=5) e 935 ±135 (com AVB, n=5). A adição de protamina (0,8 UI/mL) aos 15 minutos de incubação da mistura heparina + veneno causou o bloqueio neuromuscular característico do veneno em preparações in vitro. Conclui-se que a heparina é mais eficaz (mas pode ser totalmente bloqueada pela protamina) que o AVB quanto a sua capacidade de impedir a neurotoxicidade in vitro causada por Bjssu e BthTX-I, e que nas mesmas concentrações a heparina demonstrou nenhuma neurotoxicidade in vivo (ratos) e que ela é tão eficiente quanto o AVB na miotoxicidade in vitro, mas menos eficaz in vivo em relação ao veneno bruto / Abstract: Bothrops jararacussu venom (Bjssu) and its myotoxin bothropstoxin-I (BthTX-I) induce neurotoxicity and myotoxicity. Since the treatment with the antivenom is weakly efficient against the myotoxicity, many reports concentrate on studies utilizing substances that neutralize the myotixicity activity induced by the venom, including heparin. The objectives of this work were: 1) to examine the effect of heparin on the myotoxicity induced by venom and toxin, using a low heparin concentration, capable to prevent the neuromuscular blockade and, 2) to examine the protective role of heparin against Bjssu. Control experiments were performed with commercial bothropic antivenom (CBA), Tyrode solution or saline. To examine the neurotoxicity, a conventional myoghraphic technique was used in studies with mouse phrenic nerve-diaphragm preparations (in vitro) and rat popliteal external nerve/muscle anterior tibialis (in vivo). Histological technique (light microscopy) and biochemical measurement of creatine kinase (CK) were used to examine the myotoxicity in vitro e in vivo, respectively. Protamine (a pharmaceutical antagonist) was used to evaluate the protective role of heparin. The results in vitro showed that the twitch-tension of 12 ± 2% in the presence of Bjssu (40 µg/mL; n=6) after 120 min was increased to 79.6 ± 5.9% when preincubated with heparin (5 UI/ml; n=6) and 68.3 ± 6.2% when preincubated with CBA (120 µL/mL; n=6). Similarly, the BthTX-I (2.9 µM) - induced responses amounted to 5 ± 1.3% (n=8) and 78.8 ± 6.8% with heparin (n=8) and 62.3 ± 6.1% with CBA (n=6). The quantification of morphological changes showed that the venom induced a damage of 27% and the toxin of 40%, which were reduced to 5% and 9%, when treated with heparin and 11% and 3% with CBA, respectively. The pre-treatment did not cause significant differences compared to Tyrode solution. The results in vivo showed that the same concentrations of venom and toxin utilized in in vitro assays did not induce alteration in twitch-tension. However, when injected in mouse gastrocnemius muscle, plasma levels of CK (U/l) of 1454 ± 185 (in the presence of Bjssu, n=6) were decreased to 236 ± 40 (heparin, n=6) and 47 ± 5 (CBA, n=6). Similarly, a value of 1531 ± 166 in the presence of BthTX-I (n=5) was decreased to 900 ± 149 (heparin, n=5) and 935 ±135 (CBA, n=5). The addition of protamine (0.8 UI/ml) at 15 min incubation of the mixture heparin+venom, induced a neuromuscular blockade similar to the venom in in vitro preparations. We conclude that heparin is more efficient (although totally antagonized by protamine) than CBA with respect to the in vitro neurotoxicity induced by Bjssu and BthTX-I, which did not cause myotoxicity in vivo (rats). Heparin is as efficient as CBA in myotoxicity in vitro, but less efficient in vivo compared to the crude venom / Mestrado / Mestre em Farmacologia