Los peces carnívoros presentan baja capacidad para utilizar carbohidratos provenientes de la dieta y controlar los niveles de glucosa en sangre. En comparación con los mamíferos, estos animales tras la ingesta de glucosa o de dietas con alto contenido en carbohidratos, muestran una hiperglucemia mas prolongada. La alanina aminotransferasa (ALT) constituye un nexo de interacción entre el metabolismo de aminoácidos y el de carbohidratos al catalizar la reacción de la transaminación reversible entre L-alanina y 2-oxoglutarato para formar piruvato y L-glutamato. Estudios previos de nuestro grupo indicaron la presencia de tres isoformas ALT en dorada (Sparus aurata): las isoenzimas citosólicas cALT1 y cALT2 y una isoforma mitocondrial, mALT. En hígado de dorada, la expresión de cALT2 incrementa en situación de gluconeogénesis mientras que cALT1 predomina durante el período postprandial para la utilización de los nutrientes de la dieta. El objetivo general del presente estudio es comprender a nivel molecular los efectos metabólicos derivados de la inhibición de ALT en peces para ayudar a establecer nuevas aplicaciones biotecnológicas orientadas a mejorar la utilización de los nutrientes de la dieta. Así, en acuicultura, identificar los efectos metabólicos asociados a la modulación de la actividad ALT constituye un punto de interés para conocer si es posible efectuar una sustitución parcial de las proteínas de la dieta por carbohidratos u otros nutrientes, a fin de reducir el coste de la producción en acuicultura y disminuir la eutrofización de las aguas del entorno. Nuestros estudios muestran que la inyección intraperitoneal de doradas con nanopartículas del complejo pCpG-siRNA-quitosán resultó adecuada para promover la expresión de un siRNA para bloquear la expresión de cALT1 en hígado de Sparus aurata. La inyección intraperitoneal de nanopartículas de pCpGsi1sh1-quitosán promovió la silenciación de cALT1 a nivel de mRNA y actividad enzimática en hígado de dorada. Por otra parte, hemos analizado la inhibición postranscripcional de la actividad ALT in vivo e in vitro con el compuesto aminooxiacetato (AOA) y analizado los cambios promovidos en metabolitos y enzimas clave en el metabolismo intermediario de carbohidratos y proteínas en hígado de Sparus aurata, tras la ingesta del AOA con dietas de diferente composición. In vitro, el AOA ejerce una inhibición dependiente de dosis sobre la actividad ALT hepática citosólica y mitocondrial. In vivo, el AOA se comportó como inhibidor de la actividad ALT citosólica hepática, pero no de la mitocondrial. Una exposición a largo plazo a AOA promovió un aumento de la actividad piruvato quinasa en el hígado de dorada, independientemente de la composición de la dieta suministrada a los peces. Los estudios de 1H-RMN mostraron que la inclusión de AOA en la dieta promueve una disminución en los niveles hepáticos de alanina, glutamato y glucógeno. Adicionalmente, los análisis de 2H-RMN indicaron una tasa de renovación más alta de alanina en el hígado de los peces alimentados con una dieta con un contenido alto en carbohidratos y bajo en proteínas y que el AOA disminuye el enriquecimiento de alanina en 2H independientemente de la composición de la dieta. Los estudios derivados de esta tesis indican que la inhibición dependiente de AOA de la actividad de la ALT citosólica podría contribuir a aumentar el uso de nutrientes por carbohidratos de la dieta de Sparus aurata. / Carnivorous fish have low ability to utilize dietary carbohydrates and controlling blood glucose levels. Compared with mammals, these animals after ingestion of glucose or diets high in carbohydrates show a more prolonged hyperglycemia. Alanine aminotransferase (ALT) links carbohydrate and amino acid metabolism through catalysing the reversible transamination between L-alanine and 2-oxoglutarate to form pyruvate and L-glutamate. Previous studies from our group indicated the presence of three isoforms ALT bream (Sparus aurata): cALT1 cytosolic isoenzymes and cALT2 and a mitochondrial isoform, mALT. In the liver os Sparus aurata cALT2 expression increases gluconeogenesis situation prevails while cALT1 during the postprandial period for the utilization of dietary nutrients. The overall objective of this study is to understand at a molecular level the resulting metabolic effects from the inhibition of ALT in fish to help establish new biotechnological applications aimed to improve the use of dietary nutrients. Thus in aquaculture, identifying metabolic effects associated with ALT activity modulation is a point of interest to know if it is possible to perform a partial replacement of dietary proteins by carbohydrate or other nutrients, to reduce the cost of Aquaculture production and reduce eutrophication of the environment. Our studies show that intraperitoneal injection of a chitosan-pCpG-siRNA nanoparticles complex to Gilthead seabream proved to be suitable for the expression of a siRNA to silence the expression of liver cALT1 in Sparus aurata. Intraperitoneal injection of pCpGsi1sh1-chitosan nanoparticles complex promoted cALT1 silencing at the mRNA level and a decrease of liver enzyme activity of Gilthead seabream. In the present study amino-oxyacetate (AOA) was used to evaluate its effect on liver ALT activity of the carnivorous fish Sparus aurata. Moreover, the derived metabolic effects on metabolites and other key enzymes of glycolysis, gluconeogenesis and the pentose phosphate pathway were also studied. A dose-effect-dependent inhibition of AOA on hepatic cytosolic and mitochondrial ALT activity was observed in vitro. In vivo, AOA behaved as an inhibitor of hepatic cytosolic ALT activity. A long-term exposure to AOA increased pyruvate kinase activity in the liver irrespective of the composition of the diet supplied to fish. 1H NMR studies showed that inclusion of AOA to the diet decreased the hepatic levels of alanine, glutamate and glycogen. Moreover, 2H NMR analysis indicated a higher renewal rate for alanine in the liver of fish fed with a high-carbohydrate/low-protein diet, while AOA decreased alanine 2H-enrichment irrespective of the diet. The present study indicates that AOA-dependent inhibition of the cytosolic ALT activity could help to increase the use of dietary carbohydrate nutrients by the Sparus aurata fish.

Subprojeto 1: Determinação do efeito anti-inflamatório e citoprotetor da suplementação com L-glutamina e L-alanina, ou com L-alanil-L-glutamina (DIP) em ratos submetidos a treinamento resistido. Exercícios intensos reduzem a disponibilidade de glutamina, comprometendo a função imune e a recuperação de atletas. O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos da suplementação oral crônica com L-glutamina e L-alanina, nas formas livres ou como dipeptídeo (DIP), sobre parâmetros de lesão, inflamação e citoproteção em ratos Wistar adultos submetidos a treinamento resistido (TR). Neste estudo, o TR reduziu a concentração de glutamina no plasma e no músculo EDL. No entanto, este efeito foi atenuado pelos suplementos contendo L-glutamina, os quais aumentaram os conteúdos da proteína de resposta ao estresse (HSP70) em células do sistema imune (PBMC) e no EDL, concomitantemente à redução da ativação do NF-kB e a da concentração de citocinas no EDL. O efeito protetor das suplementações também foi evidenciado pela atenuação de marcadores de lesão (CK e LDH) e inflamação (TNF-&#945 e IL-1&#946), bem como pelo aumento nas concentrações de marcadores anti-inflamatórios (IL-6, IL-10 e MCP-1) no plasma. Nossos resultados sugerem que a suplementação oral crônica com L-glutamina (administrada com L-alanina livre ou como DIP) promoveu efeitos citoprotetores mediados pela HSP70 em resposta à lesão e inflamação induzidas pelo TR. Subprojeto 2: Efeitos da L-alanil-L-glutamina sobre as vias de sinalização da insulina e da mTOR/S6K, e citoproteção em células musculoesqueléticas C2C12. O dipeptídeo L-alanil-L-glutamina é conhecido por modular o metabolismo e a viabilidade celular. Contudo, os efeitos sobre os componentes clássicos das vias de sinalização da insulina e da mTOR/S6K, bem como o efeito citoprotetor em células musculares, são pouco esclarecidos. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito do DIP sobre as vias de sinalização da insulina e da mTOR/S6K em miotubos C2C12, em condições normais ou resistentes à insulina. A exposição crônica à insulina (24h) promoveu resistência à insulina, reduzindo os conteúdos totais do receptor beta (IR-β) e do substrato do receptor de insulina (IRS-1), e diminuindo a fosforilação de IRS-1, AKT e P44/42 MAPK. Adicionalmente, houve redução na expressão do transportador de glicose (GLUT4) e HSP70, redução da viabilidade celular e menor fosforilação de p70S6k e S6, proteínas relacionadas à síntese proteica. Em contraste, a suplementação com DIP aumentou os conteúdos totais de IR-&#946 e IRS-1 e a fosforilação de IRS-1 e AKT. A glicólise anaeróbia e a capacidade glicolítica, além da fosforilação de p70S6k e S6, foram aumentadas pelo DIP em condições normais e na resistência à insulina. Nestas condições experimentais, nossos resultados sugerem que a suplementação com DIP melhorou as vias de sinalizações da insulina e da mTOR/S6K, aumentou a captação e metabolização da glicose, independente da estimulação com insulina e, finalmente, promoveu citoproteção resgatando parcialmente as células de um estado resistente à insulina, por meio do aumento de HSP70 e ativação das etapas finais da via mTOR/S6K. / Subproject 1: Determination of the anti-inflammatory and cytoprotective effects of supplementation with L-glutamine and L-alanine, or with L-alanyl-L-glutamine in rats submitted to resistance training. Intense exercise reduces glutamine availability, compromising immune function and recovery of athletes. The objective of the study was to evaluate the effects of chronic oral supplementation with L-glutamine and L-alanine, in their free form or as dipeptide (DIP), on muscle damage, inflammation and cytoprotection in adult Wistar rats submitted to resistance training (RT). In this study, RT reduced glutamine concentration in plasma and EDL muscle. However, this effect was attenuated by supplements containing L-glutamine, which increased the contents of the stress response protein (HSP70) in immune system cells (PBMC) and EDL, concomitantly with the reduction of NF-kB activation and the concentration of cytokines in EDL. The protective effect of supplementation was also evidenced by attenuation of lesion markers (CK and LDH) and inflammation (TNF-α and IL-1β), as well as by the increase in anti-inflammatory plasma markers (IL-6, IL-10 and MCP-1). Our results suggest that chronic oral supplementation with L-glutamine (administered along with free L-alanine or as DIP) promoted HSP70-mediated cytoprotective effects in response to RT-induced injury and inflammation. Subproject 2: Effects of L-alanyl-L-glutamine on the components of insulin and mTOR/ S6K signaling pathways and cytoprotection in C2C12 musculoskeletal cells. The dipeptide L-alanyl-L-glutamine is known to modulate metabolism and cell viability. However, the effects on the classical components of insulin and mTOR/ S6K signaling pathways, as well as the cytoprotective effect on muscle cells, are poorly understood. The aim of this study was to investigate the effect of DIP on insulin and mTOR/ S6K signaling pathways in C2C12 myotubes, under normal or insulin resistant conditions. Chronic insulin exposure (24h) promoted insulin resistance, reducing the total contents of the insulin receptor (IR-&#946) and the insulin receptor substrate (IRS-1), and decreasing the phosphorylation of IRS-1, AKT and P44/ 42 MAPK. In addition, there was a reduction in the expression of glucose transporter (GLUT4) and HSP70, reduction of cell viability and defective phosphorylation of p70S6k and S6, which are related to protein synthesis. On the other hand, DIP supplementation increased the total contents of IR-&#946 and IRS-1 and the phosphorylation of IRS-1 and AKT. Anaerobic glycolysis and glycolytic capacity, in addition to phosphorylation of p70S6k and S6, were increased by DIP under normal conditions and in insulin resistance. In our experimental conditions, our results suggest that DIP supplementation improved the signaling pathways of insulin and mTOR/ S6K, increased glucose uptake and metabolism, independent of insulin stimulation, and finally promoted cytoprotection by partially rescuing the cells of an insulin resistant state, by increasing HSP70 and activating the final stages of the mTOR/ S6K pathway.

Historicamente a radioterapia é divida em radioterapia externa, braquiterapia e radioisotopoterapia sistemática. As diferenças entre as três está no posicionamento da fonte de radiação com respeito ao corpo humano. Na radioterapia externa a fonte fica a uma certa distância do paciente, já no caso da braquiterapia as fontes podem ser inseridas dentro de cavidades do corpo ou implantadas diretamente nos tecidos. Na radioisotopoterapia sistemática isótopos radiativos são administrados por via oral ou venosa. Dessas três a radioterapia externa é a mais usada pois, ela permite realizar planejamentos de radioterapia em três dimensões (3D), partindo inicialmente de uma tomografia computadorizada da região do tumor. O planejamento baseado na tomografia computadorizada permite que a distribuição da radiação nos tecidos seja feito com mais precisão evitando assim, que os tecidos sadios sejam afetados. Nesse trabalho a radioterapia externa convencional, foi implementada e executada para um tratamento de próstata com implantes metálicos, usando 4 campos de irradiação (0, 90, 180, 270 graus) e uma dose total planejada de 70 Gy fracionada em 35 sessões, cada uma com 2 Gy. Em qualquer tipo de tratamento que envolva a radiação ionizante é exigido um controle de qualidade para assim, determinar se a dose inicialmente planejada será entregue ou não ao tumor. Idealmente deveria ser implementado um controle de qualidade em três dimensões mas, até o momento não há um dosímetro 3D consolidado na rotina clinica. No entanto, o uso de géis poliméricos associados à técnica de leitura de dose com imagem de ressonância magnética (IRM) possibilita a dosimetria tridimensional. Nesse contexto, é aplicada a dosimetria 3D usando para isso, o gel magic com formaldeído (magic-f). Além da dosimetria 3D, foram realizadas medidas de dose absorvida por meio de dosimetria pontual, para tal fim são utilizados dosímetros termoluminescentes e de alanina. Na avaliação da distribuição de dose feita pelo planejamento e a medida com o gel é usado a análise gama (3%/3mm), neste caso, a distribuição de dose medida concorda com a distribuição de dose planejada TPS. A análise gama apresenta um porcentagem de aprovação do 93%. Os valores de dose absorvida na interface osso-metal determinados pelos dosímetros TL apresentam um aumento de 1,73 Gy na região do osso sacro e outros aumentos entre o 0,16 e 0,33 Gy foram encontrados em regiões como a cabeça do fêmur e quadril. Esses aumentos na dose foram só para duas sessões com doses entregadas ao fantom de 2 Gy. De igual maneira para os dosímetros de alanina se encontro um aumento na dose de 1,22 e 2,42 Gy na região do osso sacro. O planejamento feito nesse caso foi de 6 Gy. Os resultados evidentemente mostram como as inomogeneidades de um material com número atómico alto, gera perturbações sobre as distribuições de dose inicialmente planejadas. / Historically, Radiotherapy is divided into external radiotherapy, brachytherapy and systemic radioisotopotherapy. The difference between the three lies in the position of the radiation source regarding the human body. In external radiotherapy the source is at a certain distances of patient, and in the case of brachytherapy, this source can be inserted into cavities of body or implanted directly in the tissues. In systemic radiotherapy radioisotopes are administered orally or intravenously. Of these three, external radiotherapy is the most used because it allows planning of radiotherapy in three dimensions (3D), starting from a CT scan of the tumor region. Computed tomography planning allows the distribution of radiation in the tissues to be more accurate thus avoiding, that healthy tissues are affected. In our case, conventional external radiotherapy was implemented and executed for a prostate treatment with metal implants, using 4 irradiation fields (0, 90, 180, 270 degrees) and a total planned dose of 70 Gy fractioned in 35 sessions each with 2 Gy. In any type of treatment involving ionizing radiation, quality control (QC) is required to determine if the dose initially planned is delivered or not to the tumor. Ideally, a quality control should be implemented in three dimensions but to date there is no consolidated 3D dosimeter system in the clinic routine. However, the used of polymeric gels associated with magnetic resonance image (IRM) allow three-tridimensional dosimetry. In this context, the 3D dosimetry is applied using the magic gel with formaldehyde (magic-f). In addition to 3D dosimetry, absorbed dose measurements were performed by means of a dose in a point, using thermoluminescent and alanine dosimeters. The comparison of dose distributions calculated by TPS and measured in the gel was made using by gamma analysis (3% / 3mm), in this case, the distribution of dose measurement agrees with the distributions expected by TPS. The analysis shows a percentage of approval of 93%. The absorbed dose values at the bone-metal interface determined by the TL dosimeters, presented a 1.73 Gy increase in the region of the sacral bone, and another increases between 0,16 and 0,33 Gy were found in the regions as the head of the femur and the hip. These dose increases were only for two sessions with doses delivered to the phanton of 2 Gy. Similarly for alanine dosimeters were found increases in the dose of 1.22 and 2.42 Gy in the region of sacral bone. The planning done in this case was 6 Gy. The results evidently show how the inomogeneities of a material with a high atomic number generate disturbances over the initially planned dose distributions.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:48:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:59:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 09619.pdf: 5936704 bytes, checksum: a799cb7aade21da395953ba57cba7dcc (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Historicamente a radioterapia é divida em radioterapia externa, braquiterapia e radioisotopoterapia sistemática. As diferenças entre as três está no posicionamento da fonte de radiação com respeito ao corpo humano. Na radioterapia externa a fonte fica a uma certa distância do paciente, já no caso da braquiterapia as fontes podem ser inseridas dentro de cavidades do corpo ou implantadas diretamente nos tecidos. Na radioisotopoterapia sistemática isótopos radiativos são administrados por via oral ou venosa. Dessas três a radioterapia externa é a mais usada pois, ela permite realizar planejamentos de radioterapia em três dimensões (3D), partindo inicialmente de uma tomografia computadorizada da região do tumor. O planejamento baseado na tomografia computadorizada permite que a distribuição da radiação nos tecidos seja feito com mais precisão evitando assim, que os tecidos sadios sejam afetados. Nesse trabalho a radioterapia externa convencional, foi implementada e executada para um tratamento de próstata com implantes metálicos, usando 4 campos de irradiação (0, 90, 180, 270 graus) e uma dose total planejada de 70 Gy fracionada em 35 sessões, cada uma com 2 Gy. Em qualquer tipo de tratamento que envolva a radiação ionizante é exigido um controle de qualidade para assim, determinar se a dose inicialmente planejada será entregue ou não ao tumor. Idealmente deveria ser implementado um controle de qualidade em três dimensões mas, até o momento não há um dosímetro 3D consolidado na rotina clinica. No entanto, o uso de géis poliméricos associados à técnica de leitura de dose com imagem de ressonância magnética (IRM) possibilita a dosimetria tridimensional. Nesse contexto, é aplicada a dosimetria 3D usando para isso, o gel magic com formaldeído (magic-f). Além da dosimetria 3D, foram realizadas medidas de dose absorvida por meio de dosimetria pontual, para tal fim são utilizados dosímetros termoluminescentes e de alanina. Na avaliação da distribuição de dose feita pelo planejamento e a medida com o gel é usado a análise gama (3%/3mm), neste caso, a distribuição de dose medida concorda com a distribuição de dose planejada TPS. A análise gama apresenta um porcentagem de aprovação do 93%. Os valores de dose absorvida na interface osso-metal determinados pelos dosímetros TL apresentam um aumento de 1,73 Gy na região do osso sacro e outros aumentos entre o 0,16 e 0,33 Gy foram encontrados em regiões como a cabeça do fêmur e quadril. Esses aumentos na dose foram só para duas sessões com doses entregadas ao fantom de 2 Gy. De igual maneira para os dosímetros de alanina se encontro um aumento na dose de 1,22 e 2,42 Gy na região do osso sacro. O planejamento feito nesse caso foi de 6 Gy. Os resultados evidentemente mostram como as inomogeneidades de um material com número atómico alto, gera perturbações sobre as distribuições de dose inicialmente planejadas. / Historically, Radiotherapy is divided into external radiotherapy, brachytherapy and systemic radioisotopotherapy. The difference between the three lies in the position of the radiation source regarding the human body. In external radiotherapy the source is at a certain distances of patient, and in the case of brachytherapy, this source can be inserted into cavities of body or implanted directly in the tissues. In systemic radiotherapy radioisotopes are administered orally or intravenously. Of these three, external radiotherapy is the most used because it allows planning of radiotherapy in three dimensions (3D), starting from a CT scan of the tumor region. Computed tomography planning allows the distribution of radiation in the tissues to be more accurate thus avoiding, that healthy tissues are affected. In our case, conventional external radiotherapy was implemented and executed for a prostate treatment with metal implants, using 4 irradiation fields (0, 90, 180, 270 degrees) and a total planned dose of 70 Gy fractioned in 35 sessions each with 2 Gy. In any type of treatment involving ionizing radiation, quality control (QC) is required to determine if the dose initially planned is delivered or not to the tumor. Ideally, a quality control should be implemented in three dimensions but to date there is no consolidated 3D dosimeter system in the clinic routine. However, the used of polymeric gels associated with magnetic resonance image (IRM) allow three-tridimensional dosimetry. In this context, the 3D dosimetry is applied using the magic gel with formaldehyde (magic-f). In addition to 3D dosimetry, absorbed dose measurements were performed by means of a dose in a point, using thermoluminescent and alanine dosimeters. The comparison of dose distributions calculated by TPS and measured in the gel was made using by gamma analysis (3% / 3mm), in this case, the distribution of dose measurement agrees with the distributions expected by TPS. The analysis shows a percentage of approval of 93%. The absorbed dose values at the bone-metal interface determined by the TL dosimeters, presented a 1.73 Gy increase in the region of the sacral bone, and another increases between 0,16 and 0,33 Gy were found in the regions as the head of the femur and the hip. These dose increases were only for two sessions with doses delivered to the phanton of 2 Gy. Similarly for alanine dosimeters were found increases in the dose of 1.22 and 2.42 Gy in the region of sacral bone. The planning done in this case was 6 Gy. The results evidently show how the inomogeneities of a material with a high atomic number generate disturbances over the initially planned dose distributions.

[pt] Compostos orgânicos observados em corpos do espaço interplanetário são de particular importância para revelar os processos físico-químicos que podem estar relacionados com a origem da vida. Aminoácidos, como a alanina, devem ter desempenhado um papel crucial neste processo, uma vez que são componentes básicos das proteínas, constituintes essenciais de todos os organismos vivos. Informações sobre a radioresistência deles são essenciais para o desenvolvimento de modelos sobre como as moléculas prebióticas são formadas ou resistem a viagens no Sistema Solar e além. Em particular, a seção de choque de destruição por impacto de elétrons precisa ser conhecida e o processo da radiólise, entendido. O presente estudo visa determinar a dependência da seção de choque de destruição da alanina por impacto de feixe de elétrons com energias na faixa de 100 eV até 1 keV para alvos com espessura entre 10 nm e 1000 nm. A degradação da amostra pelo feixe de elétrons foi monitorada por espectroscopia no infravermelho (FTIR). Além disso, são apresentadas simulações feitas pelo método Monte Carlo para irradiações na alanina com feixes de elétrons de 250 eV até 5 keV. Infere-se pelas simulações do programa CASINO que os parâmetros considerados variam em função de E(1,7). Resultados experimentais indicam que a seção de choque de destruição efetiva diminui exponencialmente com a espessura da amostra até atingir um nível de saturação. A seção de choque de destruição efetiva aumenta com a energia incidente segundo a lei de potência E (1,76). Determinou-se os valores dos A-values para as bandas estudadas, através do método de espectroscopia no infravermelho, e são da ordem de 10(-18) cm(2)/molec. Encontrou-se um acordo qualitativo moderado entre os resultados da modelagem com os dados experimentais. Conclui-se que ele será sensivelmente melhorado se for acrescentado o processo de sputtering à radiólise analisada. / [en] Organic compounds observed in interplanetary space bodies are of particular relevance for revealing the physical-chemical processes that may be related to life s origin. Amino acids, such as alanine, are supposed to have played a crucial role in this process since they are basic components of proteins, essential constituents of all living organisms. Information about their radioresistance is essential for the development of models on how prebiotics molecules are formed or resist travelling in the Solar System and beyond; in particular the destruction cross-section by electron impact needs to be known and the radiolysis process needs to be understood. The current study aims to determine the dependence of alanine destruction cross-section on electron beam impact with energies in the range of 100 eV - 1 keV for thickness targets range of 10 nm - 1000 nm. The sample s degradation by the electron beam was monitored by infrared spectroscopy (FTIR). Moreover, simulations performed by Monte Carlo method for alanine irradiation with electron beam energies from 250 eV up to 5 keV are presented. It is inferred by the CASINO simulations, that the considered parameters vary as a function of E(1.7). Experimental results indicate that the effective destruction cross section decreases exponentially with the sample s thickness until it reaches a saturation level. The effective destruction cross section increases with incident energy according to the power law of E (1.76). The bands A-values were determined by infrared spectroscopy method and are in the order of 10(-18) cm(2)/molec. A moderate qualitative agreement was found between modeling results and the experimental data. It is concluded that it will be significantly improved if the sputtering process is added to the analyzed radiolysis.

Made available in DSpace on 2017-07-20T12:40:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Agnes Thiane Machado.pdf: 7176772 bytes, checksum: 01a4049f5c4aed0935803a0cf3a6468d (MD5) Previous issue date: 2017-03-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Study of protein three-dimensional structures allow us to investigate the relations between amino acid sequence, structure and function, what is important chiefly for proteins from pathogenic organisms or ones that belong to the same genus of these, such that they can be used as a structural model. In this context, this work aims at the structural characterization of the enzymes alanine racemase long isoform from Trypanosoma cruzi and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Naegleria gruberi. The long isoform of alanine racemase catalyzes the conversion between L and D-alanine which, in turn, is part of one of the metabolic pathways in Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease. The heterologous expression of this enzyme in Escherichia coli BL21 (DE3) GroEL was analyzed by SDS-PAGE, which revealed that the protein is in higher proportion in the insoluble fraction, thus it was necessary to establish a recovery protocol followed by an in vitro refolding. Data from enzymatic assays and circular dichroism revealed the success of the recovery/refolding protocol, which may in the future contribute to the search for specific inhibitors. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Naegleria gruberi catalyzes the sixth step of the organism’s glycolytic pathway. NgGAPDH enzyme was expressed in E. coli (DE3) using the pET-15b vector, and then purified by tree chromatographic steps, two of nickel affinity and one of size exclusion. The enzymatic characterization was investigated with the enzyme without the his-tag; NgGAPDH presented higher activity at pH 8.0, 25 °C and 10 mM of arsenate, and positive cooperativity for substrates G3P and NAD+. His-tag depleted NgGAPDH crystals appeared in 3 days after drop settings, the best crystal diffracted to 1.94 A resolution and belongs to space group P21 with cell parameters a = 83.74 A, b = 94.55 A, c = 90.93 A, = 99.96 °. The final refined structure presents R = 0.1652 and Rfree = 0.2029. The catalytic domain formed by residues 134 to 313 is highly conserved, as expected, with the exception of Asn145, present only in NgGAPDH, while the other GAPDHs present either Ser or Thr on the corresponding position. Molecular dynamics analysis revealed that Asn145 has correlated motion with residues Ala123, Thr125 and Pro126 that belong to what was called "bonded loop". It should be emphasized that this is the first GAPDH from the phylum Percolozoa that has its three dimensional structure determined and kinetic parameters established, such that we expect to have contributed to the understanding of the evolution of this class of proteins. / O estudo da estrutura tridimensional de proteínas nos permite investigar as relações entre sequência de aminoácidos, estrutura e função, o que é importante principalmente para proteínas de organismos patogênicos ou mesmo pertencente ao gênero destes, que podem ser utilizadas como modelo estrutural. Neste contexto, o presente trabalho visa caracterizar estruturalmente as enzimas alanina racemase isoforma longa de Trypanosoma cruzi e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Naegleria gruberi. A alanina racemase isoforma longa catalisa a conversão entre L e D-alanina em uma das vias metabólicas do T. cruzi, que é o agente etiológico da doença de Chagas. A análise por SDS-PAGE de amostras da expressão heteróloga dessa enzima em Escherichia coli BL21(DE3) GroEL revelou que a proteína está em maior proporção na fração insolúvel, por isso, foi necessário estabelecer um protocolo de recuperação seguido de um reenovelamento in vitro. Dados de ensaios enzimáticos e dicroísmo circular revelaram o sucesso do protocolo de recuperação/reenovelamento, o que poderá no futuro contribuir para a busca de inibidores específicos. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Naegleria gruberi catalisa a sexta etapa da via glicolítica do organismo. A enzima NgGAPDH foi expressa em E. coli (DE3) usando-se o vetor pET-15b e então purificada em três passos de cromatografia, dois por afinidade a níquel e um por exclusão por tamanho. A caracterização enzimática foi realizada com a enzima sem a ―his-tag‖; a NgGAPDH apresentou maior atividade em pH 8,0, 25 °C e 10 mM de arsenato, e cooperatividade positiva frente aos substratos G3P e NAD+. Cristais de NgGAPDH sem a ―his-tag‖ apareceram em 3 dias após montagem das gotas e o melhor difratou a 1,94 A de resolução, pertencendo ao grupo espacial P21 com parâmetros de cela a = 83,74 Å, b = 94,55 A, c = 90,93 A e = 99,96 °. A estrutura final refinada apresenta R = 0,1652 e Rfree = 0,2029. O domínio catalítico formado pelos resíduos 134 a 313 é altamente conservado, como esperado, com exceção da Asn145, presente somente em NgGAPDH, enquanto que as demais GAPDHs apresentam Ser ou Thr na posição correspondente. Análises por dinâmica molecular revelaram que a Asn145 tem correlação de movimento com os resíduos Ala123, Thr125 e Pro126, pertencentes ao que se chamou de ―bonded loop‖. Ressalte-se que esta é a primeira GAPDH do filo Percolozoa que tem sua estrutura tridimensional determinada e parâmetros cinéticos estabelecidos, tal que se espera contribuir para o entendimento da evolução dessa classe de proteínas.

Hepatite C tem evolução progressiva, persiste na maioria dos pacientes (85%) e leva a uma doença crônica assintomática.A maioria dos pacientes apresenta nível de ALT elevada e aproximadamente 25% normal. Estes geralmente são mulheres e não há associação entre genótipo e severidade da lesão hepática. Histologicamente apresentam lesão mínima e leve fibrose, embora cirrose tenha sido relatado.Visando estimar a prevalência, características demográficas, genotípicas e anatomopatológicas em pacientes com ALT normal, realizamos um estudo de série de 68 casos entre janeiro de 1997 a abril de 2000. A prevalência foi de 13,82%, 45,6% do gênero masculino e 54,4% feminino, média de idade 38 +/- 13 anos. Genótipo 1 em 84,75%, 2 em 6,78% e o 3 em 8,47%. Em 52,9% dos casos biópsia hepática revelou fígado reacional, porém uma importante proporção (29%) dos nossos pacientes com transaminases normais mostrou sinais de fibrose. Estes resultados sugerem a necessidade de revisar os algoritimos da prática de biópsia hepática nessa população / Hepatitis C evolves progressively persisting in the majority of patients (85%) resulting in na asymptomatic chronic disease.Most patients have high ALT levels and approximately 25% normal ALT.The latter are usually female and there is no association between genotype and severity hepatic lesion.Histology shows small lesion and low amount of fibrosis, despite cirrhosis having been reported.Aiming at assessing prevalence, demographic, genotypical and anatomopathological characteristics in patients with normal ALT levels, we studied a series of 68 cases between January 1997 and April 2000.There was a prevalence of 13,82%, 45,6% of which were male and 54,4% female, average age of 38+/-13 years.Genotype 1 in 84,75%, 2 in 6,78% and 3 in 8,47%.In 52,9% of the cases revealed liver reaction, however, an important proportion of patients showed histologic signs of fibrosis (29%).Theses results suggest the need to revisit the algorithm for liver biopsy practice

Hepatite C tem evolução progressiva, persiste na maioria dos pacientes (85%) e leva a uma doença crônica assintomática.A maioria dos pacientes apresenta nível de ALT elevada e aproximadamente 25% normal. Estes geralmente são mulheres e não há associação entre genótipo e severidade da lesão hepática. Histologicamente apresentam lesão mínima e leve fibrose, embora cirrose tenha sido relatado.Visando estimar a prevalência, características demográficas, genotípicas e anatomopatológicas em pacientes com ALT normal, realizamos um estudo de série de 68 casos entre janeiro de 1997 a abril de 2000. A prevalência foi de 13,82%, 45,6% do gênero masculino e 54,4% feminino, média de idade 38 +/- 13 anos. Genótipo 1 em 84,75%, 2 em 6,78% e o 3 em 8,47%. Em 52,9% dos casos biópsia hepática revelou fígado reacional, porém uma importante proporção (29%) dos nossos pacientes com transaminases normais mostrou sinais de fibrose. Estes resultados sugerem a necessidade de revisar os algoritimos da prática de biópsia hepática nessa população / Hepatitis C evolves progressively persisting in the majority of patients (85%) resulting in na asymptomatic chronic disease.Most patients have high ALT levels and approximately 25% normal ALT.The latter are usually female and there is no association between genotype and severity hepatic lesion.Histology shows small lesion and low amount of fibrosis, despite cirrhosis having been reported.Aiming at assessing prevalence, demographic, genotypical and anatomopathological characteristics in patients with normal ALT levels, we studied a series of 68 cases between January 1997 and April 2000.There was a prevalence of 13,82%, 45,6% of which were male and 54,4% female, average age of 38+/-13 years.Genotype 1 in 84,75%, 2 in 6,78% and 3 in 8,47%.In 52,9% of the cases revealed liver reaction, however, an important proportion of patients showed histologic signs of fibrosis (29%).Theses results suggest the need to revisit the algorithm for liver biopsy practice

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / No presente trabalho foram realizadas medidas de espalhamento Raman polarizado em cristais de L-metionina e de DL-alanina (dois aminoÃcidos) e em diversas amostras de nanotubos de carbono de parede simples (SWNT). As medidas de espalhamento Raman em cristais de L-metionina foram realizadas no intervalo espectral entre 50 cm-1 e 3100 cm-1 desde a temperatura ambiente atà a temperatura de 17 K. No intervalo de temperatura estudado a estrutura da L-metionina manteve-se estÃvel. à temperatura ambiente tambÃm foram realizadas medidas Raman em altas pressÃes hidrostÃticas. A mÃxima pressÃo atingida foi de 4,7 GPa e diversas modificaÃÃes nos modos associados Ãs unidades CO2, NH3, CC, CS, CH, CH2 e CH3 sugerem que a L-metionina sofre um transiÃÃo estrutural de fase em torno de 2,1 GPa com histerese de aproximadamente 0,8 GPa. No cristal de DL-alanina foram realizadas medidas de espalhamento Raman no intervalo de temperatura de 15 K a 295 K. Embora nenhuma mudanÃa significativa tenha sido observada neste intervalo de temperatura, os resultados sÃo importantes para se entender o comportamento de uma molÃcula fundamental na constituiÃÃo das proteÃnas. Medidas de espalhamento Raman em SWNTâs foram realizadas em amostras preparadas pela tÃcnica de arco voltÃico, utilizando-se vÃrios catalisadores metÃlicos. As amostras foram divididas em duas sÃries: A primeira com os catalisadores à base de MnNiCo e a segunda à base de FeNiCo. Em ambas as sÃries observou-se que a inserÃÃo de CÃrio (Ce) foi responsÃvel por tornar a distribuiÃÃo de diÃmetros do subconjunto ressonante com a energia 2,41 eV mais estreita. AlÃm disso, o mÃximo da distribuiÃÃo à deslocado para o azul, provavelmente em conseqÃÃncia da seleÃÃo de tubos de menor diÃmetro dentro do subconjunto estudado. A inserÃÃo de ZircÃnio (Zr) à segunda sÃrie nÃo trouxe mudanÃas significativas. Foram realizadas medidas de espalhamento Raman em funÃÃo da pressÃo hidrostÃtica em uma amostra comercial de SWNT. Como fluido transmissor foram utilizadas soluÃÃes de dois surfactantes: o dodecil sulfato de sÃdio (SDS) e o Ãcido plurÃnico F127 (F127). Devido à baixa relaÃÃo sinal-ruÃdo, nÃo foi possÃvel estudar o comportamento dos modos de respiraÃÃo radial (RBM), mas pela descontinuidade do grÃfico da freqÃÃncia em funÃÃo da pressÃo dos modos tangenciais em aproximadamente 2 GPa à provÃvel que os nanotubos sofram uma transiÃÃo de fase estrutural nessa pressÃo, com deformaÃÃo da seÃÃo circular dos tubos como predito por estudos teÃricos. Dois conjuntos de amostras contendo diferentes nÃveis de inserÃÃo de lÃtio tambÃm foram estudados por espectroscopia Raman. Cada conjunto era formado por uma amostra sem lÃtio, uma com lÃtio e a terceira com inserÃÃo parcial de lÃtio (obtida pela lavagem da amostra que contÃm lÃtio). Nos dois conjuntos a inserÃÃo foi eficiente, contudo o mecanismo de inserÃÃo à diferente de uma sÃrie para outra. Na primeira sÃrie o catalisador utilizado para a inserÃÃo de lÃtio foi LiNi0,5Co0,5O2. Com este composto o lÃtio à intercalado intersticialmente e pode ser removido quase que completamente pela lavagem da amostra. Jà na segunda sÃrie o composto utilizado foi LiCO3/NiO/CoO o que fez com que o lÃtio fosse intercalado dentro dos tubos de modo a nÃo ser removido pela lavagem da amostra. / This work describes polarized Raman scattering measurements in L-methionine and in DL-alanine (two amino acids) crystals and in several samples of single-walled carbon nanotubes (SWNT). In L-methionine crystal the Raman spectra were obtained from 17 K to 295 K in the spectral range from 50 cm-1 to 3100 cm-1, but no indication of a phase transition was observed. At room temperature, Raman scattering measurements were also performed for pressure up to 5 GPa. Several changes observed in the spectra were interpreted as due to structural phase transition undergone by L-methionine crystal at ~ 2.1 GPa. The results for decompression show that the phase transition is reversible with a hysteresis of ~ 0.8 GPa. In DL-alanine crystal the Raman spectra were obtained at temperatures from 15 K to 295 K over the spectral range 50 cm-1 - 3100 cm-1. No evidence of structural phase transition was found in this range of temperature, although information about diverse modes of the crystal were furnished. Samples of SWNTâs studied were prepared with metallic catalysts using the arc voltaic method. MnNiCo was the main compound of the first series and FeNiCo, the main compound of the second. In both sets it was observed that Cerium (Ce) insertion induces in the sub-set, probed with the 2.41 eV excitation energy, a narrowing of the diameter distribution favoring the tubes with smaller diameter. The Raman scattering measurements in a commercial sample of SWNTâs show a discontinuity at about 2 GPa. The discontinuity was represented by a changing in the slope of the frequency versus pressure for tangential modes. The measurement was performed twice, using two different solutions of surfactants, sodium dodecil sulfate (SDS) and plurocic acid F127 (F127), and the results were similar. The anomaly was interpreted as due to the deformation of the tubes as predicted theoretically. Two sets of three samples of SWNTâs containing different levels of lithium insertion were also analyzed by Raman spectroscopy. Each set of sample was formed by a sample with lithium, a sample without lithium and a sample with partial insertion of lithium. The results show that the lithium is efficiently intercalated with both lithium containing compound (LiCO3/NiO/CoO and LiNi0.5Co0.5O2), but the mechanism of intercalation differs from one to the other. The intercalation is unstable when lithium is intercalated interstitially (LiNi0.5Co0.5O2) and it can be removed almost completely by washing the sample, but if the lithium is intercalated inside the tubes (LiCO3/NiO/CoO) it can not be removed by the same process.