RESUMO BALDISSERA, J.L.C. Avaliação das diferentes metodologias de realização do ensaio clonogênico e validação do método de criopreservação e ressuspensão do sangue de cordão umbilical e placentário criopreservado. 2015, 78 f. Dissertação. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. O sangue de cordão umbilical e placentário (SCUP) tem sido utilizado como fonte de célulastronco hematopoéticas (CTHs) para transplante. A qualidade desse produto pode ser afetada durante as várias etapas do seu processamento. Neste estudo, foi avaliada a melhor metodologia de preparo da amostra para a realização do ensaio clonogênico (pura, diluída ou lavada) e validado o método de criopreservação e de ressuspensão das bolsas de SCUP. Foi avaliada também a funcionalidade da enzima aldeído desidrogenase (ALDH) como método para determinar a função das CTHs do SCUP, em 15 unidades criopreservadas pelo Laboratório de Criobiologia e Terapia Celular do Centro de Hematologia e Hemoterapia de Santa Catarina (HEMOSC). As unidades foram descongeladas em quatro etapas. O conteúdo dos segmentos e da bolsa foi coletado e ressuspenso com solução de albumina 5%, ACD 5% e solução fisiológica. A suspensão celular obtida foi utilizada para realização do ensaio clonogênico, avaliação da viabilidade celular, quantificação das células nucleadas (CN), CD34+ e das ALDH br . Os parâmetros tempo, custo e o resultado do ensaio clonogênico, utilizados para avaliar a metodologia, indicaram que a suspensão celular diluída é o melhor método a ser utilizado para a realização do ensaio clonogênico. A quantificação das CN e das células CD34+ totais pré-criopreservação e pós-criopreservação/descongelamento foi 8,3 (±1,9) x 10 8 e 8,2 (±2,0) x 10 8 (p = 0,3388) e 3,3 (±2,7) x 10 6 e 3,2 (±2,1) x10 6 (p = 0,4455), respectivamente. A quantificação das CN e das células CD34+ viáveis pré-criopreservação e pós-criopreservação/descongelamento foi 8,1 (±1,9) e 6,3 (±1,7) x 10 8 (p < 0,0001) e 3,27 (±2,0) x 10 6 e 2,8 (±1,8) x 10 6 (p = 0,0063), respectivamente. A porcentagem de células nucleadas e CD34+ viáveis no segmento proximal e na bolsa de 20 mL foi, respectivamente, 66,3 (±11,8) e 75 (35-93); 76,5 (±11,6) e 89 (75-100). No ensaio clonogênico foi observado crescimento médio de 31,8 (±7,6) unidades formadoras de colônias granulócito-macrófago (CFU-GM) x 10 5 CN plaqueadas obtidas da bolsa pós-criopreservação/descongelamento. Não foi encontrada correlação entre as células ALDH br /CD45 + viáveis e a quantificação das CFUGM ou das células CD34+ viáveis da bolsa pós-criopreservação/descongelamento. O coeficiente de correlação entre as células nucleadas e as células ALDEFLUOR bright da bolsa e do segmento pós-criopreservação/descongelamento foi (r) = 0,9399 com p < 0,0001 e (r) = 0,5478 com p = 0,0426, respectivamente. Foi encontrada correlação entre quantificação das células CD34+ e das CFU-GM da bolsa e do segmento pós-criopreservação/descongelamento. Esses dados indicam que o método utilizado para a realização da criopreservação e o descongelamento das unidades de SCUP encontra-se validado, e que o segmento pode ser utilizado como uma ferramenta de controle de qualidade para a seleção da unidade de SCUP para transplante. Palavras-chave: Validação. Sangue de cordão umbilical e placentário. Aldefluor. Célulastronco hematopoéticas. / ABSTRACT BALDISSERA, J.L.C. Evaluation of different methods of performing clonogenic assay and validation of the method of cryopreservation and resuspension of cryopreserved umbilical cord and placental blood. 2015. 78 f. Master Dissertation. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. Umbilical cord and placental blood (UCPB) has been used as a source of hematopoietic stem cells (HSCs) for transplant. The quality of this product may be affected during the various stages of processing it. In this study, the author reviewed the best preparation methodology for performing the clonogenic assay (pure, diluted or washed) and validated the method of cryopreservation and resuspension of UCPB bags. The author also evaluated the functionality of the aldehyde dehydrogenase enzyme (ALDH) as a method to determine the function of umbilical cord and placental blood HSCs, in 15 cryopreserved units by the Laboratory of Cryobiology and Cell Therapy of the Center for Hematology and Hemotherapy of Santa Catarina (HEMOSC). The units were thawed in four steps. The content of the segments and the bag was collected and resuspended in a 5% albumin solution, 5% acid ci trate dextrose and saline solution. The cell suspension obtained was used to conduct the clonogenic assay, the assessment of cell viability, the quantification of nucleated cells (NC), CD34 + and ALDH br . The parameters of time, cost and the result of the clonogenic assay, used to evaluate the methodology, indicated that the diluted cell suspension is the best method to be used when performing a clonogenic assay. The quantification of the nucleated cells (NC) and the total CD34+ cells pre-cryopreservation and post-cryopreservation/thawing was 8,3 (±1,9) x 10 8 and 8,2 (±2,0) x 10 8 (p = 0,3388) and 3,3 (±2,7) x 10 6 and 3,2 (±2,1) x10 6 (p = 0,4455), respectively. The quantification of the NC and CD34+ viable cells pre-cryopreservation and post-cryopreservation/thawing was 8,1 (±1,9) and 6,3 (±1,7) x 10 8 (p < 0,0001) and 3,27 (±2,0) x 10 6 and 2,8 (±1,8) x 10 6 (p = 0,0063), respectively. The percentage of viable nucleated cells and CD34+ viable cells in the proximal segment and in the 20mL bag was 66,3 (±11,8) and 75 (35-93); 76,5 (±11,6) and 89 (75-100), respectively. In the clonogenic assay an average growth of 31,8 (± 7,6) colony-forming granulocyte-macrophage units (CFUGM) x 10 5 NC plated, obtained from the post-cryopreservation/thawing bag was observed. No correlation between the ALDH br /CD45 + viable cells and the quantification of CFU-GM or CD34+ viable cells obtained from the bag post cryopreservation was found. The coefficient of correlation between nucleated cells and ALDEFLUOR bright cells from the bag and segment after cryopreservation were (r) = 0, 9399 with p < 0, 0001 and (r) = 0, 5478 with p = 0,0426, respectively. A correlation between quantification of CD34+ cells and CFU-GM bag and segment cells after cryopreservation/thawing was found. This data indicates that the method used to perform the cryopreservation and thawing of the UCPB unit has been validated, and that the segment can be used as a tool for quality control when making the selection of UCPB for transplant. Keywords: Validation. Umbilical cord and placental blood. Aldefluor. Hematopoietic stem cells.

Propriedades leishmanicidas têm sido atribuídas a vários terpenos, que são compostos encontrados em plantas. Dentre esses está o limoneno, um monoterpeno presente principalmente em frutas cítricas. Em plantas e no fígado de mamíferos, o limoneno é convertido a alcool perílico (POH), aldeído perílico (PCO) e ácido perílico (PCOOH). Tanto o limoneno como seus derivados apresentam propriedades antimicrobianas e antitumorais. Neste estudo avaliamos a atividade dos derivados do limoneno para o tratamento de leishmaniose. As IC50 para POH, PCO e PCOOH foram determinadas para L. (L.) major e L. (L.) amazonensis. Demonstramos que esses compostos são citotóxicos para macrófagos, em concentrações semelhantes às efetivas contra os parasitas. Avaliação da toxicidade in vivo não evidenciou efeitos colaterais. Não houve resposta clínica à administração de POH ou PCO em camundongos infectados. A associação de POH e PCO por via intraperitoneal foi capaz de retardar a progressão da doença em camundongos infectados com L. (L.) amazonensis. / Leishmanicidal properties have been ascribed to several terpenes. Limonene is a monoterpene found mainly in citric fruits. In plants and in mammalian liver, limonene is converted to perillyl alcohol (POH), perillyl aldehyde (PCO) and perillyl acid (PCOOH). Limonene and its derivatives possess antimicrobial and antineoplasic properties. In this study we evaluated the activity of POH, PCO and PCOOH for the treatment of leishmaniasis. The inhibitory concentrations for 50% of the parasites (IC50) were determined for L. (L) major and L. (L.) amazonensis. We have shown that these drugs are toxic for macrophages, in concentrations in the same range as the effective ones against parasites. The in vivo toxicity evaluation did not show collateral effects in mice. There was no clinical response to the administration of POH or PCO to infected mice. The combination of POH e PCO by the intraperitoneal route was able to delay the disease progression in mice infected with L. (L.) amazonensis.

Vários adutos resultantes da reação de aldeídos &#945;,&#946;-insaturados, ou de seus epóxidos, com bases do DNA têm sido caracterizados nos últimos anos. Esses adutos podem levar à incorporação errada de bases durante a replicação ou a transcrição, resultando, se não reparados, em mutações que podem contribuir para a carcinogênese. O trans,trans-2,4-decadienal (DDE) é um dos aldeídos mais citotóxicos gerados endogenamente a partir da peroxidação lipídica. Verificamos que este aldeído afeta a viabilidade e altera o nível de glutationa de células CV1-P, além de induzir fragmentação do DNA e formação de diferentes produtos com o mesmo. Além da sua formação endógena, DDE é também encontrado em alguns alimentos, contribuindo para o aroma dos mesmos. Neste trabalho detectamos e isolamos 6 produtos formados a partir da reação de DDE com 2\' -desoxiguanosina (dG), sendo que fizemos a caracterização química completa de 3 desses produtos. Através desses estudos mostramos que um deles é o aduto 1,N2-eteno-2\' -desoxiguanosina (1,N2-&#949;dGuo), também formado a partir da reação de dG com compostos carcinogênicos conhecidos, como o c1oreto de vinila. Os outros dois produtos são dois diastereoisômeros correspondentes a 1,N2-&#949;dGuo com uma cadeia lateral substituinte. São produtos inéditos descritos pela primeira vez neste nosso trabalho. A detecção e caracterização desses produtos, assim como os mecanismos de fonnação propostos, podem contribuir para um melhor entendimento da genotoxicidade associada à peroxidação lipídica. Em paralelo desenvolvemos uma técnica muito sensível baseada em LC/ESI/MSMS para detecção desses adutos em sistemas biológicos. A detecção dos adutos caracterizados em DNA incubado com DDE in vitro e em DNA de células expostas ao aldeído aponta para a importância biológica desses compostos. Existe um crescente interesse no uso de adutos exocíclicos de DNA como marcadores de exposição a diversos carcinógenos ambientais e também a processos endógenos envolvendo a peroxidação lipídica. O mecanismo de formação e a estrutura química desses adutos são importantes para revelar as características estruturais queinfluenciam a alquilação do DNA por aldeídos insaturados e para que se possa estimar o papel desses aldeídos na carcinogênese. A formação dos adutos por produtos da peroxidação lipídica sugere a necessidade de estudos epidemiológicos para avaliar riscos de exposição ambiental, via alimentação ou mesmo via fatores indutores de lipoperoxidação. Os resultados aqui obtidos podem contribuir para o estabelecimento de relações entre estrutura química e função e para a avaliação do possível papel dessas lesões na toxicidade associada à exposição a essa classe de compostos. / Vários adutos resultantes da reação de aldeídos &#945;,&#946;-insaturados, ou de seus epóxidos, com bases do DNA têm sido caracterizados nos últimos anos. Esses adutos podem levar à incorporação errada de bases durante a replicação ou a transcrição, resultando, se não reparados, em mutações que podem contribuir para a carcinogênese. O trans,trans-2,4-decadienal (DDE) é um dos aldeídos mais citotóxicos gerados endogenamente a partir da peroxidação lipídica. Verificamos que este aldeído afeta a viabilidade e altera o nível de glutationa de células CV1-P, além de induzir fragmentação do DNA e formação de diferentes produtos com o mesmo. Além da sua formação endógena, DDE é também encontrado em alguns alimentos, contribuindo para o aroma dos mesmos. Neste trabalho detectamos e isolamos 6 produtos formados a partir da reação de DDE com 2\' -desoxiguanosina (dG), sendo que fizemos a caracterização química completa de 3 desses produtos. Através desses estudos mostramos que um deles é o aduto 1,N2-eteno-2\' -desoxiguanosina (1,N2-&#949;dGuo), também formado a partir da reação de dG com compostos carcinogênicos conhecidos, como o c1oreto de vinila. Os outros dois produtos são dois diastereoisômeros correspondentes a 1,N2-&#949;dGuo com uma cadeia lateral substituinte. São produtos inéditos descritos pela primeira vez neste nosso trabalho. A detecção e caracterização desses produtos, assim como os mecanismos de fonnação propostos, podem contribuir para um melhor entendimento da genotoxicidade associada à peroxidação lipídica. Em paralelo desenvolvemos uma técnica muito sensível baseada em LC/ESI/MSMS para detecção desses adutos em sistemas biológicos. A detecção dos adutos caracterizados em DNA incubado com DDE in vitro e em DNA de células expostas ao aldeído aponta para a importância biológica desses compostos. Existe um crescente interesse no uso de adutos exocíclicos de DNA como marcadores de exposição a diversos carcinógenos ambientais e também a processos endógenos envolvendo a peroxidação lipídica. O mecanismo de formação e a estrutura química desses adutos são importantes para revelar as características estruturais queinfluenciam a alquilação do DNA por aldeídos insaturados e para que se possa estimar o papel desses aldeídos na carcinogênese. A formação dos adutos por produtos da peroxidação lipídica sugere a necessidade de estudos epidemiológicos para avaliar riscos de exposição ambiental, via alimentação ou mesmo via fatores indutores de lipoperoxidação. Os resultados aqui obtidos podem contribuir para o estabelecimento de relações entre estrutura química e função e para a avaliação do possível papel dessas lesões na toxicidade associada à exposição a essa classe de compostos.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-05T14:44:35Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1067093 bytes, checksum: e638533c1c54b6ee80abd013e3fc495c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-05T14:44:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1067093 bytes, checksum: e638533c1c54b6ee80abd013e3fc495c (MD5) Previous issue date: 2005-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Antiquitina é uma família de proteínas altamente conservada na evolução que pertence à superfamília de aldeído desidrogenase (ALDH), mas cuja função biológica é desconhecida. Baseado em homologia estrutural e analogia do padrão de expressão, foi isolado um gene da soja, homólogo a antiquitina de humanos, designado GmTP-55, que codifica uma proteína de 55,562 kDa, apresentando um domínio conservado de desidrogenases. A proteína TP-55 apresenta 82% de identidade de seqüência com a proteína 26g de ervilha, induzida por déficit hídrico, e 60% de homologia com a proteína antiquitina de humanos, pertencentes a família ADLH7A1 (conhecida como antiquitina) da superfamília de ALDH. O acúmulo da proteína TP-55 em plantas de soja foi observado na raiz e predominantemente no caule, sob condições de déficit hídrico e estresse salino. Com a finalidade de examinar a função do homólogo da antiquitina in vivo, plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tabacum) e Arabidopsis thaliana expressando constitutivamente o cDNA GmTP-55 foram obtidas e submetidas a diversas condições de estresses abióticos. Enquanto que, em arabidopsis, a expressão do transgene foi confirmada por RT-PCR, em Arabidopsis, a expressão da proteína quimérica TP-55-GFP foi avaliada por microscopia de fluorescência, demonstrando seu acúmulo predominantemente no núcleo e no citoplasma. A expressão ectópica do gene viiGmTP-55 tanto em arabidopsis quanto em tabaco conferiu as plantas transgênicas tolerância a estresse salino durante a germinação e a déficit hídrico durante o desenvolvimento. A eficiência de germinação das sementes transgênicas em concentrações crescentes de NaCl foi muito superior do que a dos controles não transformados. Assim também, em condições de seca progressiva, as plantas transgênicas de tabaco mantiveram a turgidez foliar em altos níveis, contrastando com o aparecimento de murcha foliar das plantas controle. As plantas transgênicas também exibiram uma maior tolerância a estresses oxidativos, que foram induzidos por meio de tratamento com H 2 O 2 e paraquat. Tanto as sementes de arabidopsis quanto as de tabaco expressando GmTP-55 germinaram eficientemente em meio contendo 15 μM de H 2 O 2 , enquanto a germinação das sementes controle foi drasticamente reduzida nas mesmas condições. Similarmente, os discos foliares de tabacos transgênicos tratados com paraquat apresentaram uma redução significativa de lesões necróticas quanto comparadas com as plantas controle. Considerando que o denominador comum resultante dos estresses salino, hídrico e oxidativo seria a produção de ROS e aldeídos tóxicos derivados, estes resultados sugerem que o gene TP-55, homólogo da antiquitina, esteja envolvido em respostas celulares adaptativas relacionadas com detoxificação de aldeídos. / Antiquitin is an evolutionarily conserved protein family of unknown function that belongs to the aldehyde dehydrogenase (ALDH) superfamily. Based on structural homology and expression pattern analogy, we have isolated an antiquitin homolog gene from soybean, designated GmTP-55 that encodes a dehydrogenase motif- containing 55.562 kDa protein. The predicted encoded protein, TP-55, shares 82% sequence identity with the water-stress induced 26g protein from peas and 60% homology with human antiquitin that belongs to the ADLH7A1 (known as antiquitin) family of the ALDH superfamily. Accumulation of TP-55 in soybean was detected in roots and mostly in stems under water deficit and salt stress. To examine the role of antiquitin in vivo, we have obtained transgenics tobacco (Nicotiana tabacum) and Arabidopsis thaliana plants constitutively expressing GmTP-55 and analyzed their response to a variety of abiotic stress conditions. While in tobacco the transgene expression was confirmed by RT-PCR, in Arabidopsis, the expression of the TP-55-GFP chimerical protein was evaluated by fluorescence microscopy that demonstrated its major accumulation in the nucleus and cytoplasm. Ectopic expression of GmTP-55 in both Arabidopsis and tobacco conferred tolerance to salinity during germination and to water stress during plant growth. Under increasing salt concentration the germination efficiency of transgenic seeds were much greater than that of untransformed seeds. ixLikewise, under progressive drought, the transgenic tobacco kept the shoot turgidity to a normal level, which was in contrast to the leaf wilt phenotype of control plants. The transgenic plants also exhibited an enhanced tolerance to oxidative stresses that were induced by H 2 O 2 and paraquat treatments. Both Arabidopsis and tobacco seeds expressing GmTP-55 germinated efficiently in medium supplemented with H 2 O 2 15 μM, whereas the germination of control seeds was drastically reduced under the same condition. Likewise, transgenic tobacco leaf discs treated with paraquat presented a significant reduction in the necrotic lesions as compared to the control leaves. Since the common denominator resulting from salinity, dehydration and oxidative stress is the production of ROS and derived toxic aldehydes, our results suggested that the antiquitin homolog gene might be involved in adaptive responses related to aldehyde detoxification.

Vários adutos resultantes da reação de aldeídos &#945;,&#946;-insaturados, ou de seus epóxidos, com bases do DNA têm sido caracterizados nos últimos anos. Esses adutos podem levar à incorporação errada de bases durante a replicação ou a transcrição, resultando, se não reparados, em mutações que podem contribuir para a carcinogênese. O trans,trans-2,4-decadienal (DDE) é um dos aldeídos mais citotóxicos gerados endogenamente a partir da peroxidação lipídica. Verificamos que este aldeído afeta a viabilidade e altera o nível de glutationa de células CV1-P, além de induzir fragmentação do DNA e formação de diferentes produtos com o mesmo. Além da sua formação endógena, DDE é também encontrado em alguns alimentos, contribuindo para o aroma dos mesmos. Neste trabalho detectamos e isolamos 6 produtos formados a partir da reação de DDE com 2\' -desoxiguanosina (dG), sendo que fizemos a caracterização química completa de 3 desses produtos. Através desses estudos mostramos que um deles é o aduto 1,N2-eteno-2\' -desoxiguanosina (1,N2-&#949;dGuo), também formado a partir da reação de dG com compostos carcinogênicos conhecidos, como o c1oreto de vinila. Os outros dois produtos são dois diastereoisômeros correspondentes a 1,N2-&#949;dGuo com uma cadeia lateral substituinte. São produtos inéditos descritos pela primeira vez neste nosso trabalho. A detecção e caracterização desses produtos, assim como os mecanismos de fonnação propostos, podem contribuir para um melhor entendimento da genotoxicidade associada à peroxidação lipídica. Em paralelo desenvolvemos uma técnica muito sensível baseada em LC/ESI/MSMS para detecção desses adutos em sistemas biológicos. A detecção dos adutos caracterizados em DNA incubado com DDE in vitro e em DNA de células expostas ao aldeído aponta para a importância biológica desses compostos. Existe um crescente interesse no uso de adutos exocíclicos de DNA como marcadores de exposição a diversos carcinógenos ambientais e também a processos endógenos envolvendo a peroxidação lipídica. O mecanismo de formação e a estrutura química desses adutos são importantes para revelar as características estruturais queinfluenciam a alquilação do DNA por aldeídos insaturados e para que se possa estimar o papel desses aldeídos na carcinogênese. A formação dos adutos por produtos da peroxidação lipídica sugere a necessidade de estudos epidemiológicos para avaliar riscos de exposição ambiental, via alimentação ou mesmo via fatores indutores de lipoperoxidação. Os resultados aqui obtidos podem contribuir para o estabelecimento de relações entre estrutura química e função e para a avaliação do possível papel dessas lesões na toxicidade associada à exposição a essa classe de compostos. / Vários adutos resultantes da reação de aldeídos &#945;,&#946;-insaturados, ou de seus epóxidos, com bases do DNA têm sido caracterizados nos últimos anos. Esses adutos podem levar à incorporação errada de bases durante a replicação ou a transcrição, resultando, se não reparados, em mutações que podem contribuir para a carcinogênese. O trans,trans-2,4-decadienal (DDE) é um dos aldeídos mais citotóxicos gerados endogenamente a partir da peroxidação lipídica. Verificamos que este aldeído afeta a viabilidade e altera o nível de glutationa de células CV1-P, além de induzir fragmentação do DNA e formação de diferentes produtos com o mesmo. Além da sua formação endógena, DDE é também encontrado em alguns alimentos, contribuindo para o aroma dos mesmos. Neste trabalho detectamos e isolamos 6 produtos formados a partir da reação de DDE com 2\' -desoxiguanosina (dG), sendo que fizemos a caracterização química completa de 3 desses produtos. Através desses estudos mostramos que um deles é o aduto 1,N2-eteno-2\' -desoxiguanosina (1,N2-&#949;dGuo), também formado a partir da reação de dG com compostos carcinogênicos conhecidos, como o c1oreto de vinila. Os outros dois produtos são dois diastereoisômeros correspondentes a 1,N2-&#949;dGuo com uma cadeia lateral substituinte. São produtos inéditos descritos pela primeira vez neste nosso trabalho. A detecção e caracterização desses produtos, assim como os mecanismos de fonnação propostos, podem contribuir para um melhor entendimento da genotoxicidade associada à peroxidação lipídica. Em paralelo desenvolvemos uma técnica muito sensível baseada em LC/ESI/MSMS para detecção desses adutos em sistemas biológicos. A detecção dos adutos caracterizados em DNA incubado com DDE in vitro e em DNA de células expostas ao aldeído aponta para a importância biológica desses compostos. Existe um crescente interesse no uso de adutos exocíclicos de DNA como marcadores de exposição a diversos carcinógenos ambientais e também a processos endógenos envolvendo a peroxidação lipídica. O mecanismo de formação e a estrutura química desses adutos são importantes para revelar as características estruturais queinfluenciam a alquilação do DNA por aldeídos insaturados e para que se possa estimar o papel desses aldeídos na carcinogênese. A formação dos adutos por produtos da peroxidação lipídica sugere a necessidade de estudos epidemiológicos para avaliar riscos de exposição ambiental, via alimentação ou mesmo via fatores indutores de lipoperoxidação. Os resultados aqui obtidos podem contribuir para o estabelecimento de relações entre estrutura química e função e para a avaliação do possível papel dessas lesões na toxicidade associada à exposição a essa classe de compostos.

RESUMO BALDISSERA, J.L.C. Avaliação das diferentes metodologias de realização do ensaio clonogênico e validação do método de criopreservação e ressuspensão do sangue de cordão umbilical e placentário criopreservado. 2015, 78 f. Dissertação. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. O sangue de cordão umbilical e placentário (SCUP) tem sido utilizado como fonte de célulastronco hematopoéticas (CTHs) para transplante. A qualidade desse produto pode ser afetada durante as várias etapas do seu processamento. Neste estudo, foi avaliada a melhor metodologia de preparo da amostra para a realização do ensaio clonogênico (pura, diluída ou lavada) e validado o método de criopreservação e de ressuspensão das bolsas de SCUP. Foi avaliada também a funcionalidade da enzima aldeído desidrogenase (ALDH) como método para determinar a função das CTHs do SCUP, em 15 unidades criopreservadas pelo Laboratório de Criobiologia e Terapia Celular do Centro de Hematologia e Hemoterapia de Santa Catarina (HEMOSC). As unidades foram descongeladas em quatro etapas. O conteúdo dos segmentos e da bolsa foi coletado e ressuspenso com solução de albumina 5%, ACD 5% e solução fisiológica. A suspensão celular obtida foi utilizada para realização do ensaio clonogênico, avaliação da viabilidade celular, quantificação das células nucleadas (CN), CD34+ e das ALDH br . Os parâmetros tempo, custo e o resultado do ensaio clonogênico, utilizados para avaliar a metodologia, indicaram que a suspensão celular diluída é o melhor método a ser utilizado para a realização do ensaio clonogênico. A quantificação das CN e das células CD34+ totais pré-criopreservação e pós-criopreservação/descongelamento foi 8,3 (±1,9) x 10 8 e 8,2 (±2,0) x 10 8 (p = 0,3388) e 3,3 (±2,7) x 10 6 e 3,2 (±2,1) x10 6 (p = 0,4455), respectivamente. A quantificação das CN e das células CD34+ viáveis pré-criopreservação e pós-criopreservação/descongelamento foi 8,1 (±1,9) e 6,3 (±1,7) x 10 8 (p < 0,0001) e 3,27 (±2,0) x 10 6 e 2,8 (±1,8) x 10 6 (p = 0,0063), respectivamente. A porcentagem de células nucleadas e CD34+ viáveis no segmento proximal e na bolsa de 20 mL foi, respectivamente, 66,3 (±11,8) e 75 (35-93); 76,5 (±11,6) e 89 (75-100). No ensaio clonogênico foi observado crescimento médio de 31,8 (±7,6) unidades formadoras de colônias granulócito-macrófago (CFU-GM) x 10 5 CN plaqueadas obtidas da bolsa pós-criopreservação/descongelamento. Não foi encontrada correlação entre as células ALDH br /CD45 + viáveis e a quantificação das CFUGM ou das células CD34+ viáveis da bolsa pós-criopreservação/descongelamento. O coeficiente de correlação entre as células nucleadas e as células ALDEFLUOR bright da bolsa e do segmento pós-criopreservação/descongelamento foi (r) = 0,9399 com p < 0,0001 e (r) = 0,5478 com p = 0,0426, respectivamente. Foi encontrada correlação entre quantificação das células CD34+ e das CFU-GM da bolsa e do segmento pós-criopreservação/descongelamento. Esses dados indicam que o método utilizado para a realização da criopreservação e o descongelamento das unidades de SCUP encontra-se validado, e que o segmento pode ser utilizado como uma ferramenta de controle de qualidade para a seleção da unidade de SCUP para transplante. Palavras-chave: Validação. Sangue de cordão umbilical e placentário. Aldefluor. Célulastronco hematopoéticas. / ABSTRACT BALDISSERA, J.L.C. Evaluation of different methods of performing clonogenic assay and validation of the method of cryopreservation and resuspension of cryopreserved umbilical cord and placental blood. 2015. 78 f. Master Dissertation. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. Umbilical cord and placental blood (UCPB) has been used as a source of hematopoietic stem cells (HSCs) for transplant. The quality of this product may be affected during the various stages of processing it. In this study, the author reviewed the best preparation methodology for performing the clonogenic assay (pure, diluted or washed) and validated the method of cryopreservation and resuspension of UCPB bags. The author also evaluated the functionality of the aldehyde dehydrogenase enzyme (ALDH) as a method to determine the function of umbilical cord and placental blood HSCs, in 15 cryopreserved units by the Laboratory of Cryobiology and Cell Therapy of the Center for Hematology and Hemotherapy of Santa Catarina (HEMOSC). The units were thawed in four steps. The content of the segments and the bag was collected and resuspended in a 5% albumin solution, 5% acid ci trate dextrose and saline solution. The cell suspension obtained was used to conduct the clonogenic assay, the assessment of cell viability, the quantification of nucleated cells (NC), CD34 + and ALDH br . The parameters of time, cost and the result of the clonogenic assay, used to evaluate the methodology, indicated that the diluted cell suspension is the best method to be used when performing a clonogenic assay. The quantification of the nucleated cells (NC) and the total CD34+ cells pre-cryopreservation and post-cryopreservation/thawing was 8,3 (±1,9) x 10 8 and 8,2 (±2,0) x 10 8 (p = 0,3388) and 3,3 (±2,7) x 10 6 and 3,2 (±2,1) x10 6 (p = 0,4455), respectively. The quantification of the NC and CD34+ viable cells pre-cryopreservation and post-cryopreservation/thawing was 8,1 (±1,9) and 6,3 (±1,7) x 10 8 (p < 0,0001) and 3,27 (±2,0) x 10 6 and 2,8 (±1,8) x 10 6 (p = 0,0063), respectively. The percentage of viable nucleated cells and CD34+ viable cells in the proximal segment and in the 20mL bag was 66,3 (±11,8) and 75 (35-93); 76,5 (±11,6) and 89 (75-100), respectively. In the clonogenic assay an average growth of 31,8 (± 7,6) colony-forming granulocyte-macrophage units (CFUGM) x 10 5 NC plated, obtained from the post-cryopreservation/thawing bag was observed. No correlation between the ALDH br /CD45 + viable cells and the quantification of CFU-GM or CD34+ viable cells obtained from the bag post cryopreservation was found. The coefficient of correlation between nucleated cells and ALDEFLUOR bright cells from the bag and segment after cryopreservation were (r) = 0, 9399 with p < 0, 0001 and (r) = 0, 5478 with p = 0,0426, respectively. A correlation between quantification of CD34+ cells and CFU-GM bag and segment cells after cryopreservation/thawing was found. This data indicates that the method used to perform the cryopreservation and thawing of the UCPB unit has been validated, and that the segment can be used as a tool for quality control when making the selection of UCPB for transplant. Keywords: Validation. Umbilical cord and placental blood. Aldefluor. Hematopoietic stem cells.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The aim of this work was to evaluate the effect of post harvest ethanol or acetaldehyde application and to compare them with consolidated storage techniques on the quality maintenance of Royal Gala‟ apples. Also, we aimed to evaluate the effect of controlled atmosphere condition with ultra low oxygen partial pressures on the post storage quality maintenance of Royal Gala‟ apples. To reach such aims, three experiments were performed during 2008 and 2009. In the first experiment, carried out in 2008, the following treatments were evaluated: [1] control; [2] application of 0.5mL of ethanol month-1 kg-1; [3] application of 0.25mL acetaldehyde month-1 kg-1; [4] application of 625 ηL L-1 1-MCP; and [5] ethylene scrubbing (<0.02μL L-1). All fruits from the evaluated treatments were stored in CA with 1.0kPa O2 and 2.0kPa CO2. In the second experiment, carried out in 2009, the treatments were constituted in the following way: [1] control; [2] low relative air humidity (LRH); [3] LRH and application of 0.3mL of ethanol month-1 kg-1; and [4] application of 0.3mL of ethanol month-1 kg-1. All treatments were stored in CA with 1.2kPa O2 associated with 2.5kPa CO2. In the two experiments the fruits were stored at 0.5°C. In the third experiment, carried out in 2008, five CA conditions were evaluated: [1] 1.0kPa O2 and 2.0kPa CO2; [2] 0.8kPa O2 and 1.5kPa CO2; [3] 0.8kPa O2 and 1.0kPa CO2; [4] 0.6kPa O2 and 1.5kPa CO2; and [5] 0.6kPa O2 and 1.0kPa CO2. All conditions were stored in 0.0°C, 0.5°C and 1.0°C resulting in a factorial experiment. The application of 0.5mL ethanol month-1 kg-1 or 0.25mL acetaldehyde month-1 kg-1 cause increase in mealiness, flesh browning and rottenness incidence and decrease flesh firmness, resulting in decrease in the quality maintenance when compared with the application of 1-MCP and ethylene scrubbing. However, 0.3mL ethanol month-1 kg-1, performed on second experiment, resulted in higher flesh firmness retention, lower ACC oxidase activity and lower ethylene production. The lower relative air humidity is not efficient in maintain apple quality, however, it potentiated the effect of the application of 0.3mL ethanol month-1 kg-1. Royal Gala‟ apples stored in CA with O2 partial pressures below to 0.8kPa show lesser quality after storage. Temperature of 1.0ºC, compared with 0.0°C and 0.5°C, provided highest apple quality maintenance after eight months of storage and more seven days in shelf life at 20ºC. The best ULO condition for fruits stored at 1.0ºC is 1.0kPa O2 with 2.0kPa CO2. The interaction between ULO and storage temperature showed a necessity to increase O2 partial pressures when the storage temperature was increased. This behavior were verified especially when ACC oxidase activity and flesh browning incidence were analyzed. / O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da aplicação pós-colheita de etanol e aldeído acético e comparar com tecnologias de armazenamento comprovadamente eficientes sobre a manutenção da qualidade de maçãs Royal Gala‟. Além disso, objetivou-se avaliar o efeito de condições de atmosfera controlada (AC) com pressões parciais ultrabaixas de oxigênio sobre a manutenção da qualidade de maçãs, Royal Gala‟ após o armazenamento. Para atingir tais objetivos foram conduzidos três experimentos no decorrer dos anos de 2008 e 2009. No primeiro experimento, realizado em 2008, foram testados os seguintes tratamentos: [1] controle; [2] aplicação de 0,5mL de etanol mês-1 kg-1; [3] aplicação de 0,25mL de aldeído acético mês-1 kg-1; [4] aplicação de 625 ηL L-1 de 1-MCP; e [5] absorção de etileno (<0,02μL L-1). Todos os frutos dos tratamentos avaliados foram armazenados em AC na condição de 1,0kPa O2 e 2,0kPa CO2. No segundo experimento, conduzido em 2009, os tratamentos avaliados foram constituídos da seguinte forma: [1] controle; [2] baixa umidade relativa do ar (BUR); [3] BUR com aplicação de etanol na dosagem de 0,3mL mês-1 kg-1; e [4] aplicação de etanol na dosagem de 0,3mL mês-1 kg-1. Todos os frutos dos tratamentos foram armazenados em AC com 1,2kPa O2 + 2,5kPa CO2. Nos dois experimentos os frutos foram armazenados na temperatura de 0,5°C. No terceiro experimento, conduzido em 2008, foram avaliadas cinco condições de AC: [1] 1,0kPa O2 e 2,0kPa CO2; [2] 0,8kPa O2 e 1,5kPa CO2; [3] 0,8kPa O2 e 1,0kPa CO2; [4] 0,6kPa O2 e 1,5kPa CO2; e [5] 0,6kPa O2 e 1,0kPa CO2, combinadas com temperaturas de 0,0°C, 0,5°C e 1,0°C, resultando em um experimento fatorial. A aplicação de 0,5mL de etanol mês-1 kg-1 ou 0,25mL de aldeído acético mês-1 kg-1, provocou aumento da incidência de polpa farinácea, degenerescência de polpa e podridões, assim como diminuição da firmeza de polpa, resultando em menor manutenção da qualidade comparada com a aplicação de 1-MCP e absorção de etileno. Entretanto, a dose de 0,3mL de etanol mês-1 kg-1, do segundo experimento, resultou na manutenção de maior firmeza de polpa, menor atividade da ACC oxidase e menor produção de etileno. A redução da umidade relativa do ar (BUR) não apresentou eficiência na manutenção da qualidade, porém, potencializou o efeito da aplicação de 0,3mL de etanol mês-1 kg-1. Maçãs Royal Gala‟ armazenadas em AC sob pressões parciais de O2 abaixo de 0,8kPa apresentaram inferior qualidade após o armazenamento. A temperatura de 1,0ºC, comparado a 0,0°C e 0,5°C, manteve a qualidade superior após oito meses de armazenamento e mais sete dias de exposição à temperatura de 20ºC. A melhor condição de ULO para frutos armazenados na temperatura de 1,0ºC é de 1,0kPa O2 combinado com 2,0kPa de CO2. A interação entre ULO e temperatura de armazenamento evidenciou a necessidade de elevação das pressões parciais de O2 quando a temperatura de armazenamento foi aumentada. Este comportamento foi verificado quando analisadas atividade da ACC oxidase e incidência de degenerescência de polpa.

Propriedades leishmanicidas têm sido atribuídas a vários terpenos, que são compostos encontrados em plantas. Dentre esses está o limoneno, um monoterpeno presente principalmente em frutas cítricas. Em plantas e no fígado de mamíferos, o limoneno é convertido a alcool perílico (POH), aldeído perílico (PCO) e ácido perílico (PCOOH). Tanto o limoneno como seus derivados apresentam propriedades antimicrobianas e antitumorais. Neste estudo avaliamos a atividade dos derivados do limoneno para o tratamento de leishmaniose. As IC50 para POH, PCO e PCOOH foram determinadas para L. (L.) major e L. (L.) amazonensis. Demonstramos que esses compostos são citotóxicos para macrófagos, em concentrações semelhantes às efetivas contra os parasitas. Avaliação da toxicidade in vivo não evidenciou efeitos colaterais. Não houve resposta clínica à administração de POH ou PCO em camundongos infectados. A associação de POH e PCO por via intraperitoneal foi capaz de retardar a progressão da doença em camundongos infectados com L. (L.) amazonensis. / Leishmanicidal properties have been ascribed to several terpenes. Limonene is a monoterpene found mainly in citric fruits. In plants and in mammalian liver, limonene is converted to perillyl alcohol (POH), perillyl aldehyde (PCO) and perillyl acid (PCOOH). Limonene and its derivatives possess antimicrobial and antineoplasic properties. In this study we evaluated the activity of POH, PCO and PCOOH for the treatment of leishmaniasis. The inhibitory concentrations for 50% of the parasites (IC50) were determined for L. (L) major and L. (L.) amazonensis. We have shown that these drugs are toxic for macrophages, in concentrations in the same range as the effective ones against parasites. The in vivo toxicity evaluation did not show collateral effects in mice. There was no clinical response to the administration of POH or PCO to infected mice. The combination of POH e PCO by the intraperitoneal route was able to delay the disease progression in mice infected with L. (L.) amazonensis.

O carcinoma epidermóide é uma neoplasia que pode ter origem do revestimento mucoso de vários sítios das vias aerodigestivas superiores, sendo a língua o sítio primário com maior incidência. Entre os fatores de risco para a doença estão a idade, as mutações genômicas, o hábito tabagista e principalmente o consumo de etanol. O etanol é considerado um agente cocarcinogênico no processo de desenvolvimento do câncer de boca. Por outro lado, o acetaldeído, subproduto da oxidação do etanol, é tóxico e participa diretamente na carcinogênese. Assim, polimorfismos genéticos que alteram a oxidação de etanol para acetaldeído promovendo seu acúmulo podem alterar o risco de câncer oral. Os resultados sugerem que pacientes portadores do polimorfismo do gene ADH1C Ile350Val possuem maior risco de tornarem-se etilistas crônicos (OR=2,0199), mas o risco de desenvolverem câncer não é alterado quando comparado aos não portadores. Já os portadores dos polimorfismos nos genes ADH1B Arg47His (OR=0,3445), CY2E1 (ins) (OR=0,3261) e ALDH2 (GA) (OR=0,4811) apresentaram menores riscos de desenvolverem câncer oral, mas estes polimorfismos não estavam associados ao risco de tornarem-se etilistas crônicos. Observou-se também uma possível interação entre a baixa atividade da enzima ALDH2 e a expressão do gene CYP2E1 como um fator protetor no desenvolvimento do câncer de boca. Entretanto, há necessidade de mais estudos para comprovar esses achados / Squamous cell carcinoma is a neoplasm that may originate from the mucosal tissue from various sites of the upper aerodigestive tract, the tongue being the primary site with the highest incidence. Among the risk factors for the disease are age, genomic mutations, smoking habit, and especially the consumption of ethanol. Ethanol is considered a co-carcinogenic agent in the development of oral cancer. Moreover, acetaldehyde, ethanol oxidation product, is toxic and is directly involved in carcinogenesis. Thus, genetic polymorphisms that alter the oxidation of ethanol to acetaldehyde by promoting its accumulation can alter the risk of oral cancer. The results suggest that patients with the ADH1C Ile350Val polymorphism have increased risk of becoming chronic drinkers (OR = 2.0199), but the risk of developing cancer is not changed when compared to non carriers. Since the carriers of polymorphisms in genes ADH1B Arg47His (OR = 0.3445), CY2E1 (ins) (OR =0.3261) and ALDH2 (GA) (OR = 0.4811) lower risk of developing oral cancer, but these polymorphisms were not associated with risk of becoming chronic drinkers .There was also a possible interaction between the low activity of the enzymeALDH2 and CYP2E1 gene expression as a protective factor in the development of oral cancer. However, we need more studies to confirm these findings

Avaliou-se o efeito de tratamentos químicos, revestimentos comestíveis e irradiação na conservação de mamões processados minimamente. Após seleção, lavagem e sanitização, os mamões foram descascados e cortados em meias rodelas, as quais foram submetidas a diferentes tratamentos, embaladas e armazenadas a 5±1°C e 90±2%UR. Os mamões PM foram avaliados após 1, 3, 6, 9, 12 e 15 dias. As análises microbiológicas foram fundamentadas na quantificação de coliformes totais e termotolerantes, bactérias psicrotróficas, bolores e leveduras, assim como na verificação da presença de Salmonella. As avaliações físico-químicas basearam-se na determinação da concentração de CO2 no interior das embalagens, perda de massa, cor, firmeza, sólidos solúv eis, acidez titulável, ratio e pH. As características sensoriais aparência, aroma, sabor e textura foram avaliad as por meio de testes com escala hedônica. No primeiro experimento os tratamentos foram: controle, aldeído cinâmico a 0,1%, cloreto de cálcio a 0,75% e combinação de aldeído cinâmico a 0,1% com cloreto de cálcio a 0,75%. O uso de tratamentos químicos em mamões PM resultou em: maior controle de coliformes totais para os mamões PM tratados com aldeído cinâmico e com a combinação de aldeído cinâmico e cloreto de cálcio; menor concentração de CO2 e maior manutenção da firmeza para mamões PM tratados com a combinação de aldeído cinâmico e cloreto de cálcio; e maior concentração de CO2 para os mamões PM tratados apenas com aldeído cinâmico. A imersão nos tratamentos químicos resultou em maior descoloração da polpa dos mamões PM e redução do teor de sólidos solúveis ao longo do armazenamento. No segundo experimento foram utilizados os tr atamentos: controle, amido de arroz a 3%, alginato de sódio a 0,5% e carboximetilcelulose a 0,25%. O uso desses três tipos de revestimento resultou em maior controle de coliformes totais do que o observado no controle. Mamões PM revestidos com amido de arroz e carboximetilcelulose apresentaram redução e aumento da concentração de CO2, respectivamente. Os mamões PM revestidos apresentaram menores teores de sólidos solúveis e seus valores de pH se tornaram menores após 9 dias de armazenamento refrigerado. O r evestimento com carboximetilcelulose proporcionou maior firmeza da polpa no 15° dia. No terceiro experimento foram utilizados os tratamentos: controle, radiação nas doses de 2kGy e 4kGy. O uso de radiação gama em mamões PM resultou em: maior controle de coliformes totais; menor concentração de CO2 nos mamões PM tratados com 2kGy; maior concentração de CO2 e maior descoloração da polpa nos mamões PM tratados com 4kGy; redução da firmeza nos mamões PM tratados com 2kGy e 4kGy; ligeira redução do teor de sólidos solúveis e pequenas variações da acidez titulável em todos os tratamentos. As características sensoriais dos mamões PM tratados com radiação gama não diferiram significativamente do controle durante os 15 dias de armazenamento / The effect of chemical treatments, edible coatings , and irradiation on fresh-cut papaya conservation was evaluated. After selection, washing, and sanitation the papayas were peeled and cut into half slices, which were submitted to different treatments, packed, and stored at 5±1°C and 90±2%RU. The fresh-cut papayas were evaluated after 1, 3, 6, 9, 12, and 15 days. The microbiological analyses were based on the count of total coliform, thermotolerant and psychrotrophic bacteria, molds and yeasts, as well as on the presence of Salmonella. The physicochemical evaluations were based on the determination of CO2 concentration inside the package, weight loss, color, firmness, soluble solids, titratable acidity, ratio, and pH. The sensory characteristics appearance, aroma, flavor, and texture were evaluated using a hedonic scale. In the first experiment, the treatments tested we re: control, cinnamic aldehyde 0.1%, calcium chloride 0.75%, and the combination of cinnamic aldehyde 0.1% and calcium chloride 0.75%. Using chemical treatments to preserve fresh cut papaya resulted in: higher control of total coliforms in fresh-cut papayas treated with cinnamic aldehyde and with the combination of cinnamic aldehyde and calcium chloride; lower CO2 concentration and increased maintenance of firmness in freshcut papayas treated with the combination of cinnamic aldehyde and calcium chloride; and increased in the CO2 concentration in fresh-cut papayas treated only with cinnamic aldehyde. Immersion in chemical treatments caused higher pulp discoloration and reduction in solu ble solids during storage. In the second experiment, the treatments tested were: control, rice starch 3%, sodium alginate 0.5%, and carboxymethylcellulose 0.25%. The use of these three coatings resulted in higher control of total coliforms compared to the control treatment. The fresh-cut papayas coated with rice starch and carboxymethylcellulose presented reduction and increase in the CO2 concentration, respectively. Coated fresh-cut papayas presented lower soluble solids and pH values were lower after 9 days of cold storage. Carboxymethylcellulose coating increased firmness maintenance at day 15. In the third experiment, the following treatments were used: control, radiation at the doses of 2kGy and 4kGy. The use of Gamma radiation in fresh-cut papaya resulted in: higher control of total coliforms; lower CO2 concentration in fresh-cut treated with 2kGy; increased CO2 concentration and increased pulp discoloration in fresh-cut papayas treated with 4kGy; reduction in firmness in fresh-cut papayas treated with 2kGy and 4kGy; slight reduction in soluble solids and small changes in titratable acidity in all treatments. The sensory characteristics of fresh-cut papayas treated with gamma radiation did not significantly differ from the control during the 15 days of storage