Celiac disease (CD) is a highly prevalent autoimmune disease in which intestinal inflammation is induced by dietary gluten. The means through which gluten-specific CD4+ T cell activation culminates in intraepithelial T cell (T-IEL) mediated intestinal damage remain unclear. Here, we performed multiplexed-single cell analysis of intestinal and gluten-induced peripheral blood T cells from patients with different celiac disease states and controls. Untreated, active CD (ACD) and potential CD (PCD) were associated with an enrichment of activated intestinal T cell populations including CD4+ follicular T-helper (TFH) cells, regulatory T cells (Tregs), and Natural CD8+ αβ and γδ T-IELs. Natural CD8+ αβ and γδ T-IELs expressing activating Natural Killer Cell Receptors (NKRs) exhibited a distinct TCR repertoire in CD and persisted in patients on a gluten-free diet (GFD) without intestinal inflammation. Our data further show that NKR-expressing cytotoxic cells, which appear to mediate intestinal damage in CD, arise from a distinct NKR-expressing memory population of T-IELs. Following gluten ingestion, both αβ and γδ T cell clones from this memory population of T-IELs circulated systemically with gluten-specific CD4+ T cells and assumed a cytotoxic and activating NKR-expressing phenotype. In patient-derived organoid (PDO) model of CD, gluten exposure induced the presence of this cytotoxic, NKR-expressing population exclusively in PDOs generated from CD patients. The increased abundance of cytotoxic, NKR-expressing T-IELs following gluten exposure corresponded to histologic observations of altered organoid morphology including degenerated organoid structures and the presence of infiltrating immune cells co-localized with apoptotic epithelial cells. Collectively, these findings suggest that these cytotoxic, NKR-expressing T cells in CD are rapidly mobilized in parallel with gluten-specific CD4+ T cells following gluten ingestion to mediate the destruction of intestinal epithelial cells in CD.

Os parâmetros de avaliação de segurança de alimentos geneticamente modificados fundamentam-se na comparação de equivalência substancial entre as variedades e pela inocuidade de proteínas da planta GM com as proteínas encontradas nas plantas convencionais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a segurança alimentar de três cultivares de sojas geneticamente modificadas para tolerarem o herbicida glifosato através da determinação da equivalência substancial e do potencial alergênico das mesmas quando comparadas às suas respectivas parentais isogênicas. Seis amostras de soja foram analisadas, sendo três convencionais parentais e três GM, referentes ao cultivo de 2004-2005, em Goiás. Para a composição química foram realizadas análises em triplicata de proteínas, lipídeos, umidade, minerais e fibra alimentar. Análises complementares para determinação de aminoácidos, ácidos graxos, isoflavonas e ácido fítico também foram realizadas. O potencial de alergenicidade foi avaliado em extratos protéicos brutos de três cultivares convencionais e suas correspondentes GM. Os mesmos extratos protéicos foram fracionados para obter as globulinas 7S e 11S por precipitação e posterior purificação em coluna de bioafinidade Sepharose 4B. A glicoproteína 7S foi obtida a partir da eluição com tampão contendo -D-mannopyranoside. A resistência à proteólise foi realizada a partir de dois fluidos gástricos simulados com pepsina nas proporções 2,5:100 e 13:1 de enzima/substrato. As amostras foram submetidas à eletroforese dissociante para se estimar a resistência à ação da pepsina em função da concentração da enzima e do tempo de incubação. Extratos brutos protéicos e frações hidrolisadas foram testados contra soros de pacientes comprovadamente alérgicos e não alérgicos à soja nas concentrações de 1/20 em ensaios imunoquímicos do tipo ELISA e 1/10 em ensaios do tipo Western blotting. Os resultados da composição básica de nutrientes mostraram dispersões normais esperadas entre as amostras de mesma origem, com tendências de níveis superiores de proteínas de 9 a 16% nas amostras GM. As análises de fibras insolúveis e isoflavonas revelaram valores de decréscimo das amostras GMs em relação aos teores das variedades convencionais, contrastando com o acréscimo de valores de ácido fítico nas mesmas cultivares. Quanto à proteólise, foi possível observar estabilidade de bandas protéicas com pesos moleculares em torno de 50 e 18 KDa nos extratos brutos, 10 KDa nos extratos de 11S e 50 KDa nos extratos de 7S, em geral similares entre as parentais isogênicas e GMs. Os testes de reatividade dos soros de pacientes alérgicos e não alérgicos em extratos brutos protéicos das cultivares GM demonstraram reatividade similar quando comparados às suas respectivas parentais isogênicas. Com a observação dos resultados pode-se concluir que as diferenças significativas apresentadas pelas amostras GM não as tornam inseguras para o consumo humano e animal. Da mesma forma que não foram observadas alterações na alergenicidade das amostras GM em relação às amostras parentais isogênicas por apresentarem perfis semelhantes de proteólise frente à pepsina e aos testes imunológicos contra soros de pacientes alérgicos. / The parameters of security evaluation of genetically modified foods are based on the substantial equivalence among varieties and the innocuity of GM vegetal proteins compared with conventional vegetal proteins. The aim of this work was to evaluate the food safety of three genetically modified soybean cultivars to tolerate glyphosate herbicide through substantial equivalence determination and allergenic potential when compared to their respective isogenic parental. Six samples analyzed were three parental soybean (conventional) and the others GM, regarding to the crop of 2004-2005, grown in Goiás state. The chemical composition was performed in triplicate and the content of moisture, minerals, proteins, lipids and fiber were determined. Additional compounds like aminoacids, fatty acids, isoflavons and phytates were analyzed. The potential of allergenic reactions was evaluated in crude protein extracts of three conventional and their corresponding GM cultivars. The same protein extracts were fractionated to obtain 7S and 11S globulins by precipitation and posterior purification on Sepharose 4B bioaffinity column. The 7S glycoprotein was obtained by elution with -D-mannopyranoside buffer. The resistance to proteolysis was performed by two simulated gastric fluids with pepsin at the proportions 2,5:100 and 13:1 enzyme/substrate. The samples were run by SDS electrophoresis to estimate the resistance to pepsin action according to enzyme concentration and incubation time. Crude protein extracts and hydrolyzed fractions were tested against serum of allergic and non-allergic patients through ELISA immunochemistry essays at concentrations of 1/20 and Western blotting, 1/10. The results of chemical composition of nutrients showed an expected normal dispersion among samples from the same origin, with tendencies for superior levels of proteins from 9 to 16% by GM samples. The analyses of insoluble fibers and isoflavons revealed decreased values at GM samples regarding to the contents on conventional varieties, contrasting with the increase of the phytic acid values in the same cultivars. After the proteolysis, some protein bands remained apparently stable, that correspond to molecular weights around 50 and 18 KDa for crude extracts, 10 KDa for 11S extracts and 50 KDa for 7S extracts. The undigested proteins are similar in both set of samples, the parental isogenic and GM soybeans. Immuno-reactivity of proteins from crude extracts with serum from allergic and non allergic patients were also similar for isogenic and GM cultivars. These results allow us to state that the significant differences observed in the composition of GM samples will neither affect the nutrient levels nor the safety of their consumption as food or feed. As well as there were no observed changes at the potential allergenicity of GM samples regarding to parental isogenic samples by exhibit similar proteolysis profile related to pepsin and immunological essays against allergic patient serums.

Schätzungsweise 1 – 2 % der europäischen Bevölkerung reagieren allergisch auf bestimmte Lebensmittel. Die verantwortlichen Allergene sind meist Proteine und können während der Lebensmittelverarbeitung, vor allem infolge thermischer Prozesse, erheblich modifiziert werden. Daraus kann sowohl eine Senkung als auch eine Erhöhung des allergenen Potentials resultieren. Insbesondere die Entstehung von sog. „Neoepitopen“ in der Folge der Maillard-Reaktion ist bereits diskutiert worden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen der Glykierung und dem allergenen Potential von Lebensmitteln, im Speziellen von Karotten und Erdnüssen, untersucht. Die Karottenallergie ist in der europäischen Bevölkerung relativ häufig. Etwa 23 – 25 % aller Nahrungsmittelallergiker leiden an dieser meist pollenassoziierten Allergie. Es ist bekannt, dass das allergene Potential von Karotten durch Hitzebehandlung, infolge der irreversiblen Denaturierung des Hauptallergens Dau c 1, stark gesenkt wird. Daher stellte sich die Frage, ob bestimmte Maillard-Reaktionsprodukte (MRP) als Indikatoren für die Senkung des allergenen Potentials infolge der Hitzebehandlung geeignet sind. Da zum Ausmaß der Maillard-Reaktion in hitzebehandelten Karotten bisher kaum Daten vorlagen, wurden zunächst Untersuchungen zu relevanten Glykierungsprodukten und zur resultierenden Aminosäuremodifizierung durchgeführt. In verschiedenen Handelsproben (Säfte, Breie, Konserven und getrocknete Karotten) waren neben Fru-Lys die Amadori-Produkte (AP) zahlreicher Aminosäuren, wie Fru-Ala und Fru-GABA nachweisbar. Als Produkte der fortgeschrittenen Phase der Maillard-Reaktion (advanced glycation endproducts, AGEs) wurden erstmals Pyrralin, Carboxymethyllysin (CML) und Pentosidin detektiert. Die resultierenden Aminosäure-modifizierungen waren in Produkten mit hohem Wasseranteil (Säfte, Breie sowie Konserven) mit bis zu 5 % gering. Dagegen zeigten getrocknete Karotten sehr hohe Derivatisierungsgrade (z. B. Lysin bis 58 %). Dabei war besonders die frühe Phase der Glykierung von Bedeutung, während die fortgeschrittene Phase kaum eine Rolle spielte. Das AP Fru-Lys bzw. dessen Hydrolyseprodukt Furosin gilt zwar als anerkannter Erhitzungsmarker für Lebensmittel, erwies sich aber in Karottenprodukten aufgrund von schnell stagnierenden Gehalten nur als bedingt geeignet. Insbesondere FM-GABA zeigte eine wesentlich bessere Korrelation mit der Intensität der Hitzebehandlung. Zudem korrelierte der Anstieg dieses AP gut mit der Senkung des Gehaltes an IgE-reaktivem Dau c 1. Damit ist FM-GABA ein geeigneter Parameter sowohl für die Hitzebehandlung von Karotten als auch für die damit verbundene Senkung des allergenen Potentials. Die Erdnussallergie gewinnt mit dem ansteigenden Verzehr von Erdnüssen zunehmend an Bedeutung. Diese Allergie zeichnet sich durch eine mitunter sehr schwere Symptomatik aus, so dass Erdnüsse hinsichtlich lebensbedrohender und letal verlaufender Nahrungsmittel-allergien an erster Stelle stehen. Bereits der Verzehr kleinster Mengen an Erdnuss, selbst Hautkontakt oder Inhalation können eine allergische Reaktion auslösen. Die Hauptallergene der Erdnuss, Ara h 1 und Ara h 2, sind bekanntermaßen stabil und behalten ihr allergenes Potential während der Hitzebehandlung bei. Dennoch besteht die Vermutung, dass die Zubereitung von Erdnüssen deren Allergenität maßgeblich beeinflusst. Daher wurde der Einfluss des Röstens bereits untersucht, jedoch sind die erhaltenen Ergebnisse bisher sehr widersprüchlich. Während in einigen Studien keine Unterschiede zwischen rohen und gerösteten Erdnüssen beobachtet wurden, berichteten andere Autoren von einer 90-fachen Erhöhung des IgE-Bindungsvermögens infolge der Röstung, die mit der Bildung von Neoepitopen durch die Maillard-Reaktion in Verbindung gebracht wurde. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss der Röstung und insbesondere der Glykierung auf das allergene Potential von Erdnüssen untersucht. Da bisher kaum Daten zu MRP-Gehalten in Erdnüssen vorlagen, wurden zunächst verschiedene handelsübliche Proben (ungeröstete und geröstete Erdnüsse, Erdnussbutter und Erdnussflips) auf ihre Gehalte an Glykierungsprodukten und die resultierende Aminosäure-modifizierung untersucht. Dabei wurde erstmals das AP Fru-Lys und die AGEs Pyrralin und CML identifiziert und quantifiziert. Definierte Erhitzungsexperimente zeigten, dass während der Röstung von Erdnüssen insbesondere Pyrralin in hohen Mengen gebildet wird. Während in erhitzten Lebensmitteln üblicherweise Fru-Lys das dominierende MRP darstellt, trug Pyrralin in gerösteten Erdnüssen in vergleichbarem oder höherem Maße zur Lysinmodifizierung bei als das AP. Aufgrund der stetigen Zunahme ist Pyrralin als Erhitzungsparameter in Erdnüssen wesentlich besser geeignet als das Hydrolyseprodukt Furosin, dessen Gehalt schnell ein Plateau erreichte. Durch die Röstung von Erdnüssen wurden hohe Lysinmodifizierungen bis zu 55 % erreicht, die jedoch nur zu einem Zehntel durch die gemessenen MRP erklärbar waren. Da zahlreiche andere Aminosäuren ebenfalls deutliche Abnahmen zeigten, müssen andere Reaktionen neben der Maillard-Reaktion einen wesentlichen Beitrag zur Aminosäurederivatisierung leisten. Aufgrund des hohen Gehaltes an ungesättigten Fettsäuren liegt die Vermutung nahe, dass es sich um Reaktionen mit Lipidperoxidationsprodukten handeln könnte. Der Einfluss der Röstung auf das allergene Potential der Erdnüsse wurde anhand des Antikörperbindungsvermögens bewertet. Dabei zeigten die Proteinextrakte roher und gerösteter Erdnüsse keine Unterschiede in der IgE-Reaktivität. Jedoch sind aufgrund der schlechten Extrahierbarkeit gerösteter Erdnussproteine keine Rückschlüsse auf das allergene Potential der gesamten Erdnüsse möglich. Vor allem das Allergen Ara h 1 bildete zunächst Di- und Trimere, unter drastischeren Bedingungen kam es zur weiteren Aggregation und damit zur Unlöslichkeit. Analog wurde auch die Löslichkeit aller anderen Erdnussproteine deutlich reduziert. Folglich konnten insbesondere stark modifizierte, aggregierte Proteine mit der verwendeten Extraktionsmethode nicht erfasst werden. Mittels Immunoblot wurde gezeigt, dass das IgE-Bindungsvermögen des Ara h 1 bei der Röstung nicht verändert wurde, solange das Allergen noch löslich war. Aussagen zum allergenen Potential des aggregierten Proteins waren noch nicht möglich. Hingegen wurden deutliche Hinweise auf die Erhöhung der IgE-Reaktivität des Ara h 2 infolge der Röstung erhalten. Um den Einfluss der Maillard-Reaktion im Einzelnen auf die beiden Hauptallergene der Erdnuss, Ara h 1 und Ara h 2, untersuchen zu können, wurden diese Allergene aus rohen Erdnüssen isoliert und unter röstungsrelevanten Bedingungen glykiert. Durch diese Modifizierung wurde deren Antikörperbindungsvermögen jedoch nicht beeinflusst. Folglich liegen keine Hinweise auf die Bildung von Neoepitopen im Zuge der Maillard-Reaktion vor. Die beobachtete Erhöhung der IgE-Reaktivität des Ara h 2 infolge der Röstung ist daher auf andere Reaktionen, vermutlich mit Produkten der Lipidperoxidation, zurückzuführen. Die Grundvoraussetzung für eine allergische Reaktion ist, dass die verantwortlichen Epitope die gastrointestinale Verdauung überstehen und intakt aufgenommen werden. Durch thermische Behandlung und die daraus resultierende Umfaltung sowie kovalente Modifizierung kann die Verdauungsresistenz erheblich beeinflusst werden. Daher wurde mit Hilfe einer simulierten gastrointestinalen Verdauung der Einfluss der Röstung von Erdnüssen sowie der Glykierung von Ara h 1 und Ara h 2 auf die Verdaubarkeit der Allergene untersucht. Diese orientierenden Verdauungsstudien gaben Hinweise auf eine erhöhte Verdauungsresistenz der Proteinaggregate in gerösteten Erdnüssen. Durch Glykierung der Allergene Ara h 1 und Ara h 2 wurde hingegen keine Veränderung der Verdaubarkeit erreicht. Für die hohe Proteolyseresistenz der Proteine in gerösteten Erdnüssen sind offenbar wiederum Reaktionen mit peroxidierten Erdnusslipiden verantwortlich.

Die Erdnussallergie ist für 25-28 % der Lebensmittelallergien verantwortlich (Owusu-Apenten, 2002) und es wird angenommen, dass 0,6-1,0 % der Bevölkerung von Industrieländern allergisch gegenüber Erdnüssen reagiert (Al-Muhsen et al., 2003). In Deutschland tritt die Erdnussallergie bei 0,6 %, in Schweden bei 2,4 % und in den USA bei 1,1 % der Bevölkerung auf (EFSA, 2013; Östblom et al., 2008; Zuberbier et al., 2004; Sicherer et al., 1999). Dabei ist vor allem bei Kindern eine Zunahme zu beobachten (Sicherer et al., 2010; Grundy et al., 2002). Bereits geringe Mengen von 2 mg Erdnussprotein können zu objektiven allergischen Reaktionen führen (Hourihane et al., 1997b). Dies stellt im Gegensatz zu anderen Nahrungsmittelallergenen wie beispielsweise Milch (165 mg Protein), Sojabohnen (1000 mg Protein) oder Haselnüssen (168 mg Protein) eine sehr geringe Menge an benötigtem Allergen dar (Ortolani et al., 2000; Norgaard & Bindslev-Jensen, 1992; Bock et al., 1978). Weiterhin kommt es im Falle der Erdnussallergie im Vergleich zu anderen Nahrungsmittelallergien besonders häufig zu anaphylaktischen Schocks (Bock et al., 2007; Bock et al., 2001). Auffallend ist, dass Erdnüsse in westlichen Ländern, wie beispielsweise den USA ein Hauptnahrungsmittelallergen darstellen, wohingegen dies in asiatischen Ländern nicht der Fall ist (Beyer et al., 2001; Hill et al., 1997). Da die Verzehrsmengen an Erdnüssen und Erdnussprodukten in beiden Ländern mit jeweils 3 kg pro Einwohner und Jahr vergleichbar sind und die Ursache auch nicht auf einen eventuell unterschiedlichen Genpool zurückgeführt werden konnte (Beyer et al., 2001), wird angenommen, dass die jeweiligen Zubereitungsformen einen Einfluss haben könnten (Cong et al., 2008; Beyer et al., 2001). Der Verzehr erfolgt in den USA vor allem in gerösteter und in asiatischen Ländern überwiegend in gekochter oder frittierter Form (Cong et al., 2008; Beyer et al., 2001). Studien, die sich mit dem Einfluss der Zubereitungsart auf das allergene Potential beschäftigten, betrachteten das Immunglobulin E- (IgE-) Bindungsvermögen, wobei die Ergebnisse allerdings widersprüchlich sind (Blanc et al., 2011; Vissers et al., 2011; Mondoulet et al., 2003; Maleki et al., 2000a; Koppelman et al., 1999). Als Folge der Röstung von Erdnüssen wurden Lysinabnahmen von bis zu 42 % festgestellt, wovon allerdings nur 10 % durch bekannte Maillard-Reaktionsprodukte erklärbar waren (Wellner et al., 2012b). Weiterhin bestand kein Zusammenhang zwischen einer gezielten Glykierung und dem allergenen Potential (Wellner et al., 2012a). Als mögliche Ursache für den hohen Anteil an nicht erklärbarer Lysinderivatisierung wurden Reaktionen mit Carbonyl-verbindungen aus der Lipidperoxidation angenommen („Lipierung“). Erkenntnisse über Lipierungsreaktionen stammten bisher vor allem aus physiologischen Modelluntersuchungen. Über entsprechende Reaktionen in Lebensmitteln war zu Beginn der Untersuchungen nur sehr wenig bekannt. Weiterhin waren bisher keine Daten bezüglich eines Zusammenhangs entsprechender Reaktionen und dem allergenen Potential von Erdnüssen verfügbar. Deshalb wurde zunächst die Bildung ausgewählter und potentiell reaktiver Sekundärprodukte, die als Folge der Erdnussröstung entstehen können, verfolgt. Hierzu wurden Erdnuss-röstexperimente bei 170 °C für 20 und 40 min durchgeführt sowie natives Erdnussöl unter den gleichen Bedingungen erhitzt. Des Weiteren wurden für Acrolein, Malondialdehyd (MDA) und 4 Hydroxynon-2-enal (4 HNE) Quantifizierungsmethoden mittels GC MS (EI) für die Probenmatrices Erdnussöl und Erdnüsse etabliert. Dabei zeigte sich, dass die Acrolein-, MDA- und 4 HNE-Gehalte als Folge der Erhitzung des Erdnussöls zunahmen. In den Erdnussproben kam es hingegen nur zu einer Zunahme des Gehalts an Acrolein, wohingegen die Gehalte an MDA und 4 HNE abnahmen. Eine Weiterreaktion mit Aminosäureseitenketten innerhalb des Erdnussproteinverbands war somit als Folge der Erdnussröstung naheliegend. In Modelluntersuchungen wurden nachfolgend die Reaktivitäten der Sekundärprodukte Hexanal, 2 Heptenal, Acrolein, MDA und 4 HNE gegenüber Aminosäureseitenketten nativer Erdnussproteine sowie die proteinquervernetzenden Eigenschaften untersucht. Dabei führten alle Sekundärprodukte zu einer Aminosäureabnahme, wobei Lysin diejenige Aminosäure darstellte, die bevorzugt modifiziert wurde. Die Reaktivitätsreihenfolge der Sekundärprodukte lautete unter Berücksichtigung der Abnahmen aller Aminosäuren und der Eigenschaften zur Proteinquervernetzung wie folgt: Acrolein > 2 Heptenal = 4 HNE > MDA > Hexanal. Zur Identifizierung potentieller Lipierungsprodukte, die durch die Reaktion mit der ɛ Aminogruppe des Lysins hervorgehen, wurde Nα-Acetyl-L-lysin mit den ausgewählten Sekundärprodukten Hexanal, 2 Heptenal, Acrolein, MDA und 4 HNE umgesetzt. Mittels LC ESI MS/MS wurden anhand von CID-Experimenten 14 Lipierungsprodukte identifiziert, davon 6 Verbindungen erstmalig. Weiterhin wurden 7 ausgewählte Verbindungen (Nɛ Hexyllysin, LHP 1, LHP 2, (Z) BPP, (E) BPP, MP-Lysin, 2-PPL) als Referenzsubstanzen dargestellt und chemisch charakterisiert, wovon LHP 2 sowie (Z)- und (E) BPP erstmalig dargestellt werden konnten. Zusätzlich wurden die stabilisotopenmarkierten Verbindungen Nɛ Hexyllysin-d12 und LHP 1 d29 erstmalig dargestellt. Die Lipierungsprodukte Nɛ-Hexyllysin, LHP 1, LHP 2, (Z) BPP, (E) BPP, MP-Lysin und 2 PPL konnten nach Etablierung von Quantifizierungsmethoden mittels LC-ESI-MS/MS durch Vergleich mit entsprechenden Referenzsubstanzen erstmalig massenspektrometrisch in modifizierten Erdnussproteinextrakten quantifiziert werden. Dabei zeigte sich, dass bei geringen und somit lebensmittelrelevanten Gehalten an Sekundärprodukten die Lysinderivati-sierung vor allem auf die Bildung der Lipierungsprodukte (Z)- und (E)-BPP, MP-Lysin und 2 PPL zurückführbar war. In den Erdnussproben konnten ebenfalls mittels LC-ESI-MS/MS erstmalig die Lipierungsprodukte Nɛ Hexyllysin, LHP 1, MP-Lysin und 2 PPL quantifiziert werden. Dabei stellte sich MP Lysin als mögliche Markerverbindung zur Beurteilung des Oxidationsstatus eines Lebensmittels heraus. Im Vergleich zu den Maillard-Reaktionsprodukten Nɛ Fruktosyllysin, Pyrralin und Nɛ Carboxymethyllysin waren die Gehalte der quantifizierten Lipierungsprodukte deutlich geringer. Der erklärbare Lysinverlust unter Berücksichtigung der Lipierungs- und Maillard-Reaktionsprodukte wurde für die 20 und 40 min gerösteten Erdnüsse jeweils zu 17 % und 11 % bestimmt. In Modelluntersuchungen wurde gezeigt, dass es zur Bildung heterogener Lipierungsprodukte, die neben dem ursprünglichen Nukleophil aus mehreren unterschied-lichen Carbonylverbindungen aufgebaut sind, kommen kann. Weiterhin wurde gezeigt, dass Lipierungsreaktionen des oxidativ gespaltenen Fettsäurerests möglich sind. Somit ist davon auszugehen, dass als Folge der Erdnussröstung eine Vielzahl an Lipierungsprodukten entstehen kann, deren Einzelbeiträge zum Gesamtlysinverlust vermutlich relativ gering sind, in der Summe allerdings einen erheblicheren Beitrag leisten könnten. Mittels ELISA und Western Blots wurde gezeigt, dass eine gezielte Lipierung der Erdnuss-proteine mit 4 HNE das Antikörperbindungsvermögen nicht beeinflusste. Allerdings wurde mittels SDS-PAGE in Abhängigkeit des Modifizierungsgrades die Ausbildung kovalent quervernetzter Proteinaggregate beobachtet, welche im Vergleich zu den nicht modifizierten Proteinen resistenter gegenüber einem simulierten gastrointestinalen Verdau waren. Weiterhin ergab sich anhand eines simulierten gastrointestinalen Verdaus die Verdaubarkeit der unterschiedlich zubereiteten Erdnüsse wie folgt: native Erdnüsse > gekochte Erdnüsse > geröstete Erdnüsse. Lipierungs-induzierte Proteinquervernetzungen könnten somit zu einer langsameren Verdaubarkeit gerösteter Erdnüsse im Vergleich zu gekochten Erdnüssen führen. Auf Grund einer hieraus resultierenden längeren Verweilzeit von Peptiden mit intakten Epitopen im Gastrointestinaltrakt könnte die Wahrscheinlichkeit zur Sensibilisierung ansteigen und somit eine mögliche Ursache für das unterschiedlich häufige Auftreten der Erdnussallergie in China und den USA darstellen. Die Ergebnisse zeigen, dass Lipierungsreaktionen vor allem bei der thermischen Behandlung von Lebensmitteln ablaufen und im Falle der Erdnüsse einen Einfluss auf das allergene Potential haben könnten. Vor dem Hintergrund einer in China im Vergleich zu den USA geringeren Prävalenz der Erdnussallergie wurden Hinweise erhalten, dass die unterschiedlichen Zubereitungsarten (China: Kochen, USA: Rösten) vor allem die Verdaubarkeit der Proteine beeinflussen und hierüber einen direkten Einfluss auf die Sensibilisierung haben könnten.

Os parâmetros de avaliação de segurança de alimentos geneticamente modificados fundamentam-se na comparação de equivalência substancial entre as variedades e pela inocuidade de proteínas da planta GM com as proteínas encontradas nas plantas convencionais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a segurança alimentar de três cultivares de sojas geneticamente modificadas para tolerarem o herbicida glifosato através da determinação da equivalência substancial e do potencial alergênico das mesmas quando comparadas às suas respectivas parentais isogênicas. Seis amostras de soja foram analisadas, sendo três convencionais parentais e três GM, referentes ao cultivo de 2004-2005, em Goiás. Para a composição química foram realizadas análises em triplicata de proteínas, lipídeos, umidade, minerais e fibra alimentar. Análises complementares para determinação de aminoácidos, ácidos graxos, isoflavonas e ácido fítico também foram realizadas. O potencial de alergenicidade foi avaliado em extratos protéicos brutos de três cultivares convencionais e suas correspondentes GM. Os mesmos extratos protéicos foram fracionados para obter as globulinas 7S e 11S por precipitação e posterior purificação em coluna de bioafinidade Sepharose 4B. A glicoproteína 7S foi obtida a partir da eluição com tampão contendo -D-mannopyranoside. A resistência à proteólise foi realizada a partir de dois fluidos gástricos simulados com pepsina nas proporções 2,5:100 e 13:1 de enzima/substrato. As amostras foram submetidas à eletroforese dissociante para se estimar a resistência à ação da pepsina em função da concentração da enzima e do tempo de incubação. Extratos brutos protéicos e frações hidrolisadas foram testados contra soros de pacientes comprovadamente alérgicos e não alérgicos à soja nas concentrações de 1/20 em ensaios imunoquímicos do tipo ELISA e 1/10 em ensaios do tipo Western blotting. Os resultados da composição básica de nutrientes mostraram dispersões normais esperadas entre as amostras de mesma origem, com tendências de níveis superiores de proteínas de 9 a 16% nas amostras GM. As análises de fibras insolúveis e isoflavonas revelaram valores de decréscimo das amostras GMs em relação aos teores das variedades convencionais, contrastando com o acréscimo de valores de ácido fítico nas mesmas cultivares. Quanto à proteólise, foi possível observar estabilidade de bandas protéicas com pesos moleculares em torno de 50 e 18 KDa nos extratos brutos, 10 KDa nos extratos de 11S e 50 KDa nos extratos de 7S, em geral similares entre as parentais isogênicas e GMs. Os testes de reatividade dos soros de pacientes alérgicos e não alérgicos em extratos brutos protéicos das cultivares GM demonstraram reatividade similar quando comparados às suas respectivas parentais isogênicas. Com a observação dos resultados pode-se concluir que as diferenças significativas apresentadas pelas amostras GM não as tornam inseguras para o consumo humano e animal. Da mesma forma que não foram observadas alterações na alergenicidade das amostras GM em relação às amostras parentais isogênicas por apresentarem perfis semelhantes de proteólise frente à pepsina e aos testes imunológicos contra soros de pacientes alérgicos. / The parameters of security evaluation of genetically modified foods are based on the substantial equivalence among varieties and the innocuity of GM vegetal proteins compared with conventional vegetal proteins. The aim of this work was to evaluate the food safety of three genetically modified soybean cultivars to tolerate glyphosate herbicide through substantial equivalence determination and allergenic potential when compared to their respective isogenic parental. Six samples analyzed were three parental soybean (conventional) and the others GM, regarding to the crop of 2004-2005, grown in Goiás state. The chemical composition was performed in triplicate and the content of moisture, minerals, proteins, lipids and fiber were determined. Additional compounds like aminoacids, fatty acids, isoflavons and phytates were analyzed. The potential of allergenic reactions was evaluated in crude protein extracts of three conventional and their corresponding GM cultivars. The same protein extracts were fractionated to obtain 7S and 11S globulins by precipitation and posterior purification on Sepharose 4B bioaffinity column. The 7S glycoprotein was obtained by elution with -D-mannopyranoside buffer. The resistance to proteolysis was performed by two simulated gastric fluids with pepsin at the proportions 2,5:100 and 13:1 enzyme/substrate. The samples were run by SDS electrophoresis to estimate the resistance to pepsin action according to enzyme concentration and incubation time. Crude protein extracts and hydrolyzed fractions were tested against serum of allergic and non-allergic patients through ELISA immunochemistry essays at concentrations of 1/20 and Western blotting, 1/10. The results of chemical composition of nutrients showed an expected normal dispersion among samples from the same origin, with tendencies for superior levels of proteins from 9 to 16% by GM samples. The analyses of insoluble fibers and isoflavons revealed decreased values at GM samples regarding to the contents on conventional varieties, contrasting with the increase of the phytic acid values in the same cultivars. After the proteolysis, some protein bands remained apparently stable, that correspond to molecular weights around 50 and 18 KDa for crude extracts, 10 KDa for 11S extracts and 50 KDa for 7S extracts. The undigested proteins are similar in both set of samples, the parental isogenic and GM soybeans. Immuno-reactivity of proteins from crude extracts with serum from allergic and non allergic patients were also similar for isogenic and GM cultivars. These results allow us to state that the significant differences observed in the composition of GM samples will neither affect the nutrient levels nor the safety of their consumption as food or feed. As well as there were no observed changes at the potential allergenicity of GM samples regarding to parental isogenic samples by exhibit similar proteolysis profile related to pepsin and immunological essays against allergic patient serums.

Die Erdnussallergie ist für 25-28 % der Lebensmittelallergien verantwortlich (Owusu-Apenten, 2002) und es wird angenommen, dass 0,6-1,0 % der Bevölkerung von Industrieländern allergisch gegenüber Erdnüssen reagiert (Al-Muhsen et al., 2003). In Deutschland tritt die Erdnussallergie bei 0,6 %, in Schweden bei 2,4 % und in den USA bei 1,1 % der Bevölkerung auf (EFSA, 2013; Östblom et al., 2008; Zuberbier et al., 2004; Sicherer et al., 1999). Dabei ist vor allem bei Kindern eine Zunahme zu beobachten (Sicherer et al., 2010; Grundy et al., 2002). Bereits geringe Mengen von 2 mg Erdnussprotein können zu objektiven allergischen Reaktionen führen (Hourihane et al., 1997b). Dies stellt im Gegensatz zu anderen Nahrungsmittelallergenen wie beispielsweise Milch (165 mg Protein), Sojabohnen (1000 mg Protein) oder Haselnüssen (168 mg Protein) eine sehr geringe Menge an benötigtem Allergen dar (Ortolani et al., 2000; Norgaard & Bindslev-Jensen, 1992; Bock et al., 1978). Weiterhin kommt es im Falle der Erdnussallergie im Vergleich zu anderen Nahrungsmittelallergien besonders häufig zu anaphylaktischen Schocks (Bock et al., 2007; Bock et al., 2001). Auffallend ist, dass Erdnüsse in westlichen Ländern, wie beispielsweise den USA ein Hauptnahrungsmittelallergen darstellen, wohingegen dies in asiatischen Ländern nicht der Fall ist (Beyer et al., 2001; Hill et al., 1997). Da die Verzehrsmengen an Erdnüssen und Erdnussprodukten in beiden Ländern mit jeweils 3 kg pro Einwohner und Jahr vergleichbar sind und die Ursache auch nicht auf einen eventuell unterschiedlichen Genpool zurückgeführt werden konnte (Beyer et al., 2001), wird angenommen, dass die jeweiligen Zubereitungsformen einen Einfluss haben könnten (Cong et al., 2008; Beyer et al., 2001). Der Verzehr erfolgt in den USA vor allem in gerösteter und in asiatischen Ländern überwiegend in gekochter oder frittierter Form (Cong et al., 2008; Beyer et al., 2001). Studien, die sich mit dem Einfluss der Zubereitungsart auf das allergene Potential beschäftigten, betrachteten das Immunglobulin E- (IgE-) Bindungsvermögen, wobei die Ergebnisse allerdings widersprüchlich sind (Blanc et al., 2011; Vissers et al., 2011; Mondoulet et al., 2003; Maleki et al., 2000a; Koppelman et al., 1999). Als Folge der Röstung von Erdnüssen wurden Lysinabnahmen von bis zu 42 % festgestellt, wovon allerdings nur 10 % durch bekannte Maillard-Reaktionsprodukte erklärbar waren (Wellner et al., 2012b). Weiterhin bestand kein Zusammenhang zwischen einer gezielten Glykierung und dem allergenen Potential (Wellner et al., 2012a). Als mögliche Ursache für den hohen Anteil an nicht erklärbarer Lysinderivatisierung wurden Reaktionen mit Carbonyl-verbindungen aus der Lipidperoxidation angenommen („Lipierung“). Erkenntnisse über Lipierungsreaktionen stammten bisher vor allem aus physiologischen Modelluntersuchungen. Über entsprechende Reaktionen in Lebensmitteln war zu Beginn der Untersuchungen nur sehr wenig bekannt. Weiterhin waren bisher keine Daten bezüglich eines Zusammenhangs entsprechender Reaktionen und dem allergenen Potential von Erdnüssen verfügbar. Deshalb wurde zunächst die Bildung ausgewählter und potentiell reaktiver Sekundärprodukte, die als Folge der Erdnussröstung entstehen können, verfolgt. Hierzu wurden Erdnuss-röstexperimente bei 170 °C für 20 und 40 min durchgeführt sowie natives Erdnussöl unter den gleichen Bedingungen erhitzt. Des Weiteren wurden für Acrolein, Malondialdehyd (MDA) und 4 Hydroxynon-2-enal (4 HNE) Quantifizierungsmethoden mittels GC MS (EI) für die Probenmatrices Erdnussöl und Erdnüsse etabliert. Dabei zeigte sich, dass die Acrolein-, MDA- und 4 HNE-Gehalte als Folge der Erhitzung des Erdnussöls zunahmen. In den Erdnussproben kam es hingegen nur zu einer Zunahme des Gehalts an Acrolein, wohingegen die Gehalte an MDA und 4 HNE abnahmen. Eine Weiterreaktion mit Aminosäureseitenketten innerhalb des Erdnussproteinverbands war somit als Folge der Erdnussröstung naheliegend. In Modelluntersuchungen wurden nachfolgend die Reaktivitäten der Sekundärprodukte Hexanal, 2 Heptenal, Acrolein, MDA und 4 HNE gegenüber Aminosäureseitenketten nativer Erdnussproteine sowie die proteinquervernetzenden Eigenschaften untersucht. Dabei führten alle Sekundärprodukte zu einer Aminosäureabnahme, wobei Lysin diejenige Aminosäure darstellte, die bevorzugt modifiziert wurde. Die Reaktivitätsreihenfolge der Sekundärprodukte lautete unter Berücksichtigung der Abnahmen aller Aminosäuren und der Eigenschaften zur Proteinquervernetzung wie folgt: Acrolein > 2 Heptenal = 4 HNE > MDA > Hexanal. Zur Identifizierung potentieller Lipierungsprodukte, die durch die Reaktion mit der ɛ Aminogruppe des Lysins hervorgehen, wurde Nα-Acetyl-L-lysin mit den ausgewählten Sekundärprodukten Hexanal, 2 Heptenal, Acrolein, MDA und 4 HNE umgesetzt. Mittels LC ESI MS/MS wurden anhand von CID-Experimenten 14 Lipierungsprodukte identifiziert, davon 6 Verbindungen erstmalig. Weiterhin wurden 7 ausgewählte Verbindungen (Nɛ Hexyllysin, LHP 1, LHP 2, (Z) BPP, (E) BPP, MP-Lysin, 2-PPL) als Referenzsubstanzen dargestellt und chemisch charakterisiert, wovon LHP 2 sowie (Z)- und (E) BPP erstmalig dargestellt werden konnten. Zusätzlich wurden die stabilisotopenmarkierten Verbindungen Nɛ Hexyllysin-d12 und LHP 1 d29 erstmalig dargestellt. Die Lipierungsprodukte Nɛ-Hexyllysin, LHP 1, LHP 2, (Z) BPP, (E) BPP, MP-Lysin und 2 PPL konnten nach Etablierung von Quantifizierungsmethoden mittels LC-ESI-MS/MS durch Vergleich mit entsprechenden Referenzsubstanzen erstmalig massenspektrometrisch in modifizierten Erdnussproteinextrakten quantifiziert werden. Dabei zeigte sich, dass bei geringen und somit lebensmittelrelevanten Gehalten an Sekundärprodukten die Lysinderivati-sierung vor allem auf die Bildung der Lipierungsprodukte (Z)- und (E)-BPP, MP-Lysin und 2 PPL zurückführbar war. In den Erdnussproben konnten ebenfalls mittels LC-ESI-MS/MS erstmalig die Lipierungsprodukte Nɛ Hexyllysin, LHP 1, MP-Lysin und 2 PPL quantifiziert werden. Dabei stellte sich MP Lysin als mögliche Markerverbindung zur Beurteilung des Oxidationsstatus eines Lebensmittels heraus. Im Vergleich zu den Maillard-Reaktionsprodukten Nɛ Fruktosyllysin, Pyrralin und Nɛ Carboxymethyllysin waren die Gehalte der quantifizierten Lipierungsprodukte deutlich geringer. Der erklärbare Lysinverlust unter Berücksichtigung der Lipierungs- und Maillard-Reaktionsprodukte wurde für die 20 und 40 min gerösteten Erdnüsse jeweils zu 17 % und 11 % bestimmt. In Modelluntersuchungen wurde gezeigt, dass es zur Bildung heterogener Lipierungsprodukte, die neben dem ursprünglichen Nukleophil aus mehreren unterschied-lichen Carbonylverbindungen aufgebaut sind, kommen kann. Weiterhin wurde gezeigt, dass Lipierungsreaktionen des oxidativ gespaltenen Fettsäurerests möglich sind. Somit ist davon auszugehen, dass als Folge der Erdnussröstung eine Vielzahl an Lipierungsprodukten entstehen kann, deren Einzelbeiträge zum Gesamtlysinverlust vermutlich relativ gering sind, in der Summe allerdings einen erheblicheren Beitrag leisten könnten. Mittels ELISA und Western Blots wurde gezeigt, dass eine gezielte Lipierung der Erdnuss-proteine mit 4 HNE das Antikörperbindungsvermögen nicht beeinflusste. Allerdings wurde mittels SDS-PAGE in Abhängigkeit des Modifizierungsgrades die Ausbildung kovalent quervernetzter Proteinaggregate beobachtet, welche im Vergleich zu den nicht modifizierten Proteinen resistenter gegenüber einem simulierten gastrointestinalen Verdau waren. Weiterhin ergab sich anhand eines simulierten gastrointestinalen Verdaus die Verdaubarkeit der unterschiedlich zubereiteten Erdnüsse wie folgt: native Erdnüsse > gekochte Erdnüsse > geröstete Erdnüsse. Lipierungs-induzierte Proteinquervernetzungen könnten somit zu einer langsameren Verdaubarkeit gerösteter Erdnüsse im Vergleich zu gekochten Erdnüssen führen. Auf Grund einer hieraus resultierenden längeren Verweilzeit von Peptiden mit intakten Epitopen im Gastrointestinaltrakt könnte die Wahrscheinlichkeit zur Sensibilisierung ansteigen und somit eine mögliche Ursache für das unterschiedlich häufige Auftreten der Erdnussallergie in China und den USA darstellen. Die Ergebnisse zeigen, dass Lipierungsreaktionen vor allem bei der thermischen Behandlung von Lebensmitteln ablaufen und im Falle der Erdnüsse einen Einfluss auf das allergene Potential haben könnten. Vor dem Hintergrund einer in China im Vergleich zu den USA geringeren Prävalenz der Erdnussallergie wurden Hinweise erhalten, dass die unterschiedlichen Zubereitungsarten (China: Kochen, USA: Rösten) vor allem die Verdaubarkeit der Proteine beeinflussen und hierüber einen direkten Einfluss auf die Sensibilisierung haben könnten.

Schätzungsweise 1 – 2 % der europäischen Bevölkerung reagieren allergisch auf bestimmte Lebensmittel. Die verantwortlichen Allergene sind meist Proteine und können während der Lebensmittelverarbeitung, vor allem infolge thermischer Prozesse, erheblich modifiziert werden. Daraus kann sowohl eine Senkung als auch eine Erhöhung des allergenen Potentials resultieren. Insbesondere die Entstehung von sog. „Neoepitopen“ in der Folge der Maillard-Reaktion ist bereits diskutiert worden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen der Glykierung und dem allergenen Potential von Lebensmitteln, im Speziellen von Karotten und Erdnüssen, untersucht. Die Karottenallergie ist in der europäischen Bevölkerung relativ häufig. Etwa 23 – 25 % aller Nahrungsmittelallergiker leiden an dieser meist pollenassoziierten Allergie. Es ist bekannt, dass das allergene Potential von Karotten durch Hitzebehandlung, infolge der irreversiblen Denaturierung des Hauptallergens Dau c 1, stark gesenkt wird. Daher stellte sich die Frage, ob bestimmte Maillard-Reaktionsprodukte (MRP) als Indikatoren für die Senkung des allergenen Potentials infolge der Hitzebehandlung geeignet sind. Da zum Ausmaß der Maillard-Reaktion in hitzebehandelten Karotten bisher kaum Daten vorlagen, wurden zunächst Untersuchungen zu relevanten Glykierungsprodukten und zur resultierenden Aminosäuremodifizierung durchgeführt. In verschiedenen Handelsproben (Säfte, Breie, Konserven und getrocknete Karotten) waren neben Fru-Lys die Amadori-Produkte (AP) zahlreicher Aminosäuren, wie Fru-Ala und Fru-GABA nachweisbar. Als Produkte der fortgeschrittenen Phase der Maillard-Reaktion (advanced glycation endproducts, AGEs) wurden erstmals Pyrralin, Carboxymethyllysin (CML) und Pentosidin detektiert. Die resultierenden Aminosäure-modifizierungen waren in Produkten mit hohem Wasseranteil (Säfte, Breie sowie Konserven) mit bis zu 5 % gering. Dagegen zeigten getrocknete Karotten sehr hohe Derivatisierungsgrade (z. B. Lysin bis 58 %). Dabei war besonders die frühe Phase der Glykierung von Bedeutung, während die fortgeschrittene Phase kaum eine Rolle spielte. Das AP Fru-Lys bzw. dessen Hydrolyseprodukt Furosin gilt zwar als anerkannter Erhitzungsmarker für Lebensmittel, erwies sich aber in Karottenprodukten aufgrund von schnell stagnierenden Gehalten nur als bedingt geeignet. Insbesondere FM-GABA zeigte eine wesentlich bessere Korrelation mit der Intensität der Hitzebehandlung. Zudem korrelierte der Anstieg dieses AP gut mit der Senkung des Gehaltes an IgE-reaktivem Dau c 1. Damit ist FM-GABA ein geeigneter Parameter sowohl für die Hitzebehandlung von Karotten als auch für die damit verbundene Senkung des allergenen Potentials. Die Erdnussallergie gewinnt mit dem ansteigenden Verzehr von Erdnüssen zunehmend an Bedeutung. Diese Allergie zeichnet sich durch eine mitunter sehr schwere Symptomatik aus, so dass Erdnüsse hinsichtlich lebensbedrohender und letal verlaufender Nahrungsmittel-allergien an erster Stelle stehen. Bereits der Verzehr kleinster Mengen an Erdnuss, selbst Hautkontakt oder Inhalation können eine allergische Reaktion auslösen. Die Hauptallergene der Erdnuss, Ara h 1 und Ara h 2, sind bekanntermaßen stabil und behalten ihr allergenes Potential während der Hitzebehandlung bei. Dennoch besteht die Vermutung, dass die Zubereitung von Erdnüssen deren Allergenität maßgeblich beeinflusst. Daher wurde der Einfluss des Röstens bereits untersucht, jedoch sind die erhaltenen Ergebnisse bisher sehr widersprüchlich. Während in einigen Studien keine Unterschiede zwischen rohen und gerösteten Erdnüssen beobachtet wurden, berichteten andere Autoren von einer 90-fachen Erhöhung des IgE-Bindungsvermögens infolge der Röstung, die mit der Bildung von Neoepitopen durch die Maillard-Reaktion in Verbindung gebracht wurde. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss der Röstung und insbesondere der Glykierung auf das allergene Potential von Erdnüssen untersucht. Da bisher kaum Daten zu MRP-Gehalten in Erdnüssen vorlagen, wurden zunächst verschiedene handelsübliche Proben (ungeröstete und geröstete Erdnüsse, Erdnussbutter und Erdnussflips) auf ihre Gehalte an Glykierungsprodukten und die resultierende Aminosäure-modifizierung untersucht. Dabei wurde erstmals das AP Fru-Lys und die AGEs Pyrralin und CML identifiziert und quantifiziert. Definierte Erhitzungsexperimente zeigten, dass während der Röstung von Erdnüssen insbesondere Pyrralin in hohen Mengen gebildet wird. Während in erhitzten Lebensmitteln üblicherweise Fru-Lys das dominierende MRP darstellt, trug Pyrralin in gerösteten Erdnüssen in vergleichbarem oder höherem Maße zur Lysinmodifizierung bei als das AP. Aufgrund der stetigen Zunahme ist Pyrralin als Erhitzungsparameter in Erdnüssen wesentlich besser geeignet als das Hydrolyseprodukt Furosin, dessen Gehalt schnell ein Plateau erreichte. Durch die Röstung von Erdnüssen wurden hohe Lysinmodifizierungen bis zu 55 % erreicht, die jedoch nur zu einem Zehntel durch die gemessenen MRP erklärbar waren. Da zahlreiche andere Aminosäuren ebenfalls deutliche Abnahmen zeigten, müssen andere Reaktionen neben der Maillard-Reaktion einen wesentlichen Beitrag zur Aminosäurederivatisierung leisten. Aufgrund des hohen Gehaltes an ungesättigten Fettsäuren liegt die Vermutung nahe, dass es sich um Reaktionen mit Lipidperoxidationsprodukten handeln könnte. Der Einfluss der Röstung auf das allergene Potential der Erdnüsse wurde anhand des Antikörperbindungsvermögens bewertet. Dabei zeigten die Proteinextrakte roher und gerösteter Erdnüsse keine Unterschiede in der IgE-Reaktivität. Jedoch sind aufgrund der schlechten Extrahierbarkeit gerösteter Erdnussproteine keine Rückschlüsse auf das allergene Potential der gesamten Erdnüsse möglich. Vor allem das Allergen Ara h 1 bildete zunächst Di- und Trimere, unter drastischeren Bedingungen kam es zur weiteren Aggregation und damit zur Unlöslichkeit. Analog wurde auch die Löslichkeit aller anderen Erdnussproteine deutlich reduziert. Folglich konnten insbesondere stark modifizierte, aggregierte Proteine mit der verwendeten Extraktionsmethode nicht erfasst werden. Mittels Immunoblot wurde gezeigt, dass das IgE-Bindungsvermögen des Ara h 1 bei der Röstung nicht verändert wurde, solange das Allergen noch löslich war. Aussagen zum allergenen Potential des aggregierten Proteins waren noch nicht möglich. Hingegen wurden deutliche Hinweise auf die Erhöhung der IgE-Reaktivität des Ara h 2 infolge der Röstung erhalten. Um den Einfluss der Maillard-Reaktion im Einzelnen auf die beiden Hauptallergene der Erdnuss, Ara h 1 und Ara h 2, untersuchen zu können, wurden diese Allergene aus rohen Erdnüssen isoliert und unter röstungsrelevanten Bedingungen glykiert. Durch diese Modifizierung wurde deren Antikörperbindungsvermögen jedoch nicht beeinflusst. Folglich liegen keine Hinweise auf die Bildung von Neoepitopen im Zuge der Maillard-Reaktion vor. Die beobachtete Erhöhung der IgE-Reaktivität des Ara h 2 infolge der Röstung ist daher auf andere Reaktionen, vermutlich mit Produkten der Lipidperoxidation, zurückzuführen. Die Grundvoraussetzung für eine allergische Reaktion ist, dass die verantwortlichen Epitope die gastrointestinale Verdauung überstehen und intakt aufgenommen werden. Durch thermische Behandlung und die daraus resultierende Umfaltung sowie kovalente Modifizierung kann die Verdauungsresistenz erheblich beeinflusst werden. Daher wurde mit Hilfe einer simulierten gastrointestinalen Verdauung der Einfluss der Röstung von Erdnüssen sowie der Glykierung von Ara h 1 und Ara h 2 auf die Verdaubarkeit der Allergene untersucht. Diese orientierenden Verdauungsstudien gaben Hinweise auf eine erhöhte Verdauungsresistenz der Proteinaggregate in gerösteten Erdnüssen. Durch Glykierung der Allergene Ara h 1 und Ara h 2 wurde hingegen keine Veränderung der Verdaubarkeit erreicht. Für die hohe Proteolyseresistenz der Proteine in gerösteten Erdnüssen sind offenbar wiederum Reaktionen mit peroxidierten Erdnusslipiden verantwortlich.

A soja geneticamente modificada tolerante ao herbicida glifosato tem sido a cultura derivada da engenharia genética mais cultivada atualmente no mundo. Como todo alimento GM a soja tem sido alvo de investigação em relação a sua Biossegurança. Novas estratégias têm sido desenvolvidas e aplicadas neste campo de pesquisa, sendo que métodos rápidos e eficientes de análise proteômica têm sido utilizados para avaliação e monitoramento da segurança e inocuidade alimentar, indicando mudanças no perfil protéico entre variedades convencionais e GM. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os mapas protéicos de amostras de soja convencionais e suas derivadas geneticamente modificadas tolerantes ao herbicida glifosato, utilizando técnicas de análise proteômica com ênfase para inocuidade alimentar. Foram utilizadas seis amostras de soja, sendo três convencionais parentais e três derivadas GM, cultivadas entre 2004-2005, em Goiás. O extrato bruto protéico foi submetido à análise por eletroforese unidimensional e bidimensional. A eletroforese 2D, foi realizada utilizando tiras com gradiente de pH de 3-10 e 4-7. As imagens dos mapas protéicos das seis variedades, produzidas em replicatas, foram analisadas pelo software ImageMaster 2D Platinum. O potencial alergênico do extrato protéico bruto foi avaliado para todas as variedades utilizando soro de pacientes alérgicos à soja através de immunoblotting. Nos resultados obtidos observou-se a presença das principais frações protéicas da soja pela eletroforese unidimensional sem alteração significativa entre as amostras parentais e GM, exceto para uma banda de 115 kDa presente nas amostras parentais, mas ausente nas amostras GM. A partir da análise por eletroforese 2D foram identificadas as formas peptídicas correspondentes às frações de β-conglicinina e glicinina bem como diversas outras proteínas encontradas na soja como o inibidor de tripsina e a lipoxigenase. Através do software foi possível observar que um spot apresentou diferença estatística entre as amostras analisadas, expresso em maior concentração nas amostras GM do que nas parentais. Nos testes de alergenicidade, os extratos protéicos das variedades GM demonstraram reatividade similar em relação as suas respectivas variedades parentais. A proteína de 115 kDa foi sequenciada e identificada como a proteína precursora da cadeia α da β-conglicinina e o spot das amostras GM que apresentou diferença estatística significativa foi identificado como a proteína precursora de G4 glicinina. A diferença observada entre as variedades parentais e GM para as subunidades α de β-conglicinina e G4 glicinina pode ter ocorrido devido a variações normais observadas entre diferentes variedades de soja. Os resultados demonstram a viabilidade de aplicação das ferramentas proteômicas na identificação de alterações de perfis protéicos de amostras de soja parentais e GM. Pelos dados obtidos podemos concluir que as diferenças apresentadas não comprometem a inocuidade alimentar das amostras de soja GM em relação a suas respectivas variedades parentais. / Genetically modified soya-tolerant to the herbicide glyphosate culture has been derived from the more cultivated genetic engineering in the world today. As GM soya beans whole food has been investigated in relation to your biosafety. New strategies have been developed and applied research in this field, and fast and efficient methods of analysis proteomics have been used for assessment and monitoring of food security and safety, indicating changes in own protein profile between conventional and GM varieties. The aim of this work was to assess the maps soy protein samples of conventional and genetically modified their derived to the herbicide glyphosate-tolerant, using Proteomics analysis techniques with emphasis on food safety. Six samples were used for conventional soya, three and three derived from GM parental, grown between 2004-2005. The crude protein extract own was subjected to analysis by electrophoresis one-dimensional and two-dimensional. 2D electrophoresis using Strip was held with pH gradient of 3-10 and 4-7. Protein maps images of six varieties produced in replicates have been analysed by the 2D Platinum software ImageMaster. The potential allergenic in crude protein extracts was evaluated for all varieties using allergic patient serum soya by immunoblotting. In the results obtained noted the presence of the main protein fractions of soya by one-dimensional electrophoresis without significant change between parental and GM samples, except for a band of 115 parental kDa present in the sample, but absent in GM samples. From the analysis by 2D electrophoresis peptides forms were identified corresponding to fractions of β-conglicinina and glicinina as well as several other proteins found in soy as trypsin inhibitor and lipoxygenase. Through the software has been possible to observe that a spot presented statistical difference between the samples tested, expressed in greater concentration in the samples GM in parenting. In tests of allergenicity, GM varieties protein extracts showed similar reactivity in respect of their parental varieties. 115 KDa protein was sequenced and identified as the protein precursor of α subunit of β-conglicinina and the spot that GM samples presented significant statistical difference was identified as the G4 glicinina protein precursor. The difference between parental and GM varieties for subunits α of β-conglicinina and G4 glicinina may have occurred due to normal variation between different varieties of soy. The results demonstrate the viability of applying the tools Proteomics in identification of protein profiles changes of soya samples parental and GM. By data obtained can be concluded that the differences do not compromise the safety of food GM soybean samples with regard to their parental varieties.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / This work reports the biochemical characterization, cytotoxic and allergenic effects of a lipid transfer protein isolated from M. citrifolia seeds (McLTP1), with trypsin and alpha-amylase inhibition properties. McLTP1 was purified with a procedure involving trichloroacetic acid precipitation and gel filtration chromatography. This protein showed significant inhibitory activities against trypsin (767,10  8,36 TIU/mgP), chymotrypsin (25,36  0,86 IU/mgP), papain (65,419  0,152 IU/mgP) and alpha-amylase (24,40%). Atomic force microscopy displayed that McLTP1 oligomerized in tetramers showing a central channel. Fluorescence and CD assays revealed that the McLTP1 structure is highly stable, regardless of pH and temperature levels. In vitro, McLTP1 presented a selective cytotoxic effect to human ovarian cancer cells (OVCAR-8; IC50 of 16,6 μg/mL) and demonstrated hemolytic effect against fresh rabbit red blood cels. Similarly to other non-specific lipid transfer protein reported, McLTP1 showed allergenic properties in mice, being considered as a true food allergen since it was able to sensitize the animals via the gastrointestinal tract. / Morinda citrifolia L. à uma espÃcie nativa do Sudeste da Ãsia intensamente investigada em funÃÃo de suas propriedades terapÃuticas reportadas hà mais de 2.000 anos. Recentemente, uma proteÃna transferidora de lipÃdeos denominada McLTP1 (UniProt Accession Number: C0HJH5) foi isolada de sementes de noni pelo nosso grupo de pesquisa. McLTP1 à uma proteÃna termoestÃvel de massa molecular 9,4 kDa, resistente à proteÃlise e dotada de atividades moduladoras da inflamaÃÃo e da dor pela via oral, promissoras e inÃditas para esse grupo de molÃculas. Este trabalho objetivou caracterizar bioquimicamente McLTP1, bem como avaliar o seu potencial alergÃnico em camundongos, como etapas bÃsicas para o seu uso racional e seguro do ponto de vista farmacolÃgico. Em adiÃÃo, as propriedades terapÃuticas de McLTP1 foram tambÃm ampliadas, atravÃs da investigaÃÃo de seu efeito citotÃxico em diferentes linhagens de cÃlulas tumorais. A proteÃna em estudo foi isolada utilizando o protocolo jà estabelecido, envolvendo as etapas de precipitaÃÃo seletiva de proteÃnas do extrato total das sementes de noni com Ãcido tricloroacÃtico 2,5% e cromatografia de exclusÃo molecular. O ensaio de alergenicidade in vivo foi conduzido apÃs prÃvia aprovaÃÃo pelo Comità de Ãtica para Uso de Animais da Universidade Federal do Cearà e utilizou fÃmeas nulÃparas com massa corporal entre 25 e 30 g. McLTP1 apresentou in vitro atividades inibitÃrias de tripsina (767,10  8,36 UIT/mgP), quimotripsina (25,36  0,86 UI/mgP), papaÃna (65,419  0,152 UI/mgP) e alfa-amilase (24,40%). A atividade inibitÃria de tripsina de McLTP1 foi reduzida significativamente em temperaturas superiores a 37 ÂC, apresentando atividade residual de apenas 5,91% quando aquecida a 100 ÂC por 30 min. Essa atividade foi tambÃm influenciada pelo pH, sendo de apenas 30,13% e 39,05% quando a proteÃna foi incubada em tampÃes de pH 3,0 e 12,0. O padrÃo de oligomerizaÃÃo de McLTP1 demonstrou a formaÃÃo de agregados dimÃricos/tetramÃricos delimitando um canal central de diÃmetro de 4,4 nm. As anÃlises espectroscÃpicas mostraram que McLTP1 apresenta espectro de CD similar Ãquele apresentado por outras proteÃnas transferidoras de lipÃdeos e caracterÃstico de proteÃnas ricas em alfa-hÃlice. Espectro de CD de McLTP1 nÃo mostrou alteraÃÃes significativas em diferentes temperaturas e pHs, corroborando com os dados de estabilidade obtidos anteriormente. Diferentemente, em condiÃÃes redutoras (DTT 1 mM) o espectro de CD mostrou alteraÃÃo na estrutura secundÃria da proteÃna e os mÃnimos e mÃximos de elipticidade molar foram tambÃm alterados na presenÃa de micelas iÃnicas de SDS (10 mM). McLTP1 apresentou atividade citotÃxica seletiva contra cÃlulas de cÃncer de ovÃrio (Ovcar-8; CI50: 16,6 μg/mL), nÃo sendo citotÃxica para as cÃlulas tumorais de cÃlon humano (HCT-116), leucemia humano (HL-60) e glioblastoma humano (SF-295) testadas. McLTP1 foi capaz de promover hemÃlise significativa em hemÃcias de coelho a partir da concentraÃÃo de 0,005 mgP/mL. McLTP1 apresentou potencial efeito alergÃnico in silico e em camundongos imunizados pela via oral, induzindo a sÃntese de anticorpos IgG e IgG1. Tal como descrito na literatura para outras LTPs, anticorpos anti-McLTP1 produzidos em coelho foram tambÃm capazes de reconhecer proteÃnas presentes em extratos de Rosaceae, Cucurbitaceae e na polpa do fruto de noni. Os dados obtidos permitiram caracterizar parcialmente a proteÃna em estudo, bem como avaliar o seu potencial imunogÃnico apÃs administraÃÃo oral. Novos testes serÃo conduzidos objetivando avaliar a importÃncia clÃnica dessas respostas, uma vez que testes de toxicidade demonstraram que McLTP1 nÃo foi capaz de promover reaÃÃes adversas em camundongos, mesmo apÃs administraÃÃo da dose de 8 mg/kg por 28 dias.

A soja geneticamente modificada tolerante ao herbicida glifosato tem sido a cultura derivada da engenharia genética mais cultivada atualmente no mundo. Como todo alimento GM a soja tem sido alvo de investigação em relação a sua Biossegurança. Novas estratégias têm sido desenvolvidas e aplicadas neste campo de pesquisa, sendo que métodos rápidos e eficientes de análise proteômica têm sido utilizados para avaliação e monitoramento da segurança e inocuidade alimentar, indicando mudanças no perfil protéico entre variedades convencionais e GM. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os mapas protéicos de amostras de soja convencionais e suas derivadas geneticamente modificadas tolerantes ao herbicida glifosato, utilizando técnicas de análise proteômica com ênfase para inocuidade alimentar. Foram utilizadas seis amostras de soja, sendo três convencionais parentais e três derivadas GM, cultivadas entre 2004-2005, em Goiás. O extrato bruto protéico foi submetido à análise por eletroforese unidimensional e bidimensional. A eletroforese 2D, foi realizada utilizando tiras com gradiente de pH de 3-10 e 4-7. As imagens dos mapas protéicos das seis variedades, produzidas em replicatas, foram analisadas pelo software ImageMaster 2D Platinum. O potencial alergênico do extrato protéico bruto foi avaliado para todas as variedades utilizando soro de pacientes alérgicos à soja através de immunoblotting. Nos resultados obtidos observou-se a presença das principais frações protéicas da soja pela eletroforese unidimensional sem alteração significativa entre as amostras parentais e GM, exceto para uma banda de 115 kDa presente nas amostras parentais, mas ausente nas amostras GM. A partir da análise por eletroforese 2D foram identificadas as formas peptídicas correspondentes às frações de β-conglicinina e glicinina bem como diversas outras proteínas encontradas na soja como o inibidor de tripsina e a lipoxigenase. Através do software foi possível observar que um spot apresentou diferença estatística entre as amostras analisadas, expresso em maior concentração nas amostras GM do que nas parentais. Nos testes de alergenicidade, os extratos protéicos das variedades GM demonstraram reatividade similar em relação as suas respectivas variedades parentais. A proteína de 115 kDa foi sequenciada e identificada como a proteína precursora da cadeia α da β-conglicinina e o spot das amostras GM que apresentou diferença estatística significativa foi identificado como a proteína precursora de G4 glicinina. A diferença observada entre as variedades parentais e GM para as subunidades α de β-conglicinina e G4 glicinina pode ter ocorrido devido a variações normais observadas entre diferentes variedades de soja. Os resultados demonstram a viabilidade de aplicação das ferramentas proteômicas na identificação de alterações de perfis protéicos de amostras de soja parentais e GM. Pelos dados obtidos podemos concluir que as diferenças apresentadas não comprometem a inocuidade alimentar das amostras de soja GM em relação a suas respectivas variedades parentais. / Genetically modified soya-tolerant to the herbicide glyphosate culture has been derived from the more cultivated genetic engineering in the world today. As GM soya beans whole food has been investigated in relation to your biosafety. New strategies have been developed and applied research in this field, and fast and efficient methods of analysis proteomics have been used for assessment and monitoring of food security and safety, indicating changes in own protein profile between conventional and GM varieties. The aim of this work was to assess the maps soy protein samples of conventional and genetically modified their derived to the herbicide glyphosate-tolerant, using Proteomics analysis techniques with emphasis on food safety. Six samples were used for conventional soya, three and three derived from GM parental, grown between 2004-2005. The crude protein extract own was subjected to analysis by electrophoresis one-dimensional and two-dimensional. 2D electrophoresis using Strip was held with pH gradient of 3-10 and 4-7. Protein maps images of six varieties produced in replicates have been analysed by the 2D Platinum software ImageMaster. The potential allergenic in crude protein extracts was evaluated for all varieties using allergic patient serum soya by immunoblotting. In the results obtained noted the presence of the main protein fractions of soya by one-dimensional electrophoresis without significant change between parental and GM samples, except for a band of 115 parental kDa present in the sample, but absent in GM samples. From the analysis by 2D electrophoresis peptides forms were identified corresponding to fractions of β-conglicinina and glicinina as well as several other proteins found in soy as trypsin inhibitor and lipoxygenase. Through the software has been possible to observe that a spot presented statistical difference between the samples tested, expressed in greater concentration in the samples GM in parenting. In tests of allergenicity, GM varieties protein extracts showed similar reactivity in respect of their parental varieties. 115 KDa protein was sequenced and identified as the protein precursor of α subunit of β-conglicinina and the spot that GM samples presented significant statistical difference was identified as the G4 glicinina protein precursor. The difference between parental and GM varieties for subunits α of β-conglicinina and G4 glicinina may have occurred due to normal variation between different varieties of soy. The results demonstrate the viability of applying the tools Proteomics in identification of protein profiles changes of soya samples parental and GM. By data obtained can be concluded that the differences do not compromise the safety of food GM soybean samples with regard to their parental varieties.