Au cours de notre programme de thèse, nous avons isolé et caractérisé des molécules protéiques à activité antivirale intracellulaire dirigée contre le VIH-1. Ces protéines, appelées aRep, ont été obtenues par criblage d'une banque de protéines artificielles de nouvelle génération, construites de façon combinatoire à partir de protéines naturelles constituées de motifs alpha-hélicoidaux répétés. La cible virale, ou "appât", utilisé pour ce criblage a été une région de la polyprotéine Gag du VIH-1 identifiée comme une cible privilégiée de nouvelles thérapeutiques antivirales, car essentielle à l'assemblage viral, l'empaquetage du génome viral et le clivage de maturation de Gag aboutissant à la formation de virions infectieux. Deux molécules d'aRep à affinité élevée pour la cible virale, l'aRep4E3 (32 kDa; 7 motifs répétés) et l'aRep9A8 (28 kDa; 6 motifs répétés) ont ainsi été identifiées, isolées et clonées. L'étude de l'activité anti-VIH intracellulaire de ces aRep a été réalisée dans différents systèmes d'expression cellulaire, nécessitant la construction de lignées stables de cellules d'insecte et de cellules épithéliales humaines, et leur infection par différents types de vecteurs viraux recombinants, baculovirus ou lentivirus, porteurs du gène rapporteur luciférase. Mais surtout, cette étude a été menée sur des cellules lymphocytaires-T (SupT1), cibles naturelles du virus, exprimant ces aRep et infectées par du VIH-1 naturel infectieux. Nos résultats ont montré que l'aRep4E3 et l'aRep9A8 ont toutes deux un effet négatif significatif sur le cycle réplicatif du VIH-1, mais ciblent des fonctions virales différentes. L'aRep4E3 bloque l'empaquetage du génome viral, tandis que l'aRep9A8 inhibe la maturation et diminue l'infectivité virale. De plus, l'aRep9A8, exprimée de façon constitutive dans les cellules SupT1, leur confère une résistance au VIH: une lignée de SupT1 chroniquement infectée par le VIH-1 a pu être ainsi isolée et maintenue en culture pendant plusieurs semaines, sans effet cytopathique viro-induit apparent. Ces nouvelles données auront des implications non-négligeables dans le choix et la conduite de futures stratégies de thérapie cellulaire anti-VIH / HIV-1 infection is a long-term disease which required a long-life treatment. Besides the standard HAART regiment, HIV gene therapy is a promising alternative strategy which give rise to hope for the better HIV-1 treatment. Protein therapeutics is one another technique that represent high impact results in curing various types of disease. It is already become a significant part of current medical treatments. In this study we first designed aRep, a non-immunoglobulin scaffold protein which target two domains of HIV-1 Pr55Gag, SP1-NC and investigated their roles as an intracellular therapeutic agents. Phage display technology was used for the specific isolation of aRep against a critical C-terminal region of the HIV-1 Pr55Gag precursor from a large and diverse library. The antiviral activity of these two Pr55Gag binders was investigated using different cell systems. Two aRep scaffolds aRep4E3 and aRep9A8 were isolated and characterized. aRep4E3 contains 7 repeat motifs (32 kDa), meanwhile aRep9A8 has 6 repeat motifs (28 kDa). These two scaffold molecules found to be able to display antiviral effects on the late stage of HIV-1 replication, by reducing and delaying the viral progeny production. The difference in the molecular mechanism was observed between these two aRep proteins: aRep4E3 mainly interferes with the packaging of the viral genome, meanwhile aRep9A8 interferes with the proteolytic processing of Gag, and performs as a protease inhibitor to prevent the PR cleavage required for the production of newly infectious mature virus. Interestingly, aRep9A8 is able to survive in the chronical HIV-1 infected cells up to D38 pi with the low level of HIV-1 replication. Taken together, results suggested that aRep, a new type of scaffold protein could serve as a promising alternative agent in protein therapy, not only the HIV-1 infection but also the others pathogens or disorders

Les immunoglobulines ne sont pas les seules protéines capables de reconnaissance spécifique. D’autres systèmes d’immunité adaptative existent et beaucoup d’autres protéines peuvent aussi générer des interactions spécifiques de hautes affinités. Ce sont des ossatures/squelettes protéiques intéressants pour concevoir de nouveaux interacteurs.Une nouvelle famille de protéines synthétiques, appelées AlphaReps, basée sur la famille des protéines à HEAT repeat contenant un motif structural répété en double hélice alpha, a été construite au laboratoire. Le motif répété, d’abord identifié chez une archée thermostable, a été idéalisé en concevant une séquence consensus, grâce à l’alignement de séquences de motifs naturels. Une banque de protéines a alors été construite à partir de ce motif. Toutes les protéines de la banque ont une structure générale similaire mais elles diffèrent par le nombre de motifs insérés et par les cinq résidus hautement diversifiés situés sur la face externe de la seconde hélice de chacun des motifs. Ces nouvelles protéines sont exprimées très efficacement chez E. Coli, solubles, sans pont disulfure et très stables (50-100 mg. L-1 de culture, Tm > 70°C).Le travail de thèse présenté dans ce manuscrit s’intéresse à l’utilisation de ces nouvelles protéines synthétiques comme outils de reconnaissance moléculaire. Pour cela, plusieurs applications ont été développées. Dans la première partie, à l’aide de la technique du phage display, des interacteurs de hautes affinités pour la Green Fluorescent Protein ont pu être isolés au sein de la banque. Les interactions des protéines partenaires ont été caractérisées par la détermination des constantes d’affinité, ainsi que la résolution des structures cristallographiques de deux complexes contenant une AlphaRep spécifique et la GFP. Avec cette cible modèle, la possibilité d’utiliser les AlphaReps sélectionnées à l’intérieur des cellules eucaryotes vivantes pour reconnaître spécifiquement une cible protéique dans un milieu complexe a aussi été démontrée. L’utilisation des AlphaReps comme outils de diagnostique a été développée pour la détection de la cible membranaire FSHr (récepteur de l’hormone folliculo-stimulante), protéine surexprimée dans de nombreuses tumeurs. Ce projet a permis d’expérimenter des approches de sélections sur cellules entières, soulignant les progrès restant encore à accomplir pour la sélection contre des cibles plus complexes.La seconde partie de ce travail s’est intéressée à l’ingénierie et à l’évolution des AlphaReps. Ainsi, l’insertion de résidus variables sur le dernier motif (C-cap) de protéines de la banque a pu être validé. Une approche innovante de shuffling modulaire, adaptée à l’ossature AlphaRep a permis de cerner les limites de cette méthode et les améliorations à apporter pour être en mesure d’augmenter l’affinité d’interacteurs présélectionnés. La banque d’AlphaReps de phage display a également été transférée dans un vecteur de PCA (Protein Fragment Complementation Assay) utilisant la protéine scindée DHFR (Dihydrofolate Reductase) comme protéine rapportrice. Cela a permis de sélectionner des AlphaReps spécifiques pour des cibles non exploitables en phage display. L’utilisation de la cis-fusion entre une AlphaRep et sa cible, combinée à la technique de PCA, s’est révélée très efficace pour la sélection et la cristallisation de protéines réfractaires telles que la protéine ComD, ici présentée comme preuve de la réussite de cette approche.Les AlphaReps sont donc des protéines artificielles, parmi lesquelles des interacteurs spécifiques peuvent être isolés pour des cibles variées. Un large panel d’applications peut être envisagé comme le développement d’outils d’aide à la cristallogenèse ou celui d’outils de reconnaissance moléculaire in vivo. / Immunoglobulin fold is not the only basis for specific recognition proteins. Other adaptive immunity systems exist and many other proteins are also able to mediate specific high-affinity interactions. These are interesting scaffolds to generate alternative binding molecules.A new family of artificial proteins, named AlphaRep, based on HEAT repeat proteins containing an alpha-helical repeated motif, was designed in the laboratory. The repeated motif, first identified in a thermostable archae protein of unknown function was refined and idealized using a consensus design strategy. A library of artificial proteins based on this design was then constructed. All proteins from this library share the same general fold but differ both in the number of repeats and in a set of five highly randomized positions per repeat. The randomized side chains are located on the outside surface of the second helix. Sequences from this library are efficiently expressed as soluble, folded and very stable proteins (50-100 mg. L-1 of culture, Tm > 70°C).The work presented in this manuscript is focused on the use of those new synthetic proteins as molecular recognition tools. Then, different applications have been developed.In a first part, binders with high affinity for the green fluorescent protein were selected by phage display. Complexes were characterized. Affinity between partners was measured and structures of two of those complexes containing a specific AlphaRep and the protein target were solved by X-ray crystallography. Thanks to this model target, it was demonstrated that AlphaReps could be used in living cells for the specific recognition of the protein they have been selected for. AlphaReps have also been developed as a diagnostic tool to detect the membrane protein FSHr (Follicle stimulating Hormone receptor), shown to be overexpressed in various tumors. In this project, selections on entire cells have been performed, showing the limit of the selections approaches with complex targets.The second part of this work focused on engineering and evolutions of AlphaRep proteins. The insertion of randomized residues at specific positions in the last motif (C-cap) was validated. An innovative approach of modular shuffling, adjusted to the AlphaRep scaffold, was assessed. Limitations of this approach to perform affinity maturation of AlphaReps could then be understood. Finally, the AlphaRep Library was transferred to a PCA (Protein Fragment Complementation Assay) vector using the split DHFR (Dihydrofolate Reductase) as reporter protein. With this new selection system, specific Alphareps could be selected for protein targets not suitable for phage display selection. A cis-fusion strategy was employed to express the AlphaRep fused to its partner in order to increase the stability and solubility of the target as well as helping for its crystallogenesis. This approach, combined with the PCA selection, was successful to obtain crystals of the ComD protein (unstable protein), shown here as an example of success for this new method.AlphaReps are thus artificial proteins, among which specific binders can be isolated for various targets, showing a strong potential for a large range of applications from crystallogenesis helpers to in vivo molecular recognition tools.

Parmi les virus émergents transmis par des moustiques (arbovirus), le genre flavivirus est fortement représenté avec les virus Dengue, Zika, et le virus West Nile (WNV). Le WNV est responsable de nombreux cas de maladies neuroinvasives sévères, parfois mortelles, chez l'humain et les chevaux. Ce virus représente donc un problème de santé publique humaine et animale. Il n'existe pour le moment aucun vaccin humain ni aucun traitement spécifique anti-WNV.Parmi les déterminants viraux essentiels à l'infection par les flavivirus, la glycoprotéine non-structurale NS1 possède des propriétés multifonctionnelles. La forme sNS1, sécrétée dans le milieu extracellulaire, est fortement impliquée dans la dérégulation du système immunitaire de l'hôte. Ces mécanismes participent à l'évasion du virus à la réponse antivirale et, paradoxalement, à la pathogenèse observée dans les formes sévères de la maladie. L'essentiel de ces données concernant le virus de la Dengue, nous souhaitions étudier les propriétés fonctionnelles, in vitro, de la protéine sNS1WNV au cours de l'infection de cellules épithéliales, gliales et neuronales de mammifères. En effet, la structure des protéines sNS1 de flavivirus étant très similaire, notre hypothèse suppose un rôle de sNS1WNV dans les infections neuroinvasives.Si la protéine sNS1WNV ne semble pas moduler les étapes de l'infection virale, elle est cependant à l'origine d'un remodelage du cytosquelette d'actine dans les cellules épithéliales. Elle est aussi impliquée dans l'activation de voies antivirales chez les cellules neuronales non infectées. D'autre part, en ciblant sNS1 et la protéine d'enveloppe E du WNV, nous avons pu isoler, par criblage de molécules aRep (protéines artificielles à motifs répétés), des ligands de haute affinité pour ces déterminants viraux. Ces nouvelles molécules, capables de se lier spécifiquement aux protéines sNS1 et E, ont le potentiel pour servir de base au développement de nouveaux outils de diagnostics et d'agents thérapeutiques antiviraux / Among emerging mosquito-borne viruses (arboviruses), flaviviruses like Dengue, Zika and West Nile virus (WNV) are very often involved in outbreaks. WNV causes several neuroinvasive diseases, which can be lethal, in humans and horses each year. This virus is a threat for both, human and animal public health. Furthermore, there is no human vaccine currently or any specific antiviral treatments against WNV.Among viral factors which are essential for flavivirus infection, the nonstructural glycoprotein NS1 is a multifunctional protein. The secreted form sNS1, is released in the extracellular medium from infected cells and is strongly involved in immune system dysregulation. The functions of sNS1 play roles in immune escape and, paradoxically, in pathogenesis which is observed in severe forms of the disease. Because most of this data are about Dengue Virus, we would like to study, in vitro, functional properties of the sNS1WNV during infection of epithelial, glial and neuronal mammalian cells. Based on the high sNS1 protein structure similarities among flaviviruses, our hypothesis suggests a role of sNS1WNV in neuroinvasive infections.The sNS1WNV protein doesn’t seem to modulate viral infection steps. However, it is involved in actin cytoskeleton remodeling in epithelial cells. sNS1WNV is also involved in the activation of antiviral response pathways in non-infected neuronal cells. On the other hand, by targeting sNS1 and envelope protein E of WNV, we performed a screening of aRep molecules (artificial proteins with alphahelicoïdal repeats) and isolated ligands with high affinity for these viral factors. Because this new type of molecules is able to specifically bind to sNS1 and E, they have potential to be used for the development of new diagnostic tools and antiviral therapeutic agents